HERRAMIENTAS MOLECULARES

Sntesis del DNA

La replicacin del DNA es el proceso por el cual la informacin contenida en el DNA
es perpetuada.
Caractersticas:
La replicacin del DNA es semiconservadora. Cada Cadena de DNA acta como
molde para la sntesis de una nueva cadena. El resultado son dos molculas de
DNA nuevas, cada una con una cadena nueva y otra vieja.
Este proceso se denomina replicacin semiconservadora. La sntesis del DNA
progresa invariablemente en direccin 5' 3.Y por lo tanto es semidiscontinua. La
replicacin empieza en un punto de origen y normalmente avanza de forma
bidireccional formando una doble horquilla. La replicacin es muy precisa. La
replicacin tiene lugar con un grado extraordinario de fidelidad. En E. coli se comete
un error cada 1010 nucletidos incorporados.
El DNA es sintetizado por DNA polimerasas. Se conocen numerosos tipos de
Polimerasas tanto en procariotes como en eucariotes, pero su mecanismo de accin
es similar en todos los casos: todas ellas actan sintetizando una doble cadena
complementaria a la doble cadena de
DNA preexistente y todas ellas requieren un cebador inicial, cadena corta de RNA,
para poder proceder a la sntesis de DNA.
El Origen de la Replicacin
Los orgenes de replicacin son los puntos fijos, situados en la doble hlice de DNA,
a partir de los cuales se lleva cabo la replicacin, que avanza de forma secuencial
formando estructuras con forma de horquilla. La cantidad de DNA que se puede
sintetizar a partir de un nico origen de replicacin se denomina replicn o unidad
funcional de replicacin.
El genoma bacteriano es un replicn nico circular. En organismos eucariotas, la
replicacin del ADN se inicia en mltiples orgenes a la vez (hay uno cada 20 kb
aproximadamente), es decir, hay multitud de replicones.

Replicacin del DNA

Consiste en la sntesis de nuevas copias de DNA a partir de un molde preexistente.
Ocurre una sola vez en la vida de la clula antes de la divisin celular.
Es un proceso rpido y exacto, con mecanismos de reparacin eficaces.
Siempre se da en la direccin 5`-- 3`.
La replicacin es semiconservadora. Cada hebra de una cadena doble de DNA sirve
de molde para la sntesis de una hebra complementaria.

DNA Polimerasas
La replicacin del DNA se lleva a cabo mediante enzimas conocidas con el nombre
de DNA polimerasas dirigidas por DNA o simplemente como DNA polimerasas.
Estas enzimas utilizan el DNA de hebra sencilla como molde sobre el que catalizan
la sntesis de la hebra complementaria, a partir de los desoxinuclesidos trifosfato
adecuados.
Los nuevos nucletidos se seleccionan por su capacidad para aparearse, segn la
complementariedad demostrada por Watson y Crick, con las bases de la molcula
molde, de modo que la hebra recin sintetizada forma una doble hlicecon la hebra
molde.

Todas las DNA polimerasas pueden aadir el nucletido aportado por un

desoxinuclesido trifosfato nicamente al grupo 3'-OH libre de un polinucletido
preexistente, que tiene sus bases apareadas, de forma que la hebra de DNA se
extienda slo en la direccin 5 3'.

La polimerasa cataliza el ataque nucleoflico del 3-OH terminal de la cadena

nucleoltica sobre el -fosfato del desoxinucletido trifosfato que debe agregarse,
liberando pirofosfato inorgnico.
Sin embargo, las DNA polimerasas slo pueden agregar nucletidos al extremo 3 de
una cadena polinucleotdica pre-existente, no pueden iniciar por s mismas la
agregacin de bases complementarias a una hebra de DNA molde.
Para iniciar esta reaccin, las DNA polimerasas requieren un cebador (primer),
pequea cadena de RNA, que tenga un grupo 3-OH libre y que haya sido
previamente sintetizado por una enzima diferente, utilizando el principio de
complementariedad de bases, sobre el molde de DNA de una sola hebra.
Estructura de la DNA Polimerasa.
La estructura inicial conocida de la DNA polimerasa fue la de un fragmento de la
DNA polimerasa I de E. coli llamado fragmento de Klenow. Como otras DNA
polimerasas, la unidad de polimerasa semeja una mano derecha con dedos
(naranja), palma (azul), y pulgar (verde). El fragmento de Klenow incluye tambin un
dominio de exonucleasa.

Mecanismo de la DNA Polimerasa.

Dos iones metlicos (Mg2+) participan en la reaccin de la DNA polimerasa.
Uno de ellos coordina el grupo 3-OH del cebador, mientras los grupos fosfatos del
nuclesido trifosfato forman un puente entre los dos iones metlicos. El grupo 3-OH
del cebador ataca el grupo -fosfato del dNTP para formar un nuevo enlace
fosfodister.
Todas las DNA Polimerasas tienen estructuras semejantes. Su estructura se ha
dividido en varios dominios independientes que son descritos por analoga con la
mano derecha humana.
El DNA se fija en un hondo surco compuesto de tres dominios. El dominio palma
contiene varios motivos, cuyas secuencias han sido estrictamente conservadas,
donde radica el sitio activo cataltico. Los dedos participan en la colocacin del
DNA molde de manera correcta en el sitio activo. El pulgar fija el DNA a su salida
de la enzima y es importante en la determinacin de la procesividad de la enzima.
Las DNA polimerasas caen dentro de cinco familias basadas en homologas de
secuencia; la palma es el dominio mejor conservado entre todas ellas, pero el pulgar
y los dedos contienen diferencias secuenciales que permiten esta clasificacin.
Las regiones ms importantes de estos tres dominios convergen para formar una
superficie continua donde reside el sitio cataltico.
La actividad de exonucleasa reside en un dominio independiente con su propio sitio
cataltico.
El dominio amino-terminal de la Polimerasa se extiende dentro del dominio de
exonucleasa.
El hecho esencial de la sntesis de DNA es la formacin de un nuevo enlace
fosfodister entre la hebra en crecimiento 5 3 del DNA y un entrante dNTP
(desoxiribonuclesido trifosfato) que ser utilizado como sustrato.
El enlace es creado por el ataque nucleoflico del hidroxilo 3 terminal de la hebra en
crecimiento sobre el -fosfato del dNTP que funge como sustrato. Cada dNTP
entrante forma primero una interaccin apropiada con la base en el molde. Solo
despus de este reconocimiento acta la polimerasa para formar el enlace
fosfodister con la ltima base aadida. As, las DNA polimerasas son enzimas
dirigidas por el molde.

OTRAS HERRAMIENTAS DE LA REPLICACION

Primasa Sintetiza el RNA-cebador que es necesario para iniciar la

polimerizacin
Helicasa Desenrolla el DNA y lo funde
Ligasa Une dos cadenas de DNA adyacentes
Protenas de unin a hebras sencillas (SSBP) mantienen abierto el DNA
despus de la actividad de la Helicasa, y lo protegen
Girasa Es una Topoisomerasa que alivia el estrs torsional creado por la
actividad de la Helicasa sobre la molcula de DNA
Telomerasa Termina los extremos de la hebra de DNA.

Las Helicasa adoptan diferentes estructuras y estados de oligomerizacin. Mientras

que la Helicasa tipo ADN-B acta
sobre el
DNA como hexmeros en forma de
rosca,
otras
enzimas
han
demostrado ser activas como
monmeros o como dmeros.
Estudios recientes han demostrado
que las Helicasa no slo esperan de
forma pasiva a la horquilla para
abrirla, sino que desempean un
papel activo obligando a la horquilla
a abrirse, por lo que es un motor
activo en el desenrollamiento del
DNA. Las Helicasa pueden actuar
de una forma mucho ms rpida in
vivo que in vitro debido a la
presencia de una serie de protenas
accesorias que ayudan en la
desestabilizacin de la unin en la
horquilla.

Primasa
Para que se pueda iniciar la sntesis de DNA se necesita un extremo 3-OH libre al
que la DNA Polimerasa pueda ir aadiendo nucletidos. Ese extremo 3-OH lo
suministra un RNA de pequeo tamao, alrededor de 10 a 20 ribonucletidos, que
se denomina RNA cebador o Primer".
RNA polimerasa que utiliza como molde DNA.
En procariotas, esta enzima se une directamente a la DNA Helicasa, formando un
complejo llamada Primosoma, que se va desplazando con la cadena en formacin.
En Procariotas, la misma Holoenzima de DNA polimerasa III lleva a cabo la sntesis
del fragmento correspondiente de DNA en la cadena retrasada hasta llegar al
siguiente cebador.

REPARACIN Y MUTAGENESIS DE DNA

Una de las fuentes de variabilidad gentica que han hecho posible la evolucin es la
mutacin o cualquier cambio heredable en la secuencia de nucletidos del material
gentico (ADN) de un organismo. Las mutaciones suponen la alteracin del
genotipo, o constitucin gentica del individuo, y en ocasiones tambin del fenotipo
que son las caractersticas externas del individuo.
Las mutaciones ocurren al azar, esto se descubri en un experimento en el que se
hicieron 10 cultivos de 10 (8) clulas cada uno. A cada cultivo se le aadi el fago
T1, las clulas eran de E. coli. Si las mutaciones no ocurren al azar cabra esperar
que el nmero de colonias resistentes fuera ms o menos igual en cada cultivo, si la
mutacin es al azar se espera gran variabilidad en el nmero de colonias resistentes
en cada tubo. As, se comprob, que la mutacin era al azar.
Las mutaciones pueden afectar a uno (puntuales), unos pocos (pseudopuntuales) o
a un gran nmero de nucletidos de una secuencia de ADN (cromosmicas).
Tipos de mutaciones
Puntuales y pseudopuntuales
Cambios de base

transiciones: Purina por purina y pirimidina por pirimidina

transversiones: Purina por pirimidina y pirimidina por purina

Desfases (cambio en el nmero)

delecin
insercin

Cromosmicas

deleciones
duplicaciones
inversiones
translocaciones

Las mutaciones pueden ser espontneas mediante varios mecanismos diferentes,

incluyendo errores de replicacin del DNA y lesiones fortuitas de ste; o mediante
mutgenos. Los mutgenos son agentes que aumentan la frecuencia de
mutagnesis, generalmente alterando el DNA y en este caso son inducidas.

Mutaciones espontneas
Errores en la replicacin del DNA
Durante la sntesis del DNA puede producirse un error en la replicacin porque se
forme un emparejamiento ilegtimo de nucletidos como A-C que da lugar a la
sustitucin de una base por otra.
Cada una de las bases aparece en el DNA en una de varias formas
llamadas tautmeros que son ismeros que se diferencian en las posiciones de sus
tomos y en los puentes que se forman entre ellos. Esas formas estn en equilibrio.
La forma ceto es la que se encuentra normalmente en el DNA mientras que las
formas imino o enol son menos frecuentes. La capacidad del tautmero menos
frecuente de una base de emparejarse errneamente y producir mutaciones durante
la replicacin del DNA fue puesta de manifiesto por primera vez por Watson y Crick.
A estos emparejamientos errneos se les llama cambios tautomricos.
Tambin pueden ocurrir emparejamientos errneos cuando una de las bases se
ioniza, esto sucede con ms frecuencia que los cambios tautomricos.
Transiciones
Todos los emparejamientos errneos anteriores producen mutaciones por transicin,
en las que una purina es sustituida por otra purina y una pirimidina es sustituida por
otra pirimidina.
Transversiones
No pueden realizarse por emparejamientos errneos como los debidos a cambios
tautomricos.
Pero s pueden realizarse si una base sufre un cambio tautomrico mientras que la
otra base rota sobre su enlace glucosdico y quedan enfrentadas sus cargas.
Desaminacin
Es una de las ms frecuentes debido a la inestabilidad qumica, afectando
gravemente a la replicacin del ADN provocando transiciones. En este caso la base
se modifica antes de la replicacin debido a los radicales que provoca el
metabolismo.
La Desaminacin de citosina produce uracilo, as los resduos de uracilo que no
sean reparados se emparejarn con adenina durante la replicacin produciendo la
conversin de un par GC en uno AT, se produce una transicin.
Cambios de fase
Estas mutaciones pueden ser inserciones o deleciones.
Las inserciones se producen por un deslizamiento o resbaln de la cadena
sintetizada con lo que se forma un lazo de varios pares de bases. En la siguiente
ronda de replicacin se aadirn tantas bases como comprenda el lazo ya que
cuando se produce el resbaln sigue replicndose por donde se qued antes del
resbaln.

Las deleciones se producen por un deslizamiento o resbaln de la cadena molde,

como las que hay que copiar no se pueden no se aaden a la cadena hija.
Despurinizacin
El ADN pierde de alguna manera alguna de sus bases y si hay un hueco la
reparacin introduce una base.
La frecuencia de las mutaciones espontneas es generalmente baja.

Efectos de los cambios

Se expresan cuando el gen pasa a su protena correspondiente. Los efectos de los
cambios pueden ser:

Cambios de sentido: se cambia un aminocido por otro

Sin sentido: la mutacin se produce porque se transforma en un codn de
terminacin.
Desfases: si hay una delecin de la base, la pauta de lectura cambia y se
produce un gran cambio en la protena y es muy grave.
Mutaciones silenciosas: son mutaciones sin efecto: UUU (Phe)> UUC (Phe)
El aminocido que cambia es muy parecido y la protena sigue funcionando.

En eucariotas tienen un efecto muy grave ya que pueden provocar enfermedades,

se dan sobre todo, cuando hay una delecin de 5.000 pb (pares de bases) que
afecta a dos genes y producen la enfermedad como problemas respiratorios de
inteligencia.
Mutaciones inducidas
Existen puntos de un gen donde la mutacin es ms frecuente se llaman PUNTOS
CALIENTES. Al genotipo silvestre o salvaje se le utiliza como patrn y en el que se
produce la variacin se le llama mutante.
Una estirpe mutante puede cambiar a otra y luego volver a la inicial, a esto se le
llama regresin. Los mutantes se inducen con mutgenos que son de varios tipos y
cada uno induce una mutacin distinta, aunque suele ser al azar.
Los mutgenos son de varios tipos:
Mutgenos Qumicos

Anlogos de bases:
Algunos compuestos qumicos son suficientemente parecidos a las bases
nitrogenadas normales del DNA para, ocasionalmente, incorporarse a ste en lugar
de las bases normales, tales compuestos se llaman anlogos de bases. Una vez en
su sitio tienen propiedades de emparejamiento distintas de aquellas a las que han
sustituido, de este modo, causan mutaciones al provocar que, durante la replicacin,
se inserten frente a ellas nucletidos incorrectos. El anlogo de base original slo
estn en una cadena sencilla pero puede provocar el cambio de un par de
nucletidos que se replica en todas las copias de ADN descendientes de la cadena
original. Ejemplos son: 5-bromurouracilo, 2-aminopurina.
Modificadores de bases:
cido nitroso: provoca una Desaminacin que modifica las bases C>U, G>X, con
lo que se produce un apareamiento errneo.
Hidroxilamina: provoca una transicin de G>A y se da principalmente en bacterias.

Agentes alquilantes: introducen grupos alquilo a las cuatro bases en muchas

posiciones, produciendo transiciones, etilmetanosulfonato y la nitrosoguanidina.
Agentes intercalantes: son molculas planas que imitan pares de bases y son
capaces deddeslizarse entre las bases nitrogenadas apiladas en el ncleo de la
doble hlice, mediante un proceso de intercalacin. En esta posicin el agente
puede producir deleciones o deleciones de un par de nucletidos. Algunos agentes
intercalantes son: proflavina, naranja de acridina e ICRs.
Prdida del emparejamiento especfico:
Un gran nmero de mutgenos daan una o ms bases, haciendo imposible el
posterior emparejamiento especfico. El resultado es un bloqueo en la replicacin,
puesto que la sntesis del DNA no sigue ms all de una base que no puede
especificar una complementaria mediante puentes de hidrgeno. Este fallo es
replicado por el mecanismo SOS.
Radiaciones
UV que producen dmeros de timina, rayos X y las radiaciones gamma que rompen
el DNA.

MECANISMOS DE REPARACION
El nivel de fidelidad de las copias de DNA es muy alto, debido a:
1. La especificidad enzimtica de la maquinaria replicativa
2. La correccin de errores de las DNA polimerasas mediante prueba de lectura
Detectan nucletidos incorrectos y los eliminan hacia atrs (actividad exonucleasa
3 - 5)
3. Los mecanismos de reparacin post-replicativos
a) Reparacin directa. La regin daada se corrige in situ
La DNA fotoliasa utiliza energa de la luz para eliminar los dmeros de pirimidina
formados por radiacin UV
b) Reparacin por escisin de bases
Las bases daadas se retiran y se reemplazan
c) Reparacin por escisin de nucletidos
Se elimina y se reemplaza un fragmento en torno a la zona daada
La escinucleasa urvABC escinde 12 nucletidos en la zona daada
Regeneracin a cargo de la DNA Pol I y la DNA ligasa.

Mecanismos de reparacin
Reparacin directa
Son sistemas que eliminan directamente el dao del UV en el DNA, como es el caso
de los dmeros de timina. La luz visible activa la fotoliasa que rompe los dmeros de
timina.
Otro ejemplo son las alquiltransferasas y su actividad consiste en eliminar los grupos
alquilo, tambin se repara la despurinizacin gracias a las glicosidasas del ADN.
Dependiente de replicacin
Todas las clulas contienen endonucleasas que atacan los sitios que quedan tras la
prdida espontnea de resduos de purina o pirimidina. Por comodidad, los sitios sin
purina o sin pirimidina se denominan sitios AP. Las endonucleasas AP son vitales
para la clula porque, como se apunt con anterioridad, la despurinizacin
espontnea es un hecho relativamente frecuente. Estas enzimas introducen
hendiduras en la cadena mediante la rotura de enlaces fosfodisteres en los sitios
AP. Esto promueve un proceso de reparacin por escisin medidado por otras tres
enzimas: una exonucleasa, la polimerasa de DNA I y la ligasa de DNA.

Escisin
Esta va de reparacin est determinada por tres genes denominados uvrA, uvrB y
uvrC. Este sistema reconoce cualquier lesin que cree una distorsin importante en
la doble hlice de DNA. Una endonucleasa denominada nucleasa uvrABC realiza
una incisin alejada varios pares de bases a cualquier lado de la base daada,
eliminndose a continuacin un fragmente de DNA de cadena sencilla. El pequeo
hueco se rellena entonces mediante sntesis de reparacin y queda sellado por la
ligassa de DNA.
Sistema GO
Dos glucosilasas actan conjuntamente para eliminar las mutaciones causadas por
las lesiones que produce en el DNA el 8-oxodG. Las glucosilasas junto al producto
del gen mutT forman el sistema GO.
Cuando se originan lesiones GO en el DNA, por dao oxidativo espontneo, una
glucosilasa cifrada en el gen mutM elimina la lesin. An as persisten algunas
lesiones GO que emparejan errneamente con adenina. Una segunda glucosilasa
producto del gen mutY elimina la adenina de este emparejamiento errneo
especfico, llevando al restablecimiento de la citosina correcta por sntesis de
reparacin.
Sistema SOS
En E. coli depende de los genes recA, umuC y umuD. Cuando se encuentra un
tramo sin cifrar acta el sistema SOS.
Se activa la protena recA que induce la presencia de las protenas SulA y SulB que
interaccionan con la DNA pol III. sta hace que pierda afinidad y prosiga la sntesis
de ADN y dejando el hueco y sin que la clula muera.
Reparacin postreplicativa
Algunas vas de reparacin reconocen errores incluso despus de que haya tenido
lugar la replicacin. Uno de estos sistemas, denominado sistema de reparacin de
emparejamientos errneos.
Para averiguar cul de las dos bases es la errnea debe diferenciar entre la cadena
progenitora y la cadena hija. Lo diferencia porque la enzima mutiladora metilasa de
la adenina tarda varios minutos en metilar la cadena hija.
Las protenas mut S y mut L interaccionan con el sitio mal emparejado y una
protena mutH rompe la cadena recin sintetizada. Alrededor del emparejamiento
errneo, las cadenas de DNA se separan con ayuda de una protena denominada
MutU y se estabilizan con SSB. Y las polimerasas copian el segmento de DNA.

RECOMBINACION DE DNA
La recombinacin gentica es el proceso por el cual una hebra de material gentico
(usualmente ADN, pero tambin puede ser ARN) se corta y luego se une a
una molcula de material gentico diferente.
En eucariotas la recombinacin comnmente se produce durante la meiosis, como
entrecruzamiento cromosmico entre los cromosomas apareados. Este proceso
conduce a que la progenie tenga combinaciones de genes diferentes a las de sus
padres y puede producir alelos quimricos.
En biologa evolutiva se cree que esta mezcla de genes tiene varias ventajas,
incluyendo que permite a los organismos que se reproducen sexualmente y evitar
el trinquete de Muller.
En biologa molecular, "recombinacin" tambin se refiere a la recombinacin
artificial y deliberada de piezas de ADN distintas, a menudo de diferentes
organismos, creando lo que se llama ADN recombinante.
Ciertas enzimas llamadas recombinasas catalizan las reacciones de recombinacin
natural. RecA, la recombinasa encontrada en Escherichia coli, es responsable de la
reparacin de las roturas en el ADN bicatenario.
En levaduras y otros organismos eucariotas se necesitan dos recombinasas para
reparar
esas
roturas.
La
protena RAD51 es
necesaria
para
las
recombinaciones mittica y meitica, mientras que la protena DMC1 es especfica
de la recombinacin meitica.

Existen varios tipos de recombinacin gentica en las clulas eucariotas:

Recombinacin homloga
La recombinacin homloga (tambin llamada recombinacin general) sucede
durante la profase I de la meiosis y tiene lugar entre las largas regiones de ADN
cuyas secuencias son homlogas, es decir altamente similares aunque no idnticas.

Entrecruzamiento cromosmico
Se denomina as a la recombinacin entre los cromosomas apareados,
generalmente durante la meiosis. Durante la profase I, en la sub-fase de paquitene,
las cuatro cromtidas disponibles estn estrechamente posicionadas una con
respecto a la otra. En esta disposicin los sitios homlogos en las dos cromtidas
pueden coincidir entre s, y pueden intercambiar informacin gentica.

Como la recombinacin puede producirse en cualquier lugar del cromosoma,

la frecuencia de recombinacinentre dos puntos depende de la distancia entre
ambos. Por lo tanto, para genes suficientemente distantes en el mismo cromosoma
la frecuencia de recombinacin es lo suficientemente alta para destruir la correlacin
entrealelos recombinantes.

En clulas B
Las clulas B del sistema inmunitario realizan una recombinacin gentica
llamada cambio de clase de inmunoglobulinas. Es un mecanismo biolgico que
cambia un anticuerpo de una clase a otra, por ejemplo, de un isotipo llamado IgM a
otro llamado IgG.

Conversin gnica
En la conversin gnica, una seccin de material gentico se copia de un
cromosoma a otro, pero deja el cromosoma donante sin cambios.

Recombinacin especfica de sitio

Este otro tipo de recombinacin tiene lugar por rotura y posterior unin de regiones
de homologa corta y especfica de dos ADN diferentes, o dentro de la misma
molcula. Ocurre en virus (por ejemplo, el bacterifago T4) y en plsmidos.

Recombinacin no homloga
La recombinacin puede ocurrir entre secuencias de ADN que no contienen
secuencias homlogas. Esto se conoce como recombinacin no homloga.
Acontece raramente en procariotas y levaduras, pero es ms frecuente en clulas de
mamferos.

Fuentes de informacin:

http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/5_BiologiaMol
ecular/5-Replicaciondel%20DNA1Introduccion.pdf

http://cienciaybiologia.com/mutacion-y-reparacion-del-adn-1/

https://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=14&
cad=rja&uact=8&ved=0CFwQFjAN&url=http%3A%2F%2Fwww.biorom.uma.e
s%2Fcontenido%2Fav_bma%2Fapuntes%2Ft8%2Ft8_recomb.htm&ei=JwyH
VNawNcPtoASu1YDQAw&usg=AFQjCNGZoVz8_FK4qN52f9ZuNHgtWDLME
w&sig2=pr40ZjPJbkBBIuFJTFWENA

http://fbio.uh.cu/sites/genmol/confs/conf5/