CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA “PAULA SOUZA”

FACULDADE DE TECNOLOGIA DE PIRACICABA- FATEC

GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE BIOCOMBUSTÍVEIS

HIDRÓLISE DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PARA OBTENÇÃO DE

ETANOL

ALINE GRELLA DE CAMPOS

MARIA MARTINS DA SILVA
MARLENE APARECIDA DA SILVA

PIRACICABA - SP
JUNHO/ 2011
 ALINE GRELLA DE CAMPOS
MARIA MARTINS DA SILVA
MARLENE APARECIDA DA SILVA

HIDRÓLISE DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PARA OBTENÇÃO DE ETANOL

Trabalho de Graduação apresentado a Faculdade de

Tecnologia de Piracicaba como requisito parcial a
obtenção do Título de Graduação de Tecnologia em
Bicombustíveis.
Profª. Drª. Eliana Mª G. Rodrigues de Siqueira.
Co-orientadora: Profª. Drª. Sandra Helena da Cruz
ESALQ/USP

PIRACICABA - SP
JUNHO/ 2011
 ii

PIRACICABA-SP
17 /JUNHO/ 2011
 iii

"... Faça, erre, tente, falhe, lute.

Não jogue fora a extraordinária oportunidade de ter vivido.
Tendo consciência de que, cada homem foi feito para fazer história.
Que todo homem é um milagre e traz em si uma evolução.
Que é mais do que sexo ou dinheiro.
Você foi criado para construir pirâmides e versos,
para descobrir continentes e mundos.
E caminhar sempre com um saco de interrogações numa mão e
uma caixa de possibilidades na outra..."

Nizan Guanaes
 iv

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo, por todos, pela vida...

Aos nossos familiares

A todos os companheiros de jornada acadêmica

Banca examinadora
Profª. Drª. Eliana Mª G. Rodrigues de Siqueira (Orientadora)
Faculdade de Tecnologia de Piracicaba (FATEC)

Profº Dr. James Rogado

Universidade Metodista de Piracicaba (UNIMEP)

Profª. Drª. Daniela Defavari do Nascimento

Faculdade de Tecnologia de Piracicaba (FATEC)
 v

RESUMO

Recentemente há grande interesse em aproveitar materiais lignocelulósicos para produção de

combustível limpo e renovável, no Brasil por ser o segundo maior produtor de cana-de-açúcar o
principal material lignocelulósico é o bagaço advindo do processo de extração do caldo de cana-
de-açúcar, resíduo gerado em grande quantidade pelas Usinas produtoras de açúcar e álcool. O
bagaço de cana-de-açúcar, assim como outros resíduos de origem vegetal possuem parede celular
composta de celulose, hemicelulose e lignina que em associação são denominados de
lignocelulósicos que contém energia armazenada que muitas vezes são descartadas ou queimadas
para geração de vapor. Para o melhor aproveitamento desta energia contida em grande parte na
celulose é necessário desconstruir a sua estrutura, assim a produção de etanol a partir de biomassa
celulósica requer um pré-tratamento para remoção da lignina e desestruturação da celulose
através da hidrólise ácida ou enzimática. A fim de avaliar quais processos de pré-tratamento
apresenta maior influencia no rendimento de hidrolisado após a hidrólise o objetivo deste
trabalho foi utilizar bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com ácido, água e com fungos
lignocelulolíticos: Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei Rut-30, Trichoderma
harzianum 3844, Aspergillus niger IZ-9 e Agaricus bisporus (G4), capazes de hidrolisar o bagaço
a açúcares potencialmente fermentáveis por leveduras industriais e analisar o etanol obtido.
Realizando os experimentos em escala laboratorial os melhores resultados observados no pré-
tratamento foram bagaço pré-tratado com H2SO4 (2%), com 13,75 mg de AR/mL, determinado
pelo método DNS e através da hidrólise total deste resíduo realizou análise cromatográfica do
hidrolisado e observamos liberação de 1,18% e 91,38% do seu potencial de glicose e xilose,
respectivamente, isto resultou na baixa obtenção de etanol, devido a presença de resíduos tóxicos
para as leveduras, como os furfurais. No tratamento controle com fungos foram 3,0 g/ L de
açúcares redutores liberados. O fungo P. chrysosporium desenvolveu-se muito bem quando
incubados no bagaço de tratamento controle (TC) e de tratamento ácido (TA). No tratamento
bagaço pré-tratado com ácido os fungos P. chrysosporium e T. reesei Rut-30 se beneficiaram dos
carboidratos liberando aproximadamente 35g AR/L, no tempo inicial, mas posteriormente
ocorreu diminuição da concentração de AR, devido o crescimento dos fungos que consumiram
grande parte dos açúcares.

Palavras-chave: Bagaço. Hidrólise. Etanol. Ácido. Fungo

 vi

ABSTRACT

Recently there is great interest in using lignocellulosic materials for production of clean fuels and
renewable, in Brazil for being the second largest producer of cane sugar is the main
lignocellulosic bagasse coming from the process of extracting the broth of cane sugar waste
produced in large amounts by plants that produce sugar and alcohol. The crushed cane sugar, as
well as other plant wastes has cell walls composed of cellulose, hemicellulose and lignin in
combination are called lignocellulosic that contains stored energy that are often discarded or
burned to generate steam. For better utilization of energy contained largely in the cellulose is
necessary to deconstruct its structure, so the production of ethanol from cellulosic biomass
requires pretreatment to remove the lignin and cellulose breakdown by acid hydrolysis or
enzymatic. In order to evaluate which processes pre-treatment has greater influence on the yield
of hydrolyzed after hydrolysis the purpose of this study was to use bagasse-cane pre-treated with
acid, water and lignocellulolytic fungi: Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei Rut-
30, 3844 Trichoderma harzianum, Aspergillus niger IZ-9 and Agaricus bisporus (G4), capable of
hydrolyzing bagasse potentially fermentable sugars by yeasts and analyze industrial ethanol
obtained. Performing experiments on laboratory scale the best results observed in the residue
levels were pre-treated with H2SO4 (2%), AR with 13.75mg/mL, determined by the DNS method
by hydrolysis and total waste of chromatographic analysis performed hydrolyzate and observe the
release of 1.18% and 91.38% of its potential for glucose and xylose, respectively, this resulted in
lower production of ethanol, due to the presence of toxic waste to the yeasts, such as furfur. In the
control treatment fungi were 3.0 g/L of reducing sugars released. The fungus P. chrysosporium
developed very well when incubated in the bagasse treatment control (CT) and acidic (TA). In
treating bagasse pretreated with acid fungi P.chrysosporium and T. reesei Rut-30 benefited from
releasing approximately 35g carbohydrate AR/ L at baseline, but subsequently decrease in the
concentration of RA, because the growth of fungi that consumed most of the sugars.

Keywords: Bagasse. Hydrolysis. Ethanol. Acid. Fungus.

 vii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Corte transversal da fibra de material lignocelulósico...............................................14

FIGURA 2. Estrutura geral do bagaço de cana-de-açúcar............................................................ 15
FIGURA 3. Hidrólise ácida de celulose e arabinoxilano...............................................................20
FIGURA 4. Reação do DNS com açúcar redutor......................................................................... 29
FIGURA 5. Açúcares redutores liberados após pré-tratamento do bagaço de cana..................... 32
FIGURA 6. Açúcares redutores liberado após cultivo de fungos A) T. resseei Rut 30. B) T,
harzianun 3844 e C) P. Chrysosporium cultivados em bagaço de cana pré- tratado com H2O ou
H2SO4.............................................................................................................................................33
FIGURA 7. Açúcares redutores liberados durante pré-tratamento do bagaço de cana pelo método
de DNS...........................................................................................................................................34
FIGURA 8. Concentração de açúcares, obtido por HPAEC-PAC, após pré-tratamento ácido do
bagaço de cana................................................................................................................................35
FIGURA 9. Concentração de açúcares, obtido por HPAEC-PAC, do bagaço de cana submetido á
hidrolise total..................................................................................................................................36
FIGURA 10. Açúcares redutores liberados e valores de pH após pré-tratamento do bagaço de
cana.................................................................................................................................................38
FIGURA 11. Açúcares redutores liberados e valores de pH após cultivo do bagaço de cana pré-
tratado por Apergillus nizer IZ-9 (Asp) e Agaricus bisporus (G4) a 28ºC.....................................39
FIGURA 12. Açucares redutores liberados e valores de pH após cultivo simultâneo do bagaço de
cana, pré-tratado com ácido, por fungo P.chrysosporium e T. reesei Rut-30................................40
 viii

LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS

GRÁFICO 1. Curva Padrão de glicose, obtida pelo método DNS................................................30

TABELA 1. Comparação do bagaço submetido a hidrolise total e parcial...................................36
 SUMÁRIO

RESUMO ...................................................................................................................... v
ABSTRACT .................................................................................................................. vi
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... vii
LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS .......................................................................... viii
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 11
2. OBJETIVO ................................................................................................................... 12
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................... 13
3.1. Bagaço de cana-de-açúcar no Brasil ................................................................. 13
3.2. Bagaço de cana-de-açúcar como matéria-prima para produção de etanol ........ 14
3.3. Parede celular da cana-de-açúcar ..................................................................... 16
3.4. Hidrólise de material lignocelulósico............................................................... 18
3.5. .Hidrólise ácida................................................................................................. 19
3.6. Hidrólise enzimática......................................................................................... 21
3.7. Fungos lignocelulósicos.................................................................................... 23
3.8. . Fermentação do hidrolisado para obtenção do bioetanol............................... 24
4. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 26
4.1 Bagaço de cana-de-açúcar ................................................................................. 26
4.2 Microrganismos ................................................................................................. 26
4.3 Hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar .......................................................... 26
4.4 Fermentação do hidrolisado ............................................................................... 27
4.5 Análises físico-químicas e microbiológicas ...................................................... 28
4.6 Análise dos Açúcares por HPAEC-PAC ........................................................... 29
4.7 Concentração de açucares redutores totais (ART) ............................................. 29
4.8 Biomassa ............................................................................................................ 30
4.9 Viabilidade das células de levedura ................................................................... 30
4.10 Umidade de bagaço ........................................................................................ 31
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 32

5.1 Liberação do açúcar redutor do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado ............. 32

 5.2 Tratamentos biológicos do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado .................... 32

5.3 Açúcares redutores liberados no hidrolisado do bagaço de cana-de-açúcar ...... 34

5.4 Hidrólise total do bagaço de cana-de-açúcar ..................................................... 35

5.5 Análises da umidade do bagaço durante incubação a 30°C ............................... 37

5.6 Liberação de açúcar redutor de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado ............. 37

5.7 Tratamento biológico do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado ....................... 38

5.8 Tratamento biológico com dois fungos simultaneamente ................................. 39

5.9 Fermentação do hidrolisado ............................................................................... 41

5.10 Formação de outros compostos ........................................................................ 41

6 CONCLUSÃO .............................................................................................................. 42
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 43
 11

1. INTRODUÇÃO

O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo, no processamento da cana-de-

açúcar para obter açúcar e álcool, são gerados os subprodutos, bagaço e palha, resíduos
lignocelulósicos compostos por celulose, hemicelulose e lignina. A celulose é a matéria mais
abundante na terra, e ocorre em associação com a hemicelulose e a lignina, resultando assim o
termo “lignocelulósico”, este, é, portanto, o material orgânico renovável mais abundante e
favorável de conversão biológica, química e fisiológica em produtos de interesse econômico
(PAVARINA, 1997). Subprodutos como bagaço e palha de cana-de-açúcar, cascas, gramíneas e
resíduos florestais que são tradicionalmente queimados ou descartados, podem ser utilizados
como matérias-primas para obtenção de etanol (JARDINE et al., 2009).
Há décadas o Brasil utiliza o etanol como combustível, diretamente no tanque dos carros
ou sob forma de mistura com a gasolina, de 22% a 25% de álcool. O Programa Nacional do
Álcool (Proálcool), lançado em 1975, para a produção de álcool combustível, visava uma política
de independência para o setor energético em resposta à primeira crise internacional do petróleo
(BON et al., 2008).
Nesse cenário em busca de fontes de energia renováveis, desde o século XIX, a hidrólise
da biomassa surge como opção de matéria-prima para a fermentação e consequentemente
obtenção do etanol, somente nos últimos vinte anos essa tecnologia tem sido proposta para
atender o mercado de combustível no Brasil, Estados Unidos e na Europa.
As tecnologias para a obtenção de bioetanol com base em materiais lignocelulósicos
envolvem a hidrólise dos polissacarídeos da biomassa em açúcares fermentescíveis e sua
posterior fermentação para produção de bioetanol. Essa biomassa é composta de lignina,
hemicelulose e celulose. A lignina devido as suas características químicas impede a hidrólise das
camadas internas, por isto, nos processos enzimáticos de conversão de celulose a etanol ou outros
bioprodutos, um pré-tratamento é necessário para que a estrutura lignocelulósica da biomassa seja
rompida (BNDES, 2008).
 12

2. OBJETIVO

O presente trabalho visa testar a obtenção do etanol via hidrólise ácida e via fungos
lignocelulolíticos: Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei Rut-30 e Trichoderma
harzianum 3844, Aspergillus niger IZ-9, Agaricus bisporus (G4).
 13

3.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Bagaço de cana-de-açúcar no Brasil

Os países norte-americanos e europeus estão interessados no etanol brasileiro,

reconhecido mundialmente pelas suas vantagens ambientais, sociais e econômicas, diante disso
há necessidade de aumentar a produção, sendo estimados para a safra 2010/11 na região Centro-
Sul 595,89 milhões de toneladas de cana, um total de 34,09 milhões de toneladas de açúcar e de
27,39 bilhões de litros de álcool (UNICA, 2011).
No Brasil, o bagaço de cana é o resíduo agroindustrial obtido em maior quantidade,
aproximadamente 280 kg/t de cana moída. Estima-se que a cada ano sejam produzidos de 5 a
12 milhões de toneladas desse material, correspondendo a cerca de 30% do total da cana moída e
na produção de etanol, cerca de 30% da cana é transformada em bagaço (RODRIGUES e
CAMARGO, 2008).
Do processamento da cana, para obtenção de açúcar e álcool, são gerados os subprodutos,
bagaço e palha, resíduos lignocelulósicos compostos por celulose, hemicelulose e lignina. A
celulose ocorre em associação com a hemicelulose e a lignina, resultando assim o termo
“lignocelulósico”, o material orgânico renovável mais abundante da Terra e favorável de
conversão biológica, química e fisiológica em produtos de interesse econômico (PAVARINA,
1997). Subprodutos como bagaço e palha de cana-de-açúcar, cascas, gramíneas e resíduos
florestais geralmente são queimados ou descartados, mas podem ser melhores aproveitados como
matérias-primas para obtenção de etanol (JARDINE et al., 2009).
Em termos energéticos, a cana-de-açúcar equivale a 49,5% de bagaço, 43,2 % de etanol e
7,3% de vinhoto. Mesmo com esse valor energético, o destino do bagaço nas usinas, é a
incineração, para produção de vapor de baixa pressão (20 kgf/cm²). Atualmente as principais
pesquisas, em todo o mundo, estão sendo direcionadas, principalmente, para a conversão
bioquímica da celulose. As dificuldades estão na hidrólise enzimática e na lignina, pois esta
dificulta o acesso de enzimas aos carboidratos fermentáveis, acarretando perdas, uma vez que a
enzima é consumida no decorrer do processo (RODRIGUES e CAMARGO, 2008).
As fibras do bagaço são recobertas de lignina, possuindo uma camada intermediária de
hemicelulose e uma camada interna de celulose, como mostrado na Figura 1.
 14

FIGURA 1. Corte transversal da fibra de material lignocelulósico (Fonte :RODRIGUES e

CAMARGO, 2008).

De acordo com Rodrigues (2011) devido ao desenvolvimento tecnológico, os

combustíveis de segunda geração podem beneficiar o emprego de elevadas quantidades de
resíduos e rejeitos lignocelulósico que estão atualmente disponíveis e com baixo custo de
aquisição. Assim um incentivo para seu aproveitamento, permite a co-produção de combustíveis
valiosos, compostos químicos, eletricidade e calor conduzindo a produção de energia sustentável.

3.2 Bagaço de cana-de-açúcar como matéria-prima para produção de etanol

O bagaço de cana é um material fibroso obtido após a extração do caldo no processo de

moagem. Ao sair da moenda, o bagaço apresenta aproximadamente 30% da massa da cana
umidade em torno de 50%. Devido a sua acessibilidade e elevada disponibilidade, principalmente
nos grandes centros açucareiros do País, pode representar uma opção economicamente viável
para a produção de etanol (CARDOSO, 2008).
A composição química do bagaço varia de acordo com diversos fatores, dentre eles, o tipo
de cana, o tipo de solo, as técnicas de colheita e até o manuseio. A Figura 2 apresenta a estrutura
geral do bagaço de cana-de-açúcar com os seus respectivos grupos químico.
 15

FIGURA 2: Estrutura geral do bagaço de cana-de-açúcar. (Fonte: RODRIGUES e CAMARGO, 2008).

Apesar de todas as características positivas inerentes ao uso de bagaço de cana como

matéria-prima na produção de etanol, um grande desafio a superar consiste em reduzir os custos
operacionais associados à disponibilização dos carboidratos para conversão biotecnológica. O
desenvolvimento de processos eco-eficientes de pré-tratamento do bagaço e de hidrólise da
celulose emerge, neste cenário, com especial relevância (BAUDEL, 2007).

A cana de açúcar é uma das mais ricas fontes de carboidrato na natureza. De

uma tonelada de cana-de-açúcar, obtém-se 150 kg de açúcares fermentescíveis e
140 kg de bagaço seco contendo: a) kg de celulose (43%), b) kg de xilanas
(25%), c) kg de lignina (23%), além de 4 kg de ácido acético (3% em grupos
acetílicos nas heteroxilanas), 6 kg de extratos incluindo sacarose (4%) e 3 kg de
cinzas (2%). É importante observar que esse balanço de material não leva em
conta o consumo de energia, que nas usinas é suprido com a queima do próprio
bagaço. Para um processo completamente auto-sustentável, sem o uso de
combustíveis fósseis, é preciso descontar a quantidade de bagaço de cana
consumida para gerar energia para esse processo.
Considerando que a quantidade de açúcares fermentescíveis encontrada no
bagaço pode ser recuperada, por exemplo, com 90% de eficiência após 2 etapas
de tratamento ácido, o rendimento teórico de açúcares fermentescíveis na cana
de açúcar em sua totalidade (caldo e bagaço) pode chegar a 227 kg/ton, com o
 16

bagaço contribuindo com um aumento de 50% no etanol produzido. Assim, se

promove o aumento da produção sem promover a expansão de área plantada, de
forma a evitar a competição com as áreas produtoras de alimentos ou entrar em
áreas protegidas como florestas (RODRIGUES, 2007).

Segundo Baudel (2007), resultados preliminares de experimentos realizados na

Universidade de Lund (Suécia) evidenciam a possibilidade de produzir aproximadamente 210 L
etanol/ton bagaço seco utilizando levedura Saccharomices cerevisae convencional em estratégias
Sacarificação e Fermentação Separadas (“Separate Hydrolysis and Fermentation”, SHF)
utilizando unicamente glicose como substrato.
Há inúmeras opções de processo de hidrólise, todas com um pré-tratamento do material
lignocelulósico para remoção da lignina e separação da hemicelulose, em alguns casos; exemplos
de pré tratamentos: físicos (picadores, moagem), físico-químicos (auto-hidrólise: descompressão
com vapor, com amônia ou com CO2), químicos (com ozônio, ácidos diluídos ou concentrados,
alcalino) ou com solventes (para dissolver a lignina, como no processo Dedini-Copersucar)
(MACEDO e NOGUEIRA, 2005).

3.3 Parede celular da cana-de-açúcar

A cana-de-açúcar pertence a um grupo de plantas denominadas família Poaceae

(gramíneas), do qual também fazem parte o milho, sorgo, trigo e arroz os quais apresentam como
principal hemicelulose os glucuronoarabinoxilanos (GAXs), embora também possua, em
pequenas proporções, xiloglucanos, mananos e os β-glucanos, estes últimos relativamente
abundantes em todos os tecidos da cana (BUCKERIDGE et al. 2008).
A celulose é o principal componente da parede celular dos vegetais e o composto
orgânico mais abundante da natureza, composto por um polímero, com até 15.000 unidades de D-
glicose unidas por ligações glicosídicas β-1,4. Estas cadeias individuais estabelecem ligações de
hidrogênio intermoleculares, rígidas e em forma de fita. A formação de pontes de hidrogênio
intracadeias resulta na formação de fibrilas, uma estrutura altamente ordenada que se associam
formando as fibras de celulose (BON et al., 2008).
Apesar de sua estrutura relativamente simples, não é um polímero facilmente degradável;
as moléculas estão associadas formando microfibrilas cristalinas, estabilizadas por pontes de
 17

hidrogênio. Na parede celular a celulose encontra-se associada a outros polímeros como

hemiceluloses, lignina e substâncias pécticas (FERRAZ, 2004).
A hemicelulose é um grupo de polissacarídeos associados a outros componentes na
parede celular, principalmente às microfibrilas de celulose por pontes de hidrogênio e formam
ligações covalentes com a lignina e compostos fenólicos. As hemiceluloses ocorrem como
heteropolissacarídeos, consistindo de uma cadeia linear de açúcares unidos por ligações β-1,4,
geralmente com ramificações muito curtas. Os açúcares residuais presentes podem ser pentoses
(xilose e arabinose) ou hexoses (glicose, manose e galactose). Os açúcares apresentam-se na
forma de polímeros ramificados, de menor massa molecular que a celulose e podem ser
homopolímeros (exemplo: xilana, formado por xilose) ou heteropolímeros (exemplo:
glicomanana, formado por glicose e manose). O teor de polioses em diferentes tipos de
lignocelulósico é bastante variável, mas pode ser admitido um valor médio de cerca de 20%
(FERRAZ, 2004).
A lignina é um constituinte da parede celular de todas as plantas vasculares, sendo
considerada uma macromolécula constituída de unidades de fenilpropano, em uma conformação
tridimensional e amorfa, representando de 20% a 30% do total dos lignocelulósicos. É um dos
biopolímeros mais abundantes na biosfera, sendo uma parte considerável do carbono fixado por
fotossíntese. Devido à estreita associação entre celulose, hemicelulose e lignina, esses compostos
não estão uniformemente distribuídos na parede das plantas. A parte interna contém alta
quantidade de celulose, enquanto a lamela média possui maior quantidade de lignina. Entretanto,
os três compostos podem ser encontrados em todas as camadas da parede celular vegetal
(AGUIAR FILHO, 2008).
A tradicional matéria-prima para a obtenção de açúcares fermentescíveis via hidrólise
ácida tem sido a madeira, mas devido às propriedades físicas e diversas vantagens do ponto de
vista econômico, os resíduos agrícolas mostrou ser a matéria-prima mais favorável para a
indústria de sacarificação, especialmente no cenário brasileiro. Sem dúvida alguma, o etanol é o
mais importante produto final obtido pela fermentação do hidrolisado, porém outros produtos
também podem ser obtidos, (RODRIGUES, 2007).
Para obter os açúcares da celulose, principalmente a glicose, e da hemicelulose,
principalmente a xilose, é preciso um pré-tratamento do material que remova a lignina, e então
 18

uma hidrólise, quebrando as ligações nos polímeros e liberando os monômeros (glicose, xilose,
etc).
O processo de hidrólise pode causar degradação dos açúcares formados originando
compostos tóxicos ao metabolismo microbiano, como furfural, hidroximetilfurfural e compostos
fenólicos (CANETTIERE, 2004). A hidrólise alcalina proporciona baixos rendimentos na
liberação de açúcares e gera um maior volume de efluentes quando comparada com outros
processos.
A hidrólise pode ser feita com catálise ácida ou enzimática; em alguns processos a
hidrólise (sacarificação) e a fermentação são feitas simultaneamente (“Simultaneous Scarification
Fermentation”) (MACEDO e NOGUEIRA, 2005).

3.4 Hidrólise de material lignocelulósico

O material celulósico pode ser hidrolisado através de processos químico, físico,

enzimático ou uma combinação de métodos. Os pré-tratamentos biológicos são usados às vezes
em combinação com tratamentos químicos para solubilizar a lignina a fim de deixar a celulose
mais acessível à hidrólise e a fermentação (GRAF e KOEHLER, 2000). A hidrólise
(sacarificação) quebra as pontes de hidrogênio nas frações de hemicelulose e de celulose em seus
componentes do açúcar: pentose e hexoses, (MACHADO, 2009), e esses açucares podem ser
fermentados a etanol.
Um dos processos de hidrólise mais utilizado é através da elevação e queda brusca de
pressão. Portanto, a hidrólise é um processo que visa extrair do material celulósico a glicose,
açúcar formado por uma cadeia de seis carbonos, e utilizado pelas leveduras para a transformação
em etanol. A celulose, formada por moléculas de glicose unidas por ligações β-1,4, é o principal
constituinte estrutural da parede dos vegetais, responsável pela extrema resistência. Devido à
natureza da ligação β-1,4 entre as unidades de glicose, ocorre a formação de pontes de hidrogênio
dentro da molécula, o que torna a molécula de celulose bastante rígida e plana, permitindo o
empilhamento de várias cadeias que formam uma estrutura polimérica extremamente resistente
(KOOLMAN, 2005). Como os polissacarídeos possuem muitos grupos hidroxila a formação de
pontes de hidrogênio exerce uma influência forte na estrutura da cadeia. Os polímeros de D-
glicose, como a celulose, podem ser representados por uma série de anéis piranosídicos rígidos
 19

conectados por um átomo de oxigênio que faz ponte entre dois átomos de carbono, sendo difícil à
quebra dessa cadeia.
Segundo Buckeridge e colaboradores (2000), no caso da parede celular de cana, os
glucuronoarabinoxilanos possuem ramificações de ácido glucurônico e arabinose cujas ligações
são do tipo α, e estas são as primeiras a serem quebradas. Posteriormente, são quebradas as
ligações β (como as β-1,4 dos xilanos). A celulose, por sua vez, é a última a ser hidrolisada
devido à sua forte interação intermolecular, à completa ausência de água na estrutura da
microfibrila e também ao fato das fibrilas estarem cobertas pelas hemiceluloses. O problema em
um processo de hidrólise de polissacarídeos contendo ligações α e β é que o tempo necessário
para hidrólise é diferente, os monossacarídeos liberados antes tendem a se degradar. Este
processo é chamado de caramelização. Se a degradação é muito intensa ocorre formação de
furfurais, compostos tóxicos para as leveduras na etapa de fermentação. Assim, ao hidrolisar uma
mistura de celulose e hemiceluloses, a desconexão temporal das quebras das ligações glicosídicas
de cada tipo de polissacarídeo torna-se um entrave para a produção de monossacarídeos
fermentáveis. Nos processos industriais, a hidrólise ácida tem sido realizada com ácido sulfúrico
(H2SO4).
Segundo Martín e colaboradores (2007) a explosão a vapor pode ser realizada utilizando
diferentes temperaturas e tempos. Observa-se que quanto maior o tempo e temperatura aplicados
ao bagaço maior o rendimento em açúcares redutores, no entanto, maior será também a formação
de compostos como furfural e 5-hidroximetilfurfural (HMF) que são inibidores da fermentação.
A hidrólise ácida, por outro lado, pode produzir subprodutos tóxicos à fermentação, o qual reduz
a eficiência do processo fermentativo. Ao contrário deste, a hidrólise enzimática utiliza as
enzimas xilanases, que “limpam” a fibra, e permitem que as celulases atuem diretamente na
celulose; tornando o processo mais eficiente.

3.5 Hidrólise ácida

De acordo com Buckeridge et al.(2008) a produção de etanol celulósico tem como

objetivo desmanchar a estrutura da parede celular para que os polissacarídeos possam ser usados
como fonte de açúcares fermentáveis. O procedimento de hidrólise ácida utiliza um ácido
concentrado para quebrar as ligações glicosídicas entre os monossacarídeos de um polissacarídeo.
 20

A Figura 3 mostra o processo de forma simples. Os ácidos mais indicados para o processo
de hidrólise em laboratório são ácido sulfúrico, ácido clorídrico e o ácido trifluoroacético. Cada
um deles apresenta resultados diferentes, enquanto ácido sulfúrico e clorídrico discriminam
pouco as ligações glicosídicas de diferentes tipos, atacando celulose e hemicelulose de forma
similar, o ácido trifluoroacético quebra preferencialmente as ligações mais fracas, que são as
ligações do tipo alfa (α) presente nas ramificações das hemiceluloses.

FIGURA 3. Hidrólise ácida de celulose e arabinoxilano. (Fonte: BUCKERIDGE, 2000).

O processo via ácido concentrado emprega o ácido sulfúrico como agente de pré-
tratamento desfazendo a estrutura cristalina da celulose. Os carboidratos solubilizados são
finalmente hidrolisados com ácido diluído e com isso a estrutura da celulose passa para o estado
amorfo, possibilitando sua transformação completa e rápida em açúcares redutores,
(RODRIGUES e CAMARGO, 2008).
A hidrólise ácida, com ácido concentrado ou diluído ocorre em dois estágios para
aproveitar as diferenças entre a hemicelulose e celulose. O primeiro envolve a hidrólise da
hemicelulose, conduzida nas condições do pré-tratamento, em temperaturas altas, otimizando a
hidrólise da fração celulósica.
 21

O processo com ácido diluído utiliza altas temperaturas e pressões, com tempos de reação
de segundos a alguns minutos, o que facilita o uso de processos contínuos, o processo de ácidos
mais concentrado é conduzido em condições mais brandas e com a reação num longo tempo
(BNDES, 2008).
O ácido utilizado para a conversão da celulose em açúcar tem na etapa de hidrólise um
processo crítico, pois o tipo de ácido e sua concentração têm um significado muito importante no
custo da usina. Os processos que utilizam ácido clorídrico e sulfúrico concentrado podem atacar
os equipamentos da usina corroendo-os, então, estes devem ser resistente ao ácido, o que tende a
elevar o custo.
Outra dificuldade advém da necessidade de neutralização da solução contendo os açúcares
para que se possa proceder à fermentação. Em geral, para a neutralização, utiliza-se hidróxido de
cálcio (cal hidratada). No entanto, ao se proceder desse modo, o ácido sulfúrico é convertido em
sulfato de cálcio e não pode ser reaproveitado. Esse é o principal fator que contribui para o alto
custo da técnica.
Para se obterem níveis aceitáveis de comercialização (US$ 0,36/kg) será necessária a
redução dos custos associados principalmente ao consumo e reutilização do ácido e ainda a
melhora na produtividade e eficiência na conversão da biomassa (GOLDENBERG, 2007).
Segundo Rodrigues (2008), os furfurais que se formam naturalmente durante a hidrólise
ácida, poderiam ser aproveitados como matéria-prima na produção de solventes e resinas para
fabricação de fibra de vidro e outros materiais plásticos. Sua comercialização pelas usinas
poderia se tornar rentável e contribuir para reduzir o custo do etanol celulósico.
Furfural é exclusivamente produzido a partir de material lignocelulósico por desidratação
com ácido sulfúrico ou clorídrico das pentoses (principalmente a xilose) que está presente em
quantidades significativas na hemicelulose (RODRIGUES, 2007).

3.6 Hidrólise enzimática

A utilização da enzima para o processamento de biomassa para etanol é relativamente

recente. Enquanto a química de obtenções de açucares a partir de madeira tem em torno de dois
 22

séculos de pesquisa e desenvolvimento, as enzimas para hidrólise enzimática somente contam

com 50 anos (MACHADO, 2009).
Durante anos as enzimas são utilizadas como catalisadores na produção de etanol através
da hidrólise do amido. No entanto, usa-se enzimas para conseguir a celulose, um processo
complexo e protegido por matérias resistentes ao ataque químico como a lignina e a hemicelulose
(ROSA, GARCIA, 2009).
A hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos é um processo muito estudado por
apresentar especificidade da reação, ausência de reações secundárias (que levariam à perda de
rendimento), ausência de formação de produtos secundários (inibidores da fermentação alcoólica)
e reação em condições suaves que não requerem altas pressões e temperaturas ou ambientes
corrosivos para os equipamentos (BASTOS, 2007). A cristalinidade da celulose, a proteção da
lignina e as configurações espaciais do complexo celulose-hemicelulose-lignina tornam este tipo
de hidrólise um processo lento e pouco econômico. A estrutura capilar das fibras de celulose e a
presença de metais diminuem a eficiência da hidrólise enzimática (CANETTIERE, 2004).
No processo enzimático, a hidrólise é catalisada por enzimas chamadas celulases que
atacam as cadeias de celulose para obter polissacarídeos menores as enzimas exoglucanases
atuam nos terminais não-redutores das cadeias menores removendo a celobiose e β-glucosidases
que hidrolisam a celobiose e outros oligômeros à glicose.
As enzimas conhecidas como celulases hidrolisam a celulose liberando inclusive a glicose
e outros açúcares, fonte de energia dos fungos, por degradação de parte de fibras de celulose. A
celulase pode diminuir o comprometimento e o diâmetro das fibras de madeira. Um ataque
fúngico preliminar facilita a abertura das fibras de madeira por métodos mecânicos (AGUIAR,
2008). A produção de celulases pelos fungos é lenta, porém de custo potencialmente baixo.
A hidrólise conduzida em condições brandas em pH 4,8 e temperatura entre 45º e 50ºC,
apresenta custo de utilidade relativamente baixo (BNDES, 2008).No caso da hidrólise enzimática
dependente bastante da natureza do material celulolítico, a principal vantagem é que a reação
pode ser realizada em condições favoráveis não sendo necessário temperaturas altas e pressões ou
pH extremo.
Comparativamente, a hidrólise com ácido diluído encontra-se em um estágio avançado, o
limitante é o rendimento de 50 a 70%. A hidrólise com ácido concentrado apresenta rendimentos
maiores e maiores problemas de inibidores, necessidade de recuperação do ácido e de
 23

equipamentos resistentes a corrosão, o que compromete o desempenho econômico do processo. A

hidrólise enzimática apresenta rendimentos de 75 a 85%, e melhorias são esperadas para 85 a
95%. Além disso, a não utilização de ácidos pode representar grandes vantagens não só
econômica, em equipamentos com materiais mais baratos e menor custo operacional, como
também ambiental, pois não há produção de resíduos (MACHADO, 2009).

3.7 Fungos lignocelulolíticos

Há séculos os fungos filamentosos vêm sendo utilizados pela humanidade na produção de

alimentos, bebidas e fármacos. Entretanto, a exploração do imenso potencial desses organismos
como produtores de uma vasta gama de enzimas, extracelulares de aplicação industrial (catalases,
amilases, xilanases, peroxidases, invertases, pectinase, queratinases, lipase e proteases, entre
outros) somente se tornou possivel com o avanço do conhecimento da sua fisiologia, bioquímica
e genética (MACHADO, 2009).
Os fungos que decompõem substâncias lignocelulósicas ocorrem, geralmente, no solo
colonizando raízes e resíduos vegetais, com importante função de reciclagem de nutrientes. Na
natureza existe uma grande variedade de microrganismos que produzem celulases, entretanto
apenas alguns são conhecidos como verdadeiros celulolíticos, isto é, capazes de degradar a
celulose natural (AGUIAR FILHO, 2008).
Os fungos degradadores de madeira são classificados em fungos de degradação branca,
degradação marrom e degradação branda ou macia, de acordo com a morfologia da degradação.
Esses fungos degradadores são taxonomicamente variados e pertence à divisão Basidiomycotina
(MELO 2008 apud AGUIAR FILHO, 2008).
O estudo das celulases começou no pós-guerra com objetivo estratégico de bioconverter
materiais lignocelulósicos em combustíveis. Desde então, foi isolada uma espécie com alta
capacidade celulolítica que se converteu no organismo modelo para esse tipo de estudo:
Trichoderma reesei (REESE, 1976 apud GALVAGNO e FORCHIASSIN, 2004).
O Trichoderma reesei tem atraído grande interesse por ter facilidade na degradação do
material celulósico, ou seja, este fungo consegue liberar enzimas capazes de degradar o bagaço
de cana e outras plantas que constituem fibras, o principal interesse é que ele ataque a celulose.
No Brasil, onde há condição privilegiada de custo baixo de matéria-prima existem grandes
 24

chances de viabilizar a hidrólise em escala comercial. Os açúcares resultantes são matérias-

primas adequadas, não só para produção de etanol, mas para uma grande variedade de produtos.
Também se busca valorizar a lignina residual, através do desenvolvimento de seus derivados
(CARDOSO, 2008).
As celulases são enzimas que constituem um complexo capaz de atuar sobre materiais
celulósicos, promovendo sua hidrólise.
A velocidade da decomposição dos lignocelulósicos na natureza é bastante variável
dependendo das condições de umidade e temperatura nas quais são expostos, numa
biodiversidade fúngica existente no local. Assim, a decomposição completa de um fragmento de
material lignocelulósico pode demandar meses ou vários anos. Em condições frias e secas os
lignocelulósicos podem permanecer décadas antes de ser decompostos (FERRAZ, 2004).
Sistemas completos de celulases são produzidos por vários microrganismos, como os
fungos Penicillium, Aspergillus, e outros.

3.8 Fermentação do hidrolisado para obtenção do bioetanol

A fermentação ocorre diretamente em substâncias açucaradas como o caldo de cana, suco

de frutas e de beterraba açucareira, e indiretamente em substâncias amiláceas como o milho,
trigo, arroz e batatas e substâncias celulósicas como madeira e papel para obtenção de diferentes
compostos inclusive o etanol.
A utilização de hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar como substrato para
fermentação é uma opção natural para aumentar a produção de etanol nas destilarias
(CETENE,2011).
Nesta etapa o hidrolisado proveniente do pré-tratamento ácido, rico em açúcares, é
fermentado pela levedura Sacharomyces cerevisae. As leveduras são formadas por carboidratos,
que funcionam como material energético, de estrutura e de reserva, por lipídios com função
estrutural, proteínas com funções estruturais e principalmente catalíticas, sendo a hidrólise da
molécula de sacarose em uma molécula de glicose e frutose a mais importante. Essas proteínas
com ação catalítica são denominadas enzimas, e no processo fermentativo é a invertase, que
realiza a hidrólise da sacarose (AMORIM e OLIVEIRA, 1982).
 25

O hidrolisado sofre a ação das leveduras, com a transformação dos açúcares em etanol,
CO2 e outros sub-produtos em menores quantidades; duas opções básicas de processo são
consideradas para a fermentação do hidrolisado da celulose contida no material lignocelulósico; a
primeira alternativa considera a fermentação realizada após o término da etapa de hidrólise,
permitindo que o processo de produção de álcool a partir do material lignocelulósico seja
acoplado completamente à planta convencional, com o hidrolisado sendo misturado ao caldo de
cana alimentado à dorna de fermentação; a segunda alternativa para a conversão de celulose a
etanol é a realização do processo de sacarificação e fermentação de forma simultânea (SSF), num
único reator, levando teoricamente, a maiores velocidades, maiores rendimentos e mais elevadas
concentrações de produto, principalmente devido à redução do efeito de inibidores no processo,
com a desvantagem de se trabalhar com um controle rígido de temperatura, pH, entre outros
fatores durante as operações de hidrólise e fermentação (APTA, 2011).
O hidrolisado da hemicelulose contida no material lignocelulósico, rico em pentoses,
também pode ser convertido a etanol empregando microrganismos capazes de realizar esta
transformação, ou manipulados geneticamente para esta finalidade (APTA, 2011). Ele passa por
um processo de sacarificação por meio de enzimas e é fermentado pela levedura Sacharomyces
cerevisiae. Na etapa final, ambos os líquidos provenientes das diferentes fermentações são
destilados. O produto desta destilação é o etanol, que possui as mesmas características daquele
fabricado a partir da cana em processo industrial (BIODIESELBR, 2010).
A Petrobras ainda estuda enzimas mais eficazes para este processo de fabricação, testando
enzimas disponíveis no mercado e pesquisando novos preparados enzimáticos (BIODIESELBR,
2010). Para Baudel (2007) o grande desafio da produção economicamente viável de bioetanol a
partir de uma biomassa lignocelulósica consiste em determinar a melhor opção de disponibilizar a
glicose a partir da hidrólise da celulose em termos de custo global, rendimento glicosídico e
fermentabilidade do hidrolisado.
 26

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Bagaço de cana-de-açúcar

Neste estudo foi utilizado bagaço de cana-de-açúcar proveniente da Usina Ipiranga de

Açúcar e Álcool Ltda., Descalvado - SP. O material foi armazenado sob refrigeração a 15ºC até o
consumo total e peneirado em peneiras de malha 1,19 mm.

4.2 Microrganismos

Os fungos basidiomicetos: Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei Rut-30 ,

Trichoderma harzianum 3844, Aspergillus niger IZ-9 e Agaricus bisporus (G4) foram mantidas
em meio MEA (extrato de levedura - 2g/L; extrato de malte – 20g/L e ágar – 20g/L) ou BDA
(Filtrado de 200g de batata cozida em água, 15g de glicose e 15g de ágar, para 1L de meio). Os
meios após esterilização em autoclave a 121ºC, 1 atm por 20 min foram inoculados e incubados a
28ºC, e mantidas durante 7 dias a 5ºC até o uso.

4.3 Hidrólise do bagaço

No presente experimento utilizou quatro métodos de hidrólise do bagaço da cana-de-

açúcar: o tratamento controle, tratamento ácido, tratamento biológico e tratamento biológico com
dois fungos simultâneos. Segue os procedimentos realizados.

Tratamento controle (TC): Cinco gramas de bagaço de cana peneirado e umedecido com
25 mL H2O foram autoclavados a 121ºC, 1 atm por 20 min. Após resfriamento à temperatura
ambiente, foi adicionado 25 mL de H2O em cada frasco e realizada a filtração em papel de filtro,
para a remoção dos compostos hidrolisados. A concentração de açúcares redutores (AR) e o pH
foram determinados.
Tratamento ácido (TA). Cinco gramas de bagaço de cana peneirado foram submetidos à
pré-tratamento ácido, utilizando 25 mL de ácido sulfúrico (H2SO4 2%, v/v) e autoclavados a
121ºC, 1 atm por 20 min. Após o resfriamento o material foi neutralizado com adição de 8 mL de
solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH, 2N, M= 40g). Para a remoção dos compostos
 27

hidrolisados, foram adicionados 25 mL de H2O, realizada a filtração em papel de filtro, e análise

dos açúcares redutores e pH.
Tratamento biológico (TB). Os fungos Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma
reesei Rut-30, Trichoderma harzianum 3844, Agaricus bisporus (G4) e Aspergillus niger (IZ-9)
foram inoculados em bagaço tratado como o controle e como o tratamento ácido e incubados a
28ºC em incubadora tipo BOD. Após diferentes tempos de incubação o hidrolisado foi obtido
adicionando 25 mL de H2O ao frasco e filtrando em papel. Em alguns experimentos após adição
de 25 mL de H2O o material foi transferido para câmara de, um equipamento como um
destilador, onde por prensagem ocorre a obtenção do hidrolisado.
Tratamento utilizando dois fungos simultaneamente (TB2). Amostras de bagaço
preparadas como em controle e pré-tratamento ácido, conforme descrito acima, após
neutralização, o bagaço foi inoculado com um “plug” de P. chrysosporium e mantido a 28ºC em
incubadora (BOD) por 4 dias, suficiente para o desenvolvimento do fungo. Após este período, foi
inoculado nos frascos um “plug” de Trichoderma reesei Rut 30 e mantido a 28ºC em incubadora
(BOD). Em diferentes tempos de incubação foram obtidos os hidrolisados, conforme descrito
acima e realizadas as análises de AR e pH.

4.4 Fermentação do hidrolisado

Os ensaios de fermentação foram realizados com hidrolisados obtidos após tratamento

ácido do bagaço e neutralização. Para isto, os hidrolisados foram concentrados por aquecimento
direto em chama, obtendo-se o mosto de fermentação, com 14,8º Brix.
O primeiro ensaio foi analisado por determinação da perda de peso, já que ocorre
formação de CO2 na fermentação, que pode ser acompanhado por pesagem dos frascos em
balança analítica. As amostras contendo 12,5 mL de mosto e 0,25 g de fermento, Saccharomyces
cerevisiae Y – 904, foram pesadas antes e após incubação a 32ºC por 24 horas.
O segundo ensaio de fermentação foi realizado transferindo 60 mL de mosto resfriado
para Erlenmeyer (250 mL) e adicionando 1,2 g de fermento, S. cerevisiae Y-904. As amostras,
em triplicata, foram incubadas a 32ºC em estufa por 24 horas. Os Erlenmeyers foram pesados no
início e no final do experimento. Análises de ART, AR e viabilidade celular foram realizadas no
 28

início e final da fermentação, enquanto a concentração células de levedura foi obtida apenas no
vinho (final da fermentação).
O terceiro ensaio de fermentação foi realizado transferindo 80 mL de mosto resfriado para
Erlenmeyer (250 mL) e adicionando 1,6 g de fermento, S. cerevisiae Y-904. As amostras, em
triplicata, foram incubadas a 32ºC em estufa por 24 horas. Os erlenmeyers foram pesados no
início e no final do experimento. Análises de ART e AR foram realizados no início e final da
fermentação, enquanto a concentração células de levedura foi obtida apenas no vinho (final da
fermentação). A viabilidade celular foi acompanhada durante o período.

4.5 Análises físico-químicas e microbiológicas

A concentração de açúcares (AR) foi determinada pelo método do ácido

3,5 dinitrossalicílico (DNS) (MILLER, 1959), no qual alíquotas de 0,5 mL das amostras foram
transferidas para tubos de ensaio contendo 0,5 mL da solução do reagente DNS. Após
aquecimento em banho-maria em temperatura de ebulição por 5 minutos e posterior resfriamento
em água corrente foi adicionado 5 mL de água destilada a cada amostra. A leitura de absorbância
a 540 nm de cada amostra foi efetuada em espectrofotômetro digital FEMTO 700S. O branco da
reação, utilizado para calibrar o aparelho, foi obtido utilizando somente 0,5 mL água destilada.
A absorbância observada foi correlacionada em concentração de açúcar redutor (AR)
utilizando uma curva padrão de glicose, obtida a partir de uma solução estoque contendo 1,0 g de
glicose em 1000 mL de água destilada e convenientemente diluída. As amostras seguiram o
mesmo procedimento descrito acima. A equação da reta obtida no gráfico correlaciona os valores
de concentração de glicose com a respectiva absorbância.
O método do ácido dinitrossalicílico (DNS) é dos mais empregados. Este reagente é
composto de ácido dinitrossalicílico, sais de Rochele, fenóis, bissulfito de sódio e hidróxido de
sódio. O ácido DNS foi muito discutida durante vários anos. O ácido 3,5 dinitrossalicílico é
reduzido para ácido 3- amino-5 nitrosálico, um produto de coloração laranja, enquanto o grupo
aldeído dos açúcares redutores são oxidados para grupos carboxílicos(MILLER, 1959), conforme
mostra a Figura 4.
 29

FIGURA 4. Reação do DNS com o açúcar redutor (MILAGRES, 1994).

4.6 Análise dos Açúcares por HPAEC-PAC

As amostras foram submetidas à quantificação do conteúdo de monossacarídeos via

HPAEC-PAC – (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed
Amperometric Detection), ajustando o equipamento de acordo com Bragatto (2007).
As curvas de concentração para cada monossacarídeo foram construídas de acordo com o
perfil cromatográfico das amostras com os referidos padrões: D-Fucose, D-Arabinose, D-
Galactose, D-Glicose, D-Xilose, todos da Sigma®. As quantificações foram realizadas com o
auxílio do equipamento ICS 2500, HPLC Dionex® equipado com DS50 gradiente; detector
amperométrico ED50 com eletrodo de ouro e um amostrador automático AS50. O eluente de
arraste utilizado foi 4 mM de NaOH e o eluente de limpeza foi de 200 mM de NaOH, com fluxo
de 1 mL.min-1, pressão no sistema de aproximadamente 1500 psi. As amostras forma injetadas
com volume de 25 µL determinado pelo loop de amostragem. A coluna utilizada foi a de troca
aniônica Dionex® CarboPac PA1 (4 x 250 mm) com coluna-guarda CarboPac PA1 (4 x 50 mm).

4.7 Concentração de açucares redutores totais (ART)

A concentração de açúcares redutores totais (ART) foi obtida após inversão ácida da
sacarose. Para isto, 5 mL da amostra foi transferida para balão volumétrico de 100 mL,
adicionando-se 25 mL de ácido clorídrico HCl 1,3N. Após 30 minutos em banho a 60-65 ºC, os
balões foram resfriados em água corrente, até atingir a temperatura ambiente. As amostras foram
 30

neutralizadas com solução de NaOH 4N, utilizando como indicador papel Tornassol. Depois de
completar o volume do balão com água destilada e homogeneização do mesmo, as amostras
foram convenientemente diluídas de modo a situar a concentração de redutores totais no intervalo
linear da curva padrão do método adotado.

A curva padrão foi obtida toda vez que o regente de DNS foi preparado, uma das curvas
utilizadas está apresentada no Gráfico 1.

Gráfico 1. Curva padrão de glicose, obtida pelo método do DNS

4.8 Biomassa

A biomassa foi determinada por turbidimetria pela relação da absorbância da massa seca
de levedura presente em solução, em 610 nm. Para medir a concentração de células, uma alíquota
do mosto inoculado foi diluída e efetuada a leitura de absorbância a 610 nm. A curva padrão foi
obtida correlacionando uma concentração conhecida de células e a absorbância a 610nm.

4.9 Viabilidade das células de levedura

A viabilidade das células de levedura foi determinada através da coloração diferencial das
células pela solução de azul de metileno (10µL de caldo fermentado e 90 µL de solução de azul
 31

de metileno). A contagem das células foi realizada por microscopia ótica utilizando câmara de
Neubauer espelhada em microscópio OLYMPUS, modelo BH, em aumento de 400x, de acordo
com a metodologia descrita por Oliveira et al. (1996). Foram consideradas células viáveis aquelas
que se apresentavam incolores, enquanto que as não viáveis apresentavam cor azulada.
Os resultados foram expressos em porcentagem, sendo que a viabilidade representa a
relação entre células viáveis e o total de células de levedura, seguindo a relação:

Viabilidade celular no células vivas (CV) x 100

=
(% células vivas) no células contadas

4.10 Umidade de bagaço

Para a análise de umidade o bagaço de cana-de-açúcar foi umedecido com água destilada,
na proporção 1:5, foi autoclavado a 121ºC e 1 atm por 20 minutos. Após resfriamento do
material, uma amostra foi transferida para os cestos da estufa Spencer e submetido a aquecimento
a 105ºC por 60 min. Após resfriamento os cestos foram pesados novamente até peso constante.
As análises foram realizadas em duplicata, para os tempos iniciais, 5 e 10 dias. A diferença de
peso foi transformada em umidade pela fórmula:

U = (Pi – Pf) x 2
 32

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Liberação de açúcar redutor de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

O bagaço de cana foi submetido à pré-tratamento com água ou ácido sulfúrico e
aquecimento. Os resultados mostram que o pré-tratamento ácido aumenta a quantidade de açúcar
redutor obtido no hidrolisado (Figura 5).

20

18

16

14
[AR] (mg/mL)

12

10

0
H2O H2SO4

FIGURA 5. Açúcares redutores liberados após pré-tratamento do bagaço de cana

5.2 Tratamento biológico do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

Os fungos T. reesei Rut-30, T. harzianum 3844 e P. chrysosporium foram cultivados em

bagaço de cana pré-tratado com água ou ácido. Antes da inoculação o bagaço foi lavado e
neutralizado. Após 5 e 10 dias foi obtido o hidrolisado para cada frasco. Os resultados mostram
que os fungos cresceram pouco e ocorreu pequena liberação de açúcar (Figura 6). Como o bagaço
hidrolisado foi lavado, ocorrendo à retirada dos açúcares, os fungos tiveram que hidrolisar o
bagaço para o seu crescimento. Neste caso, os valores de açúcar liberado foram inferiores ao
observado em outros trabalhos. Viégas et al (2009), trabalhando com T. reesei, obteveram uma
atividade enzimática de 0,56 FPU/mL, quantidade suficiente para quebrar as moléculas de
celulose, obtendo 20,40 mg de AR/100g de bagaço.
 33

Diversos estudos demonstraram o potencial das linhagens Trichoderma na produção de

celulases. O fungo Trichoderma harzianum liberou 1,64U, quando cultivado em meio de farelo
de trigo a 25ºC por 4 dias (RUEGGER, TAUK-TORNISIELO, 2004). As linhagens Trichoderma
degradam a celulose, e degrada outros compostos facilitando o seu trabalho, e consegue liberar a
enzima celulase.

2,0
A
1,5

1,0

0,5

0,0
Açúcar redutor (g/L)

2,0 B

1,5

1,0

0,5

0,0

2,0 C
1,5

1,0

0,5

0,0

0 5 10
tempo de incubação (dias)

FIGURA 6. Açucares redutores liberado após cultivo dos fungos (A); T. reseei Rut 30 (B); T.
harzianum 3844 e C) P. chrysosporium cultivados em bagaço de cana pré-tratado com H2O ( ) ou
H2SO4 0,5% ().

O fungo P. chrysosporium produz peroxidades que degradam a lignina. Essas enzimas

possuem potencial para aplicações biotecnológicas e para bioconversão de celulose a glicose
(FERRAZ, 2004). Estudando fungos lignocelulósicos para obtenção de açúcares fermentescíveis,
Viégas et al (2009), observaram que este fungo produziu 162,34 mg AR/g de bagaço. Os valores
obtidos de 10 dias de 1,51 a 1,72g AR/mL de açúcares redutores houve a degradação da lignina e
consequentemente da celulose. Nesta fase a liberação de açúcar redutor quantificados em relação
 34

da fonte acima mostra uma quantidade favorável para hidrolisar e obter o etanol da biomassa,
mas este fungo P. chrysosporium ajuda a degradar a lignina favorecendo um meio adequado para
conseguir a celulose.

5.3 Açúcares Redutores Liberados no Hidrolisado do Bagaço de Cana-de-açúcar

O ácido sulfúrico libera diferentes quantidades de açúcares redutores, dependendo da

concentração utilizada. A presença de 0,1% de H2SO4 afeta o pH do meio enquanto 2% é o que
libera maior quantidade de açúcar redutor, dentre as concentrações estudadas, conforme
apresentado na Figura 7. Nas concentrações de ácido variando de 0,1 a 2,0% foram observados
liberação de 1,66 a 13,75 em mg de AR por mL de hidrolisado. O pH das amostras permaneceu
entre 4,03 e 1,33. O bagaço sem pré-tratamento ácido (controle) apresentou concentração de AR
de 0,778 mg/mL e pH próximo a 6,0.

13,75

12,13
5
10,50

8,875

7,250
4
5,625

4,000
pH

3 2,375

0,7500

0,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
[H2SO4] (%)
FIGURA 7. Açúcares redutores liberados durante pré-tratamento do bagaço de cana pelo método DNS.

A xilose foi o açúcar predominante no hidrolisado liberado pelo pré-tratamento ácido. A

concentração deste açúcar variou de 0,047g/L a 9,421g/L, quando a concentração do ácido
permaneceu entre 0,1 a 2,0%, respectivamente. O tratamento controle apresentou 0,001g de
 35

xilose/L como apresentado na Figura 8. Estes resultados mostram ainda que as perdas de glicose
durante o pré-tratamento ácido são muito pequenas.

12
Xilose
Glicose
10

concentração de açúcar (g/L)

8

0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
[H2SO4] (%)

FIGURA 8. Concentração de açúcares, obtido por HPAEC-PAC, após pré-tratamento ácido do

bagaço de cana.

Em pesquisas visando a produção de xilitol, Alves et al. (1998) obteveram 15,7g de

xilose/L, utilizando bagaço de cana pré-tratado com H2SO4. A predominância de xilose em
relação a outros açúcares comumente encontrados nos hidrolisados hemicelulósicos, em
particular a glicose, é uma característica indesejável para a bioconversão de glicose a etanol. A
presença de pentoses pode inibir o metabolismo de glicose pelas leveduras, sendo esta inibição
dependente da concentração dessa pentose no meio de fermentação (LEE E MCCASKEY, 1983).

5.4 Hidrólise Total do Bagaço de cana-de-açúcar

Conforme apresentado na Figura 9, a quantidade de glicose liberada é diretamente

proporcional a concentração de ácido utilizada no pré-tratamento, enquanto a xilose é
inversamente proporcional.
 36

70

60

concentração de açúcar (mg/g)

50

40 Glicose
Xilose
30

20

10

0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
[H2SO4] (%)

FIGURA 9. Concentração de açúcares, obtido por HPAEC-PAC, do bagaço de cana submetido à hidrólise
total.
A hidrólise total da amostra controle (sem pré-tratamento), obtidos por HPAEC-PAC,
apresentou 52,30 mg de glicose/g e 26,71 mg de xilose/g. A amostra com melhor desempenho,
comparada ao tratamento controle, foi de pré-tratamento com H2SO4 2%, com 68,90 mg de
glicose/g e 10,31mg de xilose/g. No entanto, a hidrólise parcial, com concentrações de ácido
variando de 0 – 2 % liberou uma quantidade muito pequena de glicose comparado ao potencial
que o bagaço possuía. Houve maior variação na liberação de xilose comparada à glicose liberada.
O pré-tratamento com H2SO4 2% liberou 91,38% de xilose e apenas 1,18% de glicose.
O resultado da análise dos hidrolisados totais e parciais está apresentado na Tabela 1.
Houve uma liberação de açúcar tanto parcial como total, comparado com outras fontes, deu para
verificar que os dados obtidos de 2% conseguiu uma pequena quantidade de glicose e um
aumento de xilose, o que impactou com os valores obtidos acima, onde se pretende obter uma
hidrolise total da matéria seca.

Tabela 1.Comparação do bagaço submetido à hidrólise total e parcial.

[GLICOSE] [XILOSE]

[H2SO4] (%) Hid. Tot .(mg/g) Hid. Parc. (g/L) Hid. Tot .(mg/g) Hid. Parc. (g/L)
0 52,30 0,002 26,71 0,001
0,1 54,36 0,082 25,17 0,047
0,26 58,16 0,092 18,78 1,477
0,65 64,54 0,197 12,95 6,789
1,04 67,28 0,452 11,97 7,619
1,2 67,69 0,478 9,32 8,271
2 68,90 0,818 10,31 9,421
 37

Em estudos usando bagaço pré-tratado com H2SO4 (0,26% a 1,2%) e hidrolisado por
Trichoderma reesei, Machado (2009) obteve concentrações de glicose e xilose variando de
0,0332 – 0,5297g/L e 0,4174 – 9,4259 g/L, respectivamente.
Viégas et al. (2009) obteve 13,97 mg de AR/mL de hidrolisado obtido do bagaço pré-
tratado com ácido a 5%. Uma concentração de ácido alta, como 5%, associada a um tempo longo
pode ter degradado não só a hemicelulose e a lignina, mas também os açúcares resultantes da
degradação desses polímeros.

5.5 Análise da umidade do bagaço durante incubação a 30ºC

O bagaço de cana, tratado como controle (TC), foi analisado após 0, 5 e 10 dias de
incubação a 30ºC em incubadora BOD, para verificar se tinha perda de umidade durante o
processo. As análises apresentaram valores de 21,0; 19,8 e 18,6% respectivamente, indicando não
haver diferença de umidade entre as amostras incubadas a 30ºC.

5.6 Liberação de açúcar redutor de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

O bagaço de cana foi submetido à pré-tratamento com água ou ácido sulfúrico e

aquecimento. Os resultados mostram que o pré-tratamento ácido aumenta a quantidade de açúcar
redutor liberado e diminui substancialmente os valores de pH (Figura 10)
Segundo Machado (2009) o bagaço de cana pré-tratado por H2SO4 0,5% sem o cultivo
com fungo liberou 13,4 g/L de AR, enquanto neste experimento o bagaço (TA) liberou 11,2 g/L,
com ácido sulfúrico 2% e bagaço proveniente de outra Usina.
A liberação de açúcar em 2% foi de 11, 2 g/L comparado com a fonte citada acima,
poderia liberar mais a glicose, mas existe uma interferência de outros compostos indesejáveis, e
também todos tipos de carboidratos, sendo difícil de separá-los e conseguir somente a celulose.
Existem estudos que buscam uma forma de estar fazendo essa separação, o que interessa para os
pesquisadores é a celulose para obtenção do etanol.
 38

16

14 5

12
4

10

AR (g/L)
3

pH
8

6
2

1
2

0 0
TC TA TC TA

FIGURA 10. Açúcares redutores liberados e valores de pH após pré-tratamento do bagaço de cana

5.7 Tratamento biológico do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado

Os fungos T. reesei Rut-30, P. chrysosporium, Agaricus bisporus (G4) ou Aspergillus

niger (IZ-9) foram cultivados em bagaço de cana pré-tratado com água ou ácido. Antes da
inoculação o bagaço foi lavado e neutralizado. Após 0, 5, 10 e 15 dias foram obtidos os
hidrolisados para cada frasco. Os resultados mostram que os fungos consumiram os carboidratos
do hidrolisado (Figura 11).
Os resultados obtidos na determinação das concentrações de açúcar, apresentados nas
Figuras 10 e 11, indicam que praticamente todo o substrato foi consumido pelos fungos. E foram
analisados as concentrações de açucares resultantes, após 5 dias de cultivo Agaricus bisporus
(G4) em bagaço foi liberado 8,423± 0,998 e Aspergillus niger (IZ-9), 10,293±1750 neste caso os
fungos consumiram e liberam muito pouco açúcar relacionados com outros trabalhos. Esperava
um valor alto de açúcar redutor liberado pelos fungos, mas o que influenciou o pH e a
neutralização de NaOH. O tratamento água e ácido um meio de adequar um meio satisfatório
para o fungo se desenvolver e liberar as enzimas.
 39

12 pH AR 12

10 10

AR liberado (g/L)
8 8

pH
2 2

0 0
TBC G4 Asp
Figura 11. Açúcares redutores liberados e valores de pH após cultivo do bagaço de cana pré-tratado por
Aspergillus niger IZ-9 (Asp) e Agaricus bisporus (G4) a 28°C.

5.8 Tratamento biológico com dois fungos simultaneamente

Para analisar o comportamento de incubação de dois fungos simultaneamente, P.

chrysosporium, que degrada preferencialmente a lignina, foi inoculado em bagaço pré-tratado
com ácido, após quatro dias de incubação foi introduzido um plug do fungo T. reesei Rut-30, que
degrada preferencialmente a celulose, e em diferentes tempos de incubação foram realizadas as
análises. O tempo inicial, dos resultados apresentados a seguir, corresponde ao tempo após
inoculação do T. reesei Rut-30. Como este experimento utiliza microrganismos, os valores
encontrados são diferentes não cabendo obter média dos mesmos.
O fungo P. chrysosporium se desenvolveu muito bem em bagaço tratamento controle
(TC) e tratamento ácido (TA). Como os fungos possuem coloração diferente, branco (P.
chrysosporium) e verde (T. reesei Rut-30), foi possível também observar o crescimento do T.
reesei Rut-30.
Análise dos resultados (Figura 12) mostra que os fungos P. chrysosporium e T. reesei
Rut-30 se beneficiaram dos carboidratos liberados pelo pré-tratamento, tendo sido liberados
aproximadamente 35g AR/L, no tempo inicial, o que corresponde ao tratamento com ácido. A
partir deste tempo ocorreu diminuição da concentração de AR, e como visualmente houve
crescimento dos fungos, pode-se dizer que os mesmos estão consumindo boa parte dos açúcares.
Para que este tratamento seja eficiente é necessário um sistema que possa retirar os açucares em 5
dias (MACHADO, 2009).
 40

35

30

25

Açúcar redutor (g/L)

20

15
TC1 TC2
10 TA1 TA2

0
7

4
pH

1 TC1 TA1
TC2 TA2
0
0 5 10 15
tempo de incubação (dias)

FIGURA 12. Açúcares redutores liberados e valores de pH após cultivo simultâneo do bagaço de cana,
pré-tratado com ácido, por fungo P. chrysosporium e T. reesei Rut-30.

O pH do meio de cultura é fundamental para proporcionar um bom crescimento

microbiano. Embora o fungo P. chrysosporium requeira um pH próximo a 4, o meio contendo
bagaço pré-tratado foi neutralizado para pH 5, e após 5 dias de cultivo, o pH diminuiu para 2. No
entanto, percebe-se que os fungos que foram incubados simultaneamente tiveram um bom
desenvolvimento, porém o meio estava condizente a ele, então houve pouca liberação de açúcares
redutores. No tratamento controle foram 3,0 g/ L de açucares redutores liberados, porém um
indicativo para perceber que os fungos consumiram e liberam poucos açúcares.
Neste caso, os valores de açúcares liberados foram inferiores ao observado em outros
trabalhos. Como as concentrações de açúcares no hidrolisado tratado e não tratado foram
determinadas por métodos diferentes, para comparar os dois resultados foi necessário somar as
concentrações dos açúcares (xilose, arabinose e glicose) obtidos na analise do hidrolisado tratado,
sendo o resultado igual a 28,83 g/L (SILVA e PRATA, 2005).
 41

5.9 Fermentação do hidrolisado

Os hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar obtidos por pré-tratamento ácido, após

concentração e autoclavagem, foram submetidos à fermentação por Saccharomyces cerevisiae Y-
904. As análises foram realizadas quanto à concentração de açúcares redutores (AR e ART), a
viabilidade celular e produção de etanol.
Os dois primeiros ensaios foram analisados por determinação da perda de peso, já que
ocorre formação de CO2 na fermentação, que pode ser acompanhado por pesagem dos frascos.
Após 24h ocorreu uma perda de peso de 0,2 ± 0,05 g, no ensaio 1 e 0,38 ± 0,125 g, no ensaio 2.
No terceiro ensaio de fermentação a perda de peso aumentou para 1,91 ± 0,15 g, no
entanto, as análises de teor alcoólico não evidenciaram a produção de etanol. A viabilidade
celular analisada após 2h de fermentação mostrou uma redução de aproximadamente 50%. O
furfural encontrado no hidrolisado concentrado não foi quantificado em valor, pois queria saber o
porquê que a levedura Y-904 não estava consumindo os açúcares e sim morrendo após duas horas
de inóculo, e então realizou a análise da viabilidades da levedura.

5.10 Formação de outros compostos

O pré-tratamento do bagaço por hidrólise com ácido (H2SO4 2%) é um método rápido e
simples, entretanto o processo pode gerar além dos açúcares redutores, outros subprodutos como
furfural, 5-hidroximetilfurfural e ácido acético. Esses compostos são formados a partir da
desidratação da pentose como a xilose e de hexoses como a glicose (BARBOSA et al., 2005).
Com isso são gerados dois tipos de açucares: pentoses e hexoses.
A presença de compostos como o furfural pode interferir negativamente na fermentação
do hidrolisado. Isto pode estar ocorrendo nos ensaios realizados com o hidrolisado concentrado,
pois durante concentração de 5 para 14,8ºBrix, provavelmente ocorreu concentração destes
compostos interferentes
 42

6. CONCLUSÃO

O bagaço de cana-de-açúcar e outros compostos lignocelulósicos podem ser utilizados

como matéria-prima para obtenção de diversos produtos, com uma perspectiva bastante
promissora para produção de etanol em larga escala a um custo competitivo.
Os fungos T. reesei Rut-30, T. harzianum 3844 e P. chrysosporium quando cultivados em
bagaço de cana pré-tratado ácido e lavado, não apresentaram crescimento satisfatório e
consequente liberação de açúcares redutores. Portanto, não adianta lavar o bagaço após pré-
tratamento ácido se o bagaço vai para a hidrólise biológica. É necessário estudar o
comportamento do fungo e adequar o meio ideal para que ocorra a degradação da celulose. O
tratamento controle é um parâmetro do tratamento ácido e o comportamento de crescimento dos
fungos no meio em um pH em torno de 6, observou o crescimento e a liberação de suas enzimas.
Alguns fungos se adaptam ao meio ligeiramente ácido, como Phanerochaete
chrysosporium, que cresce em pH 4,0. O Trichoderma reesei necessita de um meio ligeiramente
básico, com pH entre 5 e 6. O Phanerochaete chrysosporium seu pH estava em torno de 4,5 e o
Trichoderma reesei em torno de 5 e 6, um forma adequada para degradar o bagaço e liberar as
enzimas.
O processo deriva da fermentação de açucares de origem celulósica, frações de materiais
lignocelulósicos, através de um pré-tratamento adequado. A dificuldade do processo se deve a
liberação dos açucares fermentescíveis e a fermentabilidade dos hidrolisados, devido à presença
de inibidores da fermentação como o furfural, hidroximetilfurfural e ácido acético. Foi
encontrado furfural no hidrolisado concentrado e no hidrolisado sem concentrar não tinha restigio
de furfural um resíduo tóxico á levedura.
Comparado ao controle, o tratamento que apresentou melhores resultados foi o bagaço pré-
tratado com H2SO4 (2%), com 13,75 mg de AR/mL, determinado pelo método DNS. Através da
hidrólise total deste resíduo e com o auxilio de análise cromatográfica, foi observado um
potencial para obtenção de 68,902 mg de glicose/g e 10,314mg de xilose/g. No entanto, o pré-
tratamento ao qual o bagaço foi submetido resultou na liberação de 1,18% e 91,38% do seu
potencial de glicose e xilose, respectivamente.
 43

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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