IDENTIFICAO PELO DNA EM ODONTOLOGIA FORENSE

Ainda que as estruturas dentrias sejam as mais resistentes a diversas alteraes traumticas e
aos processos de putrefao, o DNA que possui as maiores chances de sobrevivncia.
Qualquer resto de tecido orgnico, fragmento de osso (com exceo dos carbonizados ou que
sofreram imerso prolongada em gua salinizada) podem ser utilizados para a pesquisa de
DNA.
Diferentemente dos processos de identificao pelas digitais ou pelos arcos dentrios, o DNA
oferece um fcil acesso ao material de confronto, j que por vezes existe a disposio famlias
inteiras para fornecer material de referncia. Alm disso, a tipificao de DNA consiste em um
mtodo rpido e de baixo custo, tornando obsoletas outras tcnicas prvias - Sistemas
eritrocitrios (ABO, RH, etc); isoenzimas, e sistemas leucocitrios (HLA).

=> A molcula de DNA

- DNA nuclear
Os cidos nucleicos se encontram formados por polmeros, ou seja, cadeias longas de
nucleotdeos ligados entre si por uma ligao 3'-5'-fosfodister.
As pentoses que se encontram nos cidos nucleicos so a RIBOSE e a DESOXIRRIBOSE (
diferentes entre si apenas pela presena/ausncia do grupo oxidrila no carbono 2)
As bases nitrogenadas podem pertencer ao grupo das pirimidinas - TIMINA e CITOSINA
(diferentes entre si apenas pelo contedo de hidrognio, maior na timina). Nestas, apenas a
Citosina comum para o DNA e o RNA, sendo que a Timina substituda pela Uracila.
As bases nitrogenadas do grupo das purinas so a GUANINA e a ADENINA

Uma das caractersticas mais importantes do DNA o fato deste ser formado por duas cadeias
de polinucleotdeos, tendo o paralelismo entre ambos eixos pentose-fosfato garantido pela
aposio exclusiva das bases pricas e pirimidnicas (que estabelecem ligaes
eletromagnticas fracas = pontes de hidrognio).
Numa clula normal, a partir do DNA, se forma no mnimo trs tipos diferentes de RNA - O
RNA -r; RINA-m e o RNA-t, encontradas tanto no ncleo, quanto no citoplasma.
Foras as diferenas qumicas, a diferena mais notvel entre o DNA e o RNA que este ltimo
apresenta apenas uma cadeia simples de polinucleotdeos.

Replicao do DNA sob forma de RNA:

- Desespirilao de um pequeno segmento do DNA;
- ciso das pontes de hidrognio entre purinas e pirimidinas complementares;
- aposio de trifosfonucleotdeos da ribose, pelas suas bases nitrogenadas, conforme
as regras de complementao, isto : T/A; A/U; G/C; C/G.
- esterificao dos trifosfonucletdeos de ribose, mediante ligaes fosfodister.
- polarizao da esterificao no sentdio 5'->3'
- ciso das pontes de hidrognio;
- reespirilizao do DNA com reparo das pontes de hidrognio independendo do tipo
de RNA a ser formado (m,r,t)

-> basicamente existem trs diferenas notveis entre o DNA e o RNA;

1-Cadeia simples nica de polinucleotdeos;
2-Timina substituida por Uracila
3 - a molcula principal possui Ribose (um Oxignio a mais), e no desoxirribose como
no DNA.

=> DNA Mitocrondrial

O DNA mitocondrial supre a necessidade das organelas da clulas da metabolizao e
produo de energia, sem a necessidade de depender do DNA Nuclear, tornando o processo
mais dinmico.
Suas diferenas com o DNA nuclear incluem:
- Localizao, limitado as mitrocondrias (no citoplasma celular);
- Dupla hlice circular (DNA Nuc. = Dupla hlice linear)
- contem menos pares de bases;
- herana exclusivamente materna (DNA nuclear = herana materna e paterna);
- permite a identificao atravs de geraes distantes da linhagem materna
- Presente em clulas anucleadas, desde que tenham mitocndrias (hemcias, ex)

- abundante em restos humanos; (DNA nuc. = Pequenas quantidade em restos

humanos - ossos, dentes, etc)

=> Estabilidade do DNA

Extremamente resistente, tolera uma larga variao na temperatura, pH, sais e outro
fatores que poderiam se fatais para qualquer outro marcador gentico.
essa estabilidade que permite a elevada "longevidade" do DNA, possibilitando traar
o perfil gentico at mesmo em mmias de 5 mil anos e de insetos de 30 milhes de anos.

=> Polimorfismos do DNA

Baseados em duas caractersticas principais: - Sequncia de bases (A/T; C/G;G/C; T/A);

- Comprimento dos segmentos;

Os polimorfismos pelo comprimento de segmentos so caractersticos do DNA

repetitivo, que no codificam nenhuma protena (chamado de Junk DNA).
Os fragmentos de DNA variam bastante de tamanho entre os indivduos, devido a
presena de um nmero varivel de sequncias repetitivas ( VNTRs - Variable Number of
Tandem Repeats).
O polimorfismo analisado atravs dos fragmentos resultantes da ao de enzimas
restrio ( restricton fragment lenght polymorphism - RFLP).
Quando necessrio, os fragmentos de DNA podem ser ampliados atravs do mtodo
AmpFLPs -Amplified fragment lenght polymorphisms.

Os polimorfismos baseados pelas sequncias de bases, oferecem a identidade pela

sequncia de fragmentos do DNA de tamanhos semelhantes. Podem ser detectados atravs de
sondas (probes), ou por seqenciao direta.

METODOS PARA EXAME DO DNA

=> Deteco dos RFLPs (restriction Fragment Lenght Polymorphism)

Utiliza oligonucleotdeos marcados com radioistopos que sero utilizados como

sondas (probes), capazes de reconhecer um par entre os milhares de fragmentos de DNA.
Tal tamanho dos fragmentos extremente varivel de uma pessoa para outra em
razo dos VNTRs de cada fragmento.
Observando-se as sries de diferentes locaes (Loci) de VNTS, pode-se traar o perfil
do indivduo, e caso haja congruncia entre os achados na cena do crime e do indivduo, em
quatro ou mais loci de VNTR, possibilitada a identificao positiva.

Tcnica da PCR (Polymerase Chain Reaction)

o procedimento de escolha quando no se conta com grandes quantidades/volumes
apreciveis de DNA. (Vestgios de sangue, saliva em um bituca de cigarro, peas dentarias, etc)
Trabalha com fragmentos menores dos Loci VNTR - os STRs (Loci dos microssatlites) e
os LRTs (Loci dos minissatlites), permitindo milhes de cpias de um nico Locus especfico.
Os produtos de multiplicao durante o pr-tratamento pela PCR - AmpFLP (Amplified
fragmente lencht polymorphism) - podem ser separados usando-se o mtodo da eletroforese
em gel de poliacrilamida (PAGE).
A deteco dos fragmentos pode ser feita por fluorescncia ou por colorao pela
prata.

Sequenciao do DNA Mitocondrial

Pouco informativa, porm com possibilidades de polimorfismos individuais altamente
informativos.
Resulta em um poder de discriminao maior do que a anlise de vrios testes de locus
nico, porm menos informativa em pesquisas de multilocus, como a RFLPs e o teste de
AmpFLP.

RESUMINDO:
Cada situao requer um determinado tipo de teste/exame para anlise do DNA
Teste RFLP:
Depende da quantidade e da qualidade do material de DNA extrado
da amostra. (superior a 50 nanogramas)
AmpFLP: Degradao do DNA (cadveres )
DNAmt: em casos que o DNA sofreu muita degradao (geralmente em cadveres) ou
que a quantidade recuperada seja muito pequena ou quando deseja-se identificar uma nica

pessoa e inexistem familiares prximos (pais/filhos) devem-se analisar as sequencias do DNA

mitocondrial pela linhagem da me.
Mtodos nucleares: Quando deseja-se identificar uma nica pessoa, e conta-se com a
disponibilidade de parentes.

A RESPONSABILIDADE DO ODONTOLEGISTA

-> Conhecimento do laboratrio

O odontolegista deve estar preparado para colher amostras e encaminha-las ao
laboratrio competente.
Deve estar familiarizado com os laboratrios que processam os exames de DNA,
preferencialmente prximo geograficamente na rea de atuao, reconhecendo as diferentes
tcnicas de colheita, os materiais que processam, as tcnicas que aplicam, os cuidados para
evitar contaminao intralaboratorial e os controles de qualidade dos resultados obtidos.
O odontolegista no deve ser um mero recebedor de laudos ou de resultados
laboratoriais para ento encaminhar s autoridades. Este, deve ser capaz de fazer a anlise
interpretativa dos resultados obtidos, mantendo contato com os tcnicos, dirimindo dvidas e
trocando informaes.

-> Manuseio das provas

curial que o odontolegista participe dos casos que impliquem em provas dentais ou
salivares, entretanto, nem sempre a colheita de restos e vestgios feita por este. Todavia, isto
no impede que o odontolegista pesquise nos autos toda a documentao referente ao
mtodo de colheita realizada.

Circunstncias adverbiais de tempo, modo e outras como temperatura, umidade e

fontes de contaminao (sangue, saliva, bacterias - fezes, vmitos, plos humanos/animais)
podem interferir em evidncias, impedindo/inibindo certos procedimentos ou alterando
resultados atravs de fontes inexplicveis de DNA.
Sendo assim, tudo deve ser feito para manter o DNA intacto, no expondo a risco ou a
perda de qualidade, j que a molcula pode sofrer:
- Desnaturao por temperaturas elevadas ou pHs extremos;
- Impedimento, pela desnaturao, de tcnicas de RFLPs;
- Rotura molecular por nucleases facilitadas em ambientes umidos;
- Dano molecular por radiaes, UV, etc.

-> DNA de tecidos e estruturas orais

O material gentico pode ser extrado dos tecidos moles (gengiva, lngua, tonsilas),
cogulos sanguneos, etc, bem como, de amostras de saliva, e diretamente encaminhados ao
laboratrio para anlise, logo aps a rotulao.
Entretanto, por vezes necessrio realizar a extrao do material do interior de um
elemento dentrio, onde o cirurgio-dentista deve participar da deciso de melhor forma de
abordagem para a extrao do DNA.
Portanto, deve-se ter em mente se o dente ser utilizado em outras anlises
(radiogrficas, bioqumicas, etc), aplicando-se mtodos de extrao do DNA mais
conservadores ou no.
Lembrando que, o tecido mais rico em DNA o tecido pulpar (geralmente extrado de
molares, por conterem uma cmara pulpar ampla e rica em tecido). Somente em raras
situaes o DNA deve ser extrado da dentina ou do cemento, nunca do esmalte.

=> Como extrair Material para estudo de DNA dos Dentes

Existem algumas exigncias:
- Trabalhar em ambiente estril;
- Usar paramento cirrgico completo;
- Trabalhar preferencialmente em cmara estril, com presso positiva
(ambiente adiabtico);
- Evitar remessa de materiais entre o local de coleta e processamento de
preparatrio at o laboratrio que se processar o exame de DNA.

O processo de extrao segue 6 passos fundamentais:

1 - Remove-se o sangue ou os restos de tecidos das superfcies externas do dente. Caso
o exame seja feito em menso de 6 horas, reserva-se este na temperatura de 4 graus C em um
tubo estril. Do contrrio, este mantido em um freezer a -20 C.
Se for optado por no realizar-se o exame de sangue e tecidos moles retirados,
procede-se o seguinte passo.
2 - Retira-se da superfcie externa do dente, com cureta, qualquer vestgio de placa
bacteriana ou clculo. Lavar com gua oxigenada e etanol, reduzindo-se as chances de
contaminao por fontes extrnsecas de DNA e a degradao pelas nucleases bacterianas (a
limpeza deve ser mais leve na proximidade dos pices radiculares ou em cavidades de cries,
de modo a no inserir produtos qumicos na polpa). Em seguida, lava-se o dente com gua
deionizada estril.

3- Caso o dente se apresente hgido e retirado recentemente do alvolo, pode-se

realizar uma abordagem endodntica convencional com a instrumentao da cmara e dos
canais.
4 - Caso o dente no se apresente intacto, deve-se cortar em um plano horizontal,
passando pela poro cervical, possibilitando o acesso amplo cmara pulpar e aos canais, se
alterar as restauraes de a morfologia da coroa clnica.
O corte pode ser feito tanto com cinzel, quanto com disco de Carburundum (evitar
superaquecimento, prejudicando o DNA).
5 - Curetar as parades da cmara pulpar recolendo o tecido da polpa e o p da abraso
em um recipiente de boca larga. Aps a instrumentao, a cmara e os canais devem ser
irrigados com uma soluo tampo (TE Buffer).
A ultrafiltrao, realizada em laboratrio, permitir retirar o material celular
necessrio para a anlise.
Materiais encaminhados de locais distantes devem ser mantidos midos e refrigerados
em gelo seco.
Os restos do dente devem ser mantido em freezer (-20C), visto que novos
procedimentos laboratoriais podem ser necessrios.
6 - Em ltimo recurso, pode ser necessria a triturao do dente, uma operao
simples, mas irreversvel. Oferece uma amostragem completa, e por vezes a unica opo
quando os mtodos de instrumentao e curetagem no ofereceram resultados satisfatrios.
Quando importante conservar a coroa , o dente deve ser cortado horizontalmente na
transio esmalte-dentina. A poro superior instrumentada, removendo-se a polpa e a
parte da dentina, e aps esta guardada apenas por motivos radiogrficos e morfolgicos.
RELATORIO => Independente do procedimento seguido, o odontolegista deve apresentar
relatrio, sob a forma de laudo, contendo tudo o que foi observado nos exames (mtodos,
resultados, etc)

=> DNA salivar recuperado das mordeduras humanas

- A saliva humana um fonte importante de DNA para uso forense;

- O DNA se mantem estvel, e pode ser recuperado aps 48-60 horas aps a salivao
(dependendo das condies ambientais e manipulaes do local).
- Por vezes, a remoo dos depsitos de saliva ocorrem de maneira precoce, ou a
vtima lava-se ou os locais de ferimentos so higienizados em pronto-atendimentos.
- O DNA da saliva seca pode ser recuperado por mais de 72 horas.

- A contaminao da saliva, geralmente pelo sangue ou por clulas de autlise da pele,

pode ser um problema. Sendo necessrio, para tais casos, uma amostra de sangue perifrico
da vtima, permitindo estabelecer o perfil, e precaver-se de resultados duvidosos.
- Atualmente a localizao de manchas possibilitada pela luz ultravioleta filtrada
(Lmpada de Woods), permitindo a observao de manchas de saliva, smen e sangue.
- A saliva recuperada permite isolar, analisar e comparar os dados com aqueles obtidos
dos suspeitos. Geralmente encontrada escarros, bitucas de cigarro, selos de correio, abas de
envelopes.

-> Tcnica para o recolhimento

1 - Molha-se um cotonete (swab) em gua estril;
2- Rola-se a extremidade do cotonete, deitado sobre a superfcie da pele, na rea da
mordedura e na rea adjacente, cuidando para lavar e recolher vestgios de saliva no algodo;
3 - Deixa-se secar completamente ao ar livre;
4 -utiliza-se um segundo swab seco, enxugando toda a umidade deixada pelo primeiro que
ainda permanea na pele;
5- Deixa-se secar o segundo swab ao ar livre;
6 - Coloca-se os 2 swabs juntos em recipiente apropriado, encaminhando-os para o
laboratrio. (Anlise imediata no laboratrio de DNA; Conservar no Freezer -20C; guardar em
um envelope um dos utilizados para conservar provas, para transferncia para um laboratrio
ou um freezer)