Professional Documents
Culture Documents
Qumica
Practica No.1
Practica No.2
Bioseguridad
Practica No.3
Espectrofotometra
10
Practica No.4
13
Practica No.5
Identificacin de aminocidos
16
Practica No.6
Disociacin de aminocidos
21
Practica No.7
24
Practica No.8
28
Practica No.9
Practica No.10
Practica No.11
33
36
41
Practica No.12
44
Practica No.13
48
Practica No. 14
Aislamiento de ADN
50
SESIN 1.
PRESENTACIN DEL DOCENTE
FORMAS DE EVALUACIN
ELABORACIN DE REPORTE
ASPECTOS GENERALES
SESIN 2
PRACTICA # 1
OBJETIVO
Desarrollar destreza en el manejo tanto de material como de instrumentacin aplicable
a tcnicas de experimentacin en el rea bioqumica.
PRERREQUISITOS
1.- Conocimientos sobre diluciones, soluciones y mezclas.
2.- Definicin de cido, base y amortiguador.
3.- Conocimiento bsico del manejo del potencimetro y el fotocolormetro.
4.- Que es una solucin Molar, Normal y % w/v
INTRODUCCIN
Para llevar a cabo con xito un experimento en cualquier laboratorio es necesario que
se manejen tcnicas bsicas de experimentacin tales como:
- Tcnicas de medicin de lquidos.
- Tcnicas de pesado de slidos.
- Tcnicas de mezclado de lquidos y slidos.
Todas estas tcnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que
cotidianamente se llevan a cabo en el laboratorio de Bioqumica. A continuacin se dan
algunos datos sobre cada una de estas tcnicas.
Medicin de lquidos: Los instrumentos de medicin de lquidos ms utilizados son:
pipetas, probetas y matraces volumtricos. Las pipetas sirven para medir volmenes de
hasta 25 ml. En este rango de volumen, las pipetas tienen un uso muy frecuente en el
laboratorio por su exactitud y confiabilidad. Existen dos tipos generales de pipetas: las
serolgicas y las volumtricas.
La pipetas serolgicas miden volmenes diversos debido a que estn graduadas en
diferentes medidas, por ejemplo, una pipeta de 1.0 ml. esta graduada en dcimas de
mililitro y por lo tanto sirve para la medicin de cualquier volumen menor de 1.0 ml. Las
pipetas ms frecuentemente usadas son de 1.0, 2.0, 5.0 y 10.0 ml.
Las pipetas volumtricas slo miden volmenes fijos ya que estn graduadas para
medir un solo volumen, por ejemplo, una pipeta volumtrica de 1.0 ml. solo servir para
medir este volumen.
Algunas pipetas estn diseadas para que al momento de liberar el lquido que se est
midiendo quede una pequea porcin en la punta de las mismas, esta porcin debe
dejarse contenida en la pipeta porque de otra manera se introducir un error en la
4
medicin. La manera de reconocer este tipo de pipetas es por las letras TD (To Deliver)
que se encuentran en la parte superior de la pipeta. Otras pipetas estn diseadas para
liberar todo el volumen incluyendo la porcin que se queda en la punta, este tipo de
pipetas se reconocen por las letras TC (To Contain), en este caso, si no se libera el
total del lquido medido se incurre en un error de medicin.
Las buretas varan en tamao, generalmente de 1 a 100 ml. El flujo del lquido es
controlado por una llave de vidrio o de tefln. Si es de vidrio requiere lubricacin. Las
buretas deben llenarse por arriba de la marca de cero y posteriormente abrir la llave
cuidadosamente para que fluya el lquido y el menisco se ajuste a cero. Dentro de los
usos indicados para las buretas se encuentran las titulaciones y para medicin de
volumenes de lquidos txicos, cidos, sustancias corrosivas, etc.
Las probetas son cilindros graduados que miden volmenes por arriba de los 25 ml.
todas ellas son usadas para medir volmenes diversos, por ejemplo, con una probeta
de 50 ml. se pueden medir volmenes de 26, 38 o 42 ml etc.. Estos volmenes se
denotan por marcas que se encuentran entre una graduacin y otra. las probetas ms
frecuentemente utilizadas son: 50, 100, 250, 500 y 1000 ml.. Para medir volumen en
una probeta se tiene que tomar en cuenta la siguiente regla: La superficie de un lquido
dentro de una probeta siempre forma una curva o menisco. El diseo de la probeta esta
hecho para medir volmenes exactos al igualar la parte inferior del menisco con la
graduacin. Si se mide el volumen con la parte superior del menisco, se incurrir en un
error.
Los matraces volumtricos, tambien llamados de aforacin, sirven para medir
volmenes exactos y son usados cuando se hacen soluciones porcentuales y molares.
Los matraces ms frecuentemente usados son de 50, 100, 500 y 1000 ml.. El uso de
estos matraces sigue la misma tcnica de medicin que las probetas.
Todos los recipientes arriba mencionados son material de vidrio, por lo tanto, estn
expuestos a cambios de tamao en altas y bajas temperaturas y esto puede modificar
drsticamente la exactitud de la medicin. El diseo de este material de cristalera est
hecho para medir volmenes a una temperatura promedio de 25C.
Medicin de slidos: La balanza granataria y la balanza analtica son las ms utilizadas
en la medicin de reactivos qumicos de textura slida.
La granataria tiene una
exactitud de aproximadamente una dcima de gramo, se utiliza para pesar cantidades
mayores de un gramo y cuando la precisin no sea menor de 0.1 g.
La balanza analtica se utiliza cuando el peso deseado requiera una precisin menor de
0.1 g. Es uno de los instrumentos ms sensibles y permite pesar hasta dcimas de
miligramo.
Sin embargo, el uso de ambos tipos de balanzas requiere de cuidados bsicos
comunes tales como: limpieza completa de todas las partes de la balanza; mantener la
tara especfica de la balanza antes de cualquier pesada y hacer pesadas racionales
con respecto a la capacidad de la balanza.
Las balanzas de torcin son tiles en el laboratorio de bioqumica como una
herramienta para el buen uso de la centrfuga ya que para equilibrar los tubos de
centrfuga siempre debe hacerse en base al peso y no al volumen del contenido.
5
SESIN 3 Y 4
PRCTICA # 2
BIOSEGURIDAD
OBJETIVO
Que el alumno se familiarice con el material Peligroso Biolgico infeccioso, su manejo y
desecho adecuado, de acuerdo a las normas mexicanas NOM-087 y NOM-052.
INTRODUCCIN
Residuos peligrosos biolgicos infecciosos
Qu son los residuos peligrosos biolgicos infecciosos?
Los residuos peligrosos biolgicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que
se generan durante las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en
los centros de salud, laboratorios clnicos o de investigacin, bioterios, centros de
enseanza e investigacin, principalmente; que por el contenido de sus componentes
puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.
Cules son considerados los RPBI?
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son
considerados los siguientes:
La sangre: La sangre y los componentes de sta, slo en su forma lquida, as como los
derivados no comerciales, incluyendo las clulas progenitoras, hematopoyticas y las
fracciones celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).
Los cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos: Los cultivos generados en los
procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en la
produccin y control de agentes biolgico-infecciosos. Utensilios desechables usados
para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biolgico-infecciosos.
Los patolgicos: Los tejidos, rganos y partes que se extirpan o remueven durante las
necropsias, la ciruga o algn otro tipo de intervencin quirrgica, que no se encuentren
en formol. Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e
histolgico, excluyendo orina y excremento. Los cadveres y partes de animales que
fueron inoculados con agentes enteropatgenos en centros de investigacin y bioterios.
Los residuos no anatmicos
Son residuos no anatmicos los siguientes:
Los recipientes desechables que contengan sangre lquida.
Los materiales de curacin, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de
los siguientes fluidos corporales: lquido sinovial, lquido pericrdico, lquido pleural,
lquido Cfalo-Raqudeo o lquido peritoneal.
Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y
cualquier material usado para contener stos, de pacientes con sospecha o diagnstico
7
SESIN 5 Y 6
PRACTICA # 3
ESPECTROFOTOMETRA
INTRODUCCIN:
La fotocolorimetra o espectrofotometra, es una tcnica que permite medir la absorcin
de radiacin electromagntica, ultravioleta y visible de numerosas especies qumicas
inorgnicas y orgnicas, para su anlisis cualitativo y cuantitativo.
Las molculas son capaces de absorber radiaciones electromagnticas. Tanto la
longitud de onda () de la radiacin absorbida como la eficiencia con que se absorbe
dependen de la estructura de la molcula y del medio en que se halla.
La mayora de los instrumentos espectroscpicos para medir las radiaciones UVVisible e IR incluyen cinco componentes, una fuente estable de engra radiante, un
selector de longitud de onda que asla una regin limitada del espectro para hacer la
medicin; uno o mas recipientes para la muestra; un detector de radiacin que
convierte la energa radiante en una seal elctrica que puede medirse y un sistema
que procesa y lee la seal que consta, actualmente de una computadora.
Cada especie molecular tiene la capacidad de absorber su propia frecuencia
caracterstica de la radiacin electromagntica. Este proceso transfiere energa a la
molcula y provoca una disminucin en la intensidad de la radiacin electromagntica
incidente. Por consiguiente, la absorcin de la radiacin atena el rayo incidente de
acuerdo con la ley de absorcin que se describe como Lambert-Beer.
Esta ley proporciona informacin cuantitativa de cmo es que la atenuacin de la
radiacin, depende de la concentracin de las molculas que la absorben y de la
distancia que recorre el rayo en el medio absorbente. Cuando la luz atraviesa una
solucin de analito, la intensidad de la radiacin disminuye como consecuencia de la
excitacin del analito.
A = bc
Donde:
que se utilizar en el anlisis cuantitativo de dicho analito. Todas las disoluciones que
presentan color, absorben radiacin electromagntica perteneciente al espectro visible.
OBJETIVO:
Aprender el uso del espectrofotmetro para determinar los espectros de
absorcin y curvas de calibracin de dos sustancias coloridas.
MATERIAL:
Solucin de H2SO4 0.5M (bureta)
Solucin de KMnO4 4x10-4 M
Solucin K2Cr2O7 1.6x10-3 M
11 tubos de ensaye de 15x160mm
2 pipetas de 10mL
2 pipetas de 5mL
2 celdillas para espectrofotmetro
1 gradilla
Espectrofotmetro
METODOLOGA:
Experimento No. 1: Determinacin de los espectros de absorcin
Tomar alcuotas de aproximadamente 3mL de KMnO4, y K2Cr2O7.
Colocar en celdillas por separado para medir la absorbancia de cada solucin desde
los 330nm a los 600nm en intervalos de 30nm; determinando as la longitud de onda de
mxima absorbancia para cada solucin.
En cada longitud de onda se deber calibrar primero a cero con la solucin de H 2SO4
(blanco).
Registrar las absorbancias de ambas soluciones a cada longitud de onda.
Experimento No. 2: Preparacin de curvas de calibracin para cada solucin estndar
Tomar alcuotas de KMnO4, y K2Cr2O7 y muestras problema.
Preparar, a partir de las soluciones estndares de KMnO 4, y K2Cr2O7 por
separado, diluciones a 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16 de cada solucin. Utilizando como diluyente
H2SO4.
Leer y registrar las absorbancias de cada dilucin a la longitud de onda que se
haya registrado el mximo de absorcin para cada solucin estndar de KMnO 4, y
K2Cr2O7. (Experimento anterior).
11
% Error
DISCUSIN:
CONCLUSIN:
BIBLIOGRAFA CONSULTADA:
CUESTIONARIO:
1) De acuerdo a sus datos, diga cual es el rango de concentraciones en el que podra
utilizar su curva de KMnO4. Por qu?
2) Qu caractersticas nos indican que una curva de calibracin es adecuada?
3) Qu pasara si intenta utilizar la curva realizada en esta prctica para calcular la
concentracin de una muestra problema conteniendo K 2Cr2O7 150 mM?
4) De acuerdo a sus datos, Cul es el coeficiente de extincin molar del K 2Cr2O7?
(utilice las unidades adecuadas).
12
SESIN 7
PRCTICA 4
OBJETIVO:
Que el alumno conozca el instrumento de medicin, principios y fundamento para
aplicarlo en las caractersticas cido base de las soluciones.
INTRODUCCIN:
El potencimetro, es un sensor utilizado en el mtodo electroqumico como equipo de
medicin, en la cuantificacin del potencial Hidrgeno (pH) de cualquier disolucin.
La determinacin del pH, consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de
una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones, con diferente concentracin
de protones. En consecuencia, se conoce la sensibilidad y la selectividad de las
membranas de vidrio ante el pH.
Un electrodo para medir el pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel
(mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolucin en la que
queremos encontrar el pH. El soporte del electrodo es de vidrio comn y no es
conductor, mientras que el bulbo sensible se encuentra formado por un vidrio
polarizable (vidrio sensible de pH). Se llena el bulbo con la solucin de HCl 0.1N
saturado con AgCl. El voltaje en el interior del tubo es constante (pH 7) de manera que
la diferencia de potencial solo depende del pH del medio externo. El alambre que se
sumerge al interior (normalmente Ag/AgCl) permite conducir este potencial hasta un
amplificador.
El pH metro es relativamente inmune a las interferencias de color, turbidez, material
coloidal, cloro libre, substancias oxidantes y/o reductoras. La medicin es afectada solo
cuando la superficie de la membrana est sucia con grasa o material orgnico insoluble
en agua, que le impide hacer contacto con la muestra, por lo que se recomienda la
limpieza escrupulosa de los electrodos. Los electrodos deben ser enjuagados con agua
destilada entre muestras (el uso adecuado de la pizeta es de vital importancia),
posteriormente deber secarse el electrodo preferentemente con papel klenex o papel
sanitario de textura suave pero que no deje pelusa, nunca debe secarse con tela
porque podra cargase electrostticamente.
Como los electrodos de vidrio de pH cuantifican la concentracin de H+ relativa a sus
referencias, deben ser calibrados peridicamente para asegurar la precisin, es por eso
que se utilizan soluciones especficas llamadas buffers de calibracin (disoluciones
reguladoras de pH conocido). Estas soluciones son: solucin buffer (fosfato) de pH 7
color amarillo, solucin buffer (biftalato) de pH 4 color rojo, solucin buffer (borato) de
pH 10 color azul.
13
14
Retire el electrodo, enjuguelo con agua destilada y proceda a efectuar las mediciones.
No olvide enjuagar el electrodo muy bien con agua destilada (pizeta) despus de cada
medicin.
Precauciones
El pHmetro debe siempre mantenerse en su estuche si no se est utilizando, con
respecto al electrodo deber mantenerse en la solucin buffer de pH 4.0, misma que se
encuentra en el pequeo recipiente en el que descansa el electrodo.
15
SESION 8 y 9
PRACTICA #5
IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS
INTRODUCCIN:
Alrededor de 20 L-amonicidos forman las unidades monomricas de las cuales se
constituyen las protenas.
Solo los L-aminocidos existen en las protenas. Todos los aminocidos
contienen grupos funcionales amino y carboxilo; en un L-aminocido, ambos grupos
estn unidos al mismo tomo de carbono, con la siguiente estructura:
RCOO- + H+
R-NH3+
R-NH2 + H+
- Papel sanitario
5 pipetas de 5.0mL
1 pipeta de 10.0mL
1 bureta
METODOLOGIA:
Experimento No. 1: Identificacin de aminocidos
A) Prueba de Sullivan: Se toman alcuotas de agua destilada, cistena o cistina, y dos
muestras problema. Y en 3 tubos por separado y previamente etiquetados se les realiza
la prueba de Sullivan como se describe en el siguiente cuadro:
Tubo
Cisteina (mL)
Muestra (mL)
NaCN (mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Se dejan reposar las soluciones en cada tubo por 10 minutos. Y se agrega a todos los
tubos Nitroprusiato de sodio (2-3 gotas) e hidrxido de amonio (NH 4OH) (2 gotas).
17
Comparar las coloraciones. Un color rojizo indicar prueba positiva, es decir, presencia
de aminocidos que en su radical contiene azufre.
B) Prueba de identificacin de fenoles p_sustituidos (tirosina) con Nitrosonaftol: En 3
tubos por separado y etiquetados se realizan las soluciones siguientes:
Tubo
H2O dest
Tirosina (mL)
Muestra
Nitrosofaftol
0.5 mL
2-3 gotas
0.5
2-3 gotas
0.5
2-3 gotas
H20 dest
(mL)
Prolina (mL)
Tirosina
(mL)
Muestra
Ninhidrina
(mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Frente de soluto
19
20
SESIN 10 y 11
PRCTICA # 6
DISOCIACIN DE AMINOCIDOS
OBJETIVO
Comprender el comportamiento de los aminocidos como molculas anfotricas y
correlacionar esta propiedad con las caractersticas de los grupo radicales.
FUNDAMENTO:
Los aminocidos son molculas que presentan la siguiente estructura qumica
genrica:
H
|
R
COO-
C |
+
NH3
H
pk1
H
pK2
NH3
pH = cido
|
+
NH3
l
NH2
pH = alcalino
21
ANLISIS DE DATOS
a)
Elaborar una curva de titulacin para cada aminocido, con los valores de pH en
el eje de las oredenadas y los volmenes equivalentes del cido y de la base en el eje de
las absisas.
b)
Determinar en la grfica de titulacin los valores de pKa, punto isoelctrico y las
zonas de amortiguamiento de cada aminocido.
23
SESIN 12 y 13
PRCTICA # 7
Aminocido 2:
NH2-CH-COOH
R
H-N-CH-COOH
H R
Prdida de Agua
Enlace peptdico:
Entre las reacciones coloreadas especficas de las protenas, que sirven por
tanto para su identificacin, destaca la reaccin de Biuret. Esta reaccin la producen
los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la presencia
del enlace peptdico CO-NH que se destruye al liberarse los aminocidos. En el
reactivo de Biuret (CuSO4 + NaOH), el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se
coordina con los enlaces peptdicos, formando un complejo de color violeta, cuya
intensidad de color depende de la concentracin de protenas.
Reaccin con Ninhidrina:
Al igual que las otras reacciones, esta forma un complejo color prpura, para
todas las sustancias o mezclas que presentan aminocidos. No es especfica como las
anteriores, pero es de gran ayuda para la identificacin primaria de protenas, que
despus nos lleven a realizar ms pruebas de identificacin ya especfica.
OBJETIVO:
Identificar protenas por la presencia de enlaces peptdicos y grupos aromticos,
y cuantificarlas mediante la tcnica de Biuret.
MATERIAL:
15 tubos de ensaye
1 gradilla
5 pipetas de 1.0mL
2 pipetas de 5.0mL
1 pipeta de 10.0mL
1 bureta
METODOLOGIA:
Experimento No. 1: Identificacin de protenas
A) Reaccin Xantoprotica
Colocar los mismos estndares en tubos por separado, como lo indica el
siguiente cuadro:
Tubo
Estandar (mL)
HNO3 (mL)
0.5 peptona
0.5
0.5 gelatina
0.5
0.5 albmina
0.5
0.5 tirosina
0.5
5 (blanco)
0.5
0.5
25
Estandar (mL)
Reactivo de Biuret
1 peptona
1 gelatina
1 albmina
1 tirosina
5 (blanco)
26
RESULTADOS:
Se reportan los resultados de las pruebas Xantoproteica, y Biuret, como la
descripcin de los cambios de colores en las soluciones de la siguiente forma: (++)
color intenso, (+) cambio ligero, y (-) sin formacin de color. Indicar que significa el
cambio de color en cada reaccin.
Se reportara una grfica en la que se presenten las distintas concentraciones de
albmina (estndares) contra la absorbancia que presentan de modo que se obtenga
una curva de calibracin. Incluya una tabla con los valores de absorbancia de cada
estndar y muestra problema.
Utilizar esta curva para determinar las concentraciones de las soluciones
problema con su respectivo porcentaje de error:
% Error
DISCUSIN:
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
CUESTIONARIO:
1) Describir y explicar mediante un esquema la reaccin entre el reactivo de Biuret y los
enlaces peptdicos.
2) Investigue otros dos mtodos empleados comnmente para cuantificar protenas.
Diga cual es el rango de concentraciones en el que se utilizan estos dos mtodos, as
como el mtodo de Biuret. Cul de los tres mtodos es el mas sensible?
3) Explique por qu razn en la presente prctica se utiliz una curva de calibracin de
albmina para luego cuantificar muestras problema que no contenan albmina.
27
SESIN 14 y 15
PRACTICA # 8
28
MATERIAL:
1.- 13 tubos de ensaye de 10 x150 mm.
2.- 1 pipeta de 10ml.
3.- 6 pipetas de 5ml.
4.- 1 gradilla
METODOLOGA:
En esta prctica se trata de provocar cambios de solubilidad en las protenas
que se encuentran en el organismo, mediante la modificacin de las propiedades de
los solventes.
Experimento No.1 Determinacin del punto isolelctrico del albuminato de sodio por
adicin de un cido
Preparar una serie de tubos como se indica a continuacin (mL):
Tubo
Acetato de sodio
0.1 N
cido actico
cido actico
0.1 N
0.01 N
0.5
9.5
1.5
8.5
10
29
pH
PRECIPITACI
N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NaCl 10 %
ZnSO4 10 %
Co(CH3COO)2 10%
Etanol
H2O
0.5
0.5
0.1
0.9
0.5
0.5
0.1
0.9
0.5
0.5
0.1
0.9
10
11
0.5
0.5
12
0.1
0.9
30
Fuerza
TUBO
Sal
inica
% Solubilidad
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
RESULTADOS:
Se reportara para el primer experimento una tabla con los valores de pH calculados
para cada tubo, as como la cantidad de precipitado formado. Para ello se utilizarn
cruces: (+++) muy precipitada (++) precipitacin media (+) poca precipitacin (-)
completamente solubilizada. A partir de esta tabla, se determinar el punto isoelctrico
del albminato como aquel pH al cual exista el mayor precipitado.
En el experimento dos se reportar la tabla con fuerza inica de cada tubo as como
porcentaje de solubilidad asignado. NOTA: el porcentaje de solubilidad ser inverso a
la cantidad de precipitado.
A partir de esta tabla, construya una grafica de %de solubilidad contra fuerza inica,
utilizando una lnea diferente para cada sal. O bien, construya tres grficas de barras
separadas, una para cada sal. NOTA: En el eje de las x, las fuerzas inicas deben estar
ordenadas de menor a mayor.
DISCUSION:
31
Se compararn los valores obtenidos de punto isoelctrico con los que presenta la
bibliografa y se dar una explicacin del por que de las diferencias encontradas (si las
hay).
Explicar el comportamiento observado en las graficas de solubilidad contra fuerza
inica. Explicar las diferencias existentes entre el comportamiento de las tres sales (si
las hay).
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
32
SESION 16 Y 17
Prctica # 9
INTRODUCCIN:
Las enzimas son protenas especializadas en la catlisis de las reacciones
biolgicas. Se encuentran entre las mas notables de las biomolculas conocidas
debido a su extraordinaria especificidad y a su poder cataltico, que es mucho mayor
que la de los catalizadores hechos por el hombre.
Gran parte de la historia de la bioqumica es la historia de la investigacin de
las enzimas. El nombre enzima no se emple sino hasta 1887, pero mucho antes ya
se sospechaba que ciertos catalizadores biolgicos intervenan en la fermentacin del
azcar para formar alcohol (de aqu el nombre de fermentos). La primera teora
general sobre la catlisis qumica, publicada por J. J. Berzelius en 1835, inclua un
ejemplo de lo que ahora conocemos como enzimas; como la diastasa de la malta, y
sealaba que la hidrlisis del almidn se cataliza por el cido sulfrico con menor
eficacia que con la diastasa.
La actividad e algunas enzimas dependen solamente de su estructura
proteica, mientras que otros necesitan adems, de uno ms componentes no proteicos
llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metlico o bien puede ser una
molcula orgnica llamada coenzima. Algunas enzimas necesitan ambos.
Los cofactores son generalmente estables frente a la accin del calor,
mientras que muchas protenas enzimticas pierden su actividad por la calefaccin.
El complejo enzima-cofactor catalticamente activo recibe el nombre de
holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la protena restante por si sola es inactiva
catalticamente, recibe el nombre de apoenzima.
OBEJTIVO:
Determinar el efecto fisicoqumico que generan las enzimas sobre diferentes
sustratos.
MATERIAL:
6 tubos de ensaye
3 pipetas de 1 mL
2 pipetas de 5mL
2 pipetas pasteur
2 gradillas
6 tapones
33
METODOLOGIA:
Experimento No. 1 Actividad de la ureasa
Preparar tres tubos como se indica en el siguiente cuadro.
Tubo
Semilla
vegetal
Agua(ml)
Pizca
Pizca
pizca
tubo
Agua (ml)
Azul de
bromotimol (gotas)
5.0
En caso de que la solucin tenga color azul en algn tubo, aadir cido dbil (gotas),
hasta obtener una coloracin amarilla en todos los tubos.
Aadir a todos los tubos 5ml de urea. Mezclar rpidamente y tomar el tiempo que
transcurre en cada tubo hasta alcanzar el vire de color amarillo a color azul.
Experimento No. 2 Determinacin de la actividad de la renina
Preparar la siguiente serie de tubos como se muestra a continuacin:
tubo
leche
(mL)
oxalato de amonio
(mL)
sol. de renina
(gotas)
0.5
0.5
3
34
35
SESION 19 Y 20
Prctica #. 10
OBJETIVOS:
El alumno analizar el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica
en una reaccin. Basado en:
Discutir el efecto sobre el comportamiento cataltico de una enzima al variar el pH de
la mezcla de reaccin.
Discutir los cambios que se presentan en la cintica enzimtica al variar la
temperatura de reaccin.
Determinar las condiciones ptimas de reaccin en funcin de estos dos factores ( pH,
temperatura).
PRE-RREQUISITOS:
Describir el efecto del pH sobre la estabilidad y actividad de una enzima.
Describir el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad de una enzima.
Describir el sitio activo y sitio de enlace de una enzima.
Describir los agentes desnaturalizantes y su mecanismo de accin sobre una enzima.
Explicar los conceptos de pH y temperatura ptimos de una enzima en una reaccin
catalizada.
INTRODUCCION:
Es lgico pensar que el pH de una solucin influye sobre la velocidad de una reaccin
catalizada por enzimas. El sitio activo y el sitio de enlace de una enzima generalmente
estn compuestos por grupos ionizables que deben presentarse con una forma inica
apropiada o especfica, de tal manera, que se pueda mantener la conformacin
adecuada de estos sitios en la enzima y pueda llevarse a cabo la unin del sustrato y
su transformacin hacia productos.
Igualmente puede existir un sustrato con grupos ionizables y debe contener una forma
inica especfica para que pueda unirse a la enzima y posteriormente se realize la
catlisis. Los efectos de pH sobre la estabilidad de una enzima se debe tomar en
cuenta en cualquier estudio de efecto de pH sobre la catlisis de sustrato.
Se observa que el pH ptimo de la reaccin enzima -sustrato es a 6.8 segn la grfica
de la curva A, sin embargo, no nos indica porque declina la velocidad por arriba y abajo
de este valor.
En la curva B se observa que la preincubacin de la enzima entre pH de 5.0 - 8.0 no
tiene efecto sobre la actividad medida a pH 6.8. Por lo tanto, la interpretacin de las 2
grficas nos indica que la cada en la actividad entre 6.8 - 8.0 y entre 6.8 - 5.0 es el
36
37
METODOLOGIA:
Efecto del pH
Tubo
Sacarosa 0.3 M
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Amortiguador pH =
2.5
0.5
Amortiguador pH =
2.5
0.5
Amortiguador pH =
3.5
0.5
Amortiguador pH =
4.5
0.5
Amortiguador pH =
5.5
0.5
Amortiguador pH =
6.5
0.5
Amortiguador pH =
7.5
0.5
Agua
1.0
Efecto de la Temperatura
38
Tubo
Sacarosa 0.3 M
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Amortiguaor pH = 4.7
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Invertasa
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Agua
1.0
Temperatura C
26
37
45
60
100
25
40
SESION 21 Y 22
Prctica #. 11
E+S
k-1
k2
ES
k-2
E+P
Vo
Vmax S
KM S
Ecuacin de Michaelis-Menten
41
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Una gradilla
Pipetas de 1 mL
Pipetas de 5 mL
Un bao de agua a 37 grados centgrados
Un bao de agua a ebullicin
METODOLOGIA:
La invertasa es una enzima hidroltica que acta sobre la sacarosa (un
disacrido) liberando glucosa y fructosa. La actividad de la enzima se detiene al aadir
una disolucin alcalina y el poder reductor de los productos se mide hacindolos
reaccionar en el reactivo de dinitrosalicilato.
SACAROSA (M)
TUBO
ENZIMA AMORTIGUADOR
0.02
0.03
0.05
0.1
0.3
AGUA
1mL
0.5mL
1mL
0mL
0mL
0mL
0mL
0mL
1mL
0.5mL
0mL
1mL
0mL
0mL
0mL
0mL
1mL
0.5mL
0mL
0mL
1mL
0mL
0mL
0mL
1mL
0.5mL
0mL
0mL
0mL
1mL
0mL
0mL
1mL
0.5mL
0mL
0mL
0mL
0mL
1mL
0mL
1mL
0.5mL
0mL
0mL
0mL
0mL
0mL
1mL
42
Abs/10 min
Abs/20min
0
0.02
0.03, etc.
En base a sta, calcule la actividad de la enzima (velociad inicial, Vo) como el cambio
en unidades de absorbancia por unidad de tiempo. Hay dos formas de hacerlo: 1)
Graficando Abs vs. Tiempo, donde Vo = pendiente de la regin recta de la grfica. 2) Si
se cuenta con un solo dato de Abs a un solo tiempo, Vo = Abs/tiempo (min).
Con los valores de actividad en unidades de absorbancia/min y las concentraciones
construya la grafica de Michaelis-Menten y la de Linewaver-Burk, y en base a estas
determine los parmetros cinticos de la enzima.
DISCUSION Y CONCLUSIONES:
Explique claramente la forma en que se calcul la velocidad inicial. Compare sus
resultados de ambos das y de motivos para las diferencias (si las hay). Lo mismo para
el clculo de Km y Vmax. Compare estos parmetros con valores encontrados en
alguna referencia. Explique la reaccin catalizada por la enzima y su importancia.
43
SESION 23 Y 24
CINTICA ENZIMTICA.
PRACTICA No. 12
EFECTO DE INHIBIDORES
INTRODUCCION:
Algunos compuestos reaccionan con las enzimas disminuyendo su actividad
cataltica. Este efecto se utiliza para preparar frmacos o insecticidas que inhiben
selectivamente ciertas enzimas en las bacterias o insectos, sin afectar al hospedero.
La inhibicin puede ser reversible o irreversible, sin embargo, la inhibicin
reversible es generalmente ms til para regular la actividad de las enzimas. Los
estudios logrados en base a inhibidores, han contribuido a la informacin actual sobre
cintica enzimtica y mecanismos tanto metablicos como clnicos.
Los dos tipos principales de inhibicin reversible son: La inhibicin competitiva y la
no competitiva. En la primera, el compuesto inhibidor interacciona con el sitio cataltico,
compitiendo con el sustrato por la unin con dicho sitio. En este caso el grado de
inhibicin depende directamente de la concentracin del inhibidor, con respecto al
sustrato especfico, por lo tanto, si la concentracin de sustrato es mayor que la del
inhibidor, no se presentar el efecto inhibitorio. Ms an, si a una enzima bajo el efecto
de un inhibidor competitivo se le adiciona mayor cantidad de sustrato, casi siempre
desaparecer el efecto inhibitorio.
La mayora de los inhibidores competitivos tienen una estructura qumica
semejante a la del sustrato natural por lo tanto son muy especficos.
La inhibicin no competitiva es aquella, donde el inhibidor se combina con la
enzima unindose a un sitio diferente al sitio cataltico de manera que la enzima puede
unirse al sustrato y al inhibidor simultneamente. La inhibicin ocurre porque al unirse el
inhibidor provoca cambios moleculares en la enzima que disminuyen su actividad. De
acuerdo al modo en que el inhibidor se une a la enzima y al efecto cintico que tiene
sobre ella, esta inhibicin se subdivide en Acompetitiva y Mixta. Dentro de los inhibidores
mixtos se incluyen los clsicos no-competitivos.
Los inhibidores no competitivos son a veces inespecficos o sea que un mismo
inhibidor puede afectar a varias enzimas a la vez. Existen inhibidores muy complejos
como el pentacloruro de mercurio, el benzoato de sodio o muy simples como los iones
metlicos plata, cobre, plomo y cianuro. Algunos de estos inhibidores son reversibles y
otros irreversibles.
OBJETIVO:
Determinar el tipo de inhibicin ejercida por CuSO 4 sobre la actividad de la enzima
invertasa.
44
MATERIAL :
1.- 21 tubos de ensaye
2.- 2 gradillas
3.- 2 Celdas de fotocolormetro
4.- Fotocolormetro
5.- Baos de agua de temperatura controlada
6.- 3 Pipetas de 1.0 ml
7.- 2 pipetas de 5.0 ml
METODOLOGIA:
Primer da:
Preparar los siguientes tubos:
Tubo
Sacarosa
Agua
Amortiguado
r
Arabinosa
0.02 Molar
Invertasa
2 mL [0.02]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.03]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.05]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.10]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.30]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.02]
----
1 mL
2 mL
2 mL
2 mL [0.03]
----
1 mL
2 mL
2 mL
2 mL [0.05]
----
1 mL
2 mL
2 mL
2 mL [0.10]
----
1 mL
2 mL
2 mL
10
2 mL [0.30]
----
1 mL
2 mL
2 mL
11
1 mL
0.5 mL
1 mL
1 mL
Sacarosa
Agua
Amortiguado
r
Arabinosa
0.01 Molar
Invertasa
2 mL [0.02]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.03]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.05]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.10]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.30]
2 mL
1 mL
----
2 mL
2 mL [0.02]
1 ml
1 mL
1 mL
2 mL
2 mL [0.03]
1 mL
1 mL
1 mL
2 mL
2 mL [0.05]
1 mL
1 mL
1 mL
2 mL
2 mL [0.10]
1 mL
1 mL
1 mL
2 mL
10
2 mL [0.30]
1 mL
1 mL
1 mL
2 mL
11
1 mL
0.5 mL
1 mL
1 mL
Calcule parmetros cinticos (Km y Vmax) de la enzima, reales y aparentes, para cada
condicin.
Determine, de acuerdo a esta grfica y a los parmetros calculados, que tipo de
inhibicin presenta la Arabinosa.
DISCUSION Y CONCLUSIONES:
Compare sus velocidades control contra las de la prctica 6. Explique las diferencias
basndose en todos los factores que modifican la actividad enzimtica. Explique
claramente que tipo de inhibidor es la Arabinosa e indique de que forma se unir a la
enzima. Busque en bibliografa usos de la arabinosa y efectos sobre algn tipo de
enzima (no necesariamente la invertasa) o incluso sobre microroganismos. Compare la
estructura del inhibidor con la del sustrato para apoyar mas su conclusin sobre tipo de
inhibodor.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
47
SESION 25 y 26
PRACTICA # 13
49
SESION 28 Y 29
PRACTICA No. 14
Descartar el sobrenadante
Agregar 500 microlitros de etanol 75% mezclar y centrifugar a 14000 rpm por 10
minutos
Descartar el sobrenadante y dejar secar
Re suspender en 40 microlitros de agua
Almacenar a -20C, correr en gel de agarosa al 1%
Bibliografa
Russell, David W.; Sambrook, Joseph 2001. Molecular cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory.
51