GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Y PREGUNTAS SOBRE TEMAS DE LAS CLASES

TERICAS

CURSO DE INMUNOLOGA BSICA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

U.N.C.P.B.A.

2014

CURSO DE INMUNOLOGA BSICA

2014
Contenidos
I Inmunobiologa
1. Introduccin a la Inmunologa: referencias histricas.
2. Inmunologa; relaciones con otras ciencias. Especialidades.
3. Inmunidad; funciones; clasificacin.
4. Asociaciones biolgicas: Integrantes. Enfermedad infecciosa; etiologas. Factores de
virulencia; toxinas; enzimas; adhesinas; cpsulas. Dosis infectante. Puerta de entrada.
Sobrevida intra y extracelular. Patogenia: contacto; penetracin; histotropismo; infeccin;
enfermedad; transmisin (en comn con el curso de microbiologa).
I.I Sistema inmunitario
1. Sistema inmunitario o inmunocompetente; Comparacin del SI de los vertebrados
superiores con el de especie animales ms primitivas. Ontogenia; Composicin: rganos.
Sector de formacin. Mdula sea. Clulas troncales. Mielopoyesis y linfopoyesis.
Citoquinas participantes. Sector de diferenciacin (rganos primarios). Timo; bolsa de
Fabricio; placas de Peyer ileocecales; Sector de activacin y generacin de respuestas
inmunitarias (rganos secundarios) mdula sea; ganglios linfticos; bazo. Tonsilas,
ndulos linfoides. Estructura relacionada con la funcin.
2. Sistema inmunitario asociado a mucosas; organizacin y funcin. Sectores inductivos y
efectores. Linfocitos intraepiteliales. Placas de Peyer yeyunales. Clulas M.
3. Clulas: clasificacin; ontogenia. Linfocitos T y B; marcadores; receptores; recirculacin;
maduracin final. Subpoblaciones T (Th1, Th2, Th3) Diferencias segn especie;
polimorfonucleares neutrfilos, eosinfilos y basfilos; mastocitos; plaquetas.
4. Clulas presentadoras; macrfagos; sistema de Langerhans; clulas dendrticas
(interdigitantes); endoteliales; linfocitos B. Otras clulas. Importancia; funciones.
I.2 Inmunidad Innata
1. Factores condicionantes: genticos, nutricionales, edad, estrs, sanidad.
2. Barrera cutneo-mucosa, piel. Aparato digestivo. Aparato respiratorio. Aparato
genitourinario. Glndula mamaria. Ojos.
3. Mecanismos de reconocimiento inmunitario innatos (inmunidad innata): Patrones
moleculares de agentes patgenos (PMAP). Receptores para PMAP.
4. Indicadores tempranos de infeccin: inflamacin: signos clnicos; dinmica. Protenas
de fase aguda (PFA). Colectinas. Pentraxinas: protena C reactiva, amiloide srico.
Protenas fijadoras de manosa y de lipopolisacridos. Sistema del Complemento;
nomenclatura. Vas de activacin: va clsica: inductores; unidad de reconocimiento;
unidad de activacin; unidad de ataque de membrana; amplificacin. Va alterna:
inductores; unidad de activacin; unidad de ataque de membrana; amplificacin. Va de
las lectinas. Enzimas lticas: Lisozima y otras. Interferones tipo I.
5. Sistemas de captura de material extrao. Fagocitosis. Sistema mieloide:
polimorfonucleares neutrfilos; polimorfonucleares eosinfilos. Sistema Fagoctico
Mononuclear; Clulas de Langerhans. Quimioquinas: funcin en la infeccin. Selectinas.
Integrinas. Mecanismo de la fagocitosis. Funciones. Mecanismos microbicidas
dependientes e independientes del oxgeno. Compuestos microbicidas derivados del
nitrgeno. Defensinas.
6. Clulas Asesinas Naturales (NK): tipos; caractersticas; funciones y mecanismos de
accin. Perforinas y granzimas.
2

I.3 Inmunidad adaptativa: Inmungenos y Antgenos.

1. Inmungenos; Inmunogenicidad. Atributos de un inmungeno: exogenicidad, tamao,
estabilidad metablica, estado biolgico. Efecto de la dosis, adyuvantes, especie animal,
edad.
2. Especificidad. Antgenos: caractersticas, clasificacin. Composicin qumica: protenas,
hidratos de carbono, lpidos, mixtos o combinados. Antgenos timoindependientes y
timodependientes. Epitopes T y B. Superantgenos y su relacin con la enfermedad.
Competicin antignica; importancia. Metabolismo: caractersticas; fases; destino.
I.4 Generacin y expresin de la respuesta inmunitaria adaptativa.
1. Inmunidad adaptativa (adquirida o especfica). Inmunidad mediada por anticuerpos;
inmunidad mediada por clulas.
2. Procesamiento de protenas y presentacin de antgenos. Clulas presentadoras
profesionales y no profesionales. Clulas dendrticas, macrfagos y linfocitos B. Gnesis
de las molculas del complejo mayor de histocompatibilidad (mCMH: clases I y II). Vas
de procesamiento endgena (citoslica) y exgena (endosmica). Circuitos del antgeno
(pptido) dentro de la clula presentadora. Presentacin. Interaccin con receptores y
correceptores. CD4 y CD8; B7. Superantgenos. Interaccin con LT . Importancia de la
va de procesamiento en el establecimiento de una respuesta efectora adecuada.
Presentacin de antgenos no peptdicos. Presentacin va CD1.
3. Inmunidad mediada por anticuerpos: Inmunoglobulinas; Anticuerpos; seleccin clonal.
Anatoma y dinmica de los centros germinativos: induccin, ubicacin ganglionar,
procesamiento, presentacin, colaboracin celular, proliferacin celular; hipermutaciones
y ajuste de la afinidad; diferenciacin celular. Clula plasmtica: biosntesis de Ac; clula
B de memoria.
4. Inmunoglobulinas: sntesis, composicin; estructura; dimensiones; propiedades;
distribucin; funciones; catabolismo; isotipos; subisotipos; idiotipos; alotipos. Nociones
sobre generacin de la diversidad. Inmunoglobulinas secretorias: induccin; isotipos; Ig
A secretoria: biosntesis, estructura, secrecin, circuito enteroheptico, funciones.
5. Dinmica de la respuesta inmunitaria; respuesta primaria y secundaria: evolucin y
caractersticas. Cambio isotpico. Afinidad. Memoria inmunitaria.
6. Inmunidad mediada por clulas: induccin: linfocitos T efectores: linfocitos T de
hipersensibilidad tarda; linfocitos T citotxicos; linfocitos T colaboradores; linfocitos T
supresores; linfocitos T de memoria Fenmenos de citotoxicidad. Apoptosis. Citotoxinas:
perforina y granzimas. Activacin del macrfago.
I. 5 Regulacin de la Respuesta Inmunitaria
1. Mecanismos de control: importancia; tipos: fisiolgicos, celulares, genticos, (i) por el
inmungeno: Tolerancia inducida; caractersticas: tipos de inmungenos, dosis, va, edad,
aparicin, persistencia, uso de drogas; induccin: subpoblaciones LT y LB; (ii) por los
Ac: mecanismos de retroalimentacin, concentracin de Ig, inmunocomplejos (IC),
idiotipos; (iii) por clulas: mecanismos de restriccin del CMH, linfocitos CD4 y CD8,
macrfagos supresores; (iv) por otros factores.
2. Equilibrio de respuesta inmunitaria humoral versus celular. Nociones de respuesta de
tipo I y tipo II. Citoquinas reguladoras.
II Inmunodiagnstico
1. Pruebas in vitro: Reactantes: tipos, obtencin, manejo, conservacin. Suero, plasma,
otros fludos biolgicos.

2. Unin Ag-Ac: teoras, fase especfica, fuerza de unin, afinidad, avidez; fase inespecfica:
factores condicionantes, clasificacin: interaccin primaria, secundaria y terciaria.
3. Pruebas de interaccin primaria: tipos: radioinmunoensayo, inmunofluorescencia,
inmunoenzimticas (ELISA, Western blot, dot-blot): Fundamentos.
4. Pruebas de interaccin secundaria: tipos: precipitacin en medios lquidos y
gelificados; aplicacin; aglutinacin: directas, indirectas; aplicaciones. Fundamentos.
5. Expresin del resultado de una prueba: pruebas cualitativas, semicuantitativas y
cuantitativas. Ttulo: significado y determinacin. Conversin serolgica.
6. Estudio de las protenas sricas: electroforesis, inmunoelectroforesis, aplicaciones.
7. Anticuerpos monoclonales: propiedades, obtencin y aplicaciones.
III Inmunoprofilaxis
1. Inmunoprofilaxis: Objetivos. Inmunidad activa: vacuna: finalidad, caractersticas:
seguridad y eficacia; clasificacin: (i) por su finalidad, (ii) por su substrato, (iii) por su
especificidad, (iv) por su estado biolgico, (v) por la va de aplicacin.
2. Vacunas y respuesta inmunitaria: vas de inmunizacin en relacin con la patogenia y
la respuesta inmunitaria buscada, seleccin, aplicaciones.
3. Vacunas convencionales: tipos. Atenuacin: por pasajes en otras especies o por cultivos.
Razones de la atenuacin: ejemplos. Vacunas inactivadas. Mtodos de inactivacin.
4. Vacunas de nueva generacin: recombinantes (protenas de fusin, vectores vacunales
bacterianos y virales, mutantes atenuadas, mutantes con antgenos marcadores),
peptdicas, a ADN desnudo, anti-idiotpicas, otras. Caractersticas, ventajas potenciales.
5. Adyuvantes. Tipos. Clasificacin (origen animal, vegetal, mineral, sinttico).
Mecanismos de accin. Inmunomodulacin. Usos.

PERFIL DEL CURSO

Departamento: Sanidad Animal y Medicina Preventiva (SAMP)
Cuatrimestre de Dictado: 1er Cuatrimestre
Duracin: 10 semanas
Pgina web: http://www.vet.unicen.edu.ar/facultad/areas
Organizacin:
Clases gua: 9
Talleres de integracin: 2
Trabajos Prcticos: 5
Integrantes del curso:
Guillermo Arroyo, M. V.
Silvia Estein, M. V., Dr.
Anala Etcheverra, M. V., Dr
Silvina Gutirrez, M. V., Dr.
Paula Lucchesi, Ing. Agr., Dr.
Claudia Ltzelschwab, M.V., Dr.
Nora La Padola, M. V., Dr.
Marcelo Sanz, M.V., Dr.
Daniel Fernndez, M.V., Dr.
Vanesa Fernndez, M.V.

gharroyo@vet.unicen.edu.ar
silmares@vet.unicen.edu.ar
analiain@vet.unicen.edu.ar
segutier@vet.unicen.edu.ar
paulaluc@vet.unicen.edu.ar
clutzvet@gmail.com
nlpadola@vet.unicen.edu.ar
msanz@vet.unicen.edu.ar
dfer_inm@vet.unicen.edu.ar
vanesaf@vet.unicen.edu.ar

Descripcin del curso:

El curso provee conocimientos sobre los componentes del sistema inmune y los
mecanismos inmunolgicos bsicos, cubriendo aspectos importantes para la formacin del
profesional veterinario. En los talleres de integracin se realizarn actividades de
autoevaluacin con una discusin grupal posterior. Los trabajos prcticos desarrollarn los
fundamentos de las pruebas de diagnstico con base inmunolgica ms importantes para el
diagnstico clnico. Los talleres y los trabajos prcticos son de asistencia obligatoria.
Objetivos
A-Objetivos del Curso
Los objetivos del curso son:
1. Comprender los conceptos ms importantes sobre los que se basa el funcionamiento
del sistema inmune.
2. Conocer las funciones de tejidos, clulas, protenas y genes del sistema inmune.
3. Comprender los mecanismos, interacciones y regulacin de la respuesta inmune.
4. Conocer el fundamento de los mtodos con base inmunolgica utilizados para el
diagnstico veterinario.
B-Objetivos de aprendizaje
Para que el alumno adquiera dominio de la fisiologa del sistema inmune debe lograr:
1. Adquirir el vocabulario especfico de la materia.
2. Identificar los estmulos capaces de activar al sistema inmune.
3. Conocer la diferencia conceptual entre la inmunidad innata y adaptativa.
4. Comprender los mecanismos humorales y celulares que intervienen en la inmunidad
innata.
5. Comprender los mecanismos que intervienen en la respuesta humoral y celular de la
respuesta inmune adaptativa y su regulacin.
6. Explicar los principios de la inmunoprofilaxis
7. Comprender los fundamentos de los mtodos inmunolgicos utilizados para el
diagnstico veterinario.
5

Objetivos de
aprendizaje

Recursos para la
enseanza

Clases tericas
gua
3 Talleres de
integracin
3 Uso de libros de
texto y material
seleccionado por los
docentes
3 Confeccin de
glosario personal
3

B1, B2, B3, B4, B5,

B6

Clases prcticas
Clases tericas
gua
3 Taller
3 Uso de libros de
texto y material
seleccionado por los
docentes

Aptitudes que se
pretende
desarrollar
3 Seleccin de
conceptos relevantes
3 Comprensin e
3 Evaluacin
interrelacin de
sumativa mediante 2
componentes y
exmenes parciales
mecanismos
escritos
3 Comprensin de
3
Evaluacin
los mecanismos
formativa durante los
inmunitarios ms
talleres de integraimportantes
cin
3 Adquisicin y
desarrollo de una
metodologa de
estudio
Evaluacin

3
3

B7

3 Evaluacin
escrita de trabajos
prcticos
3 Examen parcial
escrito

3 Manejo de
material de
laboratorio
3 Comprensin del
fundamento de las
pruebas con base
inmunitaria.

Bibliografa
Tizard I.R. 2009. Introduccin a la Inmunologa Veterinaria: 8 va Ed. Elsevier Espaa
S. L. ISBN 978-84-8086-431-2.
Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S. 2008. 6ta. Ed. Elsevier. ISBN N
9788480863117
Fainboim, L., Geffner, J. Editores. 2011. Introduccin a la Inmunologa Humana. 6
Ed. Editorial Mdica Panamericana. ISBN 978-95-0060-270-9.
Pennimpede, E., Gomez, C., Stanchi, N. Editores. 2004. Introduccin a la
Inmunobiologa. 1 Ed. Edulp. La Plata. Argentina. ISBN 950-34-0259-x.
Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. 2001.
Immunobiology. 5th ed. New York and London: Garland Publishing;. ISBN 08153
3642X (en ingls).

Parham, Peter. 2000. The Immune System. New York and London: Garland
Publishing ; ISBN 0-8153-3043-X (en ingls).

Regueiro, J.R.; Lopez Larrea C. 1996. Inmunologa. Biologa y Patologa del sistema
inmune. 2da Ed. Editorial Medica Panamericana S.A. ISBN 84-7903-403-3

Rojas-Espinosa, O. 1996. Inmunologa (de memoria). 1 Ed. Editorial Mdica

Panamericana, S.A. de C.V. ISBN 968-7157-72-0
Material complementario elegido por los docentes.
Gua de Trabajos Prcticos. Curso de Inmunologa Bsica 2014. Disponible en
Fotocopiadora del Centro de Estudiantes. Estar disponible tambin en la pgina web del
curso.

Conocimientos Previos requeridos

Se espera de los alumnos tengan conocimiento bsico de:
biologa celular
anatoma macroscpica
histologa del sistema linftico y sanguneo
Estructura de los talleres de integracin:
Se realizarn antes de cada parcial, para reforzar e integrar los conceptos ms importantes.
Se trabajar respondiendo un cuestionario y luego se discutirn las respuestas entre docentes y
alumnos.
La presentacin verbal de los temas planteados en cada taller a los docentes y al resto de los
alumnos ejercitar la expresin oral de los alumnos, fomentar la discusin de los temas,
ayudar a la comprensin e integracin de los mismos y contribuir al dominio del
vocabulario especfico.
Estructura de las clases prcticas:
Las clases prcticas introducirn a los fundamentos de las principales pruebas inmunolgicas
utilizadas en diagnstico veterinario, para lo cual se cuenta con una gua de trabajos prcticos
que contiene los fundamentos tericos del tema a desarrollar y que cada alumno debe traer
leda al momento del prctico. Se desarrollarn en 3 comisiones de trabajo en los laboratorios
del edificio SAMP y comprendern una explicacin de 15 minutos por parte de los docentes,
con participacin activa de los alumnos, y luego la realizacin de tareas de laboratorio, lectura
de pruebas serolgicas y actividades de integracin de fundamentos tericos.
Evaluaciones:
Trabajos prcticos: sern evaluados mediante un breve cuestionario escrito al final de la
actividad de laboratorio y calificados como aprobado o desaprobado.
Exmenes parciales: sern escritos, con preguntas estructuradas, semiestructuradas y a
desarrollar.
-Condiciones de aprobacin del curso:
1) 75% de asistencia y aprobacin de actividades obligatorias (3 Trabajos Prcticos
aprobados):
2) Aprobacin de los 2 exmenes parciales y del examen final.
-Para poder recuperar, deben tener un mnimo de 2 TP aprobados y como mximo 1
ausente, dado que se recupera hasta el 50% de las actividades obligatorias desaprobadas. Los
ausentes sin certificado no se recuperan.
Los certificados mdicos se deben traer dentro de las 48 hs de la inasistencia (hasta martes
siguiente inclusive)
Un ausente con certificado a una actividad obligatoria se recupera el viernes siguiente

Clases de consulta:
Se atendern consultas, con el fin de aclarar temas puntuales, en la oficina de atencin de
alumnos del edificio SAMP, en los horarios que figuren en cartelera.

TRABAJOS PRCTICOS
TP 1: Toma y conservacin de muestras. Proteinograma. Serologa
Objetivos: Que el alumno:
Conozca las muestras ms utilizadas para la deteccin de anticuerpos y/o antgenos en el diagnstico
serolgico, su obtencin, remisin y conservacin, y los fundamentos de la serologa.
Reconozca las distintas fracciones proteicas del suero sanguneo obtenidas mediante un
proteinograma. electrofortico.
Contenido
Venas de eleccin para la extraccin de sangre en las diferentes especies. Material necesario, modo de
obtencin. Toma de muestra con y sin anticoagulantes. Remisin al laboratorio (tiempo y temperatura
de remisin).
Separacin de plasma y suero. Caractersticas de una buena muestra. Conservacin de la muestra
(tiempo y temperaturas adecuadas).
Toma de otros tipos de muestra: secreciones (leche, calostro, lgrima, mucus, secrecin vaginal y
prepucial, semen y plasma seminal, lquido articular, etc) y tejidos (biopsias).
Observacin de proteinogramas electroforticos normales e identificacin de diferentes bandas de
protenas sanguneas.
Serologa, definicin y valor diagnstico. Anticuerpos. Fuerzas de unin entre anticuerpos y antgenos.
TP2 : Pruebas de interaccin primaria: fundamentos
Objetivos: Que el alumno:
Comprenda los fundamentos de las principales tcnicas serolgicas de interaccin primaria utilizadas
en diagnstico veterinario.
Utilice el material de laboratorio para realizar algunos pasos de las pruebas de ELISA.
Interprete diferentes variantes de pruebas de ELISA y sus posibles resultados.
Contenido
Clasificacin de las pruebas serolgicas. Tcnicas de interaccin primaria. Concepto. Fundamentos,
conjugado, tipos de marcadores, enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunofluorescencia directa e
indirecta (IFD, IFI), ensayo de polarizacin de la fluorescencia (FPA), radioinmunoensayo (RIA),
Inmunocromatografa Western Blot, Citometra de flujo. Aplicacin en la identificacin de clulas.
TP3: Pruebas de interaccin secundaria
Objetivos: Que el alumno comprenda los fundamentos de las principales tcnicas serolgicas de
interaccin secundaria utilizadas en diagnstico veterinario.
Contenido
Pruebas de interaccin secundaria. Concepto. Fundamento, clasificacin (aglutinacin en placa,
aglutinacin en tubo, inmunodifusin radial, inmunodifusin bidimensional), deteccin de diferentes
isotipos de Ig. Fenmeno de prozona.
TP4: Aglutinacin y precipitacin
Objetivos: Que el alumno:
Realice pruebas de aglutinacin en placa (rpidas).
Observe los resultados de pruebas de aglutinacin en tubo (lentas) y de inmunodifusin radial y
bidimensional.
Realice reacciones de aglutinacin cualitativas y semicuantitativas.
Identifique el isotipo responsable de la aglutinacin, comparando los resultados de la prueba en
presencia y ausencia de -mercaptoetanol.
Explique el fenmeno de prozona.
Contenido
Pruebas de interaccin secundaria. Fundamento, clasificacin (aglutinacin en placa, aglutinacin en
tubo, inmunodifusin radial, inmunodifusin bidimensional), deteccin de diferentes isotipos de Ig.
Fenmeno de prozona. Ttulo de un suero.

 TP5: Caractersticas de la pruebas serolgicas. Integracin de TP

Objetivos: Que el alumno:
Discuta conceptos importantes relacionados con la serologa.
Identifique y describa las pruebas serolgicas adecuadas para distintas situaciones.
Contenido
Conversin serolgica o seroconversin, Ac monoclonales, afinidad, avidez, especificidad de un Ac,
reaccin cruzada, sensibilidad y especificidad de una prueba serolgica. Pruebas de interaccin
primaria y secundaria.

TRABAJO PRCTICO N1
TOMA Y CONSERVACIN DE MUESTRA PROTEINOGRAMA - SEROLOGA
Extraccin sangunea: obtencin de plasma y suero, remisin y conservacin de la
Muestra.
La toma de muestra es una etapa esencial para asegurar un buen diagnstico. En la extraccin
sangunea es imprescindible que se utilice material limpio y seco (agujas de calibre adecuado,
jeringas, tubos rotulados, tapones) para evitar la contaminacin y hemlisis de la muestra. Es
importante conocer para qu se utilizar la muestra y qu volumen de muestra es necesario
tomar. Si se desea obtener sangre para recuento de clulas sanguneas, para analizar la
presencia de microorganismos o para obtener plasma, la extraccin debe realizarse en tubos
con anticoagulante (EDTA o heparina). Para obtener suero, la sangre se deja coagular en
determinadas condiciones de tiempo y temperatura.

Suero
Cogulo
Sangre sin anticoagulante

Sangre entera
Plasma
Leucocitos
Glbulos rojos

Sangre con anticoagulante

Las tcnicas de extraccin varan de una especie a otra, segn el vaso sanguneo de eleccin y
el espesor, dureza y capa de la piel.
En los rumiantes y equinos, la sangre se extrae de la vena yugular o bien de la vena caudal
(bovinos). La vena yugular se ingurgita por compresin manual del canal yugular y se
introduce la aguja por encima de este punto. La extraccin puede realizarse directamente de la
aguja al tubo o con jeringa llevando el mbolo hacia atrs lentamente. Tambin puede
utilizarse el sistema de tubos al vaco (tipo vacutainer), que presentan mayor facilidad de uso
y garanta en cuanto a la asepsia y preservacin de las muestras; este sistema manejado en
forma adecuada presenta un menor riesgo de hemlisis de las muestras, con respecto al
sistema de extraccin con jeringa. Si la extraccin se practica sin jeringa, para que no se
genere turbulencia y se produzca la hemlisis, se saca la aguja y se deja que la sangre fluya
lentamente por las paredes del tubo. Cuando la extraccin se realiza a partir de la vena
caudal, se levanta la cola y se introduce la aguja a 15 cm de la base de la cola en la lnea
media hasta que penetre en el vaso.
En cerdos la muestra se obtiene a partir de la puncin de la vena de la oreja.
En perros y gatos la muestra se extrae de la vena ceflica antebraquial o de la vena safena.
10

En las aves se realiza por puncin de la vena radial (alar).

Equino

Vena yugular

Bovino, ovino, caprino

Vena yugular o vena caudal (bovino)

Cerdo

Vena de la oreja

Perro y gato

Vena ceflica antebraquial o vena safena

Ave

Vena radial

Cuando la muestra se toma con la adicin de anticoagulante, luego de verter la sangre entera
en el tubo, se realiza la homogeneizacin mediante una suave inversin. Cuando la sangre
entera no se procesa inmediatamente, debe conservarse refrigerada (4C-8C) de lo contrario
se mantiene a temperatura ambiente (20-22C). Para obtener el plasma, la sangre se centrifuga
a 1500-2000 r.p.m. durante 10-15 min. y se separa la capa lquida (superior). ste se extrae
mediante aspiracin con una pipeta y se almacena en viales o tubos.
Para la obtencin del suero, se deja coagular la sangre en el tubo a temperatura ambiente
durante un tiempo mnimo de 1-2 h. y mximo de 12 h. (cuanto ms tiempo se deje para que
la retraccin tenga lugar, mayor cantidad de suero se obtendr aunque nunca ms del 40% del
volumen total). La coagulacin y retraccin se produce ms rpido si se incuba la sangre en
estufa a 37C durante 1-2 hs y luego se lleva a refrigeracin durante 30 min. ms. El suero
obtenido a partir de la retraccin del cogulo es separado con la ayuda de una pipeta. Si
existieran glbulos rojos en suspensin deber centrifugarse a 1500-3000 r.p.m. y obtener el
sobrenadante.
La coagulacin es un proceso que ocurre a temperatura corporal. Para obtener un buen suero
la muestra se debe incubar entre 20-37C (a menor temperatura mayor tiempo de incubacin).
Las muestras de suero y plasma (sin clulas) pueden conservarse refrigeradas (4C) si van a
utilizarse en corto plazo, de lo contrario si se pretende una conservacin por ms tiempo se
distribuye en alcuotas y se congela a (-20C). El fraccionamiento evita las congelaciones y
descongelaciones sucesivas las cuales conllevan a la desnaturalizacin y agregacin de las
protenas.
Las caractersticas deseables de un suero o plasma es que sea translcido e inodoro. Esto
implica que no deben utilizarse en las pruebas serolgicas sueros hemolisados o
contaminados.
Otras muestras de utilidad para el inmunodiagnstico o diagnstico serolgico
Para obtener muestras de secreciones vaginales o de tracto prepucial se realiza la perfusin de
solucin salina, luego se colecta el lquido del lavado y se centrifuga para eliminar todo tipo
de partculas.
Cuando se desea obtener plasma seminal debe usarse un electroeyaculador o vagina artificial.
Una vez obtenida la muestra debe centrifugarse para obtener el sobrenadante que se retira con
pipeta.
Las muestras de descargas nasales, lgrimas, secreciones vaginales o prepuciales se realizan
mediante hisopado. Luego el hisopo se coloca en solucin salina con el agregado de un agente
bacteriosttico durante 24 h. a 4C para permitir la difusin de las molculas. La eliminacin
de partculas extraas se logra mediante centrifugacin. La muestra se conserva a (-20C).
Las muestras de leche o calostro se toman directamente en el tubo y se agrega algn agente
bacteriosttico. La conservacin y remisin de la muestra se realiza a 4C.

11

Muestras de tejidos:
Las muestras tomadas se procesan hasta obtener el preparado histolgico en el portaobjetos.
ste puede utilizarse para la deteccin de Ag o Ac en pruebas de inmunofluorescencia o
inmunohistoqumica. Estas pruebas tambin pueden desarrollarse sobre frotis o improntas.
PROTEINOGRAMA ELECTROFORTICO
El proteinograma electrofortico (o electroforesis de protenas del suero) es una tcnica
simple de laboratorio que permite separar las protenas sricas en distintas fracciones por
medio de la aplicacin de un campo elctrico.
Esta prueba es muy usada para evaluar y monitorear distintos cuadros clnicos as como
tambin de gran ayuda en el diagnstico de distintas enfermedades asociadas a desrdenes
proteicos.
Fundamento:
El plasma contiene muchas protenas (protenas transportadoras, enzimas, anticuerpos, etc.).
Tanto la carga elctrica que poseen las protenas, dada por los aminocidos que la componen,
como su peso molecular afectan su movimiento sobre un soporte cuando se aplica un campo
elctrico. Es decir, pequeas protenas altamente cargadas migran ms rpido que grandes
protenas, lo que permite que se separen durante la corrida electrofortica.
La distinta velocidad de migracin permite la formacin de varias bandas o fracciones en el
gel de electroforesis, formadas por grupos de protenas de tamao y carga similar.
Procedimiento:
Se coloca una pequea muestra de suero en un soporte, que puede ser de distintos tipos:
- Soportes tipo 1: acetato de celulosa gelificado o agarosa, donde se observan 5-6 bandas de
protenas plasmticas (la migracin es segn relacin carga-masa de cada protena)
- Soportes tipo 2: almidn o poliacrilamida, donde se observan 25 o ms bandas (la migracin
es segn la relacin carga-masa y tamao).
En los laboratorios se usa habitualmente los soportes tipo 1 ya que son ms fciles de
interpretar.
Se coloca el soporte en la cuba de electroforesis con un buffer de corrida de pH y fuerza
inica determinados tal que las protenas posean carga elctrica negativa y migren hacia el
nodo (polo +) cuando se aplica voltaje.
Luego de terminada la corrida se retira el soporte y se deja evaporar el solvente. Se fijan las
bandas y se colorean con algn colorante para protenas (segn el soporte usado):
- Rojo Ponceau (acetato).
- Negro Amido (agarosa), etc.
Las bandas pueden mirarse a simple vista o leerse con un densitmetro (aparato que permite
cuantificar la intensidad y el ancho de cada banda para conocer el porcentaje de cada fraccin
proteica). Si por otro mtodo se determina la concentracin de las protenas totales del suero,
es posible calcular el contenido de cada fraccin.
Albmina

Fig.1 Gel de un proteinograma de suero normal, y su lectura en densitmetro.

12

Como se observa en la Fig.1, las protenas se separan normalmente en 5 fracciones:

albmina, y 1, 2, y globulinas
Albmina: es una protena que se sintetiza en el hgado, y es la de mayor concentracin en el
suero. Adems de su funcin de transportadora de algunas sustancias endgenas y exgenas,
es de gran importancia en el mantenimiento de la presin coloidosmtica y reservorio mvil
de aminocidos.
globulinas: incluye varias protenas, algunas se mencionan a continuacin:
1globulina: incluye principalmente a la 1-antitripsina, una protena de fase aguda.
2globulina: en esta fraccin se encuentra la haptoglobina, una protena que une
hemoglobina intravascular evitando su excrecin por el hgado. Tambin se encuentran
2 macroglobulina y ceruloplasmina.
En general, los niveles de las protenas de las fracciones 1 y 2 globulina se incrementan en
inflamacin.
globulinas: incluye protenas de baja densidad involucradas en el transporte lipdico
(lipoprotenas), de hierro (transferrina) y factores del complemento (C3 y C4).
globulinas: en esta fraccin estn incluidos los Ac del isotipo IgG.
Es importante aclarar que no todos los anticuerpos migran electroforticamente con las globulinas, sino que algunos de ellos lo hacen con las y globulinas. (ver fig.2)

Fig. 2

(Fig. extrada de http://inmunologia-online.tripod.com)

Los niveles de gamma globulinas pueden estar disminuidos en hipogammaglobulinemias
como en agammaglobulinemias, mientras que pueden estar aumentados en enfermedades
inflamatorias crnicas (artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistmico) e infecciones.
Adems de las gammapatas policlonales, el proteinograma tambin permite identificar
gammapatas monoclonales mediante la deteccin de bandas estrechas en las fracciones
gamma y beta (y, excepcionalmente, en la fraccin alfa).
SEROLOGA
La serologa es la ciencia que estudia la deteccin de anticuerpos (Ac) en los distintos
lquidos corporales tales como lgrimas, secreciones bronquiales, lquido sinovial, leche,
calostro, plasma seminal, moco vaginal, suero sanguneo, plasma, etc.
Aunque la palabra "serologa" se refiere al suero (y ms precisamente, al suero sanguneo), se
utiliza en un sentido amplio abarcando todas las tcnicas empleadas para identificar Ac en

13

cualquier humor o tejido del organismo. Por ej., en el diagnstico de algunas enfermedades,
resulta importante detectar Ac en plasma seminal, en moco vaginal, en leche o suero lcteo.
Los Ac son elaborados por las clulas plasmticas en respuesta a la estimulacin producida
por una molcula extraa para el organismo llamada Ag. Estos Ag se hallan en las bacterias,
los virus, parsitos, hongos, partculas del polvo ambiental, clulas eucariticas, etc. Los Ag
poseen sitios de unin (epitopes o determinantes antignicos) a los cuales se unen los Ac en
forma especfica. El nmero de epitopes constituye la valencia del Ag. Estos pueden ser
iguales o diferentes entre s, pueden estar repetidos en un mismo Ag (Figura 2).

Figura 3 El suero contiene Ac dirigidos contra los distintos epitopes (1, 2, 3, 4)

Fuerzas de unin Ag-Ac Factores que afectan la unin
Las fuerzas de unin que participan en la interaccin Ag-Ac son de tipo no covalente (Figura
4). Si bien cada una de stas por s sola es dbil, la sumatoria de las mismas crea una
unin estable y reversible. Los factores que influyen en esta unin son:
- pH
- temperatura
- tiempo de incubacin
- agitacin
- concentraciones relativas de Ag-Ac
- concentracin de electrolitos

14

Anticuerpo

Antgeno
H

Enlace de
hidrgeno

O
N

N
H

Enlace
electrosttico

Fuerzas de
van der Waals

Fuerzas
hidrofbicas
agua excluida

Figura 4. Fuerzas de interaccin atractivas. Extrado de: Regueiro J.R., Lpez Larrea C.
Inmunologa. Biologa y Patologa del sistema inmune. Editorial Mdica Panamericana.
1996.

15

TRABAJO PRCTICO N2
PRUEBAS DE INTERACCION PRIMARIA: FUNDAMENTOS
Clasificacin de las pruebas serolgicas
Las pruebas serolgicas pueden clasificarse en tres categoras principales:
Pruebas de interaccin primaria: Detectan la unin Ag-Ac, es decir la formacin del
complejo inmune.
- inmunofluorescencia
- ensayo de polarizacin de luz fluorescente
- radioinmunoensayo
- enzimoinmunoensayo
- inmunocromatografa
Pruebas de interaccin secundaria: Detectan la consecuencia de la unin Ag-Ac que se
observa como un aglutinado o precipitado de acuerdo a las caractersticas fsicas del Ag
(particulado o soluble).
- aglutinacin
- precipitacin
Pruebas de interaccin terciaria: La unin Ag-Ac desencadena un fenmeno biolgico
visible in vitro (ej: lisis de glbulos rojos en la prueba de fijacin del complemento) o in vivo
(ej: reaccin intradrmica) gracias a la accin de otros efectores solubles o celulares.
- Fijacin de complemento
- Pruebas intradrmicas
PRUEBAS DE INTERACCION PRIMARIA:
Las pruebas de laboratorio que detectan la unin directa (o interaccin molecular) entre un Ag
determinado y el Ac especfico para ese Ag se conocen como pruebas de interaccin
primaria. Estas pruebas pueden ser utilizadas para detectar tanto Ag como Ac en muestras
problema.
Estas pruebas se basan en el reconocimiento de un Ag por parte de los Ac, formando
inmunocomplejos. Normalmente, uno de los dos componentes (Ag o Ac) est adsorbido
(inmovilizado, fijado) en una fase slida, como por ejemplo un tubo de poliestireno, una placa
multipocillos de plstico, un portaobjetos conteniendo tejidos o clulas o una membrana de
nitrocelulosa; y el otro reactivo est "marcado" para facilitar la deteccin
del
inmunocomplejo formado. Luego de producida la interaccin entre el Ag y el Ac, y para
separar el reactivo marcado libre (en exceso) de aquel que est formando parte de los
inmunocomplejos fijos a la fase slida, se realizan sucesivos lavados.
El "marcado" del Ag o del Ac se realiza mediante la unin covalente con elementos que
emiten una seal caracterstica y observable. A este reactivo (Ag o Ac) marcado se lo
denomina conjugado.
Las sustancias marcadoras ms comnmente utilizadas para la fabricacin de conjugados son
istopos radiactivos, enzimas o colorantes fluorescentes; siendo la seal emitida detectada
mediante contadores de radiactividad, a simple vista y/o con espectrofotmetros,
fluorocitmetro y/o microscopio de fluorescencia, respectivamente.
En algunas de estas pruebas se utilizan los anticuerpos anti-inmunoglobulinas. Cmo se
obtienen estos reactivos?: cuando inmunoglobulinas (Ig) purificadas provenientes de una
determinada especie animal (ej. bovino) se inyectan en un animal de otra especie (ej. conejo),
stas se comportan como Ag (son reconocidas como extraas). En este caso, el sistema
inmune del conejo reacciona formando anticuerpos (anti-inmunoglobulinas) contra las Ig
bovinas, los cuales se purifican para utilizarlos como reactivo en el laboratorio.
16

Entre las pruebas de interaccin primaria ms utilizadas en el diagnstico de enfermedades se

encuentran
Inmunofluorescencia (IF)
Enzimoinmunoensayo (Enzyme linked immunosorbent assay o ELISA)
INMUNOFLUORESCENCIA
Es una tcnica utilizada para la deteccin de molculas (Ag) usando Ac marcados con
colorantes fluorescentes, como el isotiocianato de fluorescena (FITC), la rhodamina o la
ficoeritrina (PE). Estas sustancias al ser excitadas con luz de longitud de onda del rango
ultravioleta (190-380 nm), emiten luz visible de longitud de onda mayor que se observa como
una fluorescencia amarillo-verdosa (FITC, 495 nm) o anaranjado-rojiza (PE y rhodamina,
480-565 nm).
Existen dos variantes de esta tcnica: la IF directa y la IF indirecta.
Inmunofluorescencia Directa (IFD)
En esta tcnica se utiliza un Ac marcado con una sustancia fluorescente para detectar la
presencia del Ag en una muestra de tejido o clulas o en frotis de cultivos de
microorganismos (ver Fig 1A).
La muestra es previamente fijada sobre un portaobjetos con un solvente (metanol-acetona).
Esta fijacin adems permeabiliza la membrana de las clulas para facilitar la entrada del Ac.
En un paso posterior se incuba la muestra con el conjugado y luego se elimina el reactivo
excedente por medio de lavados con solucin salina tamponada. La muestra se examina en un
microscopio de fluorescencia con luz azul o verde observndose la fluorescencia generada por
el conjugado en los lugares en que ha quedado unido al Ag de la muestra; el resto del campo
permanece oscuro.

Ac fluorescente
especfico para el
Ag

Microscopio

de
Fluoresc.

Corte de tejido

Fuente de luz
ultravioleta
(UV)

Fijacin del
antgeno (Ag)

L
a
v
a
d
o
s

L
a
v
a
d
o
s

Agregado del
Observacin con
conjugado
Microsc. de Fluorescencia
conjugado
Fig 1A. Inmunofluorescencia directa

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

Esta variante de la IF utiliza como conjugado un Ac anti-Ig marcado con sustancias
fluorescentes, para detectar la unin entre un Ac no marcado con su Ag especfico. Este tipo
de prueba permite detectar tanto Ag como Ac.
En la Fig.1B se describe una prueba de IFI para detectar Ac en una muestra de suero. El
procedimiento es similar al de IFD, excepto que al corte de tejido (o a las clulas) fijado al
portaobjetos conteniendo un Ag determinado (microorganismo, receptores, etc), se le agrega
una muestra problema (conteniendo potencialmente Ac que reconocern al Ag). Los
17

inmunocomplejos formados luego de la incubacin de estos dos componentes sern

detectados por la adicin del conjugado (la anti-Ig marcada). Luego de los lavados necesarios
para la eliminacin del conjugado libre, la muestra se observa con microscopio de
fluorescencia.
Ig srica
especfica para el Ag

Microscopio

Anti-Ig fluorescente

de
fluorescencia

Corte de tejido

Fuente de
luz ultravioleta (UV)
Fijacin del
antgeno (Ag)

L
a
v
a
d
o
s

Agregado de muestra
(Ac primario)

L
a
v
a
d
o
s

Agregado del
conjugado

L
a
v
a
d
o
s

Observacin con
microsc. de fluorescencia

Fig 1B. Inmunofluorescencia indirecta

ENSAYO DE POLARIZACIN DE LUZ FLUORESCENTE (FPA)

Se basa en que una molcula en solucin rota con una velocidad inversamente proporcional a
su tamao. Si esa molcula est unida a un marcador fluorescente (por ej. FITC) y se lo excita
con luz polarizada, se puede evaluar la tasa de rotacin de la molcula segn en qu
direcciones emita la luz. Esto es medido por un detector que lo traduce en una seal.
Para la deteccin de Ac, se hace reaccionar la muestra (por ejemplo suero o sangre) con un
Ag de pequeo tamao marcado con una sustancia fluorescente. Si en la muestra hay Ac
especficos contra ese Ag, se unirn al Ag marcado por lo cual este complejo (Ac + Ag
marcado), al tener mayor tamao molecular, tendr una menor velocidad de rotacin que el
Ag libre, y esto podr ser medido mediante un lector de polarizacin de fluorescencia.
Las principales ventajas de este ensayo son que no es necesario separar los complejos Ag-Ac
del reactivo en exceso, es una prueba rpida (el resultado se obtiene en menos de 10 minutos
habitualmente) y de fcil automatizacin. En veterinaria se ha estandarizado para el
diagnstico de unas pocas enfermedades infecciosas, y es utilizada ms ampliamente en la
deteccin de drogas y metabolitos en distintos fludos.
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
El RIA es una prueba de interaccin primaria que utiliza un radioistopo como marcador del
conjugado. El ms comn es el 125I. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar
concentraciones muy pequeas de una sustancia (hasta el orden de pg/ml), Los
radioinmunoensayos pueden realizarse en fases fluidas (RIA) o slidas. Por ejemplo, en
endocrinologa permite la cuantificacin de hormonas mientras que en clnica se usa para el
diagnstico de enfermedades atpicas detectando la presencia de IgE y alergenos (RIST y
RAST).
Estas pruebas deben ser ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los
potenciales peligros para la salud y la contaminacin ambiental que supone el manipuleo de
sustancias radiactivas.

18

ENZIMOINMUNOENSAYO (EIA)
El enzimoinmunoensayo es una tcnica verstil y muy sensible, que puede utilizarse para
detectar y medir en una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados que se emplean tienen
como marcadores a diversas enzimas. Las enzimas ms utilizadas son la peroxidasa, la
fosfatasa alcalina y la -galactosidasa.
Esta tcnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que se realiza: cuando es
en placa, se denomina ELISA; sobre tejidos, inmunohistoqumica y sobre clulas, inmunocitoqumica.
ELISA (en placa)
La prueba se realiza en placas de plstico (poliestireno) de 8 cm x 12 cm que contienen 96
pocillos, cada uno de aprox. 1 cm de profundidad y 0,7 cm de dimetro (Fig. 2)

Fig. 2 Placa de Elisa con 96 pocillos

Existen muchas variantes del ELISA y su diseo depende de lo que se quiera determinar. La
ms comnmente utilizada es el ELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de
Ac en una muestra problema, utilizando como conjugado un Ac anti-Ig marcado con una
enzima (Fig 3).
Para detectar la presencia de este conjugado, se agrega a la reaccin un sustrato especfico de
dicha enzima y un cromgeno que permita observar la accin de la enzima sobre su sustrato.
Si luego de la reaccin inmunolgica y de los posteriores lavados, el reactivo marcado
permanece unido a la fase slida, al agregar la mezcla de sustrato-cromgeno la enzima
actuar sobre su sustrato, modificndolo, y este producto inducir un cambio de color en el
cromgeno soluble sobrenadante (Fig 2). La intensidad de color es directamente proporcional
a la cantidad de anti-Ig marcada que se haya captado, y sta a su vez ser proporcional a la
cantidad de Ac que se encuentren en la muestra problema. La intensidad de color se puede
estimar a simple vista (cualitativo), o lo que es ms adecuado, mediante espectrofotometra,
expresndose como densidad ptica.

19

ELISA INDIRECTO
(reaccin positiva)
Inmovilizacin del
antgeno (Ag)

ELISA INDIRECTO
(reaccin negativa)
Ag

Lavados
Bloqueo de los
espacios libres

Protena
bloqueante

Ig srica
(Ac)

Bloqueo de los
espacios libres
Lavados
Agregado de
suero problema

Lavados

Lavados

Agregado del
conjugado

Agregado del
conjugado

Anti-Ig
marcada

Lectura de la prueba

Protena
bloqueante
No hay Ac
especficos
para el Ag
La anti-Ig
marcada
no se une

Lavados

Lavados
Agregado de la mezcla
sustrato-cromgeno

Ag

Lavados

Lavados
Agregado de
suero problema

Inmovilizacin del
Ag

Sustrato+
cromgeno

Cambio
de color

Agregado de la mezcla
sustrato-cromgeno

Lectura de la prueba

Sustrato+
cromgeno
No hay
cambio
de color

Fig 3. Enzimo inmuno ensayo (ELISA) indirecto

20

Inmunohistoqumica (IHQ) e inmunocitoqumica (ICQ)

Cuando el enzimoinmunoensayo se realiza sobre tejidos o clulas, hablamos de
inmunohistoqumica e inmunocitoqumica, respectivamente. Estas pruebas se realizan
sobre cortes de tejido de un modo similar a las IF, pudiendo ser directas o indirectas. En este
caso, el conjugado es una inmunoglobulina marcada con una enzima que al actuar sobre su
sustrato, lo modifica, y este producto induce un cambio en el cromgeno, convirtindolo en
un producto de reaccin coloreado. Esta prueba se lee con microscopio de luz observndose
una reaccin positiva como un precipitado de color sobre las estructuras histolgicas o las
clulas que contengan el Ag buscado (Fig. 4).

Fig. 4. Esquema de una Inmunohistoqumica.

INMUNOCROMATOGRAFA (CROMATOGRAFIA DE FLUJO LATERAL)
La inmunocromatografa es un tipo de prueba de interaccin primaria que se utiliza en
ensayos sencillos y de lectura rpida.
En esta prueba uno de los componentes est marcado con nanopartculas coloreadas, por
ejemplo con metales pesados (oro o selenio coloidal, generando bandas de color rosa o azul
respectivamente). Otros marcadores pueden ser partculas de ltex coloreadas o de carbn.
La reaccin se lleva a cabo sobre una tira de un material poroso (por ejemplo, nitrocelulosa).
En las tiras reactivas se pueden distinguir 5 zonas:
1.
2.
3.
4.
5.

Zonadesiembradelamuestra
Zonadelconjugado
Zonadedeteccin
Zonadecontrol
Reginabsorbente

El procedimiento es muy sencillo: la muestra con el Ag a analizar se coloca en la zona de

siembra de la muestra, y fluye por capilaridad hasta la zona del conjugado, en donde el Ac
especfico marcado (conjugado) se encuentra inmovilizado. Al pasar la muestra solubiliza al
conjugado, y en caso de haber Ag en la muestra forma inmunocomplejos. Estos
inmunocomplejos formados siguen migrando lateralmente hasta la zona de deteccin, en la
cual se hallan fijados a la membrana Acs especficos contra otro epitope del Ag, de manera
que los inmunocomplejos son fijados en esta zona de deteccin, formando una banda
coloreada, rosa o azul dependiendo del metal utilizado en el conjugado.
La muestra fluye por capilaridad hasta la zona de control. Aqu el exceso de conjugado es
capturado por un Ac anti-conjugado, formndose una banda coloreada tanto si el Ag est
presente en la muestra como si no lo est. Este control indica que la prueba ha sido realizada
correctamente y todos los reactivos funcionan bien. Finalmente el resto de la muestra es
absorbida en la regin absorbente (ver figura 1).
Esta prueba puede ser utilizada tambin para la deteccin de Acs. En este caso, el conjugado
es el Ag especfico marcado. En la zona de deteccin est fijado un Ac anti Ig (dependiendo
21

de la especie en la cual se buscan los Acs), el cual capturar los complejos inmunes formados
si la muestra posee Acs especficos. En la zona de control un Ac especfico para el conjugado
(en este caso el Ag marcado) captura el exceso de Ag solubilizado por la muestra.
Aplicaciones:
En medicina humana se utiliza este test para detectar la gonadotrofina corinica (test de
embarazo)
En medicina veterinaria se utiliza para detectar antgenos (Virus de la leucemia felina, parvo y
rotavirus, parsitos como dirofilaria immitis, y bacterias) o anticuerpos (anticuerpos antivirus de la leucemia felina).

Zona de la muestra

Zona del conjugado

Zona de deteccin

Zona de control

Fig 1: Esquema de una prueba de inmunocromatografa para deteccin de antgeno. En la parte superior se
esquematiza la prueba positiva, dando una banda en la zona de deteccin y una segunda banda en la zona de
control. En la parte inferior, se esquematiza la prueba negativa, donde slo se observa reaccin en la zona de
control.

La siguiente tabla resume los marcadores utilizados en algunas de las pruebas de

interaccin primaria ms importantes y los equipos utilizados para la lectura o
visualizacin de los resultados.
Marcador del
conjugado

Lectura de la prueba

Inmunofluorescencia

Fluorocromo

Microscopio de fluorescencia

Polarizacin de luz fluorescente

Fluorocromo

Lector de
polarizacin de fluorescencia

Radioinmunoensayo

Radioistopo

Contador de radiactividad

Enzima

Espectrofotmetro o a simple vista

Microscopio ptico
Microscopio ptico

Nanopartculas
coloreadas

A simple vista

Tcnica

EIA

ELISA
Inmunohistoqumica
Inmunocitoqumica

Inmunocromatografa

22

23

24

25

ELISA INDIRECTO: procedimiento e interpretacin de resultados

Objetivos: conocer los pasos de una prueba de ELISA indirecto, comprender la importancia
del uso de controles en la pruebas de laboratorio e interpretar los resultados.
Se utilizar la tcnica de ELISA indirecto para determinar la presencia/ ausencia de Acs
especficos contra un virus.
Materiales necesarios:
- Placas de 96 pocillos o tiras de 8 pocillos, recubiertas con Ag.
- Suero control negativo (sin Acs especficos) y positivo (con Acs especficos)
- Diluyente para las muestras y controles
- Conjugado (Ac anti-Ig bovina marcado con peroxidasa)
- Solucin de lavado
- Mezcla de sustrato-cromgeno
- Servilletas de papel
- Micropipetas mono y multicanal
- Espectrofotmetro lector de ELISA
Procedimiento:
A continuacin se detalla el procedimiento completo. En el TP terminaremos una prueba
comenzada por los docentes (a partir del paso 3)
1. Colocar los reactivos a TA con 30 minutos de anticipacin.
2. Incubacin de las muestras y controles en los pocillos recubiertos con Ag, segn el
siguiente diseo:
POCILLO
MUESTRA
COLOR
DO 405 nm
A
B
C
Ctrl. positivo
D
Ctrl. positivo
E
Ctrl. negativo
F
Ctrl. negativo
G
M. problema
H
M. problema
Las muestras se incuban a la dilucin 1:10, durante 1 hora a 37C
3. Lavar 4 veces con solucin de lavado (Invertir las tiras y eliminar el lquido, llenar los
pocillos con solucin de lavado. Repetir este procedimiento 4 veces. Invertir la tira
sobre una servilleta de papel para escurrir)
4. Agregar 100 l/pocillo de conjugado. Incubar 15 minutos a 37C.
5. Lavar 4 veces con solucin de lavado (Idem paso 3).
6. Agregar 150 l/pocillo de mezcla sustrato/cromgeno (ABTS/H2O2)
7. Incubar de 20 a 30 min a temperatura ambiente.
Observar el desarrollo o no de color en los distintos pocillos. Registrar los resultados
en la tercer columna de la tabla.
8. Realizar lectura espectrofotomtrica a 405 nm. Registrar los valores obtenidos en la
cuarta columna de la tabla.
9. Interpretacin de resultados:
A qu se debe el desarrollo de color en los pocillos C y D?
Por qu no se desarrolla color en los pocillos E y F?

26

TRABAJO PRACTICO N 3
PRUEBAS DE INTERACCION SECUNDARIA

Precipitado formado (mg)

Estas pruebas comprenden dos etapas. En la primera se forman rpidamente los complejos
Ag-Ac (complejos primarios), los cuales no pueden observarse directamente. Luego, en la
segunda etapa o reaccin secundaria, los complejos se van agregando hasta hacerse visibles
como precipitado o aglutinado. La temperatura acelera esta segunda etapa, que adems es
dependiente de la concentracin de electrolitos (generalmente la reaccin se realiza en
solucin fisiolgica).
Las uniones entre los complejos primarios dan origen a estructuras tridimensionales en forma
de red (enrejado de Marrack). La formacin de estos agregados es una consecuencia de la
bivalencia de los Ac y la multivalencia de los Ag, ya que si no se cumplen estos requisitos,
la red no puede formarse. Adems, los reactivos deben estar en proporciones ptimas, dado
que la concentracin en exceso tanto del Ag como del Ac origina complejos solubles (Fig. 1).
Si a la preparacin antignica se le agrega un exceso de Ac no se produce reaccin. Este
fenmeno se denomina prozona.
Zona de exceso de
anticuerpos

Zona de proporciones
ptimas

0,3

Zona de exceso de
antgeno

0
1,5
Antgeno (mg)

Figura 1: Curva de precipitacin cuantitativa.

Modificado de Tizard, I. Inmunologa Veterinaria. Ed. Interamericana, Mjico. 1995.

Cuando los Ac se combinan con Ag solubles (toxinas, protenas, extractos de pared

bacteriana) en soluciones con condiciones apropiadas, los complejos precipitan (REACCION
DE PRECIPITACION). Si los Ag son particulados (bacterias, eritrocitos) y estn en
suspensin, entonces se aglutinan al unirse a los Ac especficos en condiciones adecuadas
(REACCION DE AGLUTINACION). Un mismo Ac puede dar aglutinacin y
precipitacin, por ejemplo, con una suspensin bacteriana y con un lisado de la misma,
respectivamente.
Si en la prueba se enfrenta el Ag con distintas diluciones del suero a analizar, se puede
estimar la concentracin de Ac, la cual se denomina ttulo del suero. El ttulo se expresa
como la inversa de la mxima dilucin del suero que dio reaccin positiva con la
suspensin/solucin de Ag (suspensin en el caso de Ag particulado y solucin en el caso de
Ag soluble). El ttulo es una forma de expresar la potencia de un suero inmune.
PRUEBAS DE AGLUTINACION
Se pueden leer a simple vista o bajo aumento (microscopio ptico o lupa).
27

La reaccin positiva (presencia de aglutinado o grumos) indica que Ag y Ac estn presentes

en la reaccin (y en proporciones ptimas).
En la figura 2 se muestra un esquema de los resultados obtenidos en dos pruebas de
aglutinacin en tubo. La primera (Fig. 2a) se realiz con suero del primer muestreo de un
animal, ensayando las diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640. Se ve que la reaccin
es positiva slo en los 2 primeros tubos (1/20 y 1/40). La segunda prueba (Fig. 2b), realizada
con suero de un muestreo del mismo animal a los 40 das del primero, muestra reaccin
positiva hasta una dilucin 1/320. Esto indica que hubo seroconversin (conversin
serolgica), ya que el ttulo del suero en el primer muestreo fue 40 y en el segundo fue 320.

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

1/640

Figura 2a: Aglutinacin en tubo. Reaccin positiva en diluciones 1/20 y 1/40.

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

1/640

Figura. 2b: Aglutinacin en tubo. Reaccin positiva en diluciones 1/20 a 1/320.

Las pruebas de aglutinacin pueden clasificarse segn:
Los elementos reactivos, en:
- directas: cuando el Ag es particulado.
- indirectas o pasivas: cuando el Ag soluble se acopla a partculas (por ejemplo: partculas de
ltex, glbulos rojos) para que la reaccin con Ac especficos sea una aglutinacin en vez de
una precipitacin.
el tiempo de realizacin, en:
- rpidas: si se pueden realizar en pocos minutos.
- lentas: si se requiere una incubacin de horas o das.
el grado de deteccin, en:
- cualitativas: si slo detectan presencia o ausencia de Ac.
- semicuantitativas: si permiten estimar la concentracin de Ac en la muestra (ttulo del
suero).
el soporte, en:
-en placa (corresponde a las pruebas rpidas).
- en tubo (corresponde a las pruebas lentas).

28

Aplicaciones:
- Diagnstico serolgico de enfermedades infecciosas.
- Identificacin de serotipos bacterianos.
- Tipificaciones de sueros sanguneos (para determinacin de grupos sanguneos).
- Identificacin del isotipo de Ig (IgG o IgM) al que pertenecen los Ac presentes en el suero:
mediante el tratamiento previo del suero con -mercaptoetanol se despolimeriza la IgM,
perdiendo su capacidad de aglutinar. Este procedimiento permite conocer en qu etapa de la
respuesta inmune del animal se obtuvo la muestra.
- Valoracin de anticuerpos incompletos o bloqueantes: ciertos Ac (monovalentes desde el
punto de vista funcional), al estar en presencia de las partculas correspondientes, se unen a
ellas pero no las aglutinan. Esta unin bloquea a las partculas, impidiendo la aglutinacin por
Ac especficos bivalentes.
Para valorar estos Ac bloqueantes, luego de que se han unido a las partculas, se agrega una
antiglobulina la cual producir la aglutinacin unindose a los Ac bloqueantes.
PRUEBAS DE PRECIPITACIN
Se utilizan para detectar tanto Ag como Ac, en forma cuali o cuantitativa. Pueden realizarse
en medio lquido (en tubos) o en medio semislido (en tubos, placas, portaobjetos).
Cuando se realizan en medio semislido (gel de agar o agarosa) reciben el nombre de
inmunodifusin. Al difundir y ponerse en contacto el Ag con el Ac, precipitarn formando
una banda o halo cuando estn en la relacin ptima. El nmero de bandas de precipitacin
indica la cantidad mnima de sistemas reaccionantes presentes. Es decir que, si las soluciones
contienen varios Ag y Ac diferentes, se producir una lnea de precipitacin separada para
cada grupo interactuante de Ag y Ac.
En las pruebas de inmunodifusin se preparan, por ejemplo, placas de Petri con una capa de
gel de agar o agarosa donde se realizan pequeos orificios.
En la inmunodifusin radial (Fig. 3) uno de los reactivos (por ejemplo, el Ac) se aade al
gel antes de preparar la placa, y en los orificios se siembra el otro reactivo a analizar (por
ejemplo, muestras conteniendo o no al Ag), colocando siempre controles positivos. Al
difundir en forma radial y enfrentarse el Ag con el Ac correspondiente, se formar un halo o
anillo de precipitacin alrededor del orificio.
La lectura se realiza midiendo el rea del anillo de precipitacin, siendo sta proporcional a la
cantidad de reactivo sembrado en el pocillo.
anticuerpos disueltos en el
gel

antgeno en los
pocillos

Figura. 3: Inmunodifusin radial

En la inmunodifusin doble bidimensional (prueba de Ouchterlony) ambos reactivos (Ag y

Ac) son sembrados en orificios enfrentados y los dos difunden en el gel. La presencia de una
banda de precipitacin entre los dos orificios, indica una reaccin positiva (Fig. 4).

29

1
Pocillos 2, 4 y 6:
controles

Pocillos 1, 3 y 5:
problema

Ag

Pocillo central: Ag

5
4

Figura 4: Inmunodifusin doble bidimensional

De acuerdo a las leyes de la difusin, la distancia a la que una sustancia difunde est en
relacin directa con su concentracin y en relacin inversa con su peso molecular. Es decir
que, si uno de los reactivos est en exceso, la banda se formar cerca del pocillo del reactivo
presente en menor concentracin (Fig. 5, reactivo a). Y si uno de los reactivos tiene molculas
de distinto peso molecular, stas difundirn con distinta velocidad, dando lugar a la formacin
de ms de una banda (Fig. 6).

Figura 5

d
Figura 6

Aplicaciones:
- Las reacciones en medio lquido se aplican al diagnstico e identificacin de distintas
protenas animales en productos alimenticios (anlisis bromatolgicos) o en medicina forense.
- Las pruebas de inmunodifusin se aplican en el diagnstico de enfermedades infecciosas y
para la determinacin de Ig, C3, transferrina y otras protenas. Tambin se utilizan para el
anlisis de la pureza de una preparacin antignica y de las reacciones cruzadas entre distintos
Ag.
En esta ltima aplicacin se investiga el grado de identidad que presentan dos Ag entre s,
enfrentndolos con un suero especfico para uno de ellos. Pueden obtenerse distintos
resultados:
Ag x

Ag x

Ac x

Figura 7

a)Identidad total

Ag x Ag x-y

Ag x

Ag y

Ac x + Ac y

Ac x + Ac y

b) Identidad parcial

c) No identidad

La identidad total indica que ambos Ag son idnticos, es decir, no pueden ser diferenciados
entre s por el antisuero utilizado. Las bandas de precipitacin se funden en una sola lnea
(Fig. 7 a).
La identidad parcial indica que existe una cierta relacin entre los Ag, pero que uno de ellos
(Ag x-y ) presenta componentes antignicos (epitopes) no compartidos con el otro. Las

30

bandas de precipitacin se funden parcialmente en una lnea, apareciendo una prolongacin o

espoln (Fig. 7 b).
La no identidad expresa que no hay ninguna caracterstica compartida entre ambos Ag. Cada
sistema reacciona independientemente, originando bandas de precipitacin que se cruzan (Fig.
7 c).
1) Cules son las condiciones necesarias para que ocurra una reaccin de aglutinacin? Y
una de precipitacin?
2) Qu ocurre si para una precipitacin emplea un exceso de Ac?
3) Esquematice una reaccin de aglutinacin con IgG, otra con IgM. Qu ocurre en ambos
casos si el suero se trata con -mercaptoetanol?
4) Cmo se calcula el ttulo de un suero?

31

TRABAJO PRCTICO N4
AGLUTINACIN Y PRECIPITACIN
PRUEBAS DE AGLUTINACIN:
Objetivo: realizar pruebas de aglutinacin en placa (rpidas) y observar resultados de pruebas
de aglutinacin en tubo (lentas). Realizar reacciones de aglutinacin cualitativas y
semicuantitativas (empleando distintas diluciones de un suero para determinar el ttulo del
mismo). Identificar el isotipo responsable de la aglutinacin, comparando los resultados de la
prueba en presencia y ausencia de -mercaptoetanol. Explicar el fenmeno de prozona.
Materiales:
Sueros
Suspensiones de antgenos
Tubos
Pipetas
Pro-pipetas
Solucin fisiolgica
Aglutinoscopio
Procedimiento/Protocolo:
Aglutinacin en placa:
1) Colocar sobre el vidrio 30 l de la suspensin antignica y un volumen igual del suero sin
que se mezcle con la suspensin.
Repetir el procedimiento utilizando 30 l de solucin fisiolgica en vez de suero (control
negativo).
Mezclar el suero con el antgeno, y por otro lado, la solucin fisiolgica con el antgeno.
El resultado se expresa como positivo (+) cuando se forma un aglutinado o negativo (-)
cuando esto no ocurre. Esta es entonces una reaccin cualitativa.
Describa cmo observa una reaccin positiva y una negativa.
2) Emplear el suero puro y tambin realizar las siguientes diluciones, empleando solucin
fisiolgica como diluyente:

puro
Soluc. fisiol.:
Suero:
80l

1/2
40l
40l

Diluciones
1/4
1/8
40l
40l

1/16
40l

40l
40l
40l 40l
Esta es una reaccin semicuantitativa. Observar hasta cul dilucin hay aglutinacin. Calcular
el ttulo (inversa de la mxima dilucin que dio resultado positivo).
Aglutinacin en tubo:
Esta prueba es lenta, ya que luego de mezclar en el tubo la suspensin del antgeno con el
suero, debe incubarse en estufa a 37 C durante 48 hs. Por lo tanto observaremos el resultado
de pruebas realizadas con anterioridad.
Considerar que todos los tubos tienen el mismo volumen de antgeno y que las diluciones del
suero son: 1/25, 1/50, 1/100, 1200. (Esta es una reaccin semicuantitativa).
Observar aglutinado en el fondo del tubo y lquido claro (reaccin positiva). Diferenciar con
botn y lquido turbio (reaccin negativa).

32

1) Cul sera el resultado si ocurre el fenmeno de prozona con un determinado suero?

2) Calcular el ttulo de uno de los sueros en presencia y en ausencia de -mercaptoetanol.
3) Realizar un esquema de lo que ocurre en presencia y en ausencia de -mercaptoetanol si la
aglutinacin se debe a la presencia de IgM especfica contra ese antgeno. Dibujar las
molculas de antgeno y los anticuerpos.

PRUEBAS DE PRECIPITACIN (INMUNODIFUSIN):

Objetivo: Conocer cmo se realiza una inmunodifusin doble bidimensional, realizando la
siembra de sueros y soluciones de antgenos. Observar la presencia de bandas en reacciones
preparadas con anterioridad. Observar reacciones de inmunodifusin radial. Conocer los
factores que influyen sobre la velocidad de difusin y las causas que originan una doble banda
de precipitacin.
1) Realizar un esquema de:
a) una prueba de inmunodifusin doble bidimensional realizada para determinar la
presencia de anticuerpos contra un antgeno determinado.
b) una prueba de inmunodifusin radial
c) una prueba de inmunodifusin doble bidimensional que evidencia identidad parcial
entre 2 antgenos. Realice tambin el esquema para identidad total y no identidad.
2) Sobre una placa conteniendo un gel de agarosa, sembrar 5 l de la solucin del antgeno en
el pocillo central y 5 l de cada suero en los dems pocillos. Haga adems un esquema de
resultados a obtener si algunos de los sueros contienen anticuerpos especficos contra ese
antgeno.

33

TRABAJO PRCTICO N5
CARACTERSTICAS DE LAS PRUEBAS SEROLGICAS. INTEGRACIN DE TP

Repaso y discusin de conceptos importantes: conversin serolgica o seroconversin, Ac

monoclonales, afinidad, avidez, especificidad de un Ac, reaccin cruzada, sensibilidad y
especificidad de una prueba serolgica.
El suero es una fuente heterognea de Ac producto del contacto con diferentes antgenos
(Ag). Si deseamos investigar la presencia de Ac especficos contra un Ag determinado
debemos utilizar una prueba serolgica adecuada. El resultado de la prueba nos permitir
establecer si el animal tuvo contacto con el Ag en cuestin. Por esta razn, la presencia de
Ac para un determinado Ag en un nico muestreo NO IMPLICA QUE EL ANIMAL ESTE
ENFERMO. Slo dos muestras tomadas con un intervalo de 3 semanas, y que presenten
un aumento del nivel de Ac (de al menos 4 veces) indicar que corresponde a una
evolucin en la respuesta a la infeccin (conversin serolgica o seroconversin).
Por lo anteriormente expuesto se dice que la serologa cumple un papel complementario en la
confirmacin de un diagnstico.
La respuesta del sistema inmune a cualquier antgeno, an el ms simple, es policlonal. Esto
significa que el sistema fabrica anticuerpos contra un gran rango de epitopes del Ag. Los
sueros policlonales obtenidos luego de la inoculacin de un Ag en un animal, son
comnmente utilizados como herramientas en serologa, diagnstico e investigacin.
Los anticuerpos monoclonales (ANEXO 1) son anticuerpos idnticos de especificidad nica
sintetizados por un nico clon de clulas plasmticas modificadas artificialmente para que
pueda hacrselos crecer indefinidamente. Los Ac monoclonales son hoy ampliamente usados
como reactivos de diagnstico e investigacin.

Afinidad La afinidad de un Ac es la fuerza de reaccin entre un epitope simple y un sitio

individual de combinacin con el Ag sobre un Ac. Es la sumatoria de las fuerzas de atraccin
y repulsin que operan entre el determinante antignico y el sitio de unin al Ag del Ac.
(figura 5)

Alta afinidad

Baja afinidad

Ac

Ac

Figura 5.
Avidez Avidez es la medida de la fuerza total de unin de Ac multivalentes con un Ag que
presenta varios determinantes antignicos.

34

Por lo tanto, la afinidad se refiere a la fuerza de unin de un solo determinante antignico y un

sitio de combinacin para el Ag en un anticuerpo individual, mientras que la avidez se refiere
a la fuerza de unin total entre varios antgenos y anticuerpos polivalentes.
La avidez es influenciada por las valencias del anticuerpo y del antgeno.

Afinidad: 104

Avidez:
106

Avidez:
1014

Figura 6
Especificidad de un Ac: se refiere a la capacidad de un Ac de reaccionar con un solo epitope
a travs de un sitio individual de unin con el Ag. Tambin puede decirse de un conjunto de
molculas de Ac que tiene la capacidad de reaccionar con solo un Ag. En general, existe un
alto grado de especificidad en las uniones Ag-Ac.
Reaccin cruzada: se refiere a la capacidad de de un Ac individual o de un conjunto de Ac de
reaccionar con ms de un Ag. La reaccin cruzada puede originarse por el reconocimiento de
Ag que comparten epitopes con el Ag original o epitopes similares al del Ag original (Figura
7)

Reaccin cruzada

Ac
Anti-A

Ag A

Ac
Anti-A

Ac
Anti-A

Ag B

Ag C

Epitope compartido

Epitope similar

Figura 7

Dos conceptos importantes: Sensibilidad y especificidad

Para interpretar una prueba serolgica se deben tener en cuenta los conceptos de sensibilidad
y especificidad. La sensibilidad de una prueba serolgica es la capacidad para detectar la
mnima cantidad de Ag o Ac presente en la muestra (Tabla 3). La especificidad de una prueba
serolgica est dada por la capacidad de la prueba para detectar uniones Ag-Ac especficas.

35

Pruebas

Valores Ac (mg/ml)

Pruebas de unin primaria

Radioinmunoensayo competitivo
ELISA

0,00005
0,0005

Pruebas de unin secundaria

Neutralizacin de antitoxina
Inhibicin de la hemaglutinacin
Aglutinacin bacteriana
Hemaglutinacin pasiva
Prueba de precipitacin en anillo
Precipitacin en gel

0,00005
0,005
0,05
0,01
18
30

Pruebas de unin terciaria

Prueba de fijacin de complemento

0,05

Tabla 3. Cantidad mnima de anticuerpo detectable con ciertas pruebas inmunolgicas.

Extrado de: Tizard I. Inmunologa Veterinaria. Editorial Interamericana. 1996.

Cuestionario para la integracin de TP

1) Para cada uno de los siguientes objetivos, elija una prueba serolgica y describa cmo la
realizara:
a) determinar si en las muestras de suero de 3 animales hay Ac contra cierta bacteria
b) conocer cul es el ttulo de esos sueros
c) determinar el isotipo de esos Ac (si son IgM o IgG)
d) detectar la presencia de una bacteria en un tejido
e) conocer en qu clulas de un tejido est presente determinada protena
f) cuantificar IgM total en un suero canino
g) determinar si un animal est respondiendo a un determinado Ag
2) En una prueba de interaccin 2aria., en qu situaciones puede haber formacin de
complejos inmunitarios sin formacin de la red de Marrack? Cmo podran confirmar las
distintas hiptesis?

36

ANEXO 1
ANTICUERPOS MONOCLONALES
Los anticuerpos generados en un animal por inmunizacin activa, (natural o artificial),
son heterogneos ya que tienen diferentes especificidades y afinidades. Proceden de distintos
clones de linfocitos B estimulados, por lo que constituyen un conjunto policlonal de
anticuerpos. Esta respuesta policlonal representa una ventaja adaptativa, permitiendo disponer
de Ac capaces de unirse a una gran variedad de antgenos, de expresar diferentes funciones
biolgicas y de evolucionar adaptndose al curso de la respuesta inmunitaria.
Por ser reactivos especficos (hacia un antgeno), los Ac pueden ser tambin utilizados
por el hombre para diversos fines, por ejemplo, para diagnstico, en teraputica o para separar
molculas con fines industriales. Tradicionalmente, un Ac hacia un antgeno se obtiene
inmunizando animales y obteniendo su suero, fuente principal de Ac. Los conejos y los
caballos han sido y an son muy usados como productores de sueros inmunes. Recordemos
que stos son reactivos policlonales.
Para algunos usos, sin embargo, la heterogeneidad de los Ac de un suero puede ser una
desventaja. Adems, cada preparacin de suero es diferente, an cuando se usen animales
genticamente idnticos, inmunizados con la misma preparacin de antgeno y con el mismo
protocolo de inmunizacin. Dicho en otros trminos: cada respuesta inmunitaria es nica. Por
lo tanto es imposible usar reactivos serolgicos idnticos en una larga serie de pruebas.
Estas desventajas pueden ser salvadas por los anticuerpos monoclonales, que, como su
nombre lo indica, derivan de un nico clon de linfocitos B y son por lo tanto especficos para
un epitope determinado e idnticos entre s, constituyendo una poblacin homognea.
Como no es posible purificarlos a partir de un suero policlonal, G. Khler y C. Milstein
desarrollaron en 1975 un mtodo para su preparacin, que se basa en la fusin de un linfocito
B normal con una clula plasmtica tumoral (clula de mieloma). La clula hbrida resultante
(llamada hibridoma) hereda de la clula de mieloma la capacidad de crecer indefinidamente in
vitro, y del linfocito B la de secretar anticuerpos.
Luego de la fusin, las clulas hbridas deben separarse de las que no se fusionaron y de
las que se fusionaron con otra clula del mismo tipo. Esto se logra usando clulas de mieloma
deficientes en una enzima requerida para la sntesis de nucletidos y cidos nucleicos por una
va alternativa que reutiliza las purinas. Por lo tanto, si luego de la fusin las clulas se
cultivan en un medio que contiene un inhibidor de la va de sntesis de novo de los
nucletidos (medio HAT), slo podrn desarrollar las clulas que puedan utilizar la va de
sntesis alternativa (es decir, los hibridomas, porque heredan del linfocito la capacidad de
utilizar esta va). Las clulas de mieloma que no se fusionaron o se fusionaron entre ellas no
se multiplicarn porque no poseen la va alternativa, y a su vez, los linfocitos B que no se
fusionaron o se fusionaron entre ellos tampoco se multiplicarn ya que no tienen la capacidad
de crecer indefinidamente in vitro.
El paso siguiente es la seleccin de los clones que secreten el Ac con la especificidad
deseada, para lo cual se analiza el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma mediante
pruebas serolgicas como ELISA y RIA.
Una vez detectados los hibridomas productores del Ac deseado, y controlada su
clonalidad, cada clon se cultiva para producir el Ac monoclonal deseado. El cultivo puede
hacerse in vitro (en medios apropiados para clulas) o bien in vivo, inyectando
intraperitonealmente las clulas del hibridoma en ratones y obteniendo tiempo despus el
lquido asctico acumulado, que contendr una elevada concentracin del Ac monoclonal. Los
hibridomas por su parte, se conservan indefinidamente por congelacin, pudiendo
descongelarse y cultivarse todas las veces que se desee, obteniendo siempre el mismo Ac.
Como cada hibridoma es un clon derivado de la fusin de un nico linfocito B, todas las
molculas de Ac que produce son idnticas en estructura y por lo tanto tienen el mismo sitio
de unin al antgeno e isotipo.
37

Antgeno

Aislar
clulas
del bazo

Seleccin

Fusin

Suero
Linfoblastos

Cl. de mieloma

Hibridomas

Ac4

Ac1
Ac1

Ac1

Ac2

Ac3

Ac4

Ac3

Ac2
Ac3

Ac2

Ac4

Anticuerpos policlonales

Anticuerpos monoclonales

Diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales

Epitopes que
reconocen

Ac policlonales (suero)

Ac monoclonales

Varios *

Unico

Especificidad

Vara entre animales y entre

sangras.

Afinidad

Variable entre sangras.

Rendimiento

Concentracin media 1 mg/ml

Volumen variable (segn especie)

Fija
Bajo en cultivo de tejidos.
Alto (hasta 20 mg/ml) en
lquido asctico)

Costo relativo

Bajo

Alto

No vara.
Alta especificidad.

*Sin embargo, cada uno de los Ac presentes en el suero reconoce un nico epitope.

Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales

-

Investigacin (purificacin y deteccin de antgenos)

Diagnstico in vitro (de preez, microorganismos patgenos, medicin del nivel de ciertas
drogas en sangre, estudios de histocompatibilidad, deteccin de antgenos tumorales) e in
vivo (deteccin de antgenos tumorales).
Fines teraputicos (inmunotoxinas compuestas por Ac monoclonales especficos de
clulas tumorales unidos a una toxina letal).

Bibliografa:
- Kuby, J. 1997. Immunology. 3rd. ed. W. H. Freeman and Company, New York. p. 131-135.
- Campbell, A. M. 1984. Monoclonal antibody technology. 1st. ed. Elsevier Science Publishers B.V.,
Amsterdam. p. 1-30.

38

ANEXO 2
Pruebas de interaccin primaria
Enzimoinmunoensayo
Dentro de las pruebas de interaccin primaria, las pruebas de ELISA han sido de las ms
difundidas. Pueden utilizarse para detectar o cuantificar tanto antgenos como anticuerpos,
pueden aplicarse fcilmente a diversos fludos como leche u orina, requieren pequeos
volumenes de muestra y son relativamente rpidas. Otra propiedad importante es que la seal
emitida puede ser cuantificada por aparatos especficos (espectrofotmetro) dando un
resultado objetivo que puede ser fcilmente automatizado.
En el desarrollo de los TP N3 y 4, se discuti el ejemplo de prueba de ELISA llamado
ELISA indirecto. Dependiendo de la secuencia en que se empleen los diferentes reactivos
(anticuerpos, antgeno y conjugado), podemos generar gran cantidad de variantes de esta
prueba. A continuacin se describen algunas de ellas, como son el ELISA de captura o
sandwich y el ELISA competitivo (fig. 1 y 2)

ELISA de captura o Sandwich

Inmovi liz aci n del
Ac de c aptura

Ig anti Ag X

La vados
Bloque o de los
espac ios libre s

Prote na
bloqueante

La vados

Agregado de la m uestra
proble ma

Ag X

La vados
Agregado de l
conj ugado

Ig anti Ag X
marcada

La vados

Sustrato+
cromgeno

Agregado de la m ezc la
sust rato-c romgeno

Ca mbio
de color

Le ctura de la prueba

Fig 1. ELISA de captura o sandwich

39

Este tipo de ELISA puede utilizarse tanto para la deteccin de Ag como la de Ac. En este
ejemplo se utiliza para la deteccin de un AgX en una muestra compuesta por diferentes
protenas. Los Ac del isotipo.

ELISA competitivo
Inmovilizacin del
Ac de captura

Ac
monoclonal

Lavados

Protena
bloqueante

Bloqueo de los
espacios libres
Lavados
Agregado de
muestra problema

Ag no
marcado

Lavados
Agregado del
conjugado

Ag marcado

Lavados

Sustrato+
cromgeno

Agregado de la mezcla
sustrato-cromgeno

Cambio de color
inversamente
proporcional a la
concentracin del
Ag en la muestra

Lectura de la prueba

Fig. 2: ELISA competitivo.

El ELISA competitivo puede utilizarse para determinar la concentracin tanto de Ag como
Ac. En el ejemplo de la Fig. 2, se determina la concentracin de Ag de una muestra utilizando
un Ac especfico inmovilizado en la placa. El mtodo se basa en la competencia por la unin
con el Ac de captura entre el Ag de la muestra y un Ag marcado con enzima. Cuanto menor
sea la intensidad del color generado, es decir menor absorbancia medida con el
espectrofotmetro, mayor ser la concentracin de Ag en la muestra problema. El Ag de la
muestra (Ag sin marcar) desplaza al conjugado (Ag marcado), que se elimina con los lavados,
disminuyendo as la cantidad de enzima presente en el pocillo y por consiguiente la cantidad
de color generado al agregar la mezcla de sustrato-cromgeno. Las concentraciones del Ag en
la muestra se calculan a partir de una curva patrn construida con concentraciones conocidas
del Ag.
40

Veamos algunos de los reactivos que se utilizan en las pruebas de interaccin primaria:
Anticuerpos policlonales, obtenidos a partir del suero de animales inmunizados con el
antgeno de inters.
Anticuerpos monoclonales, es decir, producidos por un nico clon de clulas plasmticas, por
lo tanto con nica especificidad. Investigue en la bibliografa como se obtienen los
anticuerpos monoclonales.
Anticuerpos anti-inmunoglobulina, obtenidos por inmunizacin con inmunoglobulinas de una
especie determinada en un animal de otra especie. Por ejemplo: anticuerpos generados en
conejo anti-IgG bovina (conejo anti IgG bovina)
Por su practicidad y relativo bajo costo, las pruebas de ELISA son de fcil implementacin en
programas de control y erradicacin de enfermedades infecciosas y en relevamientos
serolgicos.

Aplicaciones del ELISA

Hay una gran variedad de infecciones en animales domsticos en las que el ELISA puede ser
aplicada para su deteccin. A continuacin se resumen algunas de las aplicaciones de esta
tcnica tanto en la deteccin de Ag como de Ac en enfermedades infecciosas (Cuadro 1) y no
infecciosas. En el cuadro 2 se muestran las aplicaciones de la tcnica de ELISA en otras reas
distintas a las enfermedades infecciosas.

Enf. Virales

Deteccin de Ac

Deteccin de
Ag

Enf.
Bacterianas

Enf.
parasitarias

Rotavirus

Leptospira

Trichinella
spiralis

Parvovirus

Salmonella

Tripanosoma

Coronavirus

Brucella
abortus

Babesia

Rabia

Campylobacter Toxoplasma
fetus
gondii

Leucosis aviar

Haemophilus

Leucosis
bovina

Toxina tetnica Fasciola

heptica

Aftosa

Enterotoxina de Ecchinoccocus
sp.
E. coli

Parvovirus

Brucella
abortus

Toxoplasma
gondii

Anemia
Infecciosa
Equina
Rotavirus
Cuadro 1: Aplicaciones de la tcnica de ELISA para el diagnstico de enfermedades
infecciosas.
41

Hormonas
Insulina

Estrgenos
Progesterona
Hormonas
tiroideas

Enf.
Autoinmunes
Ac anti
tiroglobulina
Ac anti
eritrocitos
Complejos
inmunes
Ac anti ADN

Inmunoglobuli Bromatologa
nas
IgG
especie de
origen de
carnes
IgA
IgE
IgM

Cuadro 2: Otras aplicaciones de la tcnica de ELISA.

Otras pruebas de interaccin primaria utilizadas tanto en investigacin como para el

diagnstico de enfermedades se enumeran a continuacin:
Radio Inmuno Anlisis (RIA)
Test de adsorcin inmune (Radio Inmuno Sorbent Test o RIST)
Test de adsorcin de alergeno (Radio allergo Sorbent test o RAST)
Western Blot
Inmunofluorocitometra

Radioinmunoanlisis (RIA)
El RIA es una prueba de interaccin primaria que utiliza un radioistopo como marcador. El
ms comn es el 125I. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar concentraciones muy
pequeas de una sustancia (hasta el orden de pg/ml), por ejemplo, en endocrinologa permite
la cuantificacin de hormonas (Fig 3).
En clnica se usa para el diagnstico de enfermedades atpicas detectando la presencia de IgE
total y especfica para un determinado antgeno (RIST y RAST respectivamente). El soporte
slido utilizado en ambos casos es un disco de celulosa.
RIST (radioinmunosorbent test) es un RIA competitivo en el cual se detecta la cantidad total
de IgE del suero de un paciente alrgico sin importar su especificidad. Los niveles sricos de
IgE son generalmente bajos. Una respuesta de Ac de este isotipo sugiere una predisposicin
gentica a padecer alergia, pero no aporta datos sobre el Ag que provoca esa respuesta. Se
detectan asimismo niveles aumentados de IgE en animales parasitados.
RAST (radioallergosorbent test) es un radioinmunoensayo donde se detecta IgE especfica
para un determinado Ag o alergeno.
Estas pruebas deben ser ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los
potenciales peligros para la salud y la contaminacin ambiental que supone el manipuleo de
sustancias radioactivas.

42

Fig. 3 Radioinmunoensayo competitivo

Western Blot
Mientras que el ELISA detecta los anticuerpos contra un determinado Ag presentes en
lquidos biolgicos, dando resultados negativos, positivos o indeterminados, el Western Blot
es un test ms especfico. Esta tcnica permite identificar un Ag o Ac determinado en una
muestra de composicin heterognea. Por ejemplo, se pueden identificar los Ac generados
contra diferentes fracciones de un patgeno, que componen una respuesta policlonal contra el
mismo. El Western Blot combina la separacin de protenas de una mezcla de acuerdo a su
peso molecular, con la deteccin inmunolgica de Ag individuales mediante el uso de Ac
especficos para esos Ag. (Fig. 4).

43

Dada su alta especificidad, el Western Blot se utiliza en muchos casos como prueba
confirmatoria (p.e.: SIDA) y ha probado ser una herramienta muy til para identificar los Ag
ms importantes en microorganismos complejos y parsitos.

Fig. 4 Western Blot

44

CD4-CD8+

Doble positivo
(CD4+CD8+)

CD4+CD8-

CD4-CD8-

10

100

1000

PE (CD8)

FACS (Fluorescence Activated Cell Ssorting) o Citometra de flujo

Fluorescence activated cell sorting (FACS o Citometra de flujo) es una tcnica que permite
analizar ciertas propiedades fsicas y qumicas de clulas o partculas a las que se les ha unido uno
o mas Ac monoclonales marcados con colorantes fluorescentes, capaces de reconocer epitopes
sobre antgenos de superficie celular (por ejemplo CD4, CD8 y CD3). (Fig. 5). Estas clulas o
partculas se encuentran en suspensin y fluyen, una a una, frente a un rayo lser. A su paso frente
al rayo, la luz es desviada en un ngulo determinado, el cual es proporcional al tamao de esa
clula. A su vez, los fluorocromos (colorantes fluorescentes) de los anticuerpos unidos a la clula
son activados por la luz del rayo lser, emitiendo fluorescencia, que es colectada por sensores,
filtrada y almacenada en una computadora.

Histograma

10

100

1000

FITC fluoresc. (CD4)

Diagrama de puntos

Fig. 5. Esquema de funcionamiento del Citmetro de flujo y grficos de resultados

El anlisis de poblaciones celulares mediante citometra de flujo ha impactado enormemente en
inmunologa dada su capacidad para diferenciar y cuantificar simultneamente sub-poblaciones
45

celulares. Los resultados obtenidos de este anlisis pueden graficarse de diferentes formas, entre
ellas en forma de histograma y en forma de diagrama de puntos. En el histograma se representa la
cantidad de clulas con una alta intensidad de fluorescencia (rea sombreada) debida a la unin del
conjugado con molculas de la superficie celular comparada con una poblacin control negativa
(rea blanca). En el ejemplo presentado para el diagrama de puntos se analizan, mediante el uso de
dos conjugados (Ac anti CD8 marcados con Phicoeritrina (PE), y Ac anti CD4 marcados con
fluorescena (FITC), las subpoblaciones de linfocitos T colaboradores (CD4+), citolticos (CD8+) e
inmaduros (CD4+CD8+) de una suspensin de timocitos.
Entre las aplicaciones de esta prueba se pueden nombrar medicin de la intensidad de expresin de
molculas de superficie, contenido de DNA, RNA y protena, tamao, viabilidad, granularidad y
pH.

46

Preguntas sobre temas de clases

47

INTRODUCCIN AL SISTEMA INMUNITARIO

1. Qu es el sistema inmune?Qu ocurre en ausencia de un sistema inmunitario funcional?
2. La vigilancia inmunitaria se cumple slo frente a agentes externos al organismo?
3. Indique las barreras naturales que posee un animal, clasificndolas en fsicas, qumicas y
biolgicas. Identifique algunos factores que puedan alterarlas.
4. Frente a las siguiente situaciones, indique en qu caso espera obtener mayor respuesta inmune
del animal inyectado y justifique su respuesta.
I Un bovino al que se le inyecta:
a) Una protena de ratn
b) Una protena de ovino
II
Un bovino al que se le inyecta :
a) Una protena de 200 KDa
b) Un pequeo pptido, proveniente de la digestin de esta protena.
III
Un bovino al que se le inyecta :
a) Una protena
b) Un lpido
5. Cules clulas del sistema inmune derivan de la lnea mieloide y cules de la lnea linfoide?
Para cada uno de los tipos celulares mencionados, indique la funcin y la principal localizacin.
6. Qu diferencias existen en el reconocimiento de material por parte de la inmunidad innata y la
inmunidad adaptativa. Qu estructuras son reconocidas por la inmunidad innata? Indique los
receptores que las reconocen y su localizacin.
7. Realice un esquema de los pasos del proceso de fagocitosis. Indique las clulas y molculas
involucradas.
8. Cules son las diferencias entre la actividad fagoctica de los macrfagos y de los neutrfilos?
9. Indique cules son los mecanismos bactericidas mas importantes que se desencadenan tras la
fagocitosis.
10. En qu tipo de infecciones participan las clulas NK?

Glosario
Dar una definicin de los siguientes trminos. Puede incluir en la lista otros trminos nuevos para
su vocabulario.
Antgeno
Microorganismos comensales
Epitope
Epitope
Inmungeno
Epitope secuencial y conformacional
Hapteno
Opsoninas
Barreras naturales
Quimioquinas
Paratope

Bibliografa :
Escriba los datos del /los libros o material utilizado citando: Autor/es del captulo si corresponde
(apellido e iniciales de cada uno separados por ;). Ao de publicacin. N de Captulo. Ttulo
completo del captulo. Pgina inicial y final. Editor/es o autor del libro (apellido e iniciales ). Ttulo
completo del libro. N de Edicin. Editorial, lugar de publicacin.
Ejemplo: Coffin, J.M. (1996). Captulo 26. Retroviridae: the viruses and their replication, pp 763843. En: B.N. Fields; D.M. Knipe; P.M. Howley; et al. Fundamental Virology. 3ra edicin.
Lippincott Raven Publishers, Philadelphia.
En el caso de ser material encontrado en Internet citar: Nombre del sitio. Ao de actualizacin.
Ttulo del artculo. Direccin completa del sitio.Ejemplo: ONUSIDA-OPS. 2004.
Vigilancia del SIDA en las Amricas. Disponible en http://www.unaids.org.
48

COMPONENTES HUMORALES DE LA INMUNIDAD INNATA

1) Complete el siguiente cuadro sobre el sistema del complemento:
a)
Vas
de
b)..
Activacin
c).
Funciones del a)./
C/ Factores b) ./
involucrados c) ./
d) ./
2) Teniendo en cuenta las distintas funciones del complemento, esquematice las clulas y
molculas que intervienen en los siguientes mecanismos:
a) fagocitosis
b) inflamacin
3) Complete el siguiente cuadro teniendo en cuenta solo los interferones relacionados con la
inmunidad innata:
Tipo de
interfern

Nombre

Principal clula que lo

produce

Funcin

4) A qu se llama respuesta de fase aguda? Qu componentes y mecanismos intervienen? qu

signos y sntomas se presentan a nivel sistmico?
5) Cul es la funcin de la respuesta inflamatoria? Por qu se desencadena esta respuesta?
Cmo se relaciona con otros componentes de la respuesta inmunitaria?
6) Cules son los signos caractersticos de la inflamacin local y qu los provoca?
7) Indique cules son las citoquinas proinflamatorias. Qu clulas las producen? Sobre qu
tejidos/rganos actan y qu efecto tienen sobre los mismos?

Glosario
Respuesta de fase aguda
Interferones de tipo I
Interleuquinas proinflamatorias

Virus
Inflamacin

Protenas de fase aguda

Bibliografa

49

ORGANIZACIN DEL SISTEMA INMUNITARIO. CLULAS DE LA INMUNIDAD

ADAPTATIVA.
1) Describa la organizacin celular del tejido linfoide en el ganglio linftico Cmo circulan los linfocitos
en este rgano?
2) Qu procesos se llevan a cabo en :
a. zona paracortical del ganglio
b. folculo secundario
c. centro germinativo
d. mdula
e. vnula de endotelio alto
3) Qu rol tiene la bolsa de Fabricio y cul es su equivalente en otras especies?
4) Complete el siguiente cuadro:
Propiedad
rgano donde madura
Distribucin
Circulacin
Receptores de Ag
Tipo de Ag que reconocen
Clulas diferenciadas
Productos secretados

Linfocitos B

Linfocitos T

5) Ordene en una lista las siguientes clulas en relacin con el desarrollo. Identifique al lado de cada clula
el rgano en el cual se las encuentra y adems si en el mismo hay contacto con antgeno o no.
a. Linfocito B virgen
b. Progenitor linfoide comn
c. Linfocito T citotxico
d. Plasmocito
e. Clula troncal pluripotente
f. Linfocito T virgen.
6) a)Qu componentes del sistema inmunitario se vern afectados en un animal cuya mdula sea es
destruda por irradiacin?
b)Cul sera el efecto de una timectoma (extirpacin del timo) en un animal recin nacido?
7) Realice un esquema de los mecanismos que se llevan a cabo en el timo indicando las clulas y molculas
de superficie involucradas ms importantes. Cul es la consecuencia de la falla de estos procesos?
8) Indique que tipo de seleccin interviene y su consecuencia sobre los LT inmaduros en los siguientes
casos:
a. No hay TCR
b. TCR + MHC+ autoantgeno
c. TCR + MHC de diferente haplotipo
d. TCR + MHC +Ag X extrao

9) Realice un esquema de una molcula de inmunoglobulina e identifique sus diferentes componentes y

regiones.
Glosario
Timocitos
Seleccin positiva
Seleccin negativa
Seleccin clonal
Haplotipo
Centro germinal
Clulas dendrticas
Clulas dendrticas foliculares

Vnulas de endotelio alto (HEV)

LT Autorreactivo
Tolerancia
Clulas M
rganos linfoides primarios
rganos linfoides secundarios

50

RECEPTORES DE ANTGENO. PROCESAMIENTO Y PRESENTACIN DE ANTGENO.

1) A qu se denomina Ag? Explique las caractersticas que debe poseer una sustancia para comportarse
como Ag. Cite ejemplos de sustancias antignicas y no antignicas para cada una de esas caractersticas.
2) Qu diferencias existen en el reconocimiento del Ag por el LT y el LB? Describa los receptores
involucrados en el reconocimiento.
3) Qu camino debe seguir un Ag para ser reconocido y activar a un LT? Mencione clulas, receptores
ms importantes y molculas que participan. Indique el lugar anatmico donde ocurre la activacin del
LT.
4) Cuntos pptidos diferentes puede presentar una misma clula presentadora? Cuntos epitopes
diferentes puede reconocer un LB? Y un LT? Explique
5) Cmo el sistema inmunitario puede reconocer y responder especficamente a una gran variedad de
antgenos (y al mismo tiempo preservar su identidad sin agredirse)?

Glosario
Antgeno
Hapteno
Repertorio
TCR
BCR
CMH
Restriccin del CMH
coestimulacin
Especificidad
Diversidad

Bibliografa uilizada:

51

RESPUESTA INMUNITARIA HUMORAL

1) En la respuesta inmunitaria en relacin a un antgeno T-dependiente (que es procesado por la va
endosmica):
a) Qu clulas son capaces de procesar y presentar este antgeno?
b) Cmo es reconocido este antgeno por los linfocitos B y T? Indique las molculas y clulas
involucradas. Cmo son los epitopes reconocidos en cada caso (LB y LT)?
c) Qu subpoblacin de linfocitos T interviene? Cmo lo hace?
d) Cules son las consecuencias de la activacin de los linfocitos B especficos?
2) La respuesta humoral frente a un antgeno T-dependiente evoluciona en 2 fases denominadas
respuesta primaria y secundaria.
a) Por qu se llaman 1aria y 2aria?
b) Realice una curva que represente los niveles e isotipos de anticuerpos a travs del tiempo (das)
para esas 2 respuestas
c) Observando el grfico indique cul de las 2 respuestas:
- tiene mayor duracin
- tiene menor nivel (es decir que alcanza una menor concentracin de anticuerpos)
- tiene a la IgG como isotipo predominante
- tiene a la IgM como isotipo predominante
- es ms rpida
Explique el por qu de cada una de esas caractersticas.
3) Qu caractersticas tienen los antgenos T-independientes (TI)? D ejemplos. Esquematice cmo
interacciona un antgeno TI con las clulas que intervienen y las caractersticas de la respuesta humoral
que ste genera. Realice un cuadro sealando las diferencias con la respuesta humoral que genera un
antgeno T-dependiente.
4) Identifique los mecanismos en los que los anticuerpos intervienen para eliminar o limitar la accin de
un agente patgeno. Realice esquemas en los que se representen estas funciones biolgicas de los
anticuerpos.

Glosario
Antgenos T dependientes
Antgenos T independientes
Maduracin (aumento) de la afinidad
Procesamiento de Ag
Inmunidad humoral
Centro germinal
Cooperacin celular
Cambio isotpico
Seleccin clonal
Clase o isotipo de Ig
Molculas coestimulatorias
Bibliografia utilizada

52

RESPUESTA INMUNITARIA CELULAR

1) Mencione las distintas subpoblaciones de linfocitos T y qu factores influencian su diferenciacin
2) Elabore un cuadro indicando receptores celulares de las subpoblaciones de linfocitos T, vas de
presentacin que las activan, funcin y principal citoquina/s que liberan.
3) Identifique los elementos celulares y humorales que intervienen en la respuesta inmune frente a un
antgeno que es procesado por la va citoslica
a. describa el mecanismo de presentacin del antgeno, indicando las molculas de membrana
que intervienen.
b. Cules son los requerimientos para la activacin de la clula efectora?
c. Cules son las consecuencias de la activacin de la clula efectora? Cmo lleva a cabo la
eliminacin del antgeno?
4) Elabore un cuadro comparando las vas de activacin y mecanismo de citotoxicidad de los linfocitos T
citotxicos y de las clulas NK (naturales asesinas)
5) Cmo se diferencian la va de citotoxicidad mediada por FAS de la mediada por perforinas?
6) Qu mecanismos llevan a la activacin de los macrfagos? Cules son las consecuencias de su
activacin?

Glosario
Linfocitos Th1
Linfocitos Th2
Linfocitos Th0
Apoptosis
FAS/ ligando de FAS
Perforinas
Citotoxicidad
INF
Macrfago activado
citotoxinas
Clulas naturales asesinas o NK
Bibliografia utilizada

53

RESPUESTA INMUNE EN ACCIN

1) Cite al menos 2 ejemplos de BACTERIAS EXTRACELULARES, de importancia en Medicina
Veterinaria, que sean productoras de EXOTOXINAS. Identifique sus principales factores de virulencia.
2) Ante la primer entrada de una bacteria productora de exotoxinas, identifique:
a. Las barreras naturales debe vencer para establecer una infeccin
b. Los principales mecanismos de la inmunidad innata que intervienen. Cmo actan estos
mecanismos para la eliminacin y neutralizacin del microorganismo?
c. Los mecanismos de la inmunidad adquirida que son importantes para la eliminacin de la
infeccin y para la proteccin frente a una nueva invasin del mismo microorganismo.
Explique brevemente como se inducen esos mecanismos, indicando cul es la va de
procesamiento principal del antgeno, poblaciones y subpoblaciones celulares que intervienen y
principales citoquinas liberadas.
Cmo actan estos mecanismos para la eliminacin y neutralizacin del microorganismo?
3) Conteste las preguntas 1 y 2, pero tomando en consideracin BACTERIAS de vida
INTRACELULAR FACULTATIVA de importancia en Medicina Veterinaria.
4) Conteste las preguntas 1 y 2, pero tomando en consideracin un VIRUS.
Con la informacin obtenida, complete el siguiente cuadro:
Tipo de microorganismo
Mecanismos
Bacteria extracelular
Bacteria intracelular
toxignica
Mec.
solubles
efectores de
la II
celulares

Virus

Va de procesamiento
principal del Ag
Principal subpoblacin
de LT colaborador que
acta
Mec.
Solubles
efectores de
la IA
Celulares

Glosario:
Virus
Endotoxina
Endotoxina
respuesta protectora
mecanismos de evasin de la respuesta inmune.
Bibliografa utilizada:

54

INMUNOPREVENCIN
1) Complete el siguiente cuadro con los trminos escritos en negrita:
Tipo de
inmunidad
activa/pasiva/
natural/artificial

Efectores involucrados
inducidos/transferidos
clulas/Ac

Duracin de
la proteccin
corta/larga

Generacin
de memoria
si/no

Vacunacin
Sueroterapia
Infeccin o
enfermedad
Transferencia de
Ig va placentaria
Transferencia de
Ig va calostral
2) Indique en el siguiente cuadro las ventajas y desventajas del uso de vacunas convencionales vivas y
muertas.
Tipo de vacunas
Ventajas
Desventajas/riesgos
Vivas/ atenuadas
Muertas/inactivadas/inertes

3) En qu tipo de vacunas deben usarse adyuvantes? Cmo actan estas sustancias sobre el sistema
inmunitario? Cite los adyuvantes de mayor empleo en medicina veterinaria.
4) Qu es una anavacuna/anacultivo/vacuna integral?
5) Con qu propsito vacunara una hembra gestante? Qu tipo de vacuna utilizara y en qu momento
antes del parto lo hara? Fundamente sus respuestas.
6) Cmo ser la respuesta a una vacuna en la cual el Ag es un polisacrido de la cpsula de un
microorganismo? Cmo se denominan este tipo de antgenos? Qu tipo de vacuna sera el ms
adecuado si se quiere desarrollar una respuesta ms eficiente y duradera contra ese Ag?
7) Ud. recibir en clase un frasco de vacuna. En base al estudio del mismo complete este informe:
Se trata de una vacuna:
combinada o mixta
monovalente /
polivalente
viva
/
inerte
liofilizada
/
en suspensin o solucin

El contenido es
monodosis
/
varias dosis (cuntas?)
Por qu va se aplica?
ocular / subcutnea / intramuscular./ oral/ intranasal
Contiene adyuvante? SI-NO cul?
Qu tipo de antgenos incluye? Somas bacterianos / somas virales / toxoides / lisados / otros
Hay indicaciones respecto de su conservacin?
Tiene etiqueta de aprobacin oficial (SENASA). Qu informacin hay en la misma?
A qu controles debi haberse sometido esta vacuna?
Glosario:
Bibliografa utilizada
55

REGULACIN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA

1) Describa en qu se fundamenta la tolerancia hacia los propios tejidos.
2) Por qu estn regulados los mecanismos de la inmunidad innata?
3) Por qu la respuesta inmunitaria frente a un Ag determinado no aumenta indefinidamente? Explique.
4) Identificar los procesos (incluidos los de regulacin) que ocurren en cada etapa de la respuesta inmune
humoral (1-2-3).

5) Por qu 2 animales pueden desarrollar una respuesta inmunitaria diferente frente a una misma
vacuna?
6) Compare las siguientes curvas de respuesta frente a vacunas atenuadas (vivas) e inactivadas (muertas).
A qu se debe la diferencia? Relacione con las funciones de los adyuvantes.

Rta. a vacuna
inactivada

7)
a)
b)
c)

Rta. a vacuna
atenuada

Discuta cules componentes incluira en vacunas que protejan contra:

una potente exotoxina
una bacteria de vida intracelular facultativa
un virus

8) Discuta cmo debera ser el esquema de vacunacin para proteger a un ternero contra enfermedades
que podra presentar en sus primeras semanas de vida. Vacunara al ternero recin nacido? Justifique su
respuesta.

Glosario:
Bibiografa utilizada:

56