TALLER SISTEMAS BIOQUIMICOS CINTICA ENZIMTICA

UNIVERSIDAD PEDAGOGICA NACIONAL

Profesor: RODRIGO RODRGUEZ C.
Diego Fernando Acosta, Giovanna Duque Carrillo, Mauricio Ruiz Flores, Miguel ngel Solrzano

1. Curva de Calibracin del fosforo:

Calculo de las concentraciones del patrn en cada solucin:

Con la ecuacin:
patrn fsforo:
Tubo
1
2
3
4
5

C1V1=C2V2 se determinaron las siguientes concentraciones para el

[P]
0,0008
0,0016
0,0024
0,0032
0,004

ABS
0,098
0,18
0,26
0,386
0,468

Se realiza la curva de calibracin:

Absorbancia

Curva de calibracin
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0

y = 118.25x - 0.0054

0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003 0.0035 0.004 0.0045

Concetracin Fosforo (mg/mL)

1. Determinacin pH ptimo.

Tiempo: 20 minutos
Absorbancias:
Abs = 2 Log (%T)

Se hace correccin restando a cada uno

de
los
tubos
las
absorbancias
respectivas del blanco sustrato y el
blanco enzima

Se calcula la concentracin de sustrato

a partir de la curva de calibracin.

Velocidad:
[P] / Tiempo

Concentracin Fosforo Velocidad (mg/mL)/

(mg/mL)
min

Tubo

%T

Abs

Abs corregida

pH

42

0,377

0,332

0,00285

0,000142

8,4

35

0,456

0,411

0,00352

0,000176

8,8

33,5

0,475

0,43

0,00368

0,000184

9,2

35

0,456

0,41

0,00351

0,000175

9,6

44,5

0,352

0,306

0,00263

0,000131

10

52

0,284

0,24

0,00207

0,000103

10,4

Velocidad

Velocidad vs pH
0.0002
0.00018
0.00016
0.00014
0.00012
0.0001
0.00008
0.00006
0.00004
0.00002
0

pH optimo= 9,2

pH

10

12

2. Determinacin del efecto concentracin de enzima

Tiempo: 20 minutos
Absorbancias:
Abs = 2 Log (%T)

respectivas del blanco sustrato y el

blanco enzima

Se calcula la concentracin de sustrato

a partir de la curva de calibracin
Se hace correccin restando a cada uno
de
los
tubos
las
absorbancias

Velocidad: [P] / Tiempo

Tubo

%T

Abs

Abs
Corregida

Concentracin Fosforo
(mg/mL)

Velocidad (mg/mL)/
min

Enzima ml

73,5

0,133713

0,032945

0,000324269

1,62134E-05

0.05

70,5

0,151811

0,051043

0,000477319

2,3866E-05

0.1

54,5

0,263603

0,162836

0,001422711

7,11356E-05

0.2

43,5

0,361511

0,260743

0,00225068

0,000112534

0.3

41,5

0,381952

0,281184

0,002423543

0,000121177

0.4

BS

98,5

0,006564

BE

80,5

0,094204

Efecto cantidad de enzima

0.00014

Velocidad

0.00012
0.0001
0.00008
0.00006
0.00004
0.00002
0
0

0.1

0.2

0.3

mL de enzima

0.4

0.5

De acuerdo a la grfica realizada se puede establecer que el volumen ptimo de enzima

es
0,4
mL

3. Determinacin del efecto sustrato.

Tiempo: 20 minutos

Tubo

%T

Abs

Abs
Corregida

Concentracin
Fosforo (mg/mL)

Velocidad (mg
P/mL)/ min

Concentracin de
sustrato mM

1/[S]

1/V

88

0,056

0,033

0,000327

1,63387E-05

0,5

2,00

61204,5

81,5

0,089

0,067

0,000609

3,04296E-05

1,00

32862,7

61

0,215

0,192

0,001673

8,36337E-05

0,50

11956,9

55

0,260

0,237

0,002053

0,000102647

0,25

9742,1

50

0,301

0,279

0,002403

0,00012015

0,17

8323,0

45,5

0,342

0,320

0,002749

0,000137468

0,13

7274,4

44

0,357

0,334

0,002872

0,000143624

10

0,10

6962,6

41

0,387

0,365

0,003132

0,000156592

20

0,05

6386,0

95

0,022

100

0,000

20

Absorbancias:
Abs = 2 Log (%T)

Velocidad:
Estudio cinetico Michaelis -Meten
[P] / Tiempo
70000.0

Se corrige la absorbancia, restando

(la absorbancia del blanco enzima)
de la absorbancia total del tubo.
1/V

60000.0
Se

calcula la concentracin de
+ 3029.3
sustratoy = 28742x
a partir
de la ecuacin
50000.0
C
V
=C
V
2 2
40000.01 1
30000.0
20000.0

Vmax = 1/b
Vmax= 1/3029,3
Vmax= 0,000330(mgP/mL)/ min

10000.0
0.0
0.00

0.50

1.00

1.50

1/[s]

KM = m*Vmax
KM = 28742* 0,000330
KM = 9,48 mM

4. Determinacin efecto inhibidor:

2.00

2.50

Tubo

%T

Abs

Abs Corregida

Concentracin
Fosforo (mg/mL)

Velocidad
(mg/mL)/ min

Concentracin de
sustrato mM

1/[S]

1/V

86,5

0,063

0,011

0,000143

7,13328E-06

0,5

2,00

140187,9

82

0,086

0,035

0,000339

1,6944E-05

1,00

59018,1

76

0,119

0,068

0,000618

3,08976E-05

0,50

32365,0

65

0,187

0,136

0,001192

5,9608E-05

0,25

16776,3

61

0,215

0,163

0,001425

7,12712E-05

0,17

14030,9

57,5

0,240

0,189

0,001642

8,2122E-05

0,13

12177,0

60,5

0,218

0,218

0,001891

9,45643E-05

10

0,10

10574,8

47

0,328

0,276

0,002383

0,000119149

20

0,05

8392,8

93

0,032

95,5

0,020

20

Estudio cinetico con inhibidor

160000.0
140000.0

Vmax = 1/b
Vmax= 1/1786,5
Vmax= 0,000559mgP/mL)/ min

y = 66616x + 1786.5

120000.0

1/V

100000.0
80000.0
60000.0

KM = m*Vmax
KM = 66616* 0,000559
KM = 37,28 mM

40000.0
20000.0
0.0
0.00

0.50

1.00

1.50

1/[s]

2.00

2.50

Por los resultados obtenidos se concluye que el sistema no sigue los parmetros de la
cintica de Michelis Menten, ya que la Vmax Y la KM de ambos (con y sin inhibidor) son
diferentes.