Manual de Estudiantes Biologia para Ingenieros - 2014ii

Laboratorio de Biologa para Ingenieros
DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
Facultad de Ingeniera
Departamento de Ingeniera Qumica
GUA DE LABORATORIO DE BIOLOGA PARA INGENIEROS
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA
BIOLOGA PARA INGENIEROS
MEDELLN
2014
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DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
NDICE
1.
Normas generales y de bioseguridad en el laboratorio.
2.
Identificacin de matrices con presencia de macromolculas.
3.
Determinacin de aminocidos y protenas.
4.
Determinacin de algunas propiedades y aplicaciones industriales del almidn.
5.
Transesterificacin para produccin de biodiesel.
6.
Preparacin de medios de cultivo especficos y aislamiento de microorganismos del
medio ambiente.
7.
Caracterizacin macroscpica, microscpica y aislamiento de microorganismos
ambientales.
8.
Determinacin de la capacidad metablica de microorganismos ambientales.
9.
Manejo de materiales y equipos de laboratorio.
10.
Cintica de crecimiento microbiano: Fermentacin alcohlica.
11.
Degradacin de colorantes utilizando hongos de pudricin blanca de la madera.
12.
Extraccin de enzimas de origen vegetal, efecto de inhibidores sobre la actividad
enzimtica.
13.
Actividad cataltica de la -amilasa y variables que la afectan.
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1.
UNIVERSIDAD
INTRODUCCIN AL LABORATORIO E IDENTIFICACIN DE

MATRICES CON PRESENCIA DE MACROMOLCULAS.
NORMAS GENERALES EN EL LABORATORIO

a.
Llegar puntualmente. Todas las prcticas estn programadas para ser realizadas en
el tiempo previsto.
b.
Llevar las gua de la prctica a realizar, esta debe ser leda con anticipacin.
c.
Tenga en cuenta las instrucciones dadas en cada sesin. El profesor puede preguntar
cualquier informacin que est contenida en ellas.
d.
No es permitido el uso de radios, walkman, celulares o equipos puedan interrumpir
el desarrollo de la prctica.
e.
Es prudente usar pantaln largo y evitar las faldas y pantalonetas.
f.
Usar zapatos cerrados adelante, evitar sandalias o calzado similar.
g.
No es permitido el ingreso al laboratorio de personas diferentes a los matriculados
en el curso.
h.
Desarrollar las actividades con calma, tome el tiempo necesario para hacer los
distintos procedimientos para que los resultados sean buenos.
i.
Analcelos resultados obtenidos durante la prctica. Confe en sus propias
observaciones.
j.
Est prohibido fumar dentro del laboratorio.
k.
Utilcelos reactivos adecuados en cantidades y concentraciones indicadas. No
desperdicie el material.
l.
El material de trabajo es propiedad dela universidad y debe ser devuelto en buenas
condiciones y limpios. Usted es responsable y debe reponer y pagar todo el material que sea
daado o extraviado.
m.
La limpieza, el cuidado al trabajar, el empleo correcto de las tcnicas enseadas y el
inters son factores que contribuyen al xito de la prctica.
n.
No emplee material sucio o contaminado para extraer reactivos de los recipientes.
o.
No se retire del laboratorio sin justificacin.
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DE ANTIOQUIA
p.
UNIVERSIDAD
Dejar los puestos de trabajo limpios despus de terminar la prctica.
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
La bioseguridad, se define como el conjunto de medidas preventivas, destinadas a
mantener el control de factores de riesgo en el laboratorio procedentes de agentes
biolgicos, fsicos o qumicos, logrando la prevencin de impactos nocivos, asegurando
que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la salud y
seguridad de estudiantes, docentes, monitores y el medio ambiente (Forero de Saade,
1997).
a.
Evitar contacto de piel o mucosas con lquidos.
b.
Lavado de manos al inicio de la sesin y al finalizar la misma para remover todo
tipo de contaminante qumico y/o biolgico.
c.
Usar guantes si es necesario o se sugiere por el instructor
d.
Usar la mascarilla si se recomienda.
e.
Usar la bata cerrada durante toda la prctica para evitar contacto de la ropa con los
reactivos y microorganismos usados durante la sesin.
f.
No es permitido el consumo de alimentos (chicles, bebidas, frutas, entre otros)
durante el desarrollo de la prctica.
g.
El cabello debe estar recogido.
h.
No usar gorros que no sean apropiados para la prctica.
i.
Si hay derrame de alguna sustancia qumica, el sitio debe ser limpiado
inmediatamente, para evitar que de forma accidental otra persona pueda tocarla.
j.
Si alguna sustancia qumica entra en contacto con la piel, ojos, lavar Con agua
durante unos minutos. Nota: En caso de accidentes consulte con el instructor o docente
encargado.
k.
Tenga un uso adecuado de los residuos generados durante la prctica. Si tiene dudas
pregunte al docente o al monitor encargado.
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2.
IDENTIFICACIN
MACROMOLCULAS
DE
UNIVERSIDAD
MATRICES
CON
PRESENCIA
DE
OBJETIVO
Identificar cual(es) macromolcula(s) se encuentran en cada una de las matrices mostradas.
PREGUNTAS
I.Qu es una macromolcula?
II.Cules son los tipos de macromolculas?
III.Dnde se pueden encontrar las macromolculas?
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3.
UNIVERSIDAD
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS
OBJETIVO
Reconocer la presencia de algunos aminocidos en las protenas, a travs de reacciones
especficas que permiten su identificacin.
MARCO TERICO
Protenas
Las protenas son los materiales que desempean un mayor nmero de funciones en las
clulas de todos los seres vivos. Por un lado, forman parte de la estructura bsica de los
tejidos (msculos, tendones, piel, uas, etc.) y, por otro, desempean funciones metablicas
y reguladoras (asimilacin de nutrientes, transporte de oxgeno y de grasas en la sangre,
inactivacin de materiales txicos o peligrosos, etc.). Tambin son los elementos que
definen la identidad de cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del cdigo
gentico (ADN) y de los sistemas de reconocimiento de organismos extraos en el sistema
inmunitario.
Aminocidos
Son macromolculas orgnicas, constituidas bsicamente por carbono (C), hidrgeno (H),
oxgeno (O) y nitrgeno (N); aunque pueden contener tambin azufre (S) y fsforo (P) y, en
menor proporcin, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I), entre otros.
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Se clasifican, de forma general, en holoprotenas y heteroprotenas segn estn formadas

respectivamente slo por aminocidos o bien por aminocidos ms otras molculas o
elementos adicionales no aminoacdicos (Protenas).
Reacciones caractersticas de los aminocidos y protenas.
Prueba Biuret: Es una prueba general para protenas, no especifica. Cuando una
protena reacciona con sulfato de cobre (II) (color azul) se forma como respuesta positiva
un complejo color violeta. La prueba Biuret trabaja para cualquier tipo de compuesto que
posea uno o ms de los grupos siguientes:
Prueba de Ninhidrina: Es positiva para aminocidos y protenas que tengan un

grupo -NH2 libre. Cuando el grupo -NH2 reacciona con ninhidrina, se forma un complejo
azul-violeta.
Prueba Xantoprotica: Los anillos fenilo que contengan un grupo activante pueden
ser nitrados produciendo un compuesto amarillo. La produccin de un producto coloreado
amarillo al aadir cido ntrico es una prueba para la presencia de tirosina o triptfano en
una protena. La adicin de base fuerte hace que el color se torne ms oscuro hacia
anaranjado. Las manchas amarillas en la piel causadas por cido ntrico son el resultado de
la reaccin Xantoprotica.
Prueba para metales pesados: Los metales pesados tienen el efecto de precipitar
protenas de sus soluciones creando enlaces (cross-linkings) entre los grupos amino libres y
los grupos carboxilo libres. Los iones ms comnmente usados para detector la presencia
de protenas incluyen Zn 2+, Fe 3+ , Cu 2+ , Sb 3+ , Ag 1+ , Cd 2+ y Pb 2+
Entre los metales, Hg 2+, Cd 2+, y Pb 2+ tienen una alta toxicidad. Estos pueden causar serios
daos a las protenas (especialmente enzimas) desnaturalizndolas. Victimas que han
ingerido iones de mercurio o plomo se tratan con un antdoto de algn alimento rico en
protenas. La protena se combina con los iones de mercurio y plomo minimizando la
absorcin de tales iones. Los alimentos ms usados son leche y clara cruda de huevo. La
protena que se precipita es removida inmediatamente del estmago mediante un lavado
estomacal (Alices. 2009).
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Prueba Hopkins Cole: Es especfica del grupo indol caracterstico del Triptfano. El
anillo del indol se hace reaccionar con cido Glioxlico en presencia de cido Sulfrico
concentrado para formar un compuesto violeta que se forma en la interfase entre la solucin
de protena y el cido sulfrico. La reaccin de Hopkins Cole es positiva slo para las
protenas que contienen Triptfano. Se supone que el cido concentrado hidroliza las
protenas en la interfase liberando el Triptfano para dar el producto violeta. Sin embargo,
el Triptfano puro en solucin no da positiva la reaccin, a menos que se agreguen agentes
oxidantes, por lo que es de suponer que el Triptfano de las protenas no se libera como tal,
por lo cual la reaccin presentada es slo parcialmente correcta.
Prueba para aminocidos azufrados: Esta reaccin detecta la cistena y metionina y

protenas que la contengan. En medio fuertemente alcalino el radical mercapto de la
cistena metionina se desprenden como cido sulfhdrico que se pone en evidencia
aadiendo sales de plomo para que se forme de un precipitado negro de sulfuro de plomo
(Ordorica & Velzquez. 2012).
Desnaturalizacin: Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las

estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena
polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija.
La desnaturalizacin provoca diversos efectos en la protena:
Cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y

disminuye el coeficiente de difusin.
Una drstica disminucin de su solubilidad, ya que los residuos hidrofbicos del

interior aparecen en la superficie.
Prdida de las propiedades biolgicas (Desnaturalizacin).
MATERIALES
Leche
Harina de trigo
Huevo
Gelatina sin sabor
Tubos de ensayo
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Bao termosttico.
cido ntrico concentrado
Hidrxido de sodio al 25%
Hidrxido de sodio al 50%
Sulfato de cobre al 1%

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Acetato de plomo al 2%
cido clorhdrico concentrado
Etanol
PROCEDIMIENTO
Preparar las siguientes soluciones:
Solucin de albmina 30% v/v.

Solucin de harina de trigo 1% v/v.
Solucin de gelatina sin sabor 3%p/v.
Reaccin Xantoprotica
Tubo
1
2
3
4
Solucin
Albmina
Leche
Harina de trigo
Gelatina sin sabor
Cantidad (mL)
2
2
2
2
A cada uno de los tubos adicione 5 gotas de cido ntrico concentrado.

Calintelos al bao mara hasta cambio de coloracin.
Alcalinice la mezcla adicionando gota a gota de hidrxido de sodio al 25%.
Observe y anote los resultados.
Prueba de los aminocidos azufrados

Tubo
1
2
3
4
Solucin
Albmina
Leche
Harina de trigo
Gelatina sin sabor
Cantidad (mL)
A cada tubo adicione 3 gotas de hidrxido de sodio al 25%.

Agregue 5 gotas de acetato de plomo al 2%.
Calintelos al bao mara por 10 min.
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2
2
2
2

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Prueba de Biuret
Tubo
1
2
3
4
Solucin
Albmina
Leche
Harina de trigo
Gelatina sin sabor
Cantidad (mL)
2
2
2
2
A cada tubo adicione 5 gotas de hidrxido de sodio al 25%

Adicione 5 gotas de sulfato cprico al 1%.
Desnaturalizacin
Tubo
1
Solucin
Albmina
2 Albmina
3 Albmina
4 Albmina
Cantidad
10 gotas
10 gotas
10 gotas
10 gotas
Procedimiento
Calentar gradualmente y observe
temperatura de coagulacin
20 gotas de etanol
5 gotas de HCl concentrado
5 gotas de hidrxido de sodio al 50%
Agite los tubos y observe si se produce coagulacin.

Para todas las reacciones anteriores, reporte los datos y observaciones en la siguiente tabla:
Reaccin
Leche
Albmina
Xantoprotica
Aminocido azufrados
Biuret
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10
Harina

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Desnaturalizacin
Conclusiones
PREGUNTAS
I.Qu es un pptido?
II.Qu es un enlace peptdico?
III.Cul es la estructura de una protena?
IV.Cules son las reacciones de cada una de las pruebas realizadas en el laboratorio?
V.Existen otras pruebas cualitativas y/o cuantitativas diferentes para la identificacin de
aminocidos en protenas? Cules?
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4.
UNIVERSIDAD
DETERMINACIN DE ALGUNAS PROPIEDADES DEL ALMIDN Y

POSIBLES APLICACIONES INDUSTRIALES
OBJETIVOS
Determinar propiedades del almidn tales como el punto de gelatinizacin e ndice

de hinchamiento.
Evaluar la aplicabilidad del almidn en la elaboracin de pegantes y adhesivos.
MARCO TERICO
Los grnulos de almidn, que se producen en las plantas a partir de la fotosntesis de
dixido de carbono, estn formados por polmeros de glucosa y sirven como reservas de
energa. Hacia el final de la temporada de cultivo, el almidn se acumula en las ramas de
los rboles, cerca de las yemas. Tambin se encuentra en frutas, semillas, rizomas y
tubrculos. Los grnulos de almidn son muy adecuados para el almacenamiento a largo
plazo, debido a que es un material compacto, la sequedad relativa y alta estabilidad.
La transformacin del almidn crudo en agua caliente se llama gelatinizacin: los grnulos
se hinchan y estallan, formando una pasta. Durante el almacenamiento prolongado o
refrigeracin, la pasta de almidn a menudo se espesa debido a un fenmeno llamado
retrogradacin. Gelatinizacin y retrogradacin, que corresponden a modificaciones
estructurales en los grnulos, afectan el comportamiento del almidn que contienen los
sistemas.
En consecuencia, el almidn es excelente para modificar la textura de muchos procesados y
los alimentos cocinados en casa (por ejemplo, como harina de maz o harina para espesar
las salsas) y tambin ha sido utilizado durante siglos para otros fines, incluida la fabricacin
de papel, colas o refuerzos de la tela. Hoy en da, las nuevas aplicaciones del almidn son
emergentes, incluyendo las fibras de las dietas bajas en caloras, los materiales
biodegradables, envases, pelculas delgadas y materiales termoplsticos.
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Los grnulos de almidn nativos varan enormemente de forma y de tamao (desde 0,1 a
200 nm), pero todos tienen una caracterstica comn: bajo el microscopio e iluminados con
luz polarizada, granos de almidn teidos con yodo presentan una "cruz de Malta"
distintiva lo que indica la existencia de algn orden interno comn. Cuando los grnulos se
calientan en exceso de agua, la cruz comienza a desaparecer, lo que demuestra que este
orden molecular se est interrumpido (Almidn: un misterio estructural).
MATERIALES
Almidn
Agua.
Lugol
PROCEDIMIENTO
Preparar 100 ml de una solucin de almidn al 10% p/v, con la cual se realizaran cada uno
de los siguientes procedimientos:
a)
Capacidad de retencin del agua.

Pesar un tubo de ensayo vaco
Tomar 10 mL de la solucin preparada y agregarlos al tubo.
Pesar nuevamente.
Centrifugar a 3500 rpm por 30 minutos.
Pesar otro tubo limpio y seco.
Pasar el sobrenadante al tubo anterior.
Pesar sistema con el sobrenadante.
Pesar el precipitado.
Calcular la capacidad de retencin del agua mediante:
b)
Determinacin y microscopia del punto de gelatinizacin
Llevar 90 mL de la solucin a un beaker.
Calentar con agitacin constante midiendo la temperatura peridicamente.
Tomar muestras de la suspensin a las temperaturas de 30, 60, 70 C en porta

objetos.
Teir con lugol las muestras tomadas
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Observar cambios en microscopio para cada una de las muestras utilizando un

objetivo de 40x.
Determinar la temperatura de gelatinizacin.

c)
Aplicacin: Evaluacin de pegantes.
Con el gel formado, realizar los siguientes procedimientos:
Rotulado de botellas.
Agregar gel sobre el papel kraft.
Dejar secar por 1 minuto.
Adherir el papel a una botella.
Dejar secar por 5 minutos (Hacer uso del secador).
Retirar papel.
Sellos de papel.
Esparcir gel sobre una tira de papel kraft.
Dejar secar por 10 minutos (utilizar secador).
Humedecer el papel.
Colocar la tira de papel sobre otro papel seco.
Dejar secar.
Retirar el papel.
d)
ndice de hinchamiento.
Aadir 3 g de almidn en una probeta de 10 mL.
Medir el volumen ocupado por el almidn.
Agregar agua destilada hasta completar un volumen de 10 mL.
NO AGITAR.
Dejar reposar.
Medir el volumen de almidn cada 10 o 15 minutos hasta observar que no haya

variacin.
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5.
UNIVERSIDAD
TRANSESTERIFICACIN PARA PRODUCCIN DE BIODIESEL
OBJETIVO
Producir biodiesel a partir de aceite de palma, mediante una reaccin de

transesterificacin con metanol.
Determinar el ndice de acidez de algunos aceites mediante la norma NTC por el

mtodo con etanol caliente usando indicador.
MARCO TERICO
La transesterificacin es un trmino general que se utiliza para designar a las reacciones
orgnicas en las cuales se produce un intercambio o sustitucin del grupo acilo o alquilo de
un ster. Desde una perspectiva ms contextualizada, podramos definir la
transesterificacin como la reaccin mediante la cual, los triglicridos (TG) presentes en los
aceites vegetales y grasas animales se combinan con un alcohol de bajo peso molecular
usualmente metanol o etanol en presencia de un catalizador adecuado, para formar glicerina
y steres metlicos o etlicos. Los alquil steres grasos obtenidos a partir de la reaccin
anterior, poseen propiedades y tamao similares a los constituyentes del combustible diesel,
y es lo que se conoce como biodiesel.
Los catalizadores que se suelen utilizar a escala comercial son los catalizadores
homogneos bsicos. Se ha reportado que la sntesis de biodiesel catalizada por bases es
4000 veces ms rpida que al usar cidos, pero tiene la desventaja que necesita materias
primas refinadas con un contenido de agua menor al 0,5 % p/p y de cidos grasos menor al
1,0% p/p. Entre las ventajas de utilizar un catalizador heterogneo frente al homogneo y
enzimas, se puede mencionar: reutilizacin del catalizador, facilidad de procesos continuos,
uso de materias primas de diversa fuentes, no se forman jabones, purificacin ms sencilla,
no se necesita neutralizar, tiempo de reaccin menores. Entre los posibles inconvenientes,
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podran presentarse: resistencia a la transferencia de masa, mayor temperatura de reaccin y

lixiviacin de las especies activas.
En la sntesis de biodiesel, el uso de catalizadores estructurados permitir eliminar algunos
pasos del proceso, como neutralizacin y lavado en el caso de los catalizadores
homogneos, filtrados para los heterogneos. Este ahorro de etapas podra compensar el
mayor costo del catalizador si se superan los problemas operativos que imponen entre otros
aspectos la posibilidad de regeneracin y reuso del catalizador. El depsito de catalizador
en polvo sobre el monolito debe cumplir tres requisitos fundamentales: asegurar una
cantidad suficiente de catalizador, formar una capa homognea y tener una adherencia
suficiente para su manipulacin y uso (Damiani, Reinoso & Tonetto. 2011)
Los steres grasos obtenidos a partir de la reaccin dada, poseen propiedades y tamaos
similares a los constituyentes del combustible diesel, y es lo que se conoce como Biodiesel
(Torossi. 2006)
Figura 1. Reaccion para produccin del biodiesel

Principales variables que afectan la reaccin de transesterificacin
Figura 2. Principales variables que afectan la reaccin de transesterificacin.
Tanto la acidez del aceite como su contenido acuoso, son parmetros importantes
para tener en cuenta, por lo que una valoracin previa de la acidez del aceite, es importante
para determinar la cantidad de catalizador capaz de neutralizarla sin disminuir su accin
cataltica. Para el aceite de palma a usar, se supondr un ndice de acidez de 1.5 mg
NaOH/g aceite (Torossi. 2006)
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La relacin molar entre el alcohol y el aceite es una de las variables ms influyentes

en el rendimiento de la reaccin y en la viscosidad final del biodiesel. El alcohol ms
utilizado es el metanol debido a su polaridad y a su estructura de cadena corta. Si bien la
estequiometria para la reaccin requiere tres moles de alcohol por mol de aceite, en la
prctica, se incrementar (9:1) para desplazar el equilibrio hacia una mayor formacin de
steres metlicos (Torossi. 2006).
Los catalizadores a utilizar, son catalizadores bsicos, como el hidrxido de sodio o

de potasio. Es de suma importancia utilizar reactivos concentrados, para minimizar la
presencia de agua. La cantidad de catalizador a usar el 1% p/p con respecto a la cantidad de
aceite ms la cantidad de catalizador necesario para neutralizar el cido presente en el
aceite (ndice de acidez) (Torossi. 2006).
Clculos previos a la prctica
Realizar los clculos correspondientes para procesar 50 gramos de aceite de palma

(100% de pureza, densidad 856 g/mol) con la relacin anteriormente indicada.
Calcular el peso de catalizador necesario en la reaccin y para neutralizar la acidez

del aceite
PROCEDIMIENTO
Transesterificacin
1.
Pesar el catalizador y disolverlo en el metanol.
2.
Pesar 50 gramos de aceite y calentarlo para climatizar (60 grados centgrados).
3.
Agregar la solucin de catalizador-Metanol al aceite de palma.
4.
Pasar mezcla a un baln volumtrico con un magneto y poner en el montaje
esquematizado en la figura 3.
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Figura 3. Montaje transesterificacin

5.
Asegrese de que la mezcla se mantenga aproximadamente a 60 grados centgrados
mediante un calentamiento en bao Mara con agua caliente.
6.
Encender el sistema de agitacin y de reflujo.
7.
Dejar reaccionar por 45 minutos.
8.
Desmontar y pasar la mezcla a un embudo de decantacin para separar las fases.
9.
Recuperar el biodiesel (fraccin liviana).
10.
Purificar el biodiesel mediante lavado con agua a 100 grados centgrados.
Determinacin del ndice de acidez por Mtodo con etanol caliente usando indicador.
Materiales
Etanol 95% v/v neutralizado segn la norma NTC.
2,5g de aceite.
Solucin de NaOH al 0,25M normalizada.
Bureta.
Procedimiento
1.
Pesar 2,5g de aceite en un Erlenmeyer de 100 ml.
2.
Agregar 50 ml de etanol neutralizado (segn la norma NTC.) a 75C
3.
Mezclar y llevar a ebullicin.
4.
Titular con NaOH a 0,25 M, agitando vigorosamente.
5.
Determine el ndice de acidez (ecuacin 1).
6.
Calcular la acidez (ecuacin 2).
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Donde
V: volumen usado de NaOH 0,25M en la titulacin.
c: concentracin exacta de NaOH : 0,2483M.
m: masa de aceite.
M: masa molar del aceite (Tabla 1).
Tabla 1. Masa molar de aceites
Tipo de grasa
Expresada como
Aceite de coco, de palmiste y similares
cido lurico
Masa molar
(g/mol)
200
Aceite de palma
Aceites de algunas crucferas
cido palmtico
cido ercico
256
338
Todas las otras grasas
cido oleico
282
En el caso de semillas de colza con un contenido mximo de cido Eurico de 5%(m/m), la

acidez se debe expresar como cido oleico
PREGUNTAS
I.Que son las normas NTC y que utilidad tienen?
II.Cmo se neutraliza el etanol segn la norma NTC 218 (Numeral 4.7.2)?
III.Cmo determinara si los productos de la transesterificacin si son los productos
esperados?
IV.Qu se esperara si se le mide el ndice de acidez y la acidez a la glicerina obtenida en la
transesterificacin? Tiene algn sentido medirlas?
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6.
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO ESPECFICOS Y
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE
OBJETIVOS
Preparar medios de cultivo slidos, utilizando diferentes tipos de sustratos (almidn

y casena).
Reconocer algunos ambientes que permiten evidenciar la existencia de

microorganismos.
MARCO TERICO
Los ambientes capaces de albergar vida microbiana reflejan el amplio espectro de la
evolucin de estos organismos. Se han encontrado especies que viven a temperaturas
comprendidas entre el punto de congelacin y el punto de ebullicin del agua, en agua
salada y en agua dulce, en presencia y en ausencia de aire. Los microorganismos se hallan
capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metablicas y adaptarse a
muchos ambientes diferentes. Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes
de aire y estar en todas partes, pero las caractersticas del ambiente determinan cules
especies pueden multiplicarse. Existen varias clases de microorganismos: mohos,
levaduras, bacterias, actinomicetos, protozoos, algas, virus.
El suelo es uno de los ambientes donde un conjunto ingobernable de microorganismos
compiten entre s para obtener lo que todos ellos necesitan: nutrientes y energa. Al mismo
tiempo, los productos de su metabolismo alteran la composicin qumica del suelo donde
habitan. Ms an, los propios microorganismos evolucionan en respuesta a la presin del
ambiente. Numerosas especies bacterianas y algunas veces incluso algas microscpicas o
protozoos, proliferan en las superficies expuestas a la humedad formando una biopelcula
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de microorganismos contenidos en una matriz de polisacridos, cuyo espesor puede oscilar

entre algunos micrmetros y pocos milmetros, que se adhiere fuertemente a la base. Las
biopelculas se forman en todas las superficies sumergidas, tanto en agua dulce como de
mar, o bien sobre soportes constantemente hmedos tales como paredes de la caera de
agua, pisos o dientes. El 99% de toda la actividad microbiana en un ecosistema abierto
ocurre sobre las superficies (Carrillo, 2003).
Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el desarrollo de
microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe
sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van
a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Los microorganismos son los seres ms abundantes de la tierra, pueden vivir en
condiciones extremas de pH, temperatura y tensin de oxgeno, colonizando una amplia
diversidad de nichos ecolgicos. Entre los requerimientos ms importantes para su
desarrollo estn el carbono, el oxgeno, nitrgeno, dixido de carbono e hidrgeno. Muchas
bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento especficos en
forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. Los medios de cultivo se pueden
clasificar segn la origen, consistencia y composicin (Lpez & Torres. 2006).
MATERIALES
Cajas Petri con agar nutritivo

Escobilln de algodn
Incubadora.
Mechero
Cmara de flujo laminar

Casena
Almidn soluble.
Agar bacteriolgico
PROCEDIMIENTO
Preparar los medios de cultivo (casena y almidn) de acuerdo a las composiciones

de la siguiente tabla y seguir las indicaciones que se den para su preparacin.
Tabla. Composiciones de medios especficos
Agar casena
Agar almidn
Casena 8% p/v
Almidn soluble 1% p/v
Agar 15 g/L
Agar 15 g/L
pH 7.2
pH 7.2
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Las cajas Petri, estn preparadas con anterioridad, a condiciones de pH 7.2, medio
de agar nutritivo (15 g/L) y esterilizadas para garantizar su ubicuidad.
En la caja Petri con medio slido, correspondiente a cada estudiante, inocule las
cajas con microorganismos obtenidos de las siguientes fuentes:
Del aire.
Superficie de la mesa de trabajo.
Mucosas y piel.
Manos lavadas con jabn y/o antibacterial.
Manos sin lavar.
Piel de animales.
Luego incube dejando la caja invertida a 37C de 24 a 48 horas.
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UNIVERSIDAD
ANEXO
Algunos Medios de Cultivo Especficos
Agar Nutritivo
Composicin:
Agua destilada...............1 L
Agar Nutritivo...........................................15 g
Ajustar pH del medio a 7.2
Agar-Casena (Harrigan y McCance, 1979)
Composicin:
Casena ....................................... 8% m/v
Agar Nutritivo......................................100 ml
Agar Almidn (Harrigan y McCance, 1979)
Composicin:
Almidn soluble..........1% m/v
Agar Nutritivo......................................100 ml
Agar MA (Abhaykumar&Dube, 1992)
Composicin:
Carboximetilcelulosa....1 g
Fosfato de hierro III.........................................................................................0.001 g
Agar Nutritivo...................................100 ml
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DE ANTIOQUIA
7.
UNIVERSIDAD
CARACTERIZACIN MACRO Y MICROSCPICA Y AISLAMIENTO DE

MICROORGANISMOS AMBIENTALES.
En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mnimos para el

manejo de microorganismos. Todo microorganismo en el laboratorio se debe manipular
como si fuera potencialmente perjudicial para la salud.
OBJETIVOS
Observar y describir las caractersticas morfolgicas de las colonias.

Utilizar el mtodo de coloracin de Gram para caracterizar una colonia bacteriana.
Clasificar microorganismos de acuerdo con las caractersticas morfolgicas.
MARCO TERICO
Nota: En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mnimos para el
manejo de microorganismos. Sobra decir que todo microorganismo en el laboratorio se
debe manipular como si este fuera potencialmente perjudicial para la salud. En la prctica
cuando se manipulan microorganismos provenientes de muestras ambientales se debe tener
especial cuidado en no perder microorganismos en las diferentes etapas de aislamiento,
como tampoco permitir la contaminacin.
Caracterizacin de microorganismos
La observacin de los microorganismos se valora en dos aspectos:
El aspecto macroscpico, en el que se evala color, forma y tamao de las colonias.
El aspecto microscpico en el que se evala la forma, el tamao y propiedades de la

pared del microorganismo como tal.
Estas apreciaciones le permitirn al microbilogo determinar aspectos como:
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DE ANTIOQUIA
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Pureza del cultivo, ya que las colonias observadas deben ser de un solo tipo
La morfologa microscpica debe presentar uniformidad en el tamao, absorcin de

la coloracin y forma de los microorganismos evaluados.
Composicin de la pared, ya que la coloracin de Gram utilizada para la

observacin microscpica, da cuenta de los componentes presentes en la pared celular;
puesto que al ser negativa el microorganismo en esta tendra mayor porcentaje de
lipopolisacridos, mientras que al ser positiva, indicara que el microorganismo en esta
estructura presenta mayor porcentaje de pptidoglicanos.
Viabilidad, dado que la observacin en fresco, permite ver el movimiento

microbiano.
Preparaciones
Preparaciones no coloreadas: Con este mtodo se observan los microorganismos vivos, lo
que permite detectar el tipo de movilidad y la viabilidad de los mismos.
Preparaciones coloreadas: Como los microorganismos son incoloros y tienen el mismo
ndice de refraccin del agua, es necesario utilizar colorantes para poderlos visualizar. Los
mtodos para observar los microorganismos proporcionan las siguientes ventajas:
Un contraste entre la bacteria y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar los

tipos morfolgicos microbianos.
Una visualizacin de las estructuras internas y externas tales como. Espora,

equivalente nuclear, grnulos citoplasmticos, pared celular, cpsula y flagelo.
Una de las coloraciones ms utilizadas en el laboratorio, para la identificacin de
microorganismos es la coloracin de Gram, por tal razn se ver en detalle.
Coloracin de Gram
La coloracin de Gram es un mtodo que ha permitido la divisin de las bacterias en dos
grupos: El de Gram positivas y el de las Gram negativas. La tcnica esta basada en la
capacidad de las bacterias para retener el colorante cristal violeta durante la decoloracin
con el alcohol acetona.
Las bacterias Gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo el color
prpura propio del cristal violeta (Figura 1).
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25

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
Figura 4. Gram Negativas

Las bacterias Gram positivas no se decoloran y retiene el color violeta. Despus de la
decoloracin, se utiliza la safranina, que es un colorante de contraste de color rojo, dicho
colorante da un color rosado a las clulas decoloradas (Figura 2).
Figura 5. Gram Positivas

Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de pptidoglicano como estructura
fundamental por sobre la membrana citoplasmtica, y las Gram negativas, encima de sta,
presentan una delgada capa de pptidoglicano, a la que se superpone una capa de
lipopolisacridos-lipoprotena, denominada membrana externa. La presencia de esta
membrana diferencia actualmente dos divisiones en sistemtica bacteriana: las que no lo
poseen, Gram (+) y las que s, Gram (-). La diferencia entre ambos grupos es pues de
enorme importancia taxonmica. En el comportamiento como patgenos y en la
sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ah que la realizacin rpida de una
coloracin de Gram, reviste enorme importancia en los procesos biotecnolgicos y en la
bacteriologa clnica (Facultad de qumica farmacutica).
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DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
MATERIALES
Cajas Petri con agar nutritivo con

colonias.
Colorantes Gram.
Mecheros.
Microscopio.
Estereoscopio.
Porta objetos.
Cubre objetos.
Aceite de inmersin.
PROCEDIMIENTO
Observe la morfologa de las colonias a nivel microscpico y descrbalas segn tamao,
color y forma.
1.
Observacin en fresco. Se realiza un frotis, el cual consiste en tomar con un asa una
muestra de la colonia y esparcirla en el porta objetos, previamente humedecido con una
gota de agua, realizando movimientos horizontales. Se adiciona una muestra de colorante
(azul de metilo) a la muestra fresca.
La observacin en fresco se utiliza para hongos y levaduras (cristal violeta o azul de
metilo), micro algas (lugol), clulas vegetales o bacterias coloreadas.
2.
Coloracin en seco. Es necesario fijar la muestra despus de haber realizado el
frotis, para fijar se flamea el portaobjetos, teniendo precaucin de no quemar la muestra,
hasta que se evapore todo el agua, posteriormente se adicionan los colorantes, segn el
mtodo de tincin a utilizar.
o
Coloracin de Gram: Tome colonias separadas de acuerdo a su morfologa y realice
coloracin de Gram:
a.
Teir con cristal violeta durante 30 segundos.
b.
Retirar el colorante con agua.
c.
Cubrir con lugol durante 1 minuto.
d.
Lavar con agua.
e.
Decolorar con alcohol cetona.
f.
Contrastar con safranina durante 20 segundos.
g.
Lavar con agua.
h.
Secar el exceso de agua.
Describa su forma (cocos, bacilos, espiral) tipo de agrupacin y clasifquelas segn la
absorcin de la coloracin en Gram (+ o -).
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DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
Morfologa tpica de los microorganismos
Aislamiento de microorganismos
Realice un repique de un microorganismo ambiental en cada uno de los medio de

cultivo especficos, preparados con anterioridad.
Incube dejando la caja Petri a 37C

PREGUNTAS
I.Cmo actan cada uno de los reactivos utilizados en la tincin de Gram?
II.Qu relacin existe entre la morfologa macroscpica y la microscpica?
III.Cules son los tipos de tincin y para que se utilizan?
IV.Por qu es importante la observacin microscpica en un proceso biotecnolgico?
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8.
UNIVERSIDAD
DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD METABLICA DE

MICROORGANISMOS AMBIENTALES
OBJETIVOS
Caracterizar microorganismos con actividad amiloltica y proteoltica.
Determinar cualitativamente la capacidad de un microorganismo para hidrolizar

sustrato especfico.
MARCO TERICO.
Pruebas bioqumicas.
Las pruebas bioqumicas permiten determinar las caractersticas metablicas de las
bacterias objeto de identificacin. Algunas de estas pruebas son tcnicas rpidas, ya que
evalan la presencia de una enzima preformada y su lectura varia entre unos segundos hasta
unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento del
microorganismo con una incubacin previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayora
de las pruebas que detectan componentes metablicos o aquellas que determinan la
sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de
identificacin que contienen el sustrato a metabolizar. No obstante, algunas de estas
pruebas pueden realizarse de forma rpida tras incubacin de unas 2-6h; en general, se trata
de reacciones enzimticas cromognicas o pruebas convencionales modificadas (hay discos
o
tabletas
comercializados
con
substratos
cromognicos
para
uso
individualizado)(Fernndez, Garca, Sez & Valdezate. 2010).
Hidrlisis del almidn
En la naturaleza abundan las enzimas capaces de hidrolizar los almidones. La movilizacin
del almidn exige eventual conversin en glucosa. En el hombre, las enzimas que realizan
este proceso son las amilasas salivares y las amilasas del tracto digestivo.
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DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
Las dextrinas son los fragmentos de polisacrido resultantes en la hidrolisis enzimtica de

las cadenas laterales del almidn. El termino dextrinas se aplica tambin a las sustancias
obtenidas por calentamientos del almidn seco o por hidrolisis parcial del almidn con
cidos diluidos (Geissman, 1974).
Esta prueba se realiza en agar almidn, una vez se tiene crecimiento microbiano, se inunda
el agar con lugol, se forma un complejo coloreado con el almidn, de manera que en las
zonas donde se da la hidrlisis como consecuencia de la produccin de amilasas, aparecen
zonas claras (Hidrlisis del almidn).
Hidrlisis de la casena.
La casena es una protena encontrada en la leche. Como todas las protenas, esta
compuesta de aminocidos que son utilizados por los microorganismos como fuentes de
energa y de carbono.
Cuando la leche es mezclada con un medio de cultivo, el medio pierde su transparencia y se
vuelve turbio debido a que la casena reacciona con los iones de calcio y forma complejos
coloidales insolubles de caseinato de calcio. Cuando la enzima caseinasa cataliza la
hidrlisis de la casena, los aminocidos resultantes se disuelven en el medio acuoso y el
medio se torna de nuevo transparente alrededor de la colonia de los microorganismos.
La prueba se realiza inundando el agar casena con cido clorhdrico al 1%. El cido
provoca la precipitacin de las protenas y la aparicin de zonas menos opacas en el medio,
que pueden identificarse como zonas en las que se ha hidrolizado la casena (Alarcn &
Olivas, 2004).
MATERIALES
Cajas Petri con medios de cultivo especficos incubadas.

Lugol.
cido clorhdrico al 1%
PROCEDIMIENTO
Luego de una semana de cultivo, observar variaciones en el medio de cultivo especfico y
crecimiento del microorganismo y de acuerdo con el sustrato empleado, aplicar las pruebas
cualitativas para evidenciar el consumo o no del sustrato.
PREGUNTAS
I.Defina sustrato, enzima, producto y revelador en el contexto de pruebas bioqumicas.
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DE ANTIOQUIA
9.
UNIVERSIDAD
MANEJO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO
OBJETIVOS
Conocer y/o familiarizarse con los diferentes equipos de laboratorio, a travs del
desarrollo de actividades que involucren manejo de material de vidriera (probetas,
erlenmeyers, pipetas, etc.) y equipos de laboratorio (balanzas analticas, pH metro,
espectrofotmetro, micropipetas, filtros).
Realizar la medicin de biomasa por medio de las tcnicas de peso seco y

turbidimetra (absorbancia).
Realizar la determinacin de azcares reductores por el mtodo espectrofotomtrico

del DNS.
MARCO TERICO
Para lograr resultados confiables en el laboratorio, es indispensable conocer tanto el
funcionamiento de los instrumentos y los equipos de laboratorio, como los principios
tericos que los rigen. Durante el desarrollo de esta prctica se construirn dos curvas de
calibracin para las cuales se utilizarn micro pipetas, balones volumtricos, balanzas
analticas, espectrofotmetro, bao mara, entre otros.
A continuacin se describen algunos aspectos generales relacionados con la prctica:
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UNIVERSIDAD
Micropipeta:
Es un instrumento de laboratorio empleado para absorber y transferir pequeos volmenes
de lquidos y permitir su manejo en las distintas tcnicas cientficas. Los volmenes
captables por estos instrumentos varan segn el modelo: los ms habituales, denominados
p20, p200 y p1000, admiten un mximo de 20, 200 y 1000
l, respectivamente. Es de
destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos lquidos sin tener que lavar el
aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plstico, que habitualmente son
estriles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las amarillas para pipetear volmenes
pequeos (por ejemplo, 10 l), y las azules para pipetear volmenes grandes (por ejemplo,
800 l).
Tipos: Existen micropipetas manuales, en las que el volumen a aspirar se fija girando un
botn en su parte superior que est conectado a un sistema analgico de confirmacin de
volumen, y automticas, en las cuales dicho sistema es digital. Hay micropipetas simples,
que slo acogen una punta cada vez, y multicanales, que permiten incorporar mltiples
puntas (por ejemplo, ocho), absorbiendo el mismo volumen en todas ellas.
Operacin del Equipo
a. Se presiona el botn superior suavemente hasta el primer tope.
b. Se sumerge la punta, en la solucin que se necesita pipetear estando seguros que la punta
este bien colocada y que no haya ningn tipo de residuos entre la punta y el cuerpo de la
pipeta.
c. Mantenga la pipeta verticalmente mientras toma la solucin, soltando el botn
suavemente.
d. Para descartar la solucin de la punta presione el botn hasta el segundo tope.
e. Descarte las puntas utilizando el eyector que traen las pipetas, ver figura 3
(Micropipetas).
Figura 6. Micropipeta uso y partes

Espectrofotometra:
La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la
concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las
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radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma

lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro,
en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y
medir la cantidad de luz absorbida por la misma. Para cuantificar la absorbancia se puede
usarla ley de Lambert- Beer, esta ley expresa la relacin entre absorbancia de luz
monocromtica (de longitud de onda fija) y concentracin de un cromforo en solucin:
La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a su concentracin, a mayor

nmero de molculas mayor interaccin de la luz con ellas; tambin depende de la distancia
que recorre la luz por la solucin, a igual concentracin, cuanto mayor distancia recorre la
luz por la muestra ms molculas se encontrar; y por ltimo, depende de, una constante
de proporcionalidad, denominada coeficiente de extincin, que es especfica de cada
cromforo. Como A es adimensional, las dimensiones de dependen de las de c y l. La
segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace,
siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de resultan ser M-1cm-1. Este
coeficiente as expresado, en trminos de unidades de concentracin molar (o un
submltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extincin molar
M).
( Cuando, por
desconocerse el peso molecular del soluto, la concentracin de la disolucin se expresa en
otras unidades distintas de M, por ejemplo gL-1, las dimensiones de resultan ser distintas,
por ejemplo g-1Lcm-1, y al coeficiente as expresado se denomina coeficiente de
extincin especfico (s). La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas.
La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en espectrofotmetros.
Aunque pueden variar en diseo, en especial con la incorporacin de ordenadores para el
anlisis de datos, todos los espectrofotmetros constan de:
1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada longitud de onda:
filtros, prismas, redes de difraccin.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que
contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico transparente. Para medir en UV
se deben usar las de cuarzo o slice fundido, porque el vidrio no transmite la radiacin UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas en seales
elctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.
Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud
de onda a la que se va a realizar la medida. Se mide primero la absorbancia del disolvente
(conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando,
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de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto la
absorbancia es cero. A continuacin se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee
la absorbancia de sta. (Ver figura 4) (Abril, Brcena, Fernndez, Galvn, Jorrn, Peinado,
Melndez &Tnez).
Figura 7. Funcionamiento de espectrofotmetro

Turbidimetra:
La turbidimetra es un campo analtico relacionado con la colorimetra, tanto en el aspecto
terico como experimental. La turbidimetra determina la cantidad de luz no dispersada, el
fundamento de esta tcnica es la dispersin de la luz por partculas no transparentes
suspendidas en un lquido, como por ejemplo, precipitado y suspensiones coloidales.
Cuando se utiliza esta tcnica con fines cualitativos se suelen construir curvas de calibrado
con muestras de concentraciones conocida. Estas muestras (precipitados o suspensiones)
deben prepararse bajo condiciones rigurosamente controladas ya que la cantidad de luz
dispersada depende no solo de la concentracin sino tambin del tamao y nmero de
partculas implicadas. Para que la luz dispersada pueda utilizarse comparativamente es
necesario que tanto el nmero de partculas como su tamao sean del mismo orden.
Adems, la longitud de onda de luz que es dispersada ms eficazmente depende tambin
del tamao de las partculas. Bajo condiciones controladas, se puede lograr que el tamao
de partcula en la suspensin sea reproducible y en consecuencia que esta tcnica sea de
aplicacin analtica. Las aplicaciones de la turbidimetra son muy variadas, algunos
sistemas son turbios al llegar al laboratorio analtico, como en el anlisis de los materiales
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de suspensin en las aguas. En la industria se utiliza en la medicin de la transparencia de

bebidas y productos farmacuticos. (Merino, 1996)
MATERIALES
Micropipeta de 1000L
Micropipeta de 200L
Micropipeta de 100L
Bao termosttico
Vrtex.
Espectrofotmetro
Bao de hielo
Tubos tapa rosca

Gradillas
Balones volumtricos de 100 ml
Glucosa
DNS
Solucin madre de levadura
PROCEDIMIENTO
Elaboracin de la curva estndar de glucosa
Preparar una solucin madre de glucosa a 1g/L en un baln de 100 ml.

Hacer las siguientes diluciones en tubos de ensayo usando las micropipetas
Solucin
Blanco
1
2
3
4
5
Volumen de
solucin madre
(L)
Concentracin
(g/L)
0
0,125
0,25
0,5
0,75
1
0
125
250
500
750
1000
Volumen de agua
destilada (L)
1000
875
750
500
250
0
Tomar las diluciones preparadas y adicionar a cada una 1000 L de DNS,

incluyendo al blanco.
Tapar cada tubo para evitar prdidas de muestra por evaporacin.
En el caso de no poder trabajar inmediatamente con las soluciones, guardar todos

los tubos en un lugar oscuro para evitar que el DNS comience a reaccionar.
Llevar todas las soluciones al bao termosttico a una temperatura de 80-90C

durante 5 minutos.
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Pasados los 5 minutos exactos, llevar las soluciones a un bao de hielo durante 5
minutos o hasta el momento que se vaya a realizar las lecturas de las absorbancias.
Leer las absorbancias de las soluciones a 540 nm.
Realizar una curva de calibracin de concentracin de glucosa en g/L versus

absorbancia.
Hacer un ajuste lineal de los datos

Cuantificacin de biomasa por el mtodo del peso seco
A partir de la solucin madre de levadura, adicionar los siguientes volmenes en

balones volumtricos aforados de 25 ml
Solucin
Volumen de solucin madre (mL)
1
2
3
4
5
(g/L).
20
16
12
8
4
Secar los filtros en estufa por 10 minutos a 90-100 C.

Dejar enfriar.
Pesar en balanza analtica (usar siempre la misma).
Filtrar 15 ml de la solucin preparada.
Llevar a estufa el filtro durante 30 minutos.
Enfriaren desecador.
Pesar nuevamente el filtro.
Determinar la concentracin en g/L.
Tomar una muestra de 1 ml de solucin y depositarla en una celda.
Leer absorbancia en el espectrofotmetro a 600 nm.
Hacer una curva de calibracin de absorbancia versus concentracin de levadura
Nota:
Recuerde que las soluciones deben estar homogneas en los momentos de hacer
diluciones y hacer las lecturas de absorbancias.
Los filtros nunca deben ser tocados directamente, use siempre pinzas dispuestas en
el laboratorio.
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DE ANTIOQUIA
10.
UNIVERSIDAD
CINTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO: FERMENTACIN

ALCOHLICA
OBJETIVOS
Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentacin batch

realizada por levadura Sacharomyces cerevisiae.
Estudiar la cintica de crecimiento de un cultivo batch con clulas libres.
Determinar los parmetros cinticos del modelo de Monod (Ks y mx.).
MARCO TERICO
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa
fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios
constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en
los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin
de productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el
mantenimiento celular (Medios de fermentacin).
La variedad de materias primas usadas en la manufactura de etanol va fermentacin son
clasificadas en tres tipos: azcares, almidones y materiales celulsicos. Los azcares (de
caa de azcar, remolacha de azcar, melazas y frutas) pueden ser convertidos a etanol
directamente.
La fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico realizado por las levaduras y algunas
clases de bacterias. Estos microorganismos transforman el azcar en alcohol etlico y
dixido de carbono. La fermentacin alcohlica, comienza despus de que la glucosa entra
en la celda. La glucosa se degrada en un cido pyruvic. Este cido pyruvic se convierte
luego en CO2 y etanol. Los seres humanos han aprovechado este proceso para hacer pan,
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cerveza, y vino. En estos tres productos se emplea el mismo microorganismo que es: la
levadura comn o la Sacharomyces cerevisiae (Fermentacin alcohlica).
En la actualidad, ha surgido un inters creciente en la inmovilizacin de clulas para la
produccin de alcohol, debido principalmente a las numerosas ventajas que ofrece. La
inmovilizacin celular permite el aumento en la productividad, la factibilidad del proceso
en continuo, la estabilidad celular y los bajos costos en recuperacin y reciclo en los
procesos de separacin. Sin embargo, su implementacin en los procesos industriales es
aun limitada y su aplicacin depender de los futuros desarrollos en los procedimientos de
inmovilizacin que puedan ser fcilmente escalables (Franco & Muoz).
Existen factores tanto fsicos como qumicos que inciden positivo o negativamente en el
transcurso de la fermentacin alcohlica, ya sea actuando sobre el desarrollo de las
levaduras o incidiendo directamente sobre la fermentacin. Los ms relevantes son los
siguientes:
La temperatura, a mayor temperatura la fermentacin transcurre en menor tiempo, sin
embargo es menos pura, se produce menos etanol y ms cantidad de compuestos
secundarios. Las levaduras a 30 C tienen su temperatura ptima de desarrollo. Por encina
de 35 C la actividad disminuye rpidamente y mueren antes de los 45C.
Oxgeno, aunque la fermentacin es un proceso anaerobio, las levaduras mantienen una
leve respiracin utilizando para ello el oxgeno disuelto en el mosto.
Nutrientes, Los azcares son fuente de energa para las levaduras.
PROCEDIMIENTO
Preparacin de inoculo.
Activar la levadura en, incubndola en el siguiente medio de cultivo

Reactivo
Cantidad (g/L)
Glucosa
60
MgSO4.7H2O
1
KH2PO4
2
(NH4)2 SO4
3
Extracto de levadura
4
Peptona universal
3,6
A las siguientes condiciones: 30C y 150 rpm durante 24 horas.
Medio de cultivo para realizacin de las fermentaciones
Para las fermentaciones se emplea la siguiente composicin para el medio de cultivo

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DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
Reactivo
Cantidad (g/L)
Glucosa
MgSO4.7H2O
KH2PO4
(NH4)2 SO4
Peptona universal
X
1
2
3
4
3,6
Donde X es la concentracin de glucosa en el medio, la cual puede ser 90, 60 o 30 g/L,

segn corresponda.
El pH del medio se ajusta a 5 y se esteriliza por 15 minutos a 15Psi y 121C.
Montaje para seguimiento de biomasa y consumo de sustrato
Montaje en batch en erlenmeyers de 500ml, con un volumen de fermentacin de 300 mL,

se adicionan 270 mL de medio de cultivo y 30 mL levadura, libre de glucosa. Se hacen tres
montajes cada uno con una concentracin diferente.
Montaje para la determinacin de etanol.
La cantidad de etanol producido se cuantifica de manera indirecta a partir del CO2 liberado
durante la fermentacin, apoyados en la relacin estequiomtrica:
La determinacin de etanol se realizara en erlenmeyers de 100 mL con un volumen de

fermentacin de 60 mL, se adiciona 54 mL de medio de cultivo y 6 mL de biomasa, libre de
glucosa. Al igual que para la determinacin de biomasa y consumo de sustrato se realizan
tres montajes con diferentes concentraciones. La diferencia del montaje para la
determinacin con respecto al montaje para la determinacin de biomasa y consumo de
sustrato es que este montaje lleva un fermentmetro (ver figura 5 y 6)
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DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
Figura 8. Fermentmetro
Figura 9. Montaje con fermentmetro

Mediante la relacin estequiomtrica de la reaccin de fermentacin se sabe que por cada
mol de dixido de carbono que se libera, se produce una mol de etanol; lo que permite
determinar la cantidad de etanol equivalente (g/L), conociendo el volumen de lquido en el
interior del reactor, as:
Donde
Es la concentracin de etanol equivalente en el reactor en g/L.
Cantidad de dixido de carbono liberado en gramos.
Volumen del lquido en el reactor en litros.
Toma de muestra de los montajes en batch
Se debe tomar muestra cada dos horas, en los cuales se realizar el siguiente procedimiento:
1.
Tomar el cultivo del agitador y llevarlo a la cmara de flujo laminar.
2.
Tomar dos muestras de 1 ml cada una con micro pipeta en epperndorf de 2mL.
3.
Centrifugar 1 muestra (10000 rpm por 5 min)
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DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
Cuantificacin de Biomasa:
1. Tome la muestra que no fue centrifugada.

2. Medir absorbancia a 600 nm para determinar concentracin de biomasa.
Cuantificacin de Glucosa:
1. Trasvase el sobrenadante de la muestra que fue centrifugada.

2. Cuantificar azucares reductores (ATR) por el mtodo de DNS.
Cuantificacin de Etanol indirecto:
1. Al montaje del fermentmetro se le registra el peso, con el fin de determinar la cantidad

de CO2 producido.
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DE ANTIOQUIA
11.
UNIVERSIDAD
DEGRADACIN DE COLORANTES UTILIZANDO HONGOS DE LA

PUDRICIN BLANCA DE LA MADERA.
OBJETIVO
Evaluar el porcentaje de degradacin de los colorantes azul ndigo y Orange II,

colorantes patrn e industriales en medio slido y lquido, empleando algunos hongos de
pudricin blanca de la madera.
MARCO TERICO
La lignina es un biopolmero aromtico complejo; es el segundo polmero en abundancia
despus de la celulosa, constituye cerca del 15% de la biomasa terrestre y su fuente natural
es la madera, donde se encuentra en una proporcin del 20 al 35%. Solamente un pequeo
nmero de microorganismos son responsables de la biodegradacin de la lignina, de los
cuales los hongos de la podredumbre blanca constituyen el grupo ms importante, gracias a
que producen unas enzimas ligninolticas extracelulares, lignino peroxidasa (LiP) y
manganeso peroxidasa (MnP), que tienen una potente capacidad oxidante. En la
degradacin enzimtica de la lignina intervienen una serie de reacciones inespecficas que
originan la formacin de radicales libres en el biopolmero y dan como resultado la
desestabilizacin de los enlaces y finalmente la ruptura de la macromolcula.
Los hongos de la podredumbre blanca de la madera, tambin llamados hongos
ligninolticos, as como sus enzimas ligninolticas, tienen potencial aplicacin en la
industria del papel, principalmente en el proceso de deslignificacin durante el blanqueo, y
en biorremediacin de suelos y aguas contaminadas, porque la baja especificidad de estas
enzimas les permite oxidar, adems de la lignina, una amplia variedad de compuestos
orgnicos contaminantes como tintes, hidrocarburos poliaromticos, pentaclorofenol, etc.
Algunos de los factores ms importantes que se deben tener en cuenta en las tecnologas de
biorremediacin de suelos contaminados con hongos ligninolticos, son: alcanzar una
abundante colonizacin del suelo, mantener su crecimiento por un periodo prolongado de
tiempo y favorecer la produccin de enzimas ligninolticas. Adems, que su desarrollo no
sea impedido por la microflora antagonista predominante.
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42

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
En biorremediacin de suelos, los hongos ligninolticos normalmente son aplicados en

forma de micelio crecido sobre viruta de madera, paja de trigo, carozo de maz, o algn otro
material lignocelulsico similar. Esta forma de inoculacin permite obtener una abundante
colonizacin del suelo, sostener su crecimiento por un periodo prolongado de tiempo dado
su aporte de carbono y favorecer la produccin de enzimas ligninolticas, puesto que con
estos materiales se tiende a simular su nicho ecolgico natural (Feijoo, Lema & Quintero.
2006).
Los hongos de la PB, secretan una o ms de las tres enzimas extracelulares oxidativas
esenciales en la mineralizacin de lignina: la lignina peroxidasa, que por sntesis endgena
de H2O2, oxida veratril alcohol, a la vez oxida compuestos aromticos no fenlicos, en la
reaccin se generan radicales arilo y alquilo que se anabolizan intracelularmente; la
manganeso peroxidasa, que oxida componentes fenlicos de la lignina, mediante la
reaccin de oxidacin del Mn2+ a Mn3+, la cual es dependiente del H2O2, y la Lacasa, una
fenol oxidasa con cobre, que oxida anillos de la lignina (Prez et al.,2002). El patrn de
actividad de estas enzimas es especfico del gnero y especie de hongo de la PB
involucrado, algunos excretan la LiP, la MnP y no la Lacasa o la MnP, la Lacasa y no la
LiP; existen otras enzimas que estn indirectamente asociadas con la mineralizacin de
lignina: como la glioxal oxidasa y la superxido dismutasa que sintetiza H2O2 necesario,
para la actividad de la LiP y la MnP; mientras otras enzimas fngicas funcionan como
enlace entre las rutas de mineralizacin de la lignocelulosa, como: la glucosa oxidasa, la
aril alcohol oxidaba, la celobiosa quinona oxidorreductasa y la celobiosa deshidrogenasa
(Pointing, 2001).
La sntesis fngica de la LiP y la MnP se realiza bajo una alta tensin de oxgeno, se
reprime en agitacin o cuando los hongos de la PB, se cultivan en medio lquido, sin
embargo la Lacasa se sintetiza slo en agitacin, estas tres enzimas son inespecficas y se
inducen en condicin limitante de nutrientes, como la fuente de nitrgeno, (Christian,
Shrivastava, Shukla, Modi & Vyas. 2005.), este complejo enzimtico inespecfico fngico
extracelular, tiene potencial en la eliminacin de xenobiticos con estructura qumica
similar a la lignina tales como: aromticos, nitroaromticos, aromticos policclicos,
herbicidas, pesticidas, detergentes clorofenoles y colorantes (Pointing, 2001).
Los hongos ligninolticos sintetizan un sistema enzimtico extracelular muy particular y no
especfico. El mecanismo de estos sistemas responsables de degradar la lignina est basado
en la formacin de radicales libres, lo cual hace que estas enzimas sean activas
catalticamente sobre una gran diversidad de sustratos orgnicos. Debido a esto, los hongos
ligninolticos poseen un uso potencial muy atractivo en la biorremediacin de ambientes
contaminados con mezclas complejas de contaminantes peligrosos. Estos hongos tienen la
capacidad de mineralizar completamente a CO2 los contaminantes muy recalcitrantes,
como los bifenilos policlorados, los explosivos aromticos, los hidrocarburos policclico
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43

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
aromticos, los plaguicidas clorados y organofosforados. Asimismo, pueden decolorar

efluentes contaminados con colorantes de origen industrial. Todo esto resalta la versatilidad
de los sistemas enzimticos de los hongos ligninolticos, ya que son enzimas de poca
especificidad que pueden reconocer sustratos con estructuras moleculares muy diversas. En
la literatura pueden encontrarse muchos ejemplos de tratamientos de contaminantes por
medio del uso de hongos degradadores de lignina o sus sistemas enzimticos. Se ha
demostrado la oxidacin de efluentes derivados del blanqueo del papel con Phanerochaete
chrysosporium, cuya manganeso peroxidasa es la enzima responsable. De la misma manera,
las lacasas de Trametes versicolor se han identificado como enzimas muy eficientes en la
decoloracin de estos efluentes. Las peroxidasas dependientes de manganeso obtenidas de
Bjerkandera adusta y de Pleurotus eryngii, as como las isoenzimas de lacasas de
Coriolopsis gallica, han sido utilizadas en la degradacin de colorantes sintticos tipo azo, o
de diversos colorantes industriales. Por otro lado, se ha observado la mineralizacin de 2,4diclorofenol, 2,4,6-triclorofenol, guayacoles policlorados, diversas vainillinas policloradas
y pentaclorofenol por el hongo P. chrysoporium, pero tambin se ha observado que los
fenoles policlorados son sustratos de las peroxidasas extracelulares de este hongo, como la
lignino peroxidasa y la manganeso peroxidasa. La lignino peroxidasa y la manganeso
peroxidasa de P. chrysoporium as como la cloroperoxidasa de Caldariomyces fumago son
enzimas capaces de catalizar la deshalogenacin en la posicin 4 del anillo aromtico del
pentaclorofenol. Debido a que esta deshalogenacin da lugar a la quinona, este proceso se
denomina deshalogenacin oxidativa, obtenindose la tetraclorobenzoquinona como
producto final. La combinacin de la accin de estas enzimas con el sistema intracelular
reductor en P. chrysoporium ha permitido la deshalogenacin completa del pentaclorofenol
(Tinoco & Vsquez).
La industria textil es una de las que genera mayor cantidad de aguas residuales en sus
procesos; los valores tpicos se encuentran alrededor de 80-200 m3 de efluentes lquidos
residuales generados por tonelada de producto. Estos efluentes contienen altas
concentraciones de slidos disueltos, sodio, cloro, sulfatos y tintes recalcitrantes y
cancergenos, estos ltimos pueden alcanzar valores de hasta 400 mg/L. Cerca del 15% de
los colorantes empleados en la industria textil se pierden en el proceso de teido, los cuales
en la mayora de los casos son vertidos en cuerpos de agua generando contaminacin. Estas
aguas residuales son difciles de tratar debido a que los tintes contienen estructuras
moleculares aromticas complejas, que los hacen estables en el ambiente y difciles de
degradar. Se han empleado diferentes procesos fsicos y qumicos para eliminar o remover
la carga colorante en los efluentes industriales, sin embargo se presentan inconvenientes
entre ellos: i) altos costos de tratamiento, ii) los contaminantes qumicos no son destruidos
sino simplemente removidos de los efluentes y relocalizados en otro sitio donde el
problema persiste, iii) en procesos donde se utiliza el cloro para la decoloracin, se puede
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44

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
producir compuestos rganoclorados que son altamente txicos y recalcitrantes, iv) en

ciertos tratamientos qumicos se produce ruptura del anillo aromtico del colorante
generando sustancias aun ms txicas. Actualmente los procesos biotecnolgicos para la
eliminacin de contaminantes ambientales estn en pleno proceso de investigacin y son
muy promisorios gracias a que se pueden alcanzar altas eficiencias de remocin de
contaminantes, adems poseen un costo competitivo respecto a tratamientos fsicoqumicos equivalentes y son amigables con el medio ambiente. Se ha realizado un
importante nmero de investigaciones sobre la decoloracin de colorantes sintticos para
uso no industrial y en menor proporcin se observan trabajos con colorantes industriales.
Los colorantes sintticos no industriales se emplean principalmente como indicadores de
cambios ambientales, por ejemplo: pH, redox, presencia de oxgeno, etc., y se han
empleado como modelos para evaluar el potencial del sistema ligninoltico de los hongos
de la pudricin blanca de la madera frente a otros colorantes con la misma estructura
qumica. En estudios de degradacin de colorantes industriales o hidrocarburos
poliaromticos entre otros, la degradacin de este tipo de colorantes se realiza
principalmente como control de la presencia o no de actividad ligninoltica (Cardona,
Osorio & Quintero. 2009).
MATERIALES
Cajas Petri con hongos de pudricin blanca colonizados en medio Kimura.

Erlenmeyers 250 mL.
Colorantes.
PROCEDIMIENTO
Medio de mantenimiento
Reactivo
Glucosa
Peptona universal
KH2PO4
MgSO4.7H2O
Agar
pH
Medio slido (g/L)
Medio lquido (g/L)

20
5
2
1
0.5
15
5.5
Cepas de hongos de pudricin blanca
Bjerkandera sp. Anamorfo.
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45
20
5
2
1
0.5
No
5.5

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
A. Discolor.
Peurutus Eryngii.
Lentinus Tigrinus
Colorantes
Colorante
Concentraciones (ppm)
100
200
100
200
Orange II
Azul ndigo
Determinacin de la capacidad de decoloracin
Medio slido
Cada caja Petri contiene aproximadamente 20 ml de medio de cultivo Kimura estril

.ms el colorante a la concentracin correspondiente.
Sembrar el hongo que corresponde, transfiriendo un trozo circular de agar

colonizado.
Incubar por 15 das a 30C en esttico.
Medir la velocidad de crecimiento y de decoloracin, midiendo en cada caja Petri el

crecimiento radial y el halo de decoloracin
Medio lquido
Los colorantes se adicionaran individualmente en cada erlenmeyer de 250 mL que

contienen 100 mL de medio de cultivo estril.
Los experimentos se llevaran a cabo en un shaker a 175 rpm en un tiempo de 7 a 14

das a 33C.
La concentracin del colorante ser medida tomando muestras de 1 ml y leyendo su

absorbancia en tiempos peridicos.
Antes de medir la absorbancia, se debe centrifugar durante 5 minutos la muestra a

8000 rpm, con el fin de obtener el sobrenadante libre de biomasa.
Calcular el porcentaje de decoloracin.
La lectura de la absorbancia se realizara a las siguientes longitudes de onda:
Orange II a 485 nm.
Azul ndigo a 598 nm.
Para la conversin de la absorbancia se requiere de las curvas de calibracin de cada

uno de los colorantes (Absorbancia versus concentracin).
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46

DE ANTIOQUIA
12.
UNIVERSIDAD
EXTRACCIN DE ENZIMAS DE ORIGEN VEGETAL. EFECTO DE

INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.
A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimticas. Las
enzimas son un ejemplo de que no slo es importante lo que comemos sino que adems es
indispensable tener una buena capacidad de absorber esos nutrientes.
OBJETIVOS
Determinar experimentalmente la actividad de un extracto enzimtico de origen

vegetal que contiene polifeniloxidasa (PFO).
Evaluar el efecto que ejerce un inhibidor sobre la actividad enzimtica.
Determinar los parmetros cinticos para la reaccin con y sin inhibidor.
Determinar qu tipo de inhibidor es el cido ctrico.

MARCO TERICO
Inhibidores
El efecto de un inhibidor es disminuir o bloquear la velocidad de una reaccin catalizada
unindose al enzima. La mayor parte de los enzimas estn afectados. Son especficos,
cualquier sustancia no sirve para unir cualquier enzima. Se alteran grupos importantes para
la funcin cataltica o se altera ligeramente la conformacin (con lo que la protena ya no es
activa) sin llegar a desnaturalizarlo. Los inhibidores sirven para distinguir los grupos
esenciales.
En la inhibicin acompetitiva, el inhibidor slo se une al complejo enzima - sustrato, que ya
no formar producto, por lo que la velocidad bajar. El inhibidor no se une al centro activo
sino a cualquier otro sitio, lo que hace que cambie la conformacin y el enzima ya no es tan
efectivo.
En la inhibicin mixta, intermedia entre acompetitiva y competitiva. El inhibidor (que no
tiene porqu parecerse al sustrato) no se une al centro activo aunque tiene efecto de
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47

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
competitivo. La unin de uno y otro no son excluyentes. El resultado final depende de cul
de los dos prevalezca.
Inhibicin no competitiva: En este caso da igual unirse al enzima que al complejo enzima sustrato, aunque no se transformar igual de bien porque la velocidad es diferente. Cuanto
ms se parezca el inhibidor al estado de transicin del sustrato ms eficaz ser el inhibidor.
Son inhibidores muy potentes de la actividad cataltica del enzima (Inhibidores)
Enzima polifenoloxidasa
La polifenoloxidasa, es una de las enzimas ms estudiadas en la industria de los alimentos
ya que es la responsable de las reacciones de pardeamiento enzimtico en frutas y verduras.
Una de las razones por las cuales es importante su estudio es porque comercialmente es
indeseable, ya que modifica las propiedades sensoriales, nutricionales y en general de
calidad que perjudica la comercializacin de un producto. El banano que pertenece al
gnero Musa, con sus innumerables variedades, es una fruta tropical de importancia
comercial que sufre cambios en su textura, color a travs del proceso de maduracin. Los
cambios asociados a la maduracin como bioqumicas, fisiolgicos y de composicin y el
ablandamiento de los pltanos se han estudiado y reportado ampliamente durante las
distintas fases de desarrollo en las cuales la polifenoloxidasa cumple un papel importante
(Guerrero, 2009).
Alfa metildopa
La metildopa o alfa metildopa es un frmaco simpaticoltico (acta inhibiendo el sistema
simptico) que se emplea en el tratamiento de la hipertensin arterial (Metildopa). La
metildopa es un aminocido aromtico inhibidor de la descarboxilasa en el hombre y en
animales. Aunque el mecanismo de accin an no ha sido demostrado concluyentemente, el
efecto antihipertensivo de la metildopa probablemente se debe a su transformacin en alfametilnorepinefrina, la cual disminuye la presin arterial por estimulacin de receptores
centrales alfa-adrenrgicos inhibitorios y/o por reduccin de la renina plasmtica. La
metildopa ha demostrado causar una reduccin neta en la concentracin tisular de
serotonina, dopamina, norepinefrina y epinefrina (Metildopa).
MATERIALES
6.2.
Solucin buffer de fosfato con pH

Un banano (criollo) o manzana.
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48
Pastillas
(sustrato).
de
Alfa
metildopa

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
cido Ctrico (inhibidor) 7.5%

(p/v).
Bao de hielo.
Falcn.
Centrfuga.
Espectrofotmetro.
PROCEDIMIENTO
1.
Extraccin de la enzima
Se pesan entre 10 y 15 gramos de la fruta (banano o manzana), se colocan en un mortero

pre-enfriado y se agregan 15 ml de solucin de buffer de fosfato a pH= 6.2. Se tritura el
material en el mortero. Se filtra el extracto y se centrifuga a 1500 rpm durante 5 minutos.
La solucin sobrenadante se decanta, se conserva en un bao de hielo y se rotula como
extracto enzimtico.
2.
Preparacin del sustrato
Tomar una pastilla de alfa metildopa y diluirla en 100 mL de buffer fosfato pH: 6.2. Esto
corresponde a la solucin madre.
Grupo
Diluciones de sustrato
Volumen de solucin
madre de sustrato (ml)
1
2
3
4
5
3.
Volumen de
Tampn (ml)
5
4.5
4
3.5
3
0
0.5
1
1.5
2
Medida de la actividad enzimtica
Calibre el espectrofotmetro en absorbancia = 420 nm y prepare las siguientes soluciones

en tubos de ensayo.
Buffer pH = 6.2
Alfa metildopa
Blanco
Muestra
1.5 ml
0.2 ml
1.4 ml
0.2 ml
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49
Muestra
Inhibidor
1.2 ml
0.2 ml

DE ANTIOQUIA
Inhibidor
Extracto enzimtico
UNIVERSIDAD
Calibrar el cero
---------------------
---------0.1 ml
0.2 ml
0.1 ml
Inmediatamente despus de agregar el extracto enzimtico, lea la absorbancia en el

espectrofotmetro (dejar la tapa abierta) y empiece a contar el tiempo a partir de cero.
Repita la lectura de absorbancia cada 30 segundos hasta completar 5 minutos.
Para la determinacin de la actividad enzimtica se aplica la siguiente relacin:
PREGUNTAS
I.Grafique absorbancia vs. Tiempo para la reaccin con inhibidor y sin inhibidor.
II.Grafique concentracin de sustrato vs velocidad de reaccin
III.Qu efecto tiene el inhibidor sobre la velocidad de reaccin?
IV.Discuta sobre el beneficio o las aplicaciones de los inhibidores.
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50

DE ANTIOQUIA
13.
UNIVERSIDAD
ACTIVIDAD CATALTICA DE LA -AMILASA Y VARIABLES QUE LA

AFECTAN
Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas,
siempre que sean termodinmicamente posibles: Una enzima hace que una reaccin
qumica que es energticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja
transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las
enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en
molculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas
necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas
por enzimas se las denomina reacciones enzimticas. Las enzimas son un ejemplo de que
no slo es importante lo que comemos sino que adems es indispensable una buena
capacidad de absorber esos nutrientes.
OBJETIVOS
Experimentar sobre diferentes aspectos de la actividad enzimtica.
Comprender la forma como diversos factores influyen sobre la actividad cataltica

de las enzimas.
Evaluar la dependencia que puede presentar una reaccin enzimtica con respecto a
la acidez del medio y a la temperatura.
MARCO TERICO
Constituye la forma ms generalizada, aunque no la nica, de reserva energtica en
vegetales. Se almacena en forma de grnulos, y puede llegar a constituir hasta el 70% del
peso de granos (maz y trigo) o de tubrculos (patata). El anlisis minucioso de la estructura
del almidn demuestra que es una mezcla de otros dos polisacridos: la amilosa y la
amilopectina. La proporcin de ambos polisacridos vara segn la procedencia del
almidn, pero por lo general, la amilopectina es la ms abundante.
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51

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
Los almidones constituyen la principal fuente de nutricin glicdica para la humanidad. El

almidn puede ser degradado por muchas enzimas. En los mamferos, estas enzimas se
llaman amilasas, y se producen sobre todo en las glndulas salivares y en el pncreas.
La amilosa es un polmero lineal formado por unidades
de -D-glucopiranosa, unidas
exclusivamente por enlaces (1-4). El nmero de monmeros de la molcula depende de la
procedencia del almidn: alrededor de 1000 en el caso de la papa y 4000 en el caso del
trigo. La amilosa se disuelve fcilmente en agua, adquiriendo una estructura secundaria
caracterstica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de la hlice comprende 6 unidades
de glucosa.
La amilopectina tiene un peso molecular mucho mayor que la amilosa y puede contener
cientos de miles o millones de monmeros
de -D-glucopiranosa. Es un polmero
ramificado, en el que las cadenas principales estn formadas por mosacridos unidos
mediante enlaces glucosdicos (1
-4) y donde cada rama se une a la cadena principal
mediante enlaces glucosdicos (1 -6). Estas ramificaciones estn regularmente espaciadas
(cada 25-30 residuos de glucosa) y cada rama contiene nicamente uniones (1 -4)
(Almidn).
Termamyl 120L es un producto enzimtico lquido que contiene
-amilasa sobresaliente
termoestable expresada en y producida mediante una cepa genticamente modificada de
Bacilluslicheniformis. Se utiliza en las industrias de:
Almidn: Licuefaccin contina del almidn en cocedores a presin o en equipos

que operan a similar temperatura.
Alcohol: Adelgazamiento del almidn en los macerados de la destilacin.
Cervecera: Licuefaccin del almidn.
Azcar: Rompimiento del almidn presente en el jugo de caa. Por lo que el

contenido de almidn en el azcar crudo se reduce y la filtracin en la refinera se facilita.
La enzima es una endoamilasa que hidroliza las uniones 1,4-glucosdicas de la amilosa y
amilopectina. Por lo que el almidn se rompe rpidamente en dextrinas solubles y
oligosacridos (Termamyl 120L).
Los pasos para transformar el almidn en jarabe glucosado son dos: licuefaccin, y
sacarificacin. Durante el proceso de licuefaccin se obtienen malto dextrinas empleando la
enzima alfa amilasa. Estas malto dextrinas contienen diferentes oligosacridos y dextrinas y
es ligeramente dulce. Luego se puede continuar la conversin a glucosa usando la enzima
amiloglucosidasa conocida tambin como glucoamilasa. Esta ltima etapa se conoce como
sacarificacin, donde la amiloglucosidasa puede transformar las malto dextrinas casi
completamente en glucosa; en la prctica se produce tambin un poco de maltosa (Cruz,
2012).
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52

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
MATERIALES
Almidn soluble.
DNS
Lugol
Soluciones Buffer 0.1 M
Citrato con pH:3.5
Fosfato con pH:6.3
Fosfato con pH:9
PROCEDIMIENTO
1.
Preparar las siguientes soluciones:
25 ml de Almidn al 0.5% m/v en buffer citrato pH 3.5

25 ml de Almidn al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 9
50 ml de Almidn al 0.5% m/v en buffer fosfato pH 6.3
50 ml de enzima diluida 1:150 (Preparada por el monitor)
2.
Evaluacin del cambio del pH sobre la actividad de la enzima amilasa
Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2,5 mL de la solucin de almidn, de acuerdo

a la siguiente tabla:
Nmero de tubo
1
2
3
4
5
6
pH
3,5
6,3
9
3,5
6,3
9
Llevar los tubos de ensayo por 3 minutos a bao de 90oC para temperar.
Agregar a los tubos a los tres primeros tubos 0.5 mL de la enzima diluida, agitar y
dejar los 6 tubos en el bao de 90oC por 30 minutos.
Agregar 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos, para parar la reaccin.
Tomar 0,5 mL de todos los tubos y agregar 30L de lugol.
Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio.
Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores.

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53

DE ANTIOQUIA
UNIVERSIDAD
Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la
del DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6.
3.
Evaluacin del cambio de temperatura sobre la actividad de la enzima amilasa.
Tomar 6 tubos de ensayo y adicionar 2.5ml de la solucin de almidn de pH 6.3.

Temperar cada uno de los tubos por 3 minutos as:
Nmero de tubo
1
2
3
4
5
6
C
25
60
90
25
60
90
Agregar 0.5ml de la enzima diluida a los tubos tres primeros tubos.
Agitar y llevar los 6 tubos nuevamente a la temperatura correspondiente por 30

minutos.
Parar la reaccin agregando 0.5ml de NaOH 2M a todos los tubos.
Tomar 0,5 mL de todos los tubos y agregar 30L de lugol.
Tomar 1 mL de cada uno de los tubos y agregarlos a un tubo seco y limpio.
Realizar protocolo de DNS a cada uno de los tubos anteriores.
Comparar la intensidad de los colores tanto para la prueba con lugol como para la
del DNS entre los tubos 1-4, 2-5 y 3-6.
Nota: La actividad enzimtica ser reportada como mol de azucares formados por litro de
solucin por minuto por cantidad de enzima.
Procedimiento para determinar el porcentaje de azcares reductores utilizando DNS
a.
b.
c.
d.
e.
Tomar 1 ml de solucin problema.

Adicionar 1 ml de reactivo DNS.
Tapar los tubos con papel para film y ponerlos en bao a ebullicin por 5 minutos.
Pasar los tubos a un bao de hielo, dejarlo por 5 minutos.
Leer Absorbancia de todas las soluciones a 540 nm.
Pgina
54

Manual de Estudiantes Biologia para Ingenieros - 2014ii

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Manual de Estudiantes Biologia para Ingenieros - 2014ii

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Laboratorio de Biologa para Ingenieros

GUA DE LABORATORIO DE BIOLOGA PARA INGENIEROS

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

Normas generales y de bioseguridad en el laboratorio.

Identificacin de matrices con presencia de macromolculas.

Determinacin de aminocidos y protenas.

Determinacin de algunas propiedades y aplicaciones industriales del almidn.

Transesterificacin para produccin de biodiesel.

Determinacin de la capacidad metablica de microorganismos ambientales.

Manejo de materiales y equipos de laboratorio.

Cintica de crecimiento microbiano: Fermentacin alcohlica.

Degradacin de colorantes utilizando hongos de pudricin blanca de la madera.

Actividad cataltica de la -amilasa y variables que la afectan.

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

INTRODUCCIN AL LABORATORIO E IDENTIFICACIN DE

NORMAS GENERALES EN EL LABORATORIO

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

Dejar los puestos de trabajo limpios despus de terminar la prctica.

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

DETERMINACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

Se clasifican, de forma general, en holoprotenas y heteroprotenas segn estn formadas

Prueba de Ninhidrina: Es positiva para aminocidos y protenas que tengan un

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

Prueba para aminocidos azufrados: Esta reaccin detecta la cistena y metionina y

Desnaturalizacin: Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las

Cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y

Una drstica disminucin de su solubilidad, ya que los residuos hidrofbicos del

Prdida de las propiedades biolgicas (Desnaturalizacin).

Gelatina sin sabor

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

Solucin de albmina 30% v/v.

A cada uno de los tubos adicione 5 gotas de cido ntrico concentrado.

Prueba de los aminocidos azufrados

A cada tubo adicione 3 gotas de hidrxido de sodio al 25%.

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

A cada tubo adicione 5 gotas de hidrxido de sodio al 25%

Agite los tubos y observe si se produce coagulacin.

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

DETERMINACIN DE ALGUNAS PROPIEDADES DEL ALMIDN Y

Determinar propiedades del almidn tales como el punto de gelatinizacin e ndice

Evaluar la aplicabilidad del almidn en la elaboracin de pegantes y adhesivos.

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

Capacidad de retencin del agua.

Determinacin y microscopia del punto de gelatinizacin

Llevar 90 mL de la solucin a un beaker.

Calentar con agitacin constante midiendo la temperatura peridicamente.

Tomar muestras de la suspensin a las temperaturas de 30, 60, 70 C en porta

Teir con lugol las muestras tomadas

Laboratorio de Biologa para Ingenieros

Observar cambios en microscopio para cada una de las muestras utilizando un

Determinar la temperatura de gelatinizacin.

Aplicacin: Evaluacin de pegantes.

Con el gel formado, realizar los siguientes procedimientos:

Agregar gel sobre el papel kraft.

Dejar secar por 1 minuto.

Adherir el papel a una botella.

Dejar secar por 5 minutos (Hacer uso del secador).

Esparcir gel sobre una tira de papel kraft.

Dejar secar por 10 minutos (utilizar secador).

Colocar la tira de papel sobre otro papel seco.