Fermentacao

Universidade de Braslia
Instituto de Qumica
Fatores que Influenciam na

Fermentao Etanlica do Hidrolisado
de Eucalyptus urophylla
Sumara Teixeira Alves
Orientador: Prof. Dr. Brenno Amaro da Silveira Neto

Coorientadora: Dra. Slvia Belm Gonalves
Braslia, Maro de 2014
Universidade de Braslia
Programa de Ps-Graduao Em Qumica
Fatores que Influenciam na

Fermentao Etanlica do Hidrolisado
de Eucalyptus urophylla
Sumara Teixeira Alves

Dissertao apresentada ao
Programa de Ps-Graduao
em
Qumica
como
pr-
requisito para obteno do

ttulo de Mestre.
Braslia, Maro de 2014

ii
Dedicatria
Dedicatria
Dedico este trabalho primeiramente a Deus que me ama incondicionalmente.

E a todos que contriburam para sua realizao e concluso.
iii
Agradecimentos
Agradecimentos
Ao meu Senhor e Salvador, Jesus Cristo, por estar comigo em todos os momentos
que passei, tanto os difceis como os mais alegres, e por me orientar e me guiar em
todos os passos e decises. Obrigado Senhor.
A Universidade de Braslia, ao Instituto de Qumica e a Unidade Embrapa
Agroenergia, pela oportunidade de desenvolvimento deste trabalho.
A Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES),
pela concesso da bolsa de estudo.
Ao professor Dr. Brenno Amaro da Silveira Neto, pela orientao, por ter
acreditado em mim e pela oportunidade que me concedeu em ser coorientada pela
Dra. Slvia Belm Gonalves.
A Pesquisadora Dra. Slvia Belm Gonalves, pela dedicao, ateno,
carinho, correes, pelos ensinamentos que me passou e principalmente pela
amizade. Muito obrigada.
As analistas do laboratrio, Thlyta, Thais e Carolina, pela disposio em
ajudar sempre que foi preciso.
Aos meus pais, David e Alaydes, por terem me ensinado a andar no caminho
do Senhor e me proporcionado as melhores opes de ensino e condies de vida.
Ao meu marido e amigo, Andr, pela compreenso pela ausncia, pacincia,
carinho, pelo grande amor e por muitas vezes me escutar sem entender muita coisa.
As minhas queridas irms e irmo, e seus cnjuges, pelas oraes, fora,
apoio, incentivo e compreenso por muitas vezes estar ausente.
A minha querida amiga e discipuladora, Zenaide, pelo companheirismo, pelas
oraes, pelos jejuns, por me incentivar e nunca deixar desanimar e pelo amor de
me.
Aos queridos irmos em Cristo, da Clula, e da Igreja, pelas oraes, carinho,
preocupao, e por torcerem pelo meu sucesso.
A Gisele e Gabriella, amigas do Mestrado em Qumica, pela disposio em
ajuda sempre que tive necessidade, pela pacincia e incentivo.
A todos os meus amigos, que torceram por mim, pelo grande apoio e aqueles
que contriburam mesmo no sendo citados para o meu crescimento profissional e
pessoal.
iv
Sumrio
Sumrio
Dedicatria .................................................................................................................. iii
Agradecimentos ......................................................................................................... iv
Sumrio ........................................................................................................................ v
Resumo ..................................................................................................................... viii
Abstract ....................................................................................................................... ix
Lista de Abreviaes e Acrnimos ............................................................................ x
Lista de Figuras .......................................................................................................... xi
1-Introduo................................................................................................................. 1
1.1 Produo de Bioetanol de materiais lignocelulsicos ...................................................................... 3
1.2 A madeira ......................................................................................................................................... 4
1.3 Resduos gerados pelo uso da madeira .......................................................................................... 5
1.4 O material lignocelulsico ................................................................................................................ 5
1.4.1 Celulose..................................................................................................................................... 6
1.4.2 Hemicelulose ............................................................................................................................. 6
1.4.3 Lignina ....................................................................................................................................... 7
1.5 Produo de etanol a partir de materiais lignocelulsicos ............................................................... 8
1.5.1 Pr-tratamentos ......................................................................................................................... 9
1.5.2 Hidrlise................................................................................................................................... 11
1.5.2.1 Hidrlise enzimtica ......................................................................................................... 11
1.5.2.2 Hidrlise qumica .............................................................................................................. 12
1.5.3 Fermentao ........................................................................................................................... 13
1.5.3.1 O microrganismo da fermentao .................................................................................... 14
1.5.3.2 Os inibidores da fermentao .......................................................................................... 15
2 - Objetivos ............................................................................................................... 17
2.1. Objetivos Gerais ...................................................................................................................... 17
2.2 Objetivos Especficos ............................................................................................................... 17
3. Materiais e mtodos .............................................................................................. 18

v
Sumrio
3.1 Materiais ......................................................................................................................................... 18
3.1.1 Equipamentos.......................................................................................................................... 18
3.2 Mtodos .......................................................................................................................................... 19
3.2.1 Preparo da biomassa .............................................................................................................. 19
3.2.2 Pr-tratamento......................................................................................................................... 19
3.2.2.1 Pr-tratamento cido ........................................................................................................ 19
3.2.2.2 Pr-tratamento alcalino .................................................................................................... 19
3.2.3 Caracterizao da biomassa ................................................................................................... 20
3.2.4 Hidrlise enzimtica ................................................................................................................ 21
3.2.5 Fermentao ........................................................................................................................... 22
3.2.5.1 Preparo do meio de cultura .............................................................................................. 22
3.2.5.2 Tcnica de esgotamento .................................................................................................. 22
3.2.5.3.1 Curva padro ............................................................................................................. 23
3.2.5.4 Fermentao meio sinttico ............................................................................................. 25
3.2.5.5 Fermentao meio sinttico com inibidores ..................................................................... 25
3.2.5.6 Fermentao meio hidrolisado ......................................................................................... 26
3.2.5.7 Fermentao meio hidrolisado com suplementos............................................................ 26
3.2.6 Clculos dos parmetros de fermentao .............................................................................. 27
3.2.6.1 Taxa especfica mxima de crescimento (max) ............................................................... 27
3.2.6.2 Fator de converso de substrato em produto (YP/S)......................................................... 27
3.2.6.3 Fator de converso de substrato em clulas (YX/S).......................................................... 27
3.2.6.4 Eficincia de fermentao (E) .......................................................................................... 28
4 Resultados e Discusso ..................................................................................... 29

4.1 Caracterizao qumica das biomassas bruta e pr-tratadas ........................................................ 29
4.1.1 Caracterizao qumica da biomassa bruta ............................................................................ 29
4.1.2 Caracterizao qumica das biomassas pr-tratadas ............................................................. 30
4.2 Hidrlise enzimtica ....................................................................................................................... 31
4.3 Fermentao .................................................................................................................................. 32
4.3.1 Curva padro de levedura ....................................................................................................... 33
4.3.2 Crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae ............................................................ 34
4.3.2.1 Meio sinttico ................................................................................................................... 34
4.3.2.2. Meio hidrolisado .............................................................................................................. 35
4.3.2.3 Meio sinttico com inibidores ........................................................................................... 38
4.3.2.4 Meio hidrolisado suplementado ....................................................................................... 39
4.3.3 Consumo do substrato e a produo de etanol ...................................................................... 41
4.3.3.1 Meio sinttico ................................................................................................................... 41
4.3.3.2 Meio hidrolisado ............................................................................................................... 42
4.3.3.3 Meio sinttico com inibidores ........................................................................................... 43
vi
Sumrio
4.3.3.4 Meio hidrolisado suplementado ....................................................................................... 45
5 Concluses e Perspectivas ................................................................................ 47

Referncias ................................................................................................................ 49
vii
Resumo
Resumo
Na busca de novas tecnologias, muitas pesquisas esto sendo desenvolvidas visando
produo de energias mais limpas. Uma das fontes de energias renovveis mais
pesquisadas so os resduos de biomassas lignocelulsicas, como a madeira de
eucalipto, que fornecem materiais como celulose, hemicelulose e lignina, para a
produo de biocombustveis, como briquetes e etanol. A biomassa estudada foi o
eucalipto da espcie Eucalyptus urophylla. O processo de converso destes materiais
a etanol separado em trs etapas pr-tratamento hidrlise fermentao. O prtratamento foi realizado em duas etapas a primeira foi cida com 1,5 % de H2SO4 e a
segunda etapa foi alcalina com 4% de NaOH. Em seguida foi realizada a etapa de
hidrlise enzimtica. Na etapa de fermentao foi analisado o comportamento da
levedura Saccharomyces cerevisiae, que largamente utilizada no processo de
fermentao. O pr-tratamento tem o objetivo de disponibilizar a celulose presente na
biomassa e a hidrlise enzimtica de quebrar esta celulose em glicose. Durante os
procedimentos de pr-tratamento h a formao de compostos inibidores que podem
interferir na fermentao, sendo o rendimento do etanol comprometido. Estes
produtos so os derivados do furano, como o furfural e o 5-hidroximetilfurfural, os
cidos alifticos, como o cido actico, e os derivados fenlicos. O foco deste
trabalho avaliar a produo de etanol a partir da celulose resultante das etapas
citadas acima. Na fermentao do meio hidrolisado a levedura no se desenvolveu
completamente e a produo de etanol no foi eficiente. Com isso, foram analisados
diferentes meios de fermentao e foi constado que alm da presena de inibidores
no meio hidrolisado, h a falta de nutrientes para o crescimento do microrganismo,
pois a levedura obteve resultados opostos quando analisado o meio sinttico
contendo inibidores e o meio hidrolisado suplementado com sais minerais.
viii
Abstract
Abstract
In search of new technologies, many researches are being developed aiming at the
production of cleaner energy. One of the most researched sources of renewable
energy is waste from lignocellulosic biomass such as eucalyptus wood, providing
materials such as cellulose, hemicellulose and lignin for the production of biofuels
such as ethanol and briquettes. His biomass was studied eucalypt species Eucalyptus
urophylla. The process of conversion of these materials to ethanol is separated into
three phases pre-treatment Hydrolysis Fermentation. The pre-treatment was
performed in two stages with the first acid was 1.5% H2SO4 and the second stage was
alkaline with 4% NaOH. After the enzymatic hydrolysis step was carried out. In the
fermentation step was analyzed the behavior of the yeast Saccharomyces cerevisiae,
is widely used in the fermentation process. Pretreatment aims to provide this in
biomass and enzymatic hydrolysis of cellulose into glucose break this pulp. During the
following pre-treatment for the formation of inhibitory compounds that can interfere
with the fermentation, and the yield of ethanol compromised. These products are furan
derivatives such as furfural and 5-hydroxymethylfurfural, aliphatic acids such as acetic
acid and phenolic derivatives. The focus of this study is to evaluate the production of
ethanol from cellulose resulting from the steps mentioned above. In the fermentation of
yeast hydrolysate medium not fully developed and ethanol production was inefficient.
Thus, different fermentation media was analyzed and consisted that in addition to the
presence of inhibitors in the hydrolyzate environment, there is a lack of nutrients for
growth of the microorganism, as opposed to yeast results obtained when analyzing the
synthetic medium containing inhibitors and the hydrolyzate medium supplemented
mineral salts.
ix
Lista de Abreviaes e Acrnimos
Lista de Abreviaes e Acrnimos

Absorbncia
cido desoxirribonucleico
ABS
DNA
cido ribonucleico
RNA
Adenosina trifosfato
ATP
Agncia Internacional de Energia
AIE
Ammonia fiber expansion
AFEX
Cromatgrafo Lquido de Alta Eficincia
CLAE
Densidade tica
DO
Dixido de carbono
CO2
Eficincia de fermentao
Eucalyptus urophylla
EU
Extrato de levedura, Peptona bacteriolgica, Glicose
YPG
Fator de converso de substrato em clulas
YX/S
Fator de converso de substrato em produto
YP/S
Hidroximetilfurfural
HMF
Nicotinamida adenina dinucleotdeo
NAD+
Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae
Taxa especfica de crescimento celular
max
Filter Paper of Unit
FPU
Lista de Figuras
Lista de Figuras
Figura 1 - Representao esquemtica da molcula de celulose. (adaptada da ref. 2).
...................................................................................................................................... 6
Figura 2 - Representao esquemtica da hemicelulose. (adaptada de ref. 2)............ 7
Figura 3 - Representao esquemtica da lignina de eucalipto. (adaptada de ref. 2). . 8
Figura 4 - Alteraes estruturais do complexo celulose - hemicelulose - lignina
determinadas pelo pr-tratamento. (adaptada da ref. 2) ............................................... 9
Figura 5 - Hidrlise da celulose. (adaptada da ref. 33) ............................................... 11
Figura 6 - Imagem da levedura Saccharomyces cerevisiae.44 ................................... 15
Figura 7 - Hidrlise enzimtica aps 24 horas de incubao. .................................... 22
Figura 8 - Ilustrao da tcnica de esgotamento de cultura em placa de Petri com
meio slido.3.2.5.3 Dosagem de clulas ..................................................................... 23
Figura 9 - Fermentao do meio hidrolisado com suplemento e meio sinttico como
contraprova. ................................................................................................................ 26
Figura 10 - Amostras de eucalipto EU: (A) eucalipto em seu estado bruto; (B)
eucalipto aps pr-tratamento cido; (C) eucalipto aps pr-tratamento cido e
seguido do alcalino. ..................................................................................................... 31
Figura 11 - Equao da reta gerada pela curva padro. Sendo y a concentrao
desejada e ABS a absorbncia. .................................................................................. 33
Figura 12 - Crescimento da levedura em meio sinttico. ............................................ 35
Figura 13 - Crescimento da levedura no meio hidrolisado.......................................... 36
Figura 14 - Cromatograma do tempo final da fermentao do meio hidrolisado sem
diluio realizado no CLAE. ........................................................................................ 37
Figura 15 - Crescimento da levedura em meio sinttico na presena dos compostos
furfural e HMF. ............................................................................................................ 38
Figura 16 - Crescimento da levedura no meio hidrolisado suplementado com sais
inorgnicos. ................................................................................................................. 40
Figura 17 - Consumo de glicose e produo de etanol no meio sinttico. ................. 42
Figura 18 - Consumo de glicose e formao de etanol no meio hidrolisado. ............. 43
Figura 19 - Consumo de glicose e produo de etanol no meio sinttico na presena
de inibidores. ............................................................................................................... 44
xi
Lista de Figuras
Figura 20 - Consumo de glicose e produo de etanol no meio hidrolisado
suplementado. ............................................................................................................. 46
xii
Introduo
1-Introduo
As mudanas climticas e a elevao nos custos dos combustveis provenientes do
petrleo aliadas s estratgias de produo de energia tm motivado uma corrida no
desenvolvimento da produo de biocombustveis de fontes renovveis, sendo uma
das fontes a biomassa lignocelulsica.1
O grande desafio para a produo de biocombustveis, derivados de biomassas
lignocelulsicas, esta em escolher a melhor alternativa que disponibilize a glicose, a
partir da hidrlise da celulose, visando o rendimento e a fermentabilidade do
hidrolisado.1 Neste sentido, h um grande estmulo da sociedade cientfica em
estudar a matriz energtica. Um exemplo o desenvolvimento de novos processos
economicamente viveis para o aproveitamento de biomassas lignocelulsicas.2
O etanol vem sendo utilizado em larga escala no Brasil, contudo nos Estados
Unidos e em alguns pases da Europa tm sido utilizado fundamentalmente como
aditivos aos combustveis de origem fsseis, e considerado um dos biocombustveis
renovveis mais promissores no setor de transporte nos prximos 20 anos.1
A madeira a mais antiga fonte de energia que se tem conhecimento e desde
a antiguidade utilizada como combustvel. Como fonte energtica, a madeira
denominada lenha e foi a primeira fonte de energia usada pelo homem para a
obteno de fogo.3 Sendo um grande contribuinte para o desenvolvimento da
humanidade, a madeira passou a ser utilizada como combustvel slido, lquido e
gasoso, em processos para a gerao de energia trmica, mecnica e eltrica.4
O uso da madeira na indstria, tanto primrio como secundrio gera uma
grande quantidade de resduos. A quantidade de resduos de madeira gerada no meio
urbano (entulhos da construo civil, poda de rvores, embalagens, entre outros),
tambm considervel. So geradas no Brasil, anualmente, cerca de 30.603 de
toneladas de resduos de madeira. Porm, somente uma pequena parte destes
resduos tem algum aproveitamento econmico, social e/ou ambiental. 5
No Brasil, a lenha usada como fonte de energia ocupa o terceiro lugar. Ela
aproveitada de duas maneiras diferentes: (1) combusto direta, que o processo
mais antigo para a produo de calor domstico e industrial; e (2) pirlise, que o
processo da decomposio trmica da madeira na ausncia de ar. 6
Uma forma de aproveitamento do resduo da madeira o briquete, a lenha
1
Introduo
ecolgica ou serragem prensada, que feita pelo processo de densificao dos
resduos madeireiros, sendo muito utilizada na gerao de energia calorfica em
estufas, caldeiras, foges com alimentao automtica, nas indstrias, bem como na
manuteno do fogo em lareiras, grelhas e churrasqueiras, nas residncias, etc. 7
A converso de material lignocelulsico, como os resduos de madeira, em
acar fermentveis vem sendo considerada uma alternativa promissora para
aumentar a produo de etanol.8 A utilizao de materiais lignocelulsicos para
produzir etanol envolve quatro etapas: pr-tratamento, hidrlise enzimtica,
fermentao, e destilao.9
Existem vrios pr-tratamentos sendo estudados e analisados para a obteno
de etanol proveniente da biomassa lignocelulsica. Contudo, o foco deste trabalho foi
analisar o comportamento do microrganismo no processo fermentativo em diferentes
meios de fermentao. O meio que foi usado como padro foi o meio sinttico, um
meio rico para o desenvolvimento da levedura, e o meio analisado foi o hidrolisado do
resduo da madeira de Eucalyptus urophyllaI EU, fornecida pela unidade da
Embrapa Floresta foi cultivada na regio entre Ponta Por MS e Dourados MS,
localizada em Colombo, distrito de Curitiba - PR
Na etapa da fermentao a levedura mais usada a Saccharomyces
cerevisiae, e devido sua capacidade fermentativa usada na produo industrial de
cervejas, vinhos, aguardentes e outras bebidas fermentadas. o principal
microrganismo utilizado na produo de lcool combustvel. 10 Porm, sua atuao na
fermentao de hidrolisados derivados da biomassa lignocelulsica tem sido alterada
pela presena de inibidores, levando a baixos rendimentos.
Neste sentido, o presente trabalho foi dividido em trs etapas: a etapa do prtratamento, a etapa da hidrlise enzimtica e a etapa da fermentao. Na etapa da
fermentao foram analisados o desenvolvimento da levedura quanto ao seu
crescimento e seu desempenho em produzir etanol. Os meios fermentativos em que a
levedura foi analisada foram no sinttico, no hidrolisado, no sinttico na presena de
inibidores e no hidrolisado suplementado. O mesmo faz parte do Projeto da Embrapa
Agroenergia Fontes Alternativas de Biomassa para a Produo Sustentvel de
Etanol a partir de Materiais Lignocelulsicos tendo como foco a fermentao.
Introduo
1.1 Produo de Bioetanol de materiais lignocelulsicos

Com a expectativa da diminuio das reservas de petrleo, o custo elevado para sua
obteno e os problemas ambientais correlacionados a sua utilizao como principal
fonte de combustveis e outros produtos qumicos, tem levado busca incessante de,
de novas fontes energticas, em todo o planeta, como as fontes energticas
renovveis. Dessa forma, por motivos econmicos, geopolticos e ambientais, as
atenes do mundo se voltam para fontes alternativas de energia, em especial para o
etanol.11
H muitos anos o Brasil e os Estados Unidos tem desenvolvido estudos para
obteno do biocombustvel etanol da cana de acar e do amido do milho,
respectivamente, na tentativa de propor alternativas que levem a substituio de
combustveis fsseis devido ao aumento e a variao dos preos do petrleo.1
E devido aos problemas ambientais que os combustveis fsseis desencadeiam
e a crescente procura por fontes de energia de recursos renovveis as pesquisas tm
crescido em grande escala. Estas pesquisas tem o intuito de desenvolver mtodos
que viabilize a produo de bioetanol atravs da biomassa lignocelulsica proveniente
de resduos da agroindstria.11
Primeiramente importante definir biocombustvel: o combustvel elaborado a
partir da transformao de diferentes materiais orgnicos disponveis de uma maneira
renovvel, por exemplo: produtos agrcolas, produtos florestais, resduos agrcolas e
florestais, resduos industriais, algas e resduos animais, entre outros.12
Existem diferentes biocombustveis e estes podem ser obtidos de variadas
matrias-primas a partir de diferentes processos trmicos, qumicos e bioqumicos. Os
acares e os amidos (cana de acar, mandioca, milho, beterraba e trigo) utilizam
processos fermentativos e produzem etanol, butanol, etil, butil, ter, alm de outros
produtos. As biomassas (bagao de cana, madeira, resduos agrcolas e resduos de
fazendas) fazem uso de processos de gaseificao e de fermentao e podem
produzir biodiesel, etanol, butanol, metanol, dimetileter entre outros. J leos e
gorduras (vegetal, animal e residual) passam por processos de transesterificao para
a obteno do biodiesel (ster etlico e ster metlico).13
O etanol produzido com base na biomassa lignocelulsica utiliza processos
qumicos (empregando cidos) ou da biotecnologia moderna (empregando enzimas)
3
Introduo
para a quebra de molculas de celulose e produo de acares, aps este processo
h a produo de etanol por meio de processos fermentativos alcolicos da
biotecnologia convencional.14
1.2 A madeira
A madeira usada desde os primrdios para diferentes finalidades. Alm de ser uma
matria prima abundante a madeira uma fonte com grande poder de renovao e
sua utilizao esta cada vez mais presente no nosso dia a dia.
Sem dvida a madeira um material bem conhecido e utilizado em vrios
campos tecnolgicos. Uma das espcies que tem sido empregada em grande escala
o eucalipto, devido ao seu crescimento rpido e por suas timas caractersticas
fsicas e qumicas. Em razo da preocupao com o meio ambiente e o crescente uso
desta madeira, diversos estudos tem sido realizados. Dentre eles, destacam-se o
desenvolvimento do reflorestamento, a clonagem de espcies e as mudanas
genticas em algumas espcies, alm de outras pesquisas voltadas para a
caracterizao qumica e fsica da madeira e de seus produtos.15 Dessa forma, a
madeira hoje um dos mais importantes recursos renovveis disponvel para o
homem. Podendo ser usada para a fabricao de biocombustveis e de outros
materiais de manufaturamento.3
Contudo, ainda um desafio trabalhar com este material para a produo de
aucares/etanol, devido ao arranjo de seus componentes fsicos (macroscpicos,
microscpicos e ultramicroscpicos) e qumicos, pois proporcionam sua estrutura
lenhosa uma organizao bem definida.16
A composio qumica de uma madeira de determinada espcie pode variar
com as diferentes partes da rvore (razes, tronco, ramos e casca), bem como pelas
condies ambientais de crescimento (localizao geogrfica, clima, tipo de solo,
etc.). Contudo, so considerados, de uma maneira geral, dois grandes grupos de
componentes qumicos da madeira: os componentes estruturais e os componentes
no estruturais ou extrativos. O primeiro grupo composto pelas substncias
macromoleculares que so: a celulose, as hemiceluloses e a lignina. No segundo
grupo fazem parte as substncias de baixa massa molecular como os extrativos e
substncias minerais, vulgarmente chamadas de cinzas.17
4
Introduo
1.3 Resduos gerados pelo uso da madeira

Os resduos gerados em todo o mundo so recurso de grande potencial para a
obteno de energia sendo a biomassa uma das principais fontes promissoras que
podem gerar energia.
Neste sentido, os resduos florestais constituem parte importante na
disponibilidade da biomassa em alguns pases pelas grandes quantidades geradas na
colheita e na ao industrial. Essa fonte energtica est encontrando mercado, em
consequncia do desenvolvimento tecnolgico e dos baixos custos que representa
sua utilizao eficiente. Podemos citar, por exemplo, as indstrias madeireiras, como
as serrarias e mobilirio, que produzem resduos a partir do beneficiamento de toras.
Os tipos de resduo produzidos so casca, cavaco, costaneira, p de serra, maravalha
e aparas.18
1.4 O material lignocelulsico

A biomassa, uma forma indireta de energia solar, sendo convertida em energia
qumica. Essa energia qumica pode ser liberada diretamente por combusto, ou
convertida atravs de algum processo em outras fontes energticas como lcool e
carvo vegetal.19
Biomassa qualquer tipo de matria orgnica de origem vegetal ou animal que
dispe de bioenergia e que pode ser processada para fornecer formas bioenergticas
mais elaboradas e adequadas para o uso final.1
A Agncia Internacional de Energia (AIE) calcula que nos anos 2040 cerca de
30% do total da energia consumida pela humanidade ser proveniente das fontes
renovveis, que hoje representam 14% da energia produzida no mundo, sendo que a
biomassa tem 11,4% na participao da oferta.18
Biomassa lignocelulsica so materiais formados por estruturas cristalinas e
fibrosas, compostas principalmente de celulose e hemicelulose, entremeados por
outra macromolcula formada por lcoois aromticos, a lignina, aos quais se
encontram unidos por ligaes covalentes e de hidrognio.20
A composio qumica da biomassa lignocelulsica mais apropriada para
aplicao na produo de biocombustveis, geralmente contm 35-50% de celulose,
5
Introduo
seguido de 20-35% de hemicelulose, 10-25% de lignina e uma pequena quantidade
de cinzas e extrativos. Esta composio qumica varia em funo do tipo de
biomassa.1,2
1.4.1 Celulose
O principal componente da parede celular da fibra vegetal, a celulose, um polmero
natural de cadeira longa mais abundante em todo o mundo (Figura 1).8 Sua estrutura
forma-se pela unio de molculas de -D-glicose atravs de ligaes -1,4glicosdicas carbono-carbono, onde estabelecido inmeras ligaes de hidrognio
entre os grupos hidroxilas das diferentes cadeias de glicose, o que as torna
impermeveis a gua e, consequentemente, insolveis.2
As ligaes intermoleculares (ligaes entre unidades de glicose de molculas
vizinhas) so responsveis pela rigidez. E as ligaes intramoleculares (ligaes entre
unidades de glicose da mesma molcula) so responsveis pela formao de fibrilas,
estruturas bastante organizadas que se agregam e formam as fibras de celulose.
Como resultado das ligaes de hidrognio, as molculas de celulose podem formar
regies cristalinas e amorfas, e consequentemente, tornam a celulose bastante
resistente qualquer ao externa.2
Figura 1 - Representao esquemtica da molcula de celulose. (adaptada da ref. 2).
1.4.2 Hemicelulose
Outro componente essencial na parede celular so as hemiceluloses, que so
polissacardeos formados por diferentes unidades de acares pertencentes aos
grupos das pentoses (xilose e arabinose) e hexoses (glicose, manose, galactose).
6
Introduo
Esta macromolcula possui tambm, cidos hexurnicos, como os cidos Dglucornico e o cido 4-O-metil-glucurnico (Figura 2). So estruturalmente mais
parecidas com a celulose do que com a lignina, e so depositadas na parede celular
em um estagio anterior lignificao. Sua estrutura apresenta ramificaes e cadeias
laterais que interagem facilmente com a celulose, dando estabilidade e flexibilidade ao
agregado.22
Em comparao com a celulose, as hemiceluloses apresentam baixo grau de
polimerizao, no formam arranjo fibroso e apresentam somente regies amorfas
possibilitando maior susceptibilidade hidrlise qumica, pois oferecem uma maior
acessibilidade aos cidos minerais comumente utilizados como catalisadores. 23
Porm, a fermentao dos acares derivados das pentoses ainda no to
desenvolvida quanto os processos envolvendo glicose.9
Figura 2 - Representao esquemtica da hemicelulose. (adaptada de ref. 2)
1.4.3 Lignina
Uma das substncias orgnicas macromolculas naturais mais abundantes,
depois da celulose, a lignina (Figura 3). Sua estrutura bastante heterognea e
consiste em uma rede de anis aromticos unidos, principalmente por ligaes alquilaril-ter, formando um arranjo amorfo com grandes quantidades de ligaes cruzadas
entre os anis aromticos. Esta macromolcula formada pela polimerizao de trs
diferentes monmeros: lcool cumrico, lcool coniferlico e lcool sinaplico. 22
Atua como uma barreira fsica, no processo de hidrlise enzimtica, para as
enzimas que podem ser irreversivelmente capturadas pela lignina, influenciando na
quantidade de enzima que ser usada na hidrlise, e, alm disso, dificulta a
recuperao da enzima aps a hidrlise.23 A lignina, no entanto, desempenha um
7
Introduo
papel fundamental para o sucesso da tecnologia de hidrlise, pois dificulta o acesso
celulose.
Figura 3 - Representao esquemtica da lignina de eucalipto. (adaptada de ref. 2).
1.5 Produo de etanol a partir de materiais

lignocelulsicos
A converso da biomassa lignocelulsica a etanol ocorre normalmente em quatro
etapas: (1) pr-tratamento, para melhorar a digestibilidade enzimtica ou microbiana
de componentes polissacardeos; (2) hidrlises da celulose e da hemicelulose,
hidrolisam estes polmeros em monmeros, (glicose e xilose e arabinose,
respectivamente); (3) fermentao do acar em combustvel lquido; (4) destilao,
onde separado o etanol presente no fermentado.9,24,25
Dessa forma, o pr-tratamento uma etapa fundamental para o processo de
converso da biomassa em etanol lignocelulsico, pois nesta etapa que h a
modificao da estrutura da biomassa, que atuam como barreiras que impedem a
ao das enzimas celulases durante a etapa da hidrlise enzimtica.9
8
Introduo
1.5.1 Pr-tratamentos
A etapa do pr-tratamento de suma importncia para se alcanar um rendimento
satisfatrio de acar fermentvel e por sua vez influencia as outras etapas
subsequentes.1,2,20 O objetivo do pr-tratamento separar a lignina e a hemicelulose,
do material lignocelulsico, sendo possvel a utilizao e aproveitamento de cada
parte deste material. Alm disso, o pr-tratamento aumenta a rea superficial e
diminui o grau de polimerizao e a cristalinidade da celulose, aumentando a
porosidade dos materiais.26
Com o pr-tratamento possvel melhorar a formao de acares; evitar a
degradao ou perda de carbono; evitar a formao de inibidores aos processos de
hidrlise e fermentao, aumentando por consequncia seu custo-benefcio.9
Figura 4 - Alteraes estruturais do complexo celulose - hemicelulose - lignina determinadas pelo prtratamento. (adaptada da ref. 2)
A lignina e a hemicelulose devem ser seletivamente removidas pelos mtodos

de pr-tratamentos biolgicos, fsicos, qumicos, fsico-qumicos ou por combinao
destes.27 Acredita-se que a eficincia destes processos a chave para uma eficiente
9
Introduo
degradao enzimtica do material lignocelulsico satisfatria. 26
Cada mtodo de pr-tratamento tem vantagens e desvantagens, tais como: (1)
mtodo biolgico no agride o meio ambiente, usa fungos e bactrias, tem baixo
requerimento de energia e efetiva deslignificao, mas requer um tempo excessivo de
10-14 dias; h perda de celulose; baixa taxa de hidrlise; (2) mtodo fsico reduz
mecanicamente o tamanho da partcula da biomassa, mas exige energia; caro e no
remove a lignina; (3) mtodo qumico h uma descristalizao da celulose, um alto
rendimento da celulose e uma efetiva deslignificao; difcil de recuperao de cidos;
corrosivo, altamente danoso ao meio ambiente, e h perda da lignina; (4) mtodo
fsico-qumico modifica a estrutura da lignocelulsica, aumenta a rea de superfcie
e melhora a purificao da celulose, mas exige altas presses e temperaturas e uso
de catalisadores.9,25,26,28
O tratamento atualmente mais empregado para obteno de celulose o
processo qumico Kraft, que envolve o cozimento da matria-prima com uma soluo
contendo hidrxido (hidrlise alcalina) e sulfeto de sdio, utilizando temperaturas em
torno de 160 C. Este processo remove grande parte da lignina presente na matriz
lignocelulsica. Em geral, a celulose extrada apresenta colorao escura, e quando
se trabalha na indstria de papel e celulose, contudo necessrio processos de
branqueamento para atingir maiores nveis de brancura, levando em conta as perda
das propriedades fsico-mecnicas da celulose.29
Apesar de sua popularidade e eficincia, o processo qumico Kraft envolve a
utilizao de uma variedade de produtos qumicos txicos e perigosos e gera grandes
quantidades de poluentes do ar e da gua.29 Alm disso, no processo qumico Kraft a
lignina degradada em fraes solveis em gua sendo sua reutilizao
comprometida, e, dessa forma, toda a lignina empregada na forma de queima para
gerao de calor utilizado nas caldeiras da prpria indstria.26
H, entretanto, outros mtodos de pr-tratamento como o Ammonia fiber
expansion (AFEX) que muito eficaz e esta sendo bastante difundido nos Estados
Unidos. O AFEX tem a funo de descristalizar as fibras de celulose, hidrolisar a
hemicelulose, remover a lignina despolimerizada e aumentar em tamanho e nmero
os microporos da parede celular da biomassa.21
Alm destes processos h o hidrotrmico que consiste no tratamento da
biomassa com gua a temperaturas elevadas, h a exploso com vapor onde a
biomassa tratada com vapor saturado sob alta presso e temperaturas elevadas s
10
Introduo
quais modificam as estruturas da biomassa tornando-a mais branda para a
sacarificao.21
Neste contexto, o sucesso do processo de pr-tratamento deve ser
desenvolvido pensando no processo como um todo, envolvendo a hidrlise
enzimtica, a fermentao e, alm disso, o tratamento da gua residual, visando a
no contaminao do meio ambiente.1
1.5.2 Hidrlise
A etapa da hidrlise da biomassa lignocelulsica uma etapa essencial para o
processo de obteno de etanol lignocelulsico. a fase onde ocorre a sacarificao
da celulose (Figura 5).1,25,32,33 A hidrlise da celulose pode ser realizada por dois
mtodos a hidrlise cida e a hidrlise enzimtica.32
Figura 5 - Hidrlise da celulose. (adaptada da ref. 33)
1.5.2.1 Hidrlise enzimtica

A hidrlise enzimtica de materiais lignocelulsicos conduzida atravs de enzimas
celulases, que so altamente especficas. Normalmente as celulases so uma mistura
de diversas enzimas. Os trs maiores grupos de celulases que esto envolvidas no
processo de hidrlise so: endoglucanases, exoglucanases e betaglucosidase. 9
As endoglucanases atuam aleatoriamente ao longo da molcula de celulose.
No entanto, as exoglucanases atuam nas regies terminais das molculas de
celulose, promovendo a sua despolimerizao gradativa atravs da remoo de
11
Introduo
unidades de celobiose terminais. A celobiose um dissacardeo composto por duas
molculas de glicose, produto da hidrlise incompleta da celulose. Finalmente, as
betaglucosidases hidrolisam celobiose a glicose.34
Em princpio, as rotas enzimticas apresentam vantagens importantes sobre as
rotas qumicas, no contexto da produo de bioetanol. Na maioria das vezes, o
processo de hidrlise enzimtica apresenta vantagens associadas obteno de
rendimentos, para bagao de cana, superiores a 0,85 g glicose/g celulose, sob
temperaturas moderadas (40 C a 50 C) e presso atmosfrica. Entretanto, aspectos
operacionais relacionados ao longo tempo do processo (48 a 72 horas), desativao
cataltica pela inibio da atividade enzimtica, bem como do alto custo das enzimas,
tm deixado dvidas quanto viabilidade econmica do processo de hidrlise
enzimtica para a produo de etanol a partir de biomassas lignocelulsicas. 1,35
1.5.2.2 Hidrlise qumica

A hidrlise qumica da celulose foi uma das primeiras alternativas a serem testadas,
contudo mostrou limitaes como a formao de inibidores que podem interferir na
fermentao (compostos fenlicos, cidos acticos, furfural e hidroximetilfurfural), e a
degradao de acares por exposio prolongada ao meio reacional, alm da
corroso de equipamentos.36
caracterizada por envolver solues diludas de cidos fortes como cido
clordrico e sulfrico, e condies rgidas de pH, temperatura e tempo (pH 1 e 2
temperatura entre 100 a 150 C tempo de 30 a 60 minutos).1,11
A hidrlise cida realizada em diversos compostos orgnicos (steres,
acares, aminas, etc). Alm dos cidos mais utilizados, outros cidos so
empregados. cido frmico e tricloroactico tm menor atividade, mas produzem
reaes mais limpas. cido oxlico e benzeno-sulfnico so mais ativos que
sulfrico.37
Para quebrar os polmeros celulose e hemicelulose em monmeros, glicose e
xilose, pela hidrlise cida, a biomassa lignocelulsica exposta ao cido por um
perodo de tempo e em temperaturas especficas. O cido sulfrico (H 2SO4),
normalmente, o mais investigado, contudo o cido clordrico (HCl) tambm tem sido
utilizado na produo de etanol lignocelulsico. A hidrlise cida pode ser com cido
12
Introduo
concentrado ou cido diludo. Porm, existem vantagens e desvantagens em cada
caso, mas o que mais chama a ateno o impacto ambiental, negativo, que os
cidos podem produzir.38
Entretanto, o processo de hidrlise cida tem alguns por menores como a
corroso dos equipamentos e a possvel formao de subprodutos. Contudo, o
rendimento glicosdico da ordem de 80% a 85% torna a tecnologia potencialmente
interessante para produo de etanol lignocelulsico.1
1.5.3 Fermentao
A fermentao etanlica um fenmeno bioqumico muito complexo que provoca a
transformao de acares a etanol, gs carbnico, cidos succnios, cidos volteis
e steres.39
A fermentao um processo catablico anaerbico em que h a degradao
de molculas de acar, no interior das clulas de microrganismos, at a formao de
etanol e CO2, havendo liberao de energia qumica e trmica. As leveduras so os
microrganismos mais empregados na obteno de etanol por via fermentativa.41
Seu processo iniciado com a gliclise, tambm chamada de via EmbdenMeyerhof, ocorrendo a oxidao da glicose em duas molculas de cidos pirvicos
em dois momentos, sendo na presena ou no de oxignio. No primeiro momento,
para a fosforilao da molcula de glicose so usadas duas molculas de adenosina
trifosfato ATP, em seguida reestruturada e quebrada em dois compostos de trs
carbonos: gliceraldedo 3-fosfato e diidroxiacetona fosfato, que convertida
rapidamente em gliceraldedo 3-fosfato. No segundo momento, as molculas de
gliceraldedo geradas so oxidadas em duas molculas de cido pirvico. Nessas
reaes, ocorre a reduo das duas molculas de nicotinamida adenina dinucleotdeo
NAD+ a NADH e quatro molculas de ATP so formadas pela fosforilao em nvel
de substrato, com saldo final positivo de duas molculas de ATP para cada molcula
de glicose que oxidada. Aps a gliclise, h a converso das duas molculas de
cido pirvico em dois acetaldedo e do dixido de carbono CO2. Para a formao
de etanol, produto final da fermentao, as molculas de acetaldedo so reduzidas
por duas molculas de NADH.10,39
A fermentao etanlica inicia-se, aps a adio do microrganismo ao meio
13
Introduo
fermentativo, ou seja, um meio rico em acares. Mas, existem trs fases para que
ocorra o processo de fermentao, logo aps a adio do microrganismo: a fase lag
onde ocorre a adaptao dos microrganismos ao novo ambiente, e os mesmos do
incio ao seu crescimento, e neste meio fermentativo existe, ainda, oxignio disponvel
para que ocorra a desenvolvimento das leveduras. A segunda fase, que a fase
exponencial, determinada pelo grande aumento de microrganismos e pela liberao
de gs carbnico, nesta fase o crescimento na ordem de 2n. onde haver o
aumento da temperatura e do teor alcolico. Na fase estacionria, o alimento j esta
muito pobre no meio e o crescimento das leveduras afetado, alm disso, h
diminuio de gs carbnico e precipitao do microrganismo. A fase de morte
caracterizada pela morte celular, pois o prprio meio, rico em etanol j no benfico
ao microrganismo. No final da fermentao o produto obtido o caldo bruto, que ira
apresentar 8 a 12% de etanol.40
Como relatado, a etapa de fermentao etanlica um processo biolgico, cujo
principal agente a levedura e ocorre com a transformao de acares, em etanol e
CO2, atravs deste microrganismo. Contudo, existem fatores que afetam a
fermentao, o que causa uma perda no seu rendimento, ou seja, a porcentagem do
acar que se transforma em etanol no tem relao quantidade mxima terica da
equao de Gay-Lussac, descrita no captulo de materiais e mtodos.53
1.5.3.1 O microrganismo da fermentao

As leveduras so os microrganismos mais empregados na obteno de etanol por via
fermentativa. As leveduras utilizadas na fabricao de bebidas alcolicas e
combustveis geralmente so das linhagens Saccharomyces cerevisiae.41
A Saccharomyces cerevisiae (Figura 6) amplamente utilizada na produo
comercial de etanol proveniente de acares, tais como os da sacarose da cana de
acar e os da maltose do amido do milho. 42 A sacarose hidrolisada pela S.
cerevisiae em glicose e frutose, duas hexoses com alto rendimento fermentativo.43 A
funo da levedura transformar anaerobicamente o carboidrato, para gerar ATP que
uma fonte de energia necessria para o seu desenvolvimento, como o seu
crescimento e sua multiplicao, alm da sua sobrevivncia.39
14
Introduo
Figura 6 - Imagem da levedura Saccharomyces cerevisiae.
44
Para a produo de bioetanol lignocelulsico deve-se levar em conta que a

poro hemicelulose da biomassa lignocelulsica alm de produzir hexoses na sua
degradao produz acares como a xilose e a arabinose, que so pentoses.
Entretanto, as leveduras S. cerevisiae so incapazes de assimilar ou fermentar
pentoses.45 O fato mais importante, contudo, a interferncia de compostos formados
nas etapas precedentes a fermentao que afetam a formao do etanol. 46
Variados fatores fsicos (temperatura, presso osmtica), qumicos (pH,
oxigenao, nutrientes minerais e orgnicos, inibidores) e microbiolgicos (espcies,
linhagem e concentrao de leveduras, contaminao bacteriana) prejudicam o
rendimento da fermentao, isto , a capacidade da levedura em converter acar em
etanol.47
1.5.3.2 Os inibidores da fermentao

Nas etapas do pr-tratamento ou na hidrlise cida da biomassa lignocelulsica h a
formao de acares derivados da hidrlise e da dissoluo da celulose e
hemicelulose, mas h a formao, tambm, de compostos que podem atuar como
inibidores em potencial da fermentao.47
Estes produtos de degradao, que so potenciais inibidores da fermentao,
so divididos em trs categorias: os derivados do furano; cidos alifticos de baixa
massa molecular; derivados fenlicos.46
Em funo das elevadas temperaturas aplicadas nos pr-tratamentos, os
acares produzidos na hidrlise, principalmente da hemicelulose, se degradam
15
Introduo
gerando os compostos derivados do furano: o furfural, que formado pela
degradao das pentoses (xilose e arabinose) e o 5-hidroximetilfurfural (HMF), que
por sua vez formado pela da degradao das hexoses (glicose, manose e
galactose).46 Estes inibidores danificam as paredes e membranas celulares, inibem o
crescimento celular, reduzem atividades enzimticas, causam danos ao DNA (cido
desoxirribonucleico), inibem a sntese de protenas e RNA (cido ribonucleico), e
reduzem a produo de etanol.48
O cido actico, um cido aliftico, formado pela hidrlise do grupo acetil
presente na hemicelulose. A sua presena no meio fermentativo ocasiona um
aumento no consumo de ATP pela levedura, nessas condies, parte do ATP que
seria utilizado para o crescimento ou fermentao desviado para manuteno de
seu pH interno.49
Os compostos fenlicos, formados principalmente pela degradao parcial da
lignina, podem inibir a bioconverso, inibindo a atividade enzimtica, destruindo a
integridade da membrana e afetando as suas propriedades, como a barreira
seletiva.36
Os estudos relatam que a maioria das leveduras, incluindo linhagens
industriais, suscetvel a furfurais derivados do hidrolisado, e especialmente
suscetvel a combinao destes inibidores. Embora o furfural seja mais txico do que
o 5-HMF, eles atuam em conjunto para suprimir o crescimento da levedura. Contudo,
para amenizar os efeitos dos inibidores, tratamentos adicionais so requeridos,
incluindo detoxificao qumica, fsica e bioqumica. No entanto, esses passos
adicionais acrescentam custos e complexidade ao processo e geram resduos.
Portanto, o desenvolvimento de leveduras modificadas geneticamente com maior
tolerncia a inibidores, especialmente aos furfurais, uma alternativa promissora
etapa de detoxificao.50
16
Objetivos
2 - Objetivos
2.1. Objetivos Gerais
Este trabalho tem como objetivo geral avaliar a produo de etanol a partir da
celulose presente na biomassa lignocelulsica, Eucalyptus urophylla, focando
principalmente na etapa de fermentao, utilizando a levedura Saccharomyces
cerevisiae e analisando seu comportamento.
2.2 Objetivos Especficos

Disponibilizar a celulose atravs das etapas de pr-tratamento cido e alcalino;
Hidrolisar o polmero de celulose em acares fermentescveis pela etapa da
hidrlise enzimtica;
Avaliar o comportamento da levedura em diferentes meios fermentativos, como
meio sinttico, meio hidrolisado, meio sinttico com inibidores e meio hidrolisado com
suplemento;
Verificar se h presena de inibidores no hidrolisado de eucalipto e como a
levedura se desenvolve neste meio;
Quantificar a taxa de crescimento, as taxas de converso de substrato em
clulas e em produto, e o rendimento dos processos nos meios fermentativos;
Diferenciar as fermentaes comparando a produo de cada meio analisado.
17
Parte Experimental
3. Materiais e mtodos
3.1 Materiais
Para a produo dos hidrolisados lignocelulsicos foi utilizada a espcie de
eucalipto Eucalyptus urophylla EU, cultivada na regio entre Ponta Por

MS e Dourados MS, fornecida pela Embrapa Floresta, localizada em
Colombo, distrito de Curitiba PR, como citado anteriormente. Na hidrlise
enzimtica utilizou-se o complexo enzimtico CellicCTec2, da Novozymes.
A fermentao alcolica foi realizada utilizando-se a levedura Saccharomyces
cerevisiae CAT-1 (levedura para a produo de etanol). Para o meio sinttico

foi utilizado: Extrato de levedura HIMEDIA; Peptona bacteriolgica
HIMEDIA; Glicose Vetec. Alm dos micronutrientes (NaNO3 Vetec; KH2PO4
CRQ; MgSO4 Vetec; KCl Sigma/Aldrich; FeSO4 Alphatec; ZnSO4 7H2O
Alphatec).
Para a produo de tampes e das solues utilizadas nos pr-tratamentos e
na hidrlise foram usados reagentes qumicos: cidos (H2SO4 J.T. Baker;
C6H8O7 Vetec), bases (NaOH Sigma-Aldrich), sais (Na3C6H5O7 SAFC).
3.1.1 Equipamentos
Equipamentos utilizados nas anlises e procedimentos:
Espectrofotmetro
Multimodal
com
absorbncia
UV/VIS,
marca
Molecular Devices, modelo Spectramax.

Cromatgrafo Lquido de Alta Eficincia CLAE. Marca Agilent, modelo
1260 Infinity. Coluna Aminex HPX-87H e detector ndice de refrao.
Fase mvel H2SO4 0,005 M, vazo de 0,6 mL/min, e temperatura de 45
C. Clarificadas em cartuchos C18.
Shaker orbital de bancada com incubao e refrigerao, marca Thermo
Scientific, modelo Max 4000.
Moinho de facas tipo Willey, marca Fortinox, modelo Macor Star FT-60
18
Parte Experimental
3.2 Mtodos
3.2.1 Preparo da biomassa
O material lignocelulsico que se encontrava em forma de cavacos foi processado em
moinho de facas tipo Willey, com granulometria mxima de 3 mm.
3.2.2 Pr-tratamento
O pr-tratamento foi realizado em duas etapas: o pr-tratamento cido e o alcalino.
Sendo cada etapa realizada em dias subsequentes.
3.2.2.1 Pr-tratamento cido

Foram pesados, separadamente, em 15 bqueres de plstico de 250 mL, 20 g da
madeira slida bruta. Preparou-se uma soluo cida de cido sulfrico e gua
destilada de forma a se obter uma soluo de 1,5% (v/v) de cido sulfrico H2SO4.
Esta soluo foi adicionada a cada bquer, contendo a madeira, numa razo
slido/lquido de 1/10 (200 mL de soluo).
O material autoclavado a presso de 1 atm e a temperatura de 121C por 30
minutos. Para separar a frao slida da lquida, por filtrao, foi utilizado filtro de
tecido e espremido com o intuito de retirar ao mximo a parte lquida. O slido foi
lavado duas vezes com gua destilada. Cada lavagem conteve o mesmo volume de
soluo cida utilizada no pr-tratamento (200 mL para cada bquer). Todas as
fraes slidas foram misturadas. Deste material foi retirada uma alquota para a
realizao de matria seca e o restante guardado em geladeira para ser utilizado
posteriormente no pr-tratamento alcalino. Aps a secagem do material retirou-se 3 g
em base seca da frao slida para a caracterizao em triplicata.
3.2.2.2 Pr-tratamento alcalino

Pesou-se, separadamente, em 15 bqueres de plstico de 250 mL o material que foi
19
Parte Experimental
lavado aps a etapa do pr-tratamento cido. Preparou-se uma soluo alcalina,
hidrxido de sdio NaOH 4% (m/v) em gua destilada. Com o peso seco do
material, adicionou-se a soluo alcalina ao bquer contendo o material numa razo
slido seco/lquido de 1/10.
O material misturado com a soluo alcalina foi autoclavado a presso de 1
atm e a temperatura 121C por 30 minutos. Aps atingir o tempo determinado os
bqueres foram retirados imediatamente da autoclave e ocorreu a lavagem desse
material com gua destilada fervente, aproximadamente 1 L. Para a filtrao foi usado
o tecido mencionado na etapa anterior, e foi retirado todo o excesso de gua. Deste
material foi retirada uma alquota para a realizao de matria seca e aps a
secagem do material retirou-se 3 g em base seca da frao slida para a
caracterizao em triplicata.
3.2.3 Caracterizao da biomassa

As amostras de biomassa, madeira bruta, madeira pr-tratada com cido e madeira
pr-tratada com base, foram pesadas, em frascos Duran, exatamente 1 g. Preparouse uma soluo de cido sulfrico H2SO4 72% (v/v) e transferiu-se 5 mL para um
tubo de ensaio. As amostras e os tubos de ensaio contendo a soluo cida foram
colocados em banho trmico a 45 C e agitada por 7 minutos. Em seguida o frasco foi
retirado do banho e adicionou-se gua destilada para interromper a reao.
Transferiu-se a amostra para um erlenmeyer de 250 mL lavando o frasco at
completar o volume de 125 mL, que foram fechados com papel alumnio e
autoclavados por 30 minutos a 121 C e 1 atm.
A frao slida foi separada da frao lquida por filtrao, sendo lavada com
gua destilada ate completar um balo volumtrico de 250 mL. A soluo foi
armazenada, em congelador, para anlise dos acares presentes em cada material
utilizado.57
Na caracterizao foi possvel quantificar a porcentagem de celulose, atravs
da glicose, e a hemicelulose, atravs da xilose. A lignina no foi determinada neste
estudo, dessa forma referida como outros, juntamente com os extrativos e as
cinzas.
O mtodo utilizado foi adaptado a fim de diminuir a quantidade de resduos
20
Parte Experimental
qumicos gerados durante o procedimento. Os mesmos eram tratados aps os
procedimentos.
3.2.4 Hidrlise enzimtica

O material resultante das etapas de pr-tratamento foi dividido em erlenmeyers de
250 mL (aproximadamente 12 frascos), contendo a mesma quantidade de slido.
Preparou-se uma soluo tampo citrato de sdio/cido ctrico 0,1 M pH 5. A
quantidade de tampo necessria para a hidrlise enzimtica foi calculada
considerando a diluio de 1 g do material em base seca para 10 mL de tampo. A
quantidade de enzima adicionada (15 FPU/g de substrato seco) foi calculada a partir
dos dados de peso seco e da diluio da enzima em tampo (soluo de 1/5).
Aps agitao retirou-se uma primeira alquota de 1 mL (tempo zero) de cada
erlenmeyers em eppendorfs e centrifugada imediatamente. A parte lquida foi
armazenada congelada em eppendorfs, para posterior anlise da quantidade de
glicose presente na amostra no CLAE.
Os erlenmeyers com as amostras foram colocadas e Shaker rotativo de
maneira aleatria, submetidos temperatura de 50 C e agitao de 200 rpm por 24
horas, conforme a Figura 7. Aps as 24 horas (tempo final) retirou-se, novamente,
uma alquota de cada frasco e procedeu-se da mesma maneira do ponto zero. O
restante das amostras foram centrifugadas.
21
Parte Experimental
Figura 7 - Hidrlise enzimtica aps 24 horas de incubao.
3.2.5 Fermentao
3.2.5.1 Preparo do meio de cultura
O meio de cultura utilizado foi o YPG Extrato de levedura (Yeast extract), Peptona
bacteriolgica e Glicose. A concentrao utilizada foi de 10%, sendo 10 g/L de extrato
de levedura, 20 g/L de peptona bacteriolgica e 100 g/L de glicose os meios so
esterilizados.
3.2.5.2 Tcnica de esgotamento

As colnias de leveduras foram separadas pela tcnica de esgotamento. O meio
usado para o esgotamento foi o mesmo, contudo com uma concentrao de glicose
de 2% e acrescentou-se 20 g/L de Agar a fim de que o meio se tornasse slido. O
meio foi esterilizado. Aps esterilizao foi vertido em placas de Petri, em ambiente
estril.
Para a tcnica de esgotamento as placas de Petri foram dividas em trs
setores, fazendo uma marcao com caneta na parte externa da base da placa,
conforme Figura 8. Com o auxlio da ala de platina, flambada e resfriada, coletou-se
uma poro de microrganismo e depositou-se sobre a superfcie do meio de cultura
no setor 1 em forma de estrias (Figura 8) tentando fazer o maior nmero de estrias
22
Parte Experimental
possvel. Com a ala de platina esterilizada, novamente, e sem carreg-la com
microrganismo deslizou-se a mesma sobre as ltimas estrias que foram feitas no
primeiro setor e foram feitas novas estrias no setor 2. Repetiu-se o procedimento para
o setor 3, onde ter a menor quantidade de clulas, ocorrendo o crescimento de uma
colnia proveniente de uma nica clula, denominada cultura pura. Depois de
terminado o procedimento levou-se as placas para incubao a uma temperatura
entre 20 a 25 C.
Figura 8 - Ilustrao da tcnica de esgotamento de cultura em placa de Petri com meio slido.3.2.5.3
Dosagem de clulas
Para acompanhar o crescimento celular ao longo da fermentao utilizou-se o

mtodo de espectrofotomtrico. O meio fermentativo foi diludo adequadamente e
determinou-se a absorbncia em espectrofotmetro a 650 nm. O valor lido foi
comparado com uma curva padro (Figura 11, pgina 32) que relacionou a
absorbncia com a concentrao celular em termos de massa seca em gramas por
litro, que foi construda conforme descrito abaixo. Para o branco foi utilizado gua
destilada.
3.2.5.3.1 Curva padro

Massa seca
Para este procedimento o microrganismo foi inoculado em 100 mL de YPG 10%,
23
Parte Experimental
numa concentrao aproximada a da fermentao e deixou-se crescendo em Shaker
a 30 C e 150 rpm por aproximadamente 12 horas.
O meio fermentativo foi homogeneizado e colocado em frascos Falcon de 50
mL para centrifugar por 15 minutos, para a completa sedimentao, retirou-se o
sobrenadante, adicionou-se gua destilada em seguida foi centrifugada novamente.
Esta operao foi repetida trs vezes seguidas.
Secaram-se trs placas de Petri de vidro em estufa at massa constante e
anotou-se a massa de cada um. Adicionou-se a levedura lavada em cada placa e
foram anotadas a massas de cada placa. Estas foram levadas para estufa a 80 C
para secagem at massa constante. Pesaram-se as placas e determinou-se a massa
de slido seca em cada uma. Com o volume centrifugado conhecido e a massa de
slido seca foi possvel determinar a concentrao celular em g/L presente no meio.
Determinao da razo massa de clula versos comprimento de onda

Com o mesmo meio fermentado foram feitas leitura no espectrofotmetro, com
comprimento de onda de 650 nm, em diferentes diluies. As diluies adequadas
dependeram da concentrao celular em que se encontrava o meio. Usou-se como
branco gua destilada. O procedimento foi realizado em triplicata.
Conhecidas as absorbncias relacionadas cada concentrao, pode-se ento
construir a curva padro que forneceu a concentrao de leveduras em base seca,
em g/L (ordenada), para cada absorbncia lida (abscissa). Obteve-se a equao da
reta e o R2.
Determinao da concentrao nas amostras

A turbidimetria, tcnica utilizada para quantificar o crescimento microbiano, faz o
monitoramento do crescimento bacteriano atravs da densidade tica (DO). o
mtodo mais simples e rpido para se obter resultados, uma desvantagem da
turbidimetria, no conseguir distinguir as clulas viveis das no viveis.
Com as amostras homogeneizadas e diludas dentro do intervalo especificado
pela curva padro foram feitas as leituras das absorbncias no espectrofotmetro a
650 nm. O branco utilizado foi gua destilada e o procedimento foi realizado em
24
Parte Experimental
triplicata para cada amostra.
3.2.5.4 Fermentao meio sinttico

Aps 24 horas do crescimento da colnia da levedura verteu-se em frascos de
erlenmeyer de 500 mL (aproximadamente 4 frascos) para que houvesse o
crescimento da levedura novamente, por aproximadamente 6 horas. Em seguida
foram centrifugadas e divididas em frascos de erlenmeyer de 500 mL para um novo
crescimento por 12 horas. Para obter a levedura concentrada, as mesmas foram
centrifugadas e calculou-se a concentrao pela equao da curva de crescimento
como descrito anteriormente e esta demostrado na Figura 12 da pgina 34.
Sabendo a concentrao da levedura calculou-se o volume a ser pipetado do
mesmo para uma concentrao de 10 g/L. este volume foi adicionado ao meio
sinttico. Anotou-se o tempo inicial e foram retiradas alquotas, de 1 mL de cada
amostra, de 30 em 30 minutos. Essas amostras foram diludas para a construo da
curva de crescimento atravs da leitura da densidade tica no espectrofotmetro. Em
seguida foram centrifugadas e armazenou-se o sobrenadante para posterior analise
do consumo de glicose e a produo de etanol, no CLAE.
Todo o procedimento foi mantido em Shaker a 30 C e 150 rpm, tanto para o
crescimento das leveduras quanto para a fermentao, e realizado em ambiente
esterilizado em capela de fluxo laminar. Todo material usado foi esterilizado para
evitar a contaminao da levedura.
3.2.5.5 Fermentao meio sinttico com inibidores

Aps as etapas de pr-tratamento e da hidrlise enzimtica foram feitas anlises, no
CLAE, para verificar a existncia de inibidores gerados. As amostras foram
submetidas a anlises sem diluio, para detectar os inibidores.
Com as concentraes dos inibidores furfural e HMF encontradas no CLAE
adicionou-se em quantidades equivalentes as substncias ao meio sinttico e
verificou-se o comportamento da levedura. A fermentao ocorreu de forma
semelhante ao item anterior.
25
Parte Experimental
3.2.5.6 Fermentao meio hidrolisado

As amostras retiradas na etapa da hidrlise enzimtica foram analisadas no CLAE
para verificar a quantidade de glicose presente. De posse das anlises o hidrolisado
foi suplementado com glicose para uma concentrao de 100 g/L.
Determinado o volume do creme de levedura descrito no item anterior para
uma concentrao de 10 g/L o meio hidrolisado foi inoculado para a realizao da
fermentao. O procedimento seguido foi o mesmo para o meio sinttico.
3.2.5.7 Fermentao meio hidrolisado com suplementos

Com o meio hidrolisado j suplementado, conforme o item anterior foi adicionado o
Meio Mnimo de Pontecorvo51 com algumas modificaes, com a seguinte
composio: 6,0 g de NaNO3; 1,52 g de KH2PO4; 0,52 g de MgSO4.7H2O; 0,52 g de
KCl; 0,01 g de FeSO4; 0,01 g de ZnSO4. Em seguida iniciou-se a fermentao da
mesma maneira para os meios sinttico e hidrolisado. A foto da Figura 9 ilustra os
erlenmeyers com as fermentaes desta etapa.
Figura 9 - Fermentao do meio hidrolisado com suplemento e meio sinttico como contraprova.
26
Parte Experimental
3.2.6 Clculos dos parmetros de fermentao

Os parmetros cinticos da fermentao foram obtidos atravs da utilizao dos
clculos da taxa especfica mxima de crescimento, dos fatores de converso de
substrato em clulas e em produto e da eficincia de fermentao.
3.2.6.1 Taxa especfica mxima de crescimento (max)

A taxa especfica de crescimento celular (max) foi calculada pela Equao 1.
1 dX
.
X dt
(Equao 1)
Onde X a concentrao celular (g/L) e t o tempo (minutos).
3.2.6.2 Fator de converso de substrato em produto (YP/S)

O fator de converso de substrato em produto foi expresso em g etanol/gglicose, sendo
calculado atravs da Equao 2.
YP / S
dP
dS
(Equao 2)
Onde P a concentrao do produto (g/L) e S a concentrao de substrato

(g/L).
3.2.6.3 Fator de converso de substrato em clulas (YX/S)

O fator de converso de substrato em clulas foi expresso em g clulas/gglicose, sendo
calculado atravs da Equao 3.
YX / S
dX
dS
(Equao 3)
27
Parte Experimental
3.2.6.4 Eficincia de fermentao (E)

Foi calculada com base no rendimento terico proveniente da equao de GayLussac (51,1 getanol/100gglicose),52 segundo a Equao 4.
E YP / S .100 / 0,511
(Equao 4)
28
Resultados e Discusso
4 Resultados e Discusso
4.1 Caracterizao qumica das biomassas bruta e prtratadas
Como relatado nos captulos anteriores a madeira, biomassa lignocelulsica,
composta por celulose, hemicelulose, lignina, extrativos e cinzas. A caracterizao
qumica um dado essencial para este trabalho, pois atravs desta foi possvel
calcular e analisar o percentual das fraes desta biomassa em diferentes estgios do
processo.
Os resultados da caracterizao da madeira em seu estado natural (bruta) e
depois de passar pelas etapas de pr-tratamento cido e alcalino so discutidos para
demonstrar a quantidade de celulose disponibilizada e hemicelulose nos prtratamentos. Cabe ressaltar que o mtodo usado nos pr-tratamentos so os mais
utilizados no meio cientfico para a indstria de celulose, podendo ser realizado em
diversos laboratrios e faz parte do Projeto da Embrapa Agroenergia Fontes
Alternativas de Biomassa para a Produo Sustentvel de Etanol a partir de Materiais
Lignocelulsicos, e o foco desta pesquisa a fermentao. Com efeito, este estudo
no tem como meta detalhar o pr-tratamento usado.9
4.1.1 Caracterizao qumica da biomassa bruta

Na caracterizao do eucalipto da espcie EU a quantidade de celulose verificada,
dada pela mdia das anlises realizadas, foi de 28% e este valor no compatvel ao
encontrado na literatura para a mesma espcie que est na faixa de 35 a 50%. Para a
hemicelulose o valor encontrado foi de 8% e na literatura o valor est na fixa de 17 a
19%, esta diferena pode ser proveniente do mtodo, que usou concentrao do
cido sulfrico e temperatura menores, utilizado para a caracterizao.53 Em outras
espcies como o Eucalyptus grandis composio encontrada foi de 40% para a
celulose e 9% para a hemicelulose e o hibrido das espcies Eucalyptus grandis x
urophylla a composio foi de 39% para a celulose e 10% para a hemicelulose. 54 Vale
29
argumentar que foram utilizadas variveis diferentes, como o tempo e a concentrao
de cidos para a caracterizao qumica destas espcies. Apesar de observar que
outras metodologias empregadas apresentam resultados diferentes, optamos por esta
que foi utilizada por ser a mais empregada e completamente estabelecida no
laboratrio de bioprocessos da Embrapa Agroenergia. fato que os procedimentos
experimentais
envolvendo
matrias-primas
complexas
apresentam
erros
experimentais bastante elevados.
4.1.2 Caracterizao qumica das biomassas pr-tratadas

O pr-tratamento cido foi realizado para desorganizar a estrutura da madeira e
remover a frao hemicelulsica. Dessa forma, aps esta etapa o que se percebeu foi
que o percentual de celulose aumentou e a quantidade de hemicelulose diminuiu
conforme anlise realizada no CLAE. O percentual de celulose disponibilizada nesta
etapa do pr-tratamento foi de 32% e a de hemicelulose de 6%. Aps o processo de
filtragem a biomassa resultante desta etapa tem em sua composio celulose e
lignina, visto que a hemicelulose foi removida.
Na etapa do pr-tratamento alcalino onde h a deslignificao da biomassa o
percentual de celulose disponibilizada foi de 40% e a de hemicelulose de 2%. Dessa
forma, pde-se perceber que o eucalipto pr-tratado alcalinamente teve um aumento
do percentual de celulose de 39% em relao ao estado bruto do eucalipto. Podemos
comparar, por exemplo, a caracterizao do bagao de cana de acar que teve um
percentual de celulose de 44% e que aps a etapa de pr-tratamento resultou em
64% de celulose. Dessa forma, os resultados obtidos com o pr-tratamento teve um
percentual de 56% de aumento da celulose.55 Este resultado demonstra que a
biomassa bagao da cana de acar, por apresentar em sua estrutura menos
resistncia quanto ao pr-tratamento, teve um rendimento maior que a biomassa do
EU. Com isso, apesar do resultado ter sido menor para o EU, fica evidente que a
etapa de pr-tratamento foi eficaz e disponibilizou uma frao maior de celulose, que
era o desejvel, para a etapa da hidrlise enzimtica.
Estudos relatam que a hidrlise cida, com cido concentrado a temperaturas
elevadas, pode levar a dissociao da celulose.30 Contudo, existem outros estudos
30
que apontam a eficincia em outras biomassas, como por exemplo, o bagao da cana
de acar e a palha de centeio, sendo importante lembrar que estes experimentos
foram conduzidos em condies diferentes, como em temperaturas mais amenas e
concentraes de cidos menores. Dessa forma, durante o processo adotado, as
amostras podem ter sofrido perdas dos acares, tanto da celulose quanto da
hemicelulose, ou a degradao dos mesmos.56,57,58
Na Figura 10 so apresentados os trs estados (bruto, pr-tratado cido e o
pr-tratado alcalino) do eucalipto EU. Nota-se visivelmente que o EU teve uma
mudana na sua composio, pois a cor em cada etapa vai sendo modificada pela
remoo dos componentes como a hemicelulose no pr-tratamento cido e a lignina
no alcalino.
Figura 10 - Amostras de eucalipto EU: (A) eucalipto em seu estado bruto; (B) eucalipto aps prtratamento cido; (C) eucalipto aps pr-tratamento cido e seguido do alcalino.
4.2 Hidrlise enzimtica

Na etapa da hidrlise enzimtica, onde a celulose foi convertida a glicose, acar
fermentvel, os resultados so restritos aos pontos inicial e final, uma vez que este
estudo tem como foco principal o processo de fermentao. Atravs do modelo
matemtico da equao da reta, encontrada com a curva de calibrao para a glicose
31
no CLAE, pode-se quantificar a glicose que foi formada durante o processo.
Obteve-se com 24 horas de hidrlise enzimtica 20,69 g/L de glicose no meio.
De acordo com a metodologia de caracterizao, o rendimento mximo esperado
seria de 35,05 g/L, com isso foi observado que o rendimento mdio da hidrlise foi de
20,69 g/L, atingiu-se 59%.
Esta converso j era esperada visto que a madeira um material muito
recalcitrante quando comparado com outras biomassas, soma-se a isso o fato de que
a proporo slido/lquido em todas as etapas de processos 1:10, o que
normalmente no encontrado na literatura que de 1:30. Esta proporo utilizada
visando-se um processo em escala industrial.58,59,60
A cristalinidade da biomassa lignocelulsica um dos entraves para a
digestibilidade enzimtica, mas isso no explica a recalcitrncia dos substratos
lignocelulsicos.
pr-tratamento
cido
seguido
de
alcalino
diminui
consideravelmente a cristalinidade deste material, pois remove as pores de

hemicelulose e lignina, conforme visto nas anlises da composio qumica. Se
compararmos com o bagao da cana de acar a converso de celulose em glicose
aps a hidrlise enzimtica normalmente de aproximadamente 80%.58 Outro ponto
que deve ser observado que depende, tambm, da dosagem de enzimas que foi
estabelecido no procedimento.
4.3 Fermentao
Como comentado anteriormente, existem alguns fatores que afetam o desempenho
da levedura durante a fermentao. Dentre os principais fatores que podem afetar o
crescimento da levedura e a produo de etanol foram analisados a presena de
inibidores e a falta de nutrientes no meio em que ocorreu a fermentao, bem como
em meio contendo todas as necessidades deste microrganismo.
Dentro deste contexto ser mostrado nos itens a seguir o comportamento da
levedura, quanto ao seu crescimento e a sua produtividade.
32
4.3.1 Curva padro de levedura

Com os resultados de peso seco das leveduras e as absorbncias obtidas no
espectrofotmetro pelas diluies construiu-se o grficos do tipo da Figura 11 que a
curva padro utilizada para quantificao de microrganismos. A equao da reta
encontrada foi usada para calcular as concentraes do crescimento das leveduras
durante o processo de fermentao.
Concentraao da levedura [g/L]
0,6
y=0,592(ABS) - 0,042
2
R = 0,993
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Absorbncia
Figura 11 - Equao da reta gerada pela curva padro. Sendo y a concentrao desejada e ABS a
absorbncia.
Para encontrar uma equao onde o coeficiente de correlao estivesse

prximo de 1, ou seja, uma correlao muito forte, o procedimento foi repetido
algumas vezes at se chegar ao valor de R2 = 0,993. A repetio se deu devido a
necessidade de estabelecer as absorbncias em uma faixa que fosse > 0 e < 1, e
para isso foram feitas diversas diluies do meio em que se encontrava a levedura.
Este valor foi determinado para garantir que a concentrao de clulas encontra-se na
faixa linear da curva.
33
4.3.2 Crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae

Para o sucesso no desempenho de um processo fermentativo, necessrio que as
caractersticas do agente fermentativo, a levedura S. cerevisiae, sejam observadas e
respeitadas. A sobrevivncia e o crescimento da levedura dependem de um
adequado suprimento de nutrientes e de um ambiente fsico favorvel.
As fermentaes deste trabalho foram realizadas nas condies ambientais
necessria para o desenvolvimento das leveduras. Contudo, alguns meios no
continham substratos suficientes para a manuteno das mesmas. Os grficos com o
crescimento de cada meio demostrado e discutido a seguir. Os resultados
mostrados so os que melhores representaram a reprodutibilidade dos experimentos.
4.3.2.1 Meio sinttico
Para o crescimento das leveduras necessrio um meio de cultura apropriado que

simule ou at melhore a condio natural do ambiente em que se desenvolve. Um
meio de cultura sinttico um substrato nutritivo capaz de permitir a nutrio e o
crescimento dos microrganismos. O meio de cultura YPG 10% um meio rico para o
crescimento e desenvolvimento da levedura, assim como para a fermentao e
produo de etanol, principal produto desta fermentao.
Nesse sentido, o crescimento da S. cerevisiae no meio sinttico obteve um
crescimento desejado podendo ser visto, no grfico da Figura 12, que na fase lag o
microrganismo sofre com a adaptao ao meio, mais bem sutil. Na fase exponencial
onde ocorre o crescimento na ordem de 2n, sendo n o nmero de divises, a levedura
teve um crescimento expressivo. Aps a fase exponencial a levedura entra na fase
estacionria, no chegando fase de declnio devido ao tempo a qual foi monitorada.
Esta curva de crescimento da levedura foi avaliada e utilizada como padro de
comparao com as outras curvas de crescimento da levedura em outros meios que
foram analisados.
34
19
18
Concentraao [g/L]
17
16
15
14
13
Fase Lag
12
Fase exponencial
11
Fase estacionria
10
0
60
120
180
240
300
360
420
480
Tempo (min)
Figura 12 - Crescimento da levedura em meio sinttico.
Os resultados encontrados para o meio sinttico em relao ao crescimento do

microrganismo so: a taxa especfica de crescimento () da levedura foi de 0,0017
g/h-1 e o fator de converso de substrato em clula (YX/S) foi de 0,051 g/g. Estes
resultados serviram de modelo para os meios que foram analisados, como segue
abaixo.
4.3.2.2. Meio hidrolisado
Aps o pr-tratamento e a hidrlise enzimtica e com o hidrolisado suplementado com

glicose (100 g/L) a fermentao teve incio e seguiu conforme descrito na
metodologia. Nenhum tratamento de desintoxicao, para a eliminao de inibidores,
foi realizado no meio hidrolisado antes da fermentao.
Os resultados obtidos para o crescimento da levedura no meio hidrolisado so
demostrados na Figura 13, grfico que representa o seu crescimento neste meio, e
pde-se observar que a levedura no se adaptou ao meio o que prejudicou o seu
crescimento. A taxa especfica de crescimento da levedura () foi de 0,0005 g/h-1
enquanto que no meio sinttico a taxa foi de = 0,0017 g/h-1, como pode-se notar a
taxa do meio hidrolisado foi bem inferior a taxa do meio sinttico, com isso pode-se
35
afirmar que h alguma interferncia no desenvolvimento da levedura no meio
hidrolisado. O fator de converso de substrato em clula (YX/S) foi de 0,023 g/g, ou
seja, a metade da taxa encontrada no meio sinttico que foi de 0,051 g/g,
confirmando, assim, a incapacidade do desenvolvimento da levedura. Observou-se
que no meio sinttico foi obtido um aumento de 41% na concentrao de clulas e no
meio hidrolisado o crescimento obteve um aumento de 17%.
17
16
Concentraao [g/L]
15
14
13
12
11
10
9
8
0
60
120
180
240
300
360
420
480
Tempo (min)
Figura 13 - Crescimento da levedura no meio hidrolisado.
A produtividade de etanol na fermentao esta diretamente ligada ao

crescimento das clulas e da concentrao da massa celular, e que nos hidrolisados
lignocelulsicos esta relacionado, tambm, pelos inibidores derivados do prtratamento ou pela degradao dos acares gerados no processo.61 Neste sentido,
os dados observados na fermentao levaram-nos a inferir que o crescimento foi
afetado pela presena de inibidores, pois com a mesma levedura e com as mesmas
condies de operao, mudando-se somente o substrato, do meio sinttico que
rico em nutrientes para um meio hidrolisado, houve uma grande diferena no
comportamento da levedura.
A investigao no retardo do crescimento da levedura foi realizada utilizandose o CLAE, as amostras foram analisadas sem diluio, com tempo de reteno de 52
minutos para verificar a possibilidade da existncia de algumas molculas que
estivesse interferindo no desenvolvimento da levedura. Visto que na literatura Scarlata
36
e Hyman62 demonstraram que a presena do composto HMF foi encontrada no tempo
de reteno de 32,0 minutos e o furfural no tempo de reteno de 48,8 minutos, nas
mesmas condies de anlise que foi realizada neste estudo.
As analises realizadas no CLAE identificaram a presena dos compostos
furfural e hidroximetilfurfural, que mostra o tempo de reteno para o HMF em 31,7
minutos e para o furfural de 46,7 minutos, essa diferena pode ser atribuda pela na
coluna utilizada diversas vezes. Com base na figura 14, foram calculadas as suas
concentraes atravs da curva gerada com concentraes conhecidas destes
compostos. As concentraes encontradas foram de 0,026 g/L para o furfural e 0,007
g/L para o HMF. O furfural causa sobre as leveduras uma diminuio da taxa
especifica de crescimento e o HMF, apesar de menos txico tambm causa danos
membrana celular das leveduras, isto tem sido comprovado por diferentes estudos
realizados.63,64
Glicose
1,6x10
1,4x10
Intensidade u.a.
1,2x10
1,0x10
8,0x10
Etanol
4
6,0x10
4,0x10
Acido Lactico
2,0x10
HMF
Furfural
(X100)
(X100)
0,0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tempo de retenao (min)
Figura 14 - Cromatograma do tempo final da fermentao do meio hidrolisado sem diluio realizado
no CLAE.
37
4.3.2.3 Meio sinttico com inibidores
Ao ser constatado a presena dos compostos furfural e HMF no meio hidrolisado e

calculadas as suas devidas concentraes, descritas no item anterior, avaliou-se o
comportamento da levedura durante a fermentao adicionando estes compostos ao
meio sinttico.
Na Figura 15 pode-se perceber que a levedura obteve um crescimento com
rendimento prximo ao meio sinttico sem a presena destes compostos, mas houve
uma perda em suas taxas. A taxa especifica de crescimento () foi de 0,0011 g/h-1 e
no meio sinttico o = 0,0017 g/h-1 e o fator de converso de substrato em clula
(YX/S) de 0,033 g/g e para o meio sinttico YX/S = 0,051 g/g. Alm disso, verificou-se
que o aumento na concentrao de clulas no meio sinttico com a presena de
inibidores foi de 28%, e se compararmos com o meio sinttico puro que foi de 41% e
com o meio hidrolisado que foi de 17% constatamos que houve uma queda em
relao ao meio padro, mas um aumento em relao ao meio hidrolisado. Assim,
conclumos que o fator que estava impedindo o crescimento da levedura no meio
hidrolisado no era somente o fato de apresentar os compostos furfural e HMF.
17
16
Concentraao [g/L]
15
14
13
12
11
60
120
180
240
300
360
420
480
Tempo (min)
Figura 15 - Crescimento da levedura em meio sinttico na presena dos compostos furfural e HMF.
Pode-se supor que o fato da levedura ter se desenvolvido, mesmo que

precariamente, na presena de inibidores deve-se a concentrao destes compostos
38
presentes no hidrolisado serem muito baixas, pois na literatura a concentrao para
inibirem o crescimento de microrganismos pode variar, dependendo da biomassa e do
pr-tratamento que foi submetido.65 Para o furfural a concentrao encontrada foi de
0,4 g/L para o abeto (rvore confera do gnero Abies da famlia Pinaceae)66
enquanto que para a cana de acar e seu bagao 2,22 g/L. 67 Para o HMF a menor
concentrao encontrada foi de 0,06 g/L para a palha de milho 68 e a maior foi de 3,0
g/L para o abeto.69
4.3.2.4 Meio hidrolisado suplementado
Diante dos dados da taxa de crescimento () e o fator de converso (Y X/S) percebeuse que h sim uma interferncia significativa no crescimento do microrganismo na
presena destes inibidores, mas ela no to alta como no hidrolisado. Dessa forma,
suplementou-se o hidrolisado com sais inorgnicos que os microrganismos
necessitam para um crescimento satisfatrio, tendo este suplemento as condies
mnimas para o desenvolvimento do microrganismo. De acordo com a metodologia
descrita as alquotas de hidrolisado foram suplementadas e em seguida a levedura foi
inoculada no meio.
Com os resultados obtidos gerou-se o grfico da Figura 16 que demonstrou o
crescimento da levedura, com a presena dos sais. A levedura se comportou de
maneira eficiente, mesmo em no meio hidrolisado.
39
17
16
Concentraao [g/L]
15
14
13
12
11
10
9
8
0
60
120
180
240
300
360
420
480
Tempo (min)
Figura 16 - Crescimento da levedura no meio hidrolisado suplementado com sais inorgnicos.
As taxas encontradas neste procedimento foram = 0,0015 g/h-1 e Yx/s = 0,028

g/g. Nota-se que a taxa especifica de crescimento () foi bem prxima ao do meio
sinttico que de = 0,0017 g/h-1. Contudo, o fator de converso do substrato em
celular no foi expressivo, pois para o meio sinttico o valor foi de Y x/s = 0,051 g/g e
para o meio hidrolisado foi de Yx/s = 0,023 g/g. Dessa forma, o fator de converso no
teve uma melhora significativa com a presena dos nutrientes acrescidos no meio
hidrolisado.
Ao analisarmos o crescimento das clulas da levedura no meio hidrolisado
suplementado observou-se que houve um aumento na concentrao de massa de
31% e o meio hidrolisado o percentual foi de 17%, o que demonstrou um crescimento
prximo ao do meio sinttico que foi de 41%, e superior ao meio hidrolisado com
inibidores. Dessa forma, podemos concluir que o meio hidrolisado do EU tem uma
carncia de nutrientes que interferem no crescimento da levedura, mas que tambm
possui compostos que inibem o desenvolvimento deste microrganismo.
40
4.3.3 Consumo do substrato e a produo de etanol

A concentrao de substrato, pH, tempo e temperatura, presena de contaminantes
so fatores que podem afetar o rendimento da fermentao, ou seja, a eficincia da
converso de acar em etanol. Geralmente, h queda na eficincia do processo
fermentativo ou na qualidade do produto final.70
Com as amostras, do meio sinttico, meio hidrolisado, meio sinttico com
inibidores e meio hidrolisado suplementado, das fermentaes previamente diludas e
passadas no CLAE foram calculadas as concentraes do substrato (glicose) e do
produto (etanol) atravs da curva de calibrao. A curva de calibrao, para a glicose
e para o etanol, foi preparada com uma concentrao conhecida de 5 g/L, que o
limite de deteco do equipamento.
A seguir sero apresentados os rendimentos da fermentao nos diferentes
procedimentos que foram analisados.
4.3.3.1 Meio sinttico
As anlises realizadas no CLAE demonstraram que o comportamento da levedura

condiz com o seu crescimento, pois para que haja seu crescimento a mesma
necessita de substratos, o que, consequentemente, leva formao de produtos. Isso
ocorreu, pois o meio de fermentao, meio sinttico, forneceu os nutrientes
necessrios favorecendo tanto o crescimento microbiano quanto a formao do
produto.71
41
90
Glicose
Etanol
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Concentraao [g/L]
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Tempo (min)
Figura 17 - Consumo de glicose e produo de etanol no meio sinttico.
Os resultados obtidos para o consumo de substrato e da produo do produto

esto demonstrados no grfico da Figura 17. O fator de converso de substrato em
produto encontrado foi de (YP/S) 0,51 g/g e a eficincia de fermentao (E) foi de
100%. Demonstrando que todo o substrato, a glicose, foi consumido e transformado
em produto, o etanol, pelo processo biolgico da levedura.
Como o meio sinttico um meio rico em nutrientes para o desenvolvimento da
levedura os resultados obtidos foram o desejado, pois as condies eram as mais
favorveis para este rendimento. Ao verificarmos o comportamento da levedura
durante seu crescimento observou-se um aumento da concentrao de clulas de
41% e que a mesma passou pelas fases de crescimento de maneira bem definida. E,
alm disso, a quantidade de glicose no final da fermentao foi toda consumida e teve
uma concentrao igual a zero, o que gerou um rendimento de 100% de produto.
4.3.3.2 Meio hidrolisado
Ao analisarmos os resultados do meio hidrolisado, verificou-se que o fator de

converso de substrato em produto (YP/S) foi de 0,43 g/g e a eficincia de fermentao
E= 84%. Levando em conta que para a fermentao ser produtiva h a necessidade
42
de que a levedura se desenvolva satisfatoriamente no meio em que esta ocorrendo o
processo, observou-se que no meio sinttico a levedura obteve sua produo em
100%, sendo compatvel com o consumo de glicose que foi toda convertida em
etanol, e que o seu crescimento foi bem definido.
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Tempo (min)
Figura 18 - Consumo de glicose e formao de etanol no meio hidrolisado.
Os valores encontrados para o meio sinttico, YP/S = 0,51 g/g e E = 100%, em

termos numricos no ficaram muito acima dos resultados do meio hidrolisado, mas
pde-se observar no grfico da figura 18 que a glicose no foi totalmente consumida e
que a produo de etanol foi baixa, esta diferena de 16% na produo de etanol
pode acarretar perdas significativas nos rendimento financeiros das indstrias. Isso
pode estar atribudo ao crescimento da levedura no meio hidrolisado, que obteve uma
taxa = 0,0005 g/h-1, enquanto que no meio sinttico esta taxa foi de = 0,0017 g/h-1.
O no crescimento da levedura afetou a produo de etanol, contudo houve uma
produo de etanol, muito inferior ao meio sinttico.
4.3.3.3 Meio sinttico com inibidores
Nas etapas de pr-tratamento da biomassa lignocelulsica, especialmente quando

empregada a etapa com cido, so gerados ou liberados alguns compostos que tm
43
um efeito inibidor na fermentao. Esses compostos podem trazer prejuzo taxa de
crescimento e consequentemente a produtividade.64
Os resultados do meio sinttico com a presena dos compostos furfural e HMF
foram bem prximos aos resultados do meio sinttico puro. O fator de converso de
substrato em produto YP/S foi de 0,47 g/g e sua eficincia de fermentao E = 92%.
Os dados esto representados no grfico da Figura 19. Contudo, notvel que a
levedura no apresentou uma boa converso, como no meio sinttico puro, cujo os
resultados so YP/S = 0,51 g/g e E = 100%, e isso pode ser atribudo ao estresse que
foi submetido pela presena destes compostos.
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Tempo (min)
Figura 19 - Consumo de glicose e produo de etanol no meio sinttico na presena de inibidores.
Para a levedura, S. cerevisiae, usada na fermentao o furfural tem efeito

negativo na taxa especfica de crescimento, no rendimento de massa celular e na
produo de etanol, alm de diminui a viabilidade da levedura. 65 Estudos observaram
tambm, para a S. cerevisiae, que na presena de furfural e HMF, embora o
rendimento de biomassa sobre o substrato seja menor, o rendimento de etanol
maior.65,63
Com efeito, isto pode ser analisado quando observamos os valores dos fatores
de converso de substrato em clulas para o meio sinttico puro e para o meio
sinttico com os inibidores, YX/S = 0,051 g/g e YX/S = 0,033 g/g respectivamente, e as
taxas de eficincia de fermentao, E = 100% e E = 92%. Dessa forma, verificou-se
44
que houve uma diminuio na via metablica da levedura, o que acarretou uma queda
na concentrao final do produto no meio.
4.3.3.4 Meio hidrolisado suplementado
Como foi relatado anteriormente, para a realizao da fermentao, necessrio que

seja preparado um meio, que favorea tanto o crescimento microbiano quanto a
formao do produto. Consequentemente, a falta de nutrientes bsicos para o
desenvolvimento da levedura pode afetar o seu crescimento e a produo de etanol.
De acordo com os estudos citados acima, a falta de nutrientes pode causar um
prejuzo na formao do produto, e isto pde ser visto na produo de etanol no meio
hidrolisado puro, onde o fator de converso de substrato em produto (YP/S) foi de 0,43
g/g e a eficincia de fermentao E = 84%. Os dados gerados pela fermentao do
meio hidrolisado suplementado demostrados no grfico da Figura 20 nos mostram
que a levedura se desenvolveu de forma eficiente e os valores encontrados para o
fator de converso de substrato em produto foi de 0,505 g/g e sua eficincia de 99%.
Comprovando, assim, que h uma carncia de nutrientes no meio hidrolisado de EU e
que para uma fermentao vivel importante que haja uma suplementao do meio
resultante das etapas que precedem a fermentao.
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Figura 20 - Consumo de glicose e produo de etanol no meio hidrolisado suplementado.
Dessa forma, os nutrientes so necessrios para o bom desenvolvimento da

fermentao, afetando a velocidade e a multiplicao da levedura. A concentrao
adequada destes nutrientes no meio muito importante, pois se estiverem presentes
em quantidades insuficientes ou exageradas, podem refletir de forma negativa sobre o
processo fermentativo. E a falta de nutrientes pode acarretar consideravelmente o
rendimento de etanol e a viabilidade celular da levedura.70
Estudos apontam que os nutrientes participam do metabolismo da levedura
como ativadores das enzimas. No caso, quando uma quantidade de nutrientes
insuficiente, a levedura reproduz e conduz a fermentao lentamente ou mesmo sua
reproduo impossvel.72 E isso constata o que foi analisado nos meios onde a
presena de nutrientes era satisfatria. No meio hidrolisado a falta dos nutrientes
prejudicou o desenvolvimento da levedura e, consequentemente, a produo de
etanol.
46
Concluses e Perspectivas
5 Concluses e Perspectivas
A madeira de eucalipto da espcie Eucalyptus urophylla tem potencial para a
produo de etanol lignocelulsico, pois a quantidade de celulose presente em sua
composio bastante significativa. Contudo, mais explorada em outros setores,
como a construo e a produo de celulose para a fabricao de papel, e muito
pouco explorada como fonte de acares fermentveis.54
A caracterizao qumica do EU foi essencial para o desenvolvimento do
presente trabalho e os resultados aps a etapa de pr-tratamento foram abaixo dos
encontrados na literatura. O percentual de celulose disponibilizado aps o prtratamento alcalino para a celulose foi de 40% e para a hemicelulose de 2%. Dessa
forma, houve um aumento de 39% da celulose em relao ao seu estado bruto. Este
resultado demonstra que a etapa de pr-tratamento foi eficaz, pois disponibilizou uma
frao maior de celulose para o processo de hidrlise enzimtica. Nesta etapa a
converso de celulose em glicose foi de 59%.
O processo de fermentao uma parte de extrema importncia na obteno
de etanol lignocelulsico. Para que haja um crescimento microbiano suficientemente
bom, o meio de cultura deve conter os nutrientes em quantidades e propores
corretas para o crescimento e manuteno dos microrganismos, alm disso,
caractersticas como temperatura, pH e oxignio devem estar de acordo com as
necessidades do microrganismo.
A fermentao do meio hidrolisado foi a que obteve os menores ndices quando
comparado aos outros meios. O meio sinttico serviu de padro para analisar
primeiramente o meio hidrolisado puro. Os valores encontrados para os parmetros
analisados foram: = 0,0017 g/h-1, YX/S = 0,051 g/g, YP/S = 0,51 g/g e E = 100%.
Ao verificar que o comportamento da levedura no meio hidrolisado, atravs dos
parmetros = 0,0005 g/h-1, YX/S = 0,023 g/g, YP/S = 0,43 g/g e E = 84%, comparando
com o meio sinttico, constatou-se que algum fator impede o desenvolvimento da
levedura, neste meio. E que esta diferena no rendimento da fermentao, 16%,
acarreta em perdas significativas para o setor de produo de etanol lignocelulsico,
nos rendimentos das indstrias.
47
Concluses e Perspectivas
As anlises do meio hidrolisado realizadas no CLAE mostraram a presena dos
compostos furfural e HMF, mesmo que em concentraes baixas. Aps detectar estes
compostos foi feita a fermentao em um meio sinttico com os inibidores para avaliar
o comportamento da levedura. Os valores encontrados foram: = 0,0011 g/h-1, YX/S =
0,033 g/g, YP/S = 0,47 g/g e E = 92%, e notou-se que apesar da melhora em relao
ao meio hidrolisado a levedura no apresentou uma boa converso, ao comparamos
com o meio sinttico, e isso pode ser ao fato de que a levedura sofreu na presena
dos inibidores.
Ao analisar o comportamento da levedura no meio hidrolisado suplementado
percebeu-se que o seu desenvolvimento foi melhor do que do meio hidrolisado sem o
suplemento, como mostra os resultados = 0,0015 g/h-1, YX/S = 0,028 g/g, YP/S =
0,505 g/g e E = 99%. Mesmo com os sais minerais no meio hidrolisado a levedura
teve um fator de converso muito abaixo do meio sinttico e seu rendimento no foi
total.
Como demonstrado acima, pde-se concluir que a presena de inibidores e a
ausncia de nutrientes no meio hidrolisado afetam o crescimento da levedura e,
consequentemente, a produo de etanol. Comprovando, como citado anteriormente,
que h a ao de inibidores neste processo, que causam perdas significativas no
rendimento e um tempo maior de reao.
Assim, visando a melhoria do processo e um rendimento significativo do
biocombustvel sugere-se estudar mais detalhadamente a etapa de fermentao do
hidrolisado de eucalipto. Investigando e analisando os hidrolisados quanto a sua
composio qumica e a presena de compostos que inibem a fermentao.
48
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Universidade de Braslia

Fatores que Influenciam na

Sumara Teixeira Alves

Orientador: Prof. Dr. Brenno Amaro da Silveira Neto

Braslia, Maro de 2014

Fatores que Influenciam na

Sumara Teixeira Alves

requisito para obteno do

Braslia, Maro de 2014

Dedico este trabalho primeiramente a Deus que me ama incondicionalmente.

3. Materiais e mtodos .............................................................................................. 18

4 Resultados e Discusso ..................................................................................... 29

5 Concluses e Perspectivas ................................................................................ 47

Lista de Abreviaes e Acrnimos

Lista de Abreviaes e Acrnimos

Agncia Internacional de Energia

Ammonia fiber expansion

Cromatgrafo Lquido de Alta Eficincia

Extrato de levedura, Peptona bacteriolgica, Glicose

Fator de converso de substrato em clulas

Fator de converso de substrato em produto

Nicotinamida adenina dinucleotdeo

Taxa especfica de crescimento celular

Filter Paper of Unit

1.1 Produo de Bioetanol de materiais lignocelulsicos

1.3 Resduos gerados pelo uso da madeira

1.4 O material lignocelulsico

Figura 1 - Representao esquemtica da molcula de celulose. (adaptada da ref. 2).

Figura 2 - Representao esquemtica da hemicelulose. (adaptada de ref. 2)

Figura 3 - Representao esquemtica da lignina de eucalipto. (adaptada de ref. 2).

1.5 Produo de etanol a partir de materiais

A lignina e a hemicelulose devem ser seletivamente removidas pelos mtodos

Figura 5 - Hidrlise da celulose. (adaptada da ref. 33)

1.5.2.1 Hidrlise enzimtica

1.5.2.2 Hidrlise qumica

1.5.3.1 O microrganismo da fermentao

Figura 6 - Imagem da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Para a produo de bioetanol lignocelulsico deve-se levar em conta que a

1.5.3.2 Os inibidores da fermentao

2.2 Objetivos Especficos

eucalipto Eucalyptus urophylla EU, cultivada na regio entre Ponta Por

cerevisiae CAT-1 (levedura para a produo de etanol). Para o meio sinttico

Molecular Devices, modelo Spectramax.

3.2.2.1 Pr-tratamento cido

3.2.2.2 Pr-tratamento alcalino

3.2.3 Caracterizao da biomassa

3.2.4 Hidrlise enzimtica

Figura 7 - Hidrlise enzimtica aps 24 horas de incubao.

3.2.5.2 Tcnica de esgotamento

Para acompanhar o crescimento celular ao longo da fermentao utilizou-se o

3.2.5.3.1 Curva padro

Determinao da razo massa de clula versos comprimento de onda

Determinao da concentrao nas amostras

3.2.5.4 Fermentao meio sinttico

3.2.5.5 Fermentao meio sinttico com inibidores

3.2.5.6 Fermentao meio hidrolisado

3.2.5.7 Fermentao meio hidrolisado com suplementos

3.2.6 Clculos dos parmetros de fermentao

3.2.6.1 Taxa especfica mxima de crescimento (max)

Onde X a concentrao celular (g/L) e t o tempo (minutos).

3.2.6.2 Fator de converso de substrato em produto (YP/S)

Onde P a concentrao do produto (g/L) e S a concentrao de substrato

3.2.6.3 Fator de converso de substrato em clulas (YX/S)

3.2.6.4 Eficincia de fermentao (E)