102

OPTIMIZACIN DE LA CONVERSIN DE UN PRECURSOR

DEL HERBICIDA ASULAM EMPLEANDO AMINOACILASA
SOLUBLE
Fausto Soria, Ricardo Muoz (1) y Patricio Castillo (2)
Laboratorio de Qumica Orgnica e Investigaciones Aplicadas, Departamento de Ciencias Nucleares,
Escuela Politcnica Nacional, Ladrn de Guevara E11-253, Quito, Ecuador. Telfono:
(005932)2507144(ext.446). E-Mail: (1) rmunoz@server.epn.edu.ec, (2)pesd@yahoo.com
Recibido:

Aceptado:

Resumen
En el presente trabajo se estudi la reaccin de desacetilacin del 4-acetilsulfanilil carbamato de metilo (4ASCM), catalizada con la aminoacilasa de rin porcino (ARP). El 4-ASCM es un intermediario del
sulfanililcarbamato de metilo (SCM), principio activo del herbicida Asulam.
Durante esta investigacin se determin la influencia de la naturaleza del medio tamponante, la agitacin, la
concentracin de sustrato, la temperatura y la presencia de cationes divalentes, en la actividad de la ARP.
Se estudi la influencia del tampn en la reaccin de bioconversin del 4-ASCM a valores de pH de 8, 9 y 10,
con tampones Bicina, Mops y fosfato.
Se compar el efecto de la agitacin orbitlica y magntica. Con esta ltima se obtuvo un porcentaje de
conversin dos veces superior al de la mezcla sin agitacin.
En la bioconversin del 4-ASCM el rendimiento fue mximo cuando en la mezcla de reaccin hubo una
concentracin de intermediario de 0,62 mg/ml y de enzima de 3,6 mg/ml; el medio fue tamponado con Bicina
pH 9; a 40 C y con agitacin magntica. En estas condiciones se alcanz el 75% de conversin luego de 127
horas de reaccin.
Al estudiar la presencia de cationes divalentes, las mezclas de reaccin preparadas con Co 2+ y Zn2+ favorecieron
la bioconversin. La adicin de cloruro de cobalto 0,5 mM mejor en un 37,6% la conversin del 4-ASCM en
SCM.
Palabras claves: Aminoacilasa de Rin Porcino (ARP), actividad estersica, sustratos, Asulam, bioconversin,
intermediario del Asulam.

Abstract
In the present work it was studied the deacetilation reaction of 4-acethyl sulfanilil methyl carbamate (4-ASCM)
catalyzed through the Aminoacylase of pig kidney (ARP). The 4-ASCM is an intermediate of methyl sulfanilil
carbamate (MSC), active principle of the Asulam herbicide.
During this investigation it was established the influence of the buffer medium, the agitation, the substrate
concentration, the temperature and the presence of divalent cations on the ARP activity.
It was studied the effect of the buffer on the bioconversion reaction of 4-ASCM at pH values of 8, 9 and 10 with
buffers of Bicine, Mops and phosphate.
The effect of an orbitalic agitation and a magnetic agitation was compared. A percentage two times higher was
obtained compared with the non agitated mixture, when was used the magnetic agitation.
The yields on the bioconversion of 4-ASCM was maximum when in the reaction mixture was an intermediate
concentration of 0,62 mg/ml and an enzyme concentration of 3,6 mg/ml, the buffer was Bicine at pH 9, 40C and
magnetic agitation. Under these conditions it was reached a conversion of 75% after 127 hours of reaction.
It was observed that the bioconversion was improved in the reaction mixtures prepared with Co 2+ y Zn2+. The
addition of cobalt chloride 0,5 mM shows an increase of 37,6% on the conversion of 4-ASCM until SCM.
Key words: Pig kidney Aminaylase, estearic activity, substrates, Asulam , bioconversion, Asulam precursor.

103

1.

Introduccin

Las enzimas son protenas que catalizan las

reacciones qumicas producidas en los seres
vivos. Los lmites de temperatura, presin y
pH tolerados por las clulas son estrechos,
especialmente en los organismos superiores.
Las enzimas llevan a cabo cambios qumicos
en condiciones fisiolgicas, que para realizarse
en su ausencia exigiran temperaturas,
presiones y concentraciones de hidrogeniones
peligrosas o tal vez letales para los tejidos
(Litwack, 1 967).
El empleo de las enzimas ofrece innumerables
ventajas, como su selectividad cataltica, su
biodegradabilidad o el hecho de que acten en
condiciones menos drsticas y contaminantes
que las reacciones qumicas comunes. Sin
embargo, su inestabilidad, su alto costo o la
dificultad de su recuperacin del medio de
reaccin, son algunas de las razones por las
cuales su utilizacin industrial todava es
limitada.
Dada la potencialidad que tienen las enzimas,
la biotecnologa actual desarrolla grandes
esfuerzos por buscar nuevos productos y
procesos que logren la sustitucin de
compuestos qumicos, muchas veces nocivos
para el ambiente. Uno de estos campos de
aplicacin es la agricultura, en la cual se
ensayan procedimientos no convencionales
para
la
obtencin de agroqumicos.
(Vandamme, 1 994).
Entre los herbicidas sistmicos, est muy
difundido el empleo del Asulam por su
selectividad sobre un amplio rango de malezas.
Este herbicida tiene actividad pre y postemergencia y muy poca toxicidad, ya que su
absorcin por la piel no produce consecuencias
letales (Hu et al., 1 992).
La aminoacilasa I de rin porcino (EC
3.5.1.14, Acy-1) es una enzima hidroltica que
ha demostrado ser eficiente en su accin
cataltica en procesos sintticos de diversa
ndole, como en las reacciones de
esterificacin, hidrlisis, acilaciones y
desacilaciones
selectivas
de
diversos
compuestos.

El presente trabajo contribuye a la realizacin

de una nueva aplicacin de la aminoacilasa. En
trabajos previos se estableci que esta enzima
posee una especificidad an ms amplia que la
generalmente aceptada, puesto que, se
demostr que esta enzima es capaz de catalizar
la hidrlisis del 4-acetilsulfanililcarbamato de
metilo, para producir el sulfanililcarbamato de
metilo, principio activo del herbicida Asulam.
(Castillo, 1 999).
De manera especfica, se determinaron las
condiciones ptimas de pH, temperatura,
relacin enzima/sustrato, agitacin y presencia
de cationes divalentes a escala de laboratorio,
en las cuales la hidrlisis del 4acetilsulfanililcarbamato de metilo, catalizada
por la acilasa de rin porcino logra el mayor
porcentaje de conversin.

2.

Materiales y mtodos

2.1.

Materiales

Todos los reactivos qumicos empleados

fueron de calidad analtica. El agua fue
destilada antes de su utilizacin.
La enzima usada en la bioconversin fue la
Acilasa I de rin porcino (aminoacilasa; Nacilaminocido amidohidrolasa; EC. 3.5.1.14)
de Grado II, procedente de Sigma Chemical
Co. USA, al igual que el acetonitrilo (ACN), el
para-dimetilaminobenzaldehdo (p-DAB), el
acetato de para-nitrofenilo (p-NPA) y los
tampones orgnicos Bicina (N,N-bis(2hidroxyethyl)-glicine),
Mes
(4morpholinethane sulfonic acid), Mops (4morpholinepropanesulfonic acid) y Hepes (2[4-(2-Hydroxyethyl-1-piperazinyl)]
ethanesulfonic acid).
El 4-acetilsulfanililcarbamato de metilo (4ASCM) intermediario del herbicida Asulam,
fue sintetizado de acuerdo con el mtodo
descrito por Mrquez (1 994), en el Laboratorio de Sntesis Orgnica de la Universidad de
la Habana, Cuba.
En el estudio de la influencia de los cationes
divalentes en la reaccin de bioconversin, se
usaron cloruros de cobalto, magnesio, zinc y
calcio, de grado analtico, que debido a las
condiciones de almacenamiento se encontraban

104

hidratados, por lo que fue necesario someterlos

a un proceso de calentamiento.
2.2.

Mtodos

Las mediciones experimentales en los ensayos

de actividad enzimtica se realizaron por
triplicado y en los ensayos de bioconversin,
por duplicado. Con los resultados obtenidos se
determinaron los valores promedio y las
desviaciones
estndar.
Los
resultados
mostrados corresponden al valor promedio,
que se acept cuando la desviacin estndar
fue menor al 10% del valor promedio.

transformacin del intermediario en Asulam,

segn el mtodo de Balasingham et al. 1 972.
En estos ensayos se descont la hidrlisis
espontnea del intermediario y la posible
aparicin de grupos amino liberados por la
hidrlisis de los enlaces peptdicos del
catalizador, por medio de los blancos de la
enzima y el sustrato, que fueron sometidos a
las mismas condiciones de reaccin.
Para determinar el porcentaje de conversin en
la hidrlisis enzimtica se construyeron curvas
de calibracin, para lo cual se us un estndar
de Asulam del 96.5% de pureza.

2.2.1. Determinacin de la actividad de la

ARP

2.2.3. Estudio de la influencia del pH en

el proceso de bioconversin.

La actividad estersica de la ARP, se determin

con p-NPA como sustrato, de acuerdo con el
mtodo descrito por De Caro et al. y
modificado por Reina (De Caro et al.,
1
986; Reina, 1 997). En el espectrofotmetro, se
midi el incremento de la densidad ptica a
348 nm (DO348), producido por la hidrlisis del
p-NPA, por accin cataltica de la ARP. Las
lecturas de la densidad ptica se realizaron
cada 15 segundos durante 3 minutos.

a.

La variacin de la actividad estersica frente al

p-NPA con el tiempo se midi en soluciones de
enzima tamponadas con Mes, Mops, Bicina y
Hepes a pH 7,5 y con Mops y Bicina a pH 9,
durante 91 y 44 horas de incubacin,
respectivamente. Durante el tiempo de
incubacin se tomaron las alcuotas para la
realizacin del ensayo. El tampn se escogi
tomando en cuenta el ms alto valor de
actividad en los ensayos.

b.

2.2.2. Determinacin del porcentaje de

conversin
La conversin enzimtica del 4-ASCM en
SCM se realiz en mezclas de reaccin
formadas por el intermediario disuelto en ACN
y la enzima, en un tampn adecuado. Para
garantizar la estabilidad de la enzima, las
mezclas de reaccin mantenan solamente 10%
de ACN (Castillo, 1 999) y se incubaron
durante perodos de ms de 44 horas.
El avance de la reaccin de bioconversin se
determin de acuerdo con la formacin de los
grupos aminos libres, producidos durante la

Seleccin del mejor tampn en el

proceso de bioconversin del 4acetil sulfanilil-carbamato de
metilo

En este anlisis se compararon dos de los

tampones orgnicos utilizados anteriormente,
Bicina y Mops, con un tampn inorgnico, el
fosfato.

Estudio de la influencia del pH en

el proceso de bioconversin.

Con el mejor tampn obtenido en los ensayos

de actividad descritos anteriormente se estudi
el comportamiento de este tampn en el
proceso de bioconversin, a valores de pH de
6, 7, 8, 9 y 10.

2.2.4. Estudio de la influencia de la

agitacin en la reaccin de
bioconversin
Se estudiaron dos tipos de agitacin, orbitlica
y magntica. En los ensayos se emplearon
muestras tamponadas con Bicina 100 mM, pH
9. El agitador orbitlico gir a 60 rpm,
mientras que en el agitador magntico, con la
mnima agitacin, para evitar que se produjera
espuma en las soluciones utilizadas.

105

2.2.5. Estudio de la influencia de la

relacin enzima sustrato en la
reaccin de bioconversin
Para este estudio se mantuvo constante la
concentracin de 4 mg de solucin de ARP/ml
de tampn, el tampn usado fue Bicina 100
mM, pH 9. Se vari la concentracin de
intermediario (sustrato) a concentraciones de:
0,15; 0,31; 0,46; 0,62 y 0,92 mg/ml . El tiempo
de duracin del ensayo fue de 150 horas.

2.2.6. Estudio del efecto de la

temperatura en la reaccin de
bioconversin
Las mezclas de reaccin tamponadas con
Bicina 100 mM, pH 9 y una concentracin de
intermediario de 0,62 mg/ml de solucin, se
incubaron a temperaturas de 30, 40, 50 y 60C,
en bao-mara.

En los ensayos empleados para la

determinacin de la influencia de los cationes
divalentes en la bioconversin del 4-ASCM, se
usaron soluciones tamponadas con Bicina 100
mM pH 9, a una temperatura de reaccin de
40C,
con
agitacin
magntica.
La
concentracin de las sales fue de 0,25, 0,5 y 1
mM.

2.2.8. Determinacin de los parmetros

cinticos de la ARP en la reaccin
de bioconversin
Con los resultados obtenidos en el estudio de la
bioconversin en funcin de la concentracin
del intermediario se determinaron las
constantes de Michaelis-Menten (KM) y de la
velocidad (VMAX) con el mtodo de
linealizacin de Lineweaver-Burk.
3.

Resultados y discusin

2.2.7. Estudio de la influencia de los

cationes divalentes en la reaccin
de bioconversin

3.1.

Estudio
de
la
actividad
enzimtica de la ARP soluble
frente al p-NPA.

En este estudio se usaron cloruro de calcio,

cloruro de cobalto, cloruro de magnesio y
cloruro de zinc. Previamente, las sales se
secaron mediante su calentamiento en un horno
microondas PANASONIC, a una potencia
media-media alta, durante 10 segundos.

La actividad estersica de la ARP soluble

(U/ml de solucin) se midi hasta 91 horas, en
cuatro tampones orgnicos, a pH 7,5 y sin
agitacin, como se muestra en la Figura 1.

Actividad (U/m l de s ol.)

1,40
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0

20

40
60
Tiem po en horas

Mes

Mops

Bicina

80

100

Hepes

Figura 1. Actividad enzimtica de la ARP soluble (U/ml de solucin) pH 7,5, en un reactor batch sin
agitacin.

En la Figura 1 se observa que en el tampn

Bicina y en el tampn Mops, la ARP presenta
los valores ms altos de actividad durante todo
el tiempo del ensayo. Este comportamiento se
debera a que la Bicina posee una menor
habilidad quelante respecto a la molcula del
Mops y a los otros compuestos usados como
tampones (Henseling y Rohn, 1 988).

3.2.

3.2.1. Influencia de la naturaleza del

tampn en la reaccin de
bioconversin
del
4-acetilsulfanilil carbamato de
metilo.

En la Tabla 1, se indican los resultados de

la estabilidad de la ARP, en estos dos
tampones a valores de pH de 7,5 y 9,
durante 44 horas.

El porcentaje de conversin obtenido en los

ensayos, con dos tampones orgnicos, Bicina y
Mops y con un tampn inorgnico, el fosfato,
de concentraciones 100 mM, a pH 9, durante
180 h y con una agitacin manual cada 4 h,
mostraron diferencias apreciables.

Tabla 1. Porcentaje de la Actividad estersica

residual de ARP incubada en Bicina y Mops a
pH 7,5 y pH 9, en un tiempo de 44 horas, en un
reactor batch sin agitacin.
Tiempo
(horas)

1
44

Los resultados del porcentaje de conversin

obtenidos, al final del ensayo, con Bicina
fueron mayores en un 65,3% comparado con el
tampn Mops y en un 75,6%, comparado con
el tampn fosfato. Estos resultados ratifican las
ventajas de utilizar los tampones orgnicos con
metalo-enzimas, como la aminocilasa, por su
baja capacidad quelante, que se evidenci
cuando se determin la actividad estersica de
la ARP incubada en diferentes tampones.

% Actividad estersica residual

Bicina

Mops

pH 7,5

pH 9,0

pH 7,5

pH 9,0

100,0
87,7

100,0
91,0

100,0
62,1

100,0
70,0

Estudio de la bioconversin del 4acetilsulfanilil carbamato de

metilo catalizada con ARP soluble

En la Tabla 1, se observa que la actividad

de la ARP, en cada tampn, es
prcticamente la misma, a los dos valores
de pH y garantiza que la enzima se
mantenga activa durante largos perodos de
incubacin, usualmente necesarios para las
bioconversiones.

3.2.2. Influencia del pH en el porcentaje

de conversin del 4-ASCM
Estos ensayos se realizaron a valores de pH de
8, 9 y 10, en los tampones estudiados Bicina,
Mops y fosfato. Un resumen comparativo de
los principales resultados obtenidos se muestra
en la Figura 2.

20
18

% d e c o n v e rs i n

16
14
12
10
8
6
4

Bicina

Mops

0
pH 8

Fosf ato
pH 9

pH 10

Figura 2. Porcentaje de conversin del 4-ASCM a las 177 horas de reaccin, en diferentes tampones a
valores de pH de 8, 9 y 10.

Con estos resultados se demostr que el valor

ptimo del pH para la reaccin de
bioconversin del 4-ASCM, catalizada con la
ARP, es de 9, independientemente del tampn
empleado y el tiempo de reaccin.

3.2.3. Influencia de la agitacin en el

porcentaje de conversin del
4-acetilsulfanilil carbamato de
metilo

Este resultado pondra de manifiesto que ms

importante para la bioconversin es el estado
inico de los grupos funcionales del sustrato y
de la enzima, logrados por el valor del pH del
medio, antes que la accin directa de la
molcula tamponadora sobre la enzima.

La influencia del tipo de agitacin en el

porcentaje de conversin se efectu mediante
la comparacin del porcentaje de conversin
obtenido en ensayos realizados sin agitacin y
con dos tipos de agitacin: orbitlica y
magntica, en medios de reaccin tamponados
con Bicina 100 mM pH 9.

De la Figura 2, tambin se puede observar que

el porcentaje de conversin obtenido con
Bicina, pH 9, supera en un 30,2% al alcanzado
con Mops y en un 53,5% al correspondiente
con fosfato. Consecuentemente, la Bicina es el
tampn que presenta las condiciones ptimas
de amortiguamiento a pH 9 para obtener el
mayor porcentaje de conversin.

En los ensayos realizados con agitacin

magntica se obtuvo el mayor porcentaje de
conversin. Tanto a las 162 como a las 217
horas de reaccin el porcentaje de conversin
alcanzado con agitacin magntica fue el doble
del alcanzado sin agitacin y 1,4 veces, del
alcanzado con agitacin orbitlica.
Esto puede deberse a que magnticamente se
tiene un mejor control en la agitacin durante
el tiempo que dura el ensayo. Adems, se
puede tomar la muestra sin necesidad de parar
la reaccin. En todo caso, estos resultados
demostraran que se logra una mejor
homogenizacin de la mezcla de reaccin con
la agitacin magntica y al mismo tiempo un
mejor y eficiente contacto entre el sustrato y la
enzima.

V e lo c id a d inic ia(%
l /h )

Por los resultados mostrados se decidi realizar

los ensayos posteriores en mezclas de reaccin,
tamponadas con Bicina 100 mM a pH 9.

0,30
0,25

0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

Concentracin inicial del sustrato (mg/ml de sol.)

Figura 3. Representacin de la velocidad de la reaccin de bioconversin, en funcin de la

concentracin del sustrato.

en los mejores valores encontrados. El tampn

usado en el medio de reaccin fue Bicina 100
mM pH 9, la concentracin de la enzima fue de
3,6 mg/ml, la concentracin del intermediario
fue de 0,62 mg/ml, en un reactor batch con
agitacin magntica. Las temperaturas usadas
en este ensayo fueron de 30, 40, 50 y 60o C.

3.2.4. Influencia de la concentracin del

sustrato en la reaccin de
bioconversin
En esta serie de ensayos, en los que
permaneci constante la concentracin de la
enzima (3,6 mg/ml); mientras que, las
concentraciones del sustrato, el intermediario
del herbicida Asulam, fueron de 0,15; 0,31;
0,46; 0,62 y 0,92 mg/ml, se obtuvo el mayor
porcentaje
de
conversin
con
una
concentracin de intermediario mayor a 0,62
mg/ml.

En la Figura 4 se observa el porcentaje de

conversin del intermediario del Asulam (4ASCM) a diferentes temperaturas. La
temperatura ptima de las reacciones de
bioconversin estudiadas hasta 26 horas fue de
60o C. A esta temperatura la reaccin alcanza el
mayor porcentaje de conversin.

La velocidad de reaccin obtenida para las

diferentes concentraciones de intermediario
utilizadas, se muestra en la Figura 3 y permiti
determinar los parmetros cinticos.

La Figura 4 muestra que, a partir de las 60

horas de la reaccin de bioconversin se
aprecian diferencias en el comportamiento del
porcentaje de conversin con la temperatura.
En este ensayo la temperatura ptima de
reaccin fue de 40 C; a esta temperatura se
alcanz el 75% de conversin, al cabo de 127
horas de reaccin.

Estos
resultados
demostraron
el
comportamiento michaeliano de la ARP en la
reaccin de bioconversin. Los valores de la
constante de Michaelis- Menten y de la
velocidad mxima se calcularon de acuerdo
con el mtodo de Lineweaver-Burk (Lehninger
1 981). Se obtuvo un valor de KM = 7,47 mM y
el valor de VMAX = 1,59x10-3 mol/(g.s).

Estos resultados demuestran que en el inicio de

la reaccin predomina el incremento de la
velocidad de reaccin con la temperatura, de
acuerdo con la ecuacin de Arrhenius; pero,
cuando se trabaja en perodos largos de
incubacin a temperaturas elevadas, predomina
la desnaturalizacin trmica de la enzima, con
la correspondiente prdida de actividad.

3.2.5. Influencia de la temperatura en

la reaccin de bioconversin
Se trabaj con diferentes temperaturas de
reaccin y los otros parmetros se mantuvieron
80

% de Conversin del 4-ASCM

70
60
50
40
30
20
10
0
0

20

40

60

80

100

120

140

Tiempo en horas
30 C

40 C

50 C

60 C

Figura 4. Efecto de la temperatura en el porcentaje de conversin del intermediario del Asulam

(4-ASCM), hasta un tiempo de reaccin de 127 horas.

A pesar de que la ARP es muy termoestable en

perodos cortos de incubacin en temperaturas
de hasta 70C (Szajani, 1 981), presenta un
comportamiento similar al de otras enzimas en
perodos largos de incubacin (Lehninger,
1
986).

indicados anteriormente, con cloruros de

cobalto
(CoCl2.2H2O),
magnesio
(MgCl2.4H2O), calcio (CaCl2.3H2O) y zinc
(ZnCl2.2H2O), a concentraciones de 0,25 mM;
0,5 mM y 1 mM, mostraron una influencia
diversa en la bioconversin del intermediario
del herbicida Asulam.

3.2.6. Influencia
de
los
cationes
divalentes en la reaccin de
bioconversin

El ensayo se realiz con referencia a un blanco

que contena la mezcla de reaccin, sin la
adicin de ningn cloruro. A continuacin, en
la Figura 5, se presenta un resumen
comparativo de los resultados obtenidos de la
bioconversin del 4-ASCM en SCM, en
presencia de los cationes divalentes sealados.

Este ensayo, que se realiz en las condiciones

ptimas de tamponamiento, pH, agitacin,
concentracin de sustrato y temperatura,
60
50
40
30
20
10

1mM
0,5 mM

0
Co

Zn

Ca

0,25 mM
Mg

* Control: Mezcla de reaccin sin cationes

divalentes divalentes

Control*

Figura 5. Porcentaje de conversin en mezclas de reaccin que contienen cationes divalentes a las 170
horas de reaccin.
En la Figura 5 se observa que la presencia del
in cobalto, o el in zinc en el medio de
reaccin favorecen a la bioconversin;
mientras que, los iones calcio y magnesio
producen una disminucin del porcentaje de
conversin, con relacin al porcentaje obtenido
en el control, mezcla de reaccin, sin la adicin
de cationes divalentes.
Como se puede observar en Figura 6, luego de
170 horas de reaccin, el porcentaje de
bioconversin del ensayo realizado con una
concentracin 0,5 mM del in cobalto, supera
en un 37,63% al porcentaje de bioconversin
alcanzado en el control; mientras que, la
presencia de 0,5 mM de in zinc supera en
28,72% al porcentaje de bioconversin del
control. La presencia de 0,5 mM de in calcio
y de in magnesio disminuye el porcentaje de
conversin respecto al control en un 15,7% y
64,5%, respectivamente.

Los valores de VMAX y KM para la reaccin de

bioconversin en presencia del in Co 2+
tambin se calcularon, de acuerdo con el
mtodo de Lineweaver-Burk (Lehninger
1 981). Estos resultados indican que KM incrementa en 1,5 veces, con un valor de 10,9
mM y la VMAX en 2 veces, con un valor de
3,01x10-3 mol g-1 s-1, respecto a los
parmetros determinados en la reaccin de
bioconversin sin la presencia de cationes
divalentes.
Los resultados obtenidos con la presencia de
iones divalentes indican un comportamiento
similar al encontrado por otros autores (Heese,
et. al, 1 990 ; Bommarius, et al., 1 992). Es
evidente el efecto positivo de la sustitucin del
in Zn2+ en la ARP nativa, con el in Co 2+
aadido a la solucin y que determinan
incrementos significativos de VMAX y un menor
incremento en el valor de KM (Heese et al,
1 990).

V
e
lo
c
id
a
din
ic
ia
l (%
/h
)

0,30

Sin
SinCoCl2
Co 2+

0,25

Con
ConCoCl2
Co2+

0,20

Polinmica (Sin
CoCl2)
Polinmica (Con
CoCl2)

0,15
0,10
0,05
0,00
0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

Concentracin inicial del sustrato (mg/ml de sol.)

Figura 6. Curvas de comparacin de la velocidad inicial con respecto a la concentracin del sustrato, para
ensayos con y sin la presencia del in cobalto en la mezcla de reaccin.

4.

Conclusiones

1. Con los cuatro tampones orgnicos (Bicina,

Hepes, Mes y Mops), utilizados en el estudio de
la actividad y estabilidad estersica de la ARP,
se obtuvo una buena estabilidad. En los
tampones Bicina y Mops, la ARP soluble
mostr los valores ms altos de actividad.
2. En los ensayos batch estudiados, la
conversin del intermediario del Asulam (4ASCM) fue mxima cuando en la mezcla de
reaccin haba una concentracin de
intermediario de 0,62 mg/ml y de enzima de 3,6
mg/ml; el medio fue tamponado con Bicina pH
9; a 40 C y con agitacin magntica.
3. Si bien la velocidad de bioconversin del
intermediario a 60 C es la mayor en el ensayo
de la influencia de la temperatura en un perodo
inicial de 26 horas, en perodos ms largos
(hasta 127 horas) la velocidad de reaccin
disminuye por la posible desnaturalizacin
trmica de la enzima. Se estableci que la
temperatura ptima para perodos largos de
reaccin fue de 40 C, en las condiciones
estudiadas.
4. La presencia de cobalto en una concentracin
de 0,5 mM, en la mezcla de reaccin mejor el
rendimiento de la bioconversin en un 37,63%,
respecto a la reaccin sin adicin de metales
divalentes. La mezcla de reaccin preparada
con la adicin de Zn2+ muestra incrementos
menores. El empleo de los iones Ca 2+ y Mg2+,
por el contrario, provocaron una disminucin

del porcentaje de conversin respecto al

control.

Agradecimientos
Los autores del presente artculo dejan constancia de
su agradecimiento a la Dra. Florinella Muoz
Bisesti por la estructuracin del presente artculo.

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