Cromatografa de exclusin molecular o

filtracin en gel:
Objetivo: Separacin de protenas por cromatografa en columna segn el tamao y la
forma.

Fundamento: La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas

diferentes presentes en una misma muestra. El mtodo est basado en la circulacin de
una fase mvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a travs de una f
ase
estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los
distintos
compuestos presentes en la mezcla resultar su separacin.
La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel o de
tamiz molecular) es una tcnica empleada en la separacin de protenas y cidos
nucleicos. Este tipo de cromatografa se realiza en columnas cilndricas rellenas co
n
algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tip
os:
dextranos con enlaces cruzados (sephadex), poliacrilamida, agarosa, difiriendo c
ada uno
de ellos en el valor de su lmite de exclusin, siendo stos entre 0,7 y 800 kD, 0,2 y
400 kD
y hasta 40.000 kD respectivamente. Todos estos geles (fase estacionaria) se hall
an
constituidos por grnulos de un material esponjoso hidratado, que contiene poros c
on un
dimetro determinado.
Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao, a travs de una
columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el dimetro de
los poros de las partculas, slo podrn moverse en su camino, a travs de la fase
estacionaria, en el espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto, no se
vern
retrasadas en su descenso. En cambio aquellas molculas capaces de penetrar en las
partculas se vern retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto men
or
sea su tamao. Por lo tanto, las molculas eluyen en este tipo de cromatografa por or
den
decreciente de tamao molecular.

Tcnica: Se empaqueta el gel dentro de la columna: con la columna cerrada se coloc

a una
pequea cantidad de un buffer adecuado (pH 7) y luego se aade lentamente la cantida
d
necesaria del gel previamente hidratado en el mismo buffer, evitando la formacin
de
burbujas de aire dentro de la columna.
Colocando un recipiente debajo, se lava la columna y se regula la velocidad de f
lujo.
A continuacin, se marcan diferentes tubos en los que se recoger la muestra eluda y

se
procede a la elucin de la columna. Para ello, se deja que la columna gotee hasta
eliminar
el buffer de la parte superior del gel y, posteriormente, se siembra la muestra
sobre el
mismo, previamente teida con un colorante apropiado, con pipeta Pasteur dejando
gotear nuevamente hasta que toda la solucin del analito ingrese en el gel. Por en
cima de
la siembra se deja goteando el solvente de elucin desde una ampolla de decantacin
para lograr la corrida de la muestra y evitar la deshidratacin de la fase estacio
naria.

Se recogen las distintas fracciones del eludo en los tubos numerados, logrando as
la
separacin por tamao de las molculas contenidas en la muestra.
Debemos recordar que previo a realizar la experiencia con nuestra muestra proble
ma se
debe llevar a cabo la calibracin de la columna cromatogrfica. Esto se hace con una
elucin que contenga molculas de peso molecular conocido, coloreadas y con el buffe
r a
utilizar.

a) Grnulo del gel, puntos rosados: partculas pequeas. Puntos azules: Partculas de
mayor tamao.
b) Sembrado de la muestra.
c) Y d) Elucin de las partculas segn su tamao.
d) Diagrama de elusin: cromatograma.

. Factores que influyen en la separacin:

- Longitud de la columna. La capacidad de separacin de sustancias de diferente ta
mao
aumenta con la longitud de la columna.
- Flujo. La resolucin de la separacin disminuye al aumentar el flujo del lquido con
que
son arrastradas las molculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscil
a entre 2
y 10 cm h-1.
- El volumen de la muestra a cromatografiar debe ser pequeo comparado con el volu
men
total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volmenes de
muestra iguales o menores al 5% del volumen total.
- Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alte
ran
profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no est empaquetado
homogneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.

. Interpretacin de resultados:
Puede caracterizarse cuantitativamente el comportamiento de una molcula sobre una
columna de gel particular.
Si :
VX =volumen ocupado por los grnulos del gel.
V0 =volumen vacio (volumen de disolvente del espacio que rodea los grnulos).
Vt =volumen del lecho total de la columna
Vt = V0 + Vx
V0 es tpicamente 35% de Vt aproximadamente.
El volumen de elucin de un soluto determinado Ve es el volumen del disolvente nec
esario
para eluir el soluto desde la columna luego de ser sembrado. El volumen vaco de u
na
columna se mide como volumen de elucin de un soluto cuya masa molecular es mayor
que el lmite de exclusin del gel. Por lo tanto, la relacin Ve/V0 (volumen de elucin
relativo) es caracterstica de cada soluto sobre un gel determinado, ya que dicha
relacin
es independiente de la columna utilizada.
Una vez recogidas todas las muestras, se mide su absorbancia en el espectrofotmet
ro,
calculando con esto la concentracin (ley de Lambert- beer). Luego se realiza el
cromatograma, indicando en el eje de las abscisas el volumen de elucin y en el ej
e de las
ordenadas la concentracin.

. Aplicaciones:
Determinacin del peso molecular de protenas: al existir una relacin lineal entre el
volumen de elucin relativo de una sustancia y el logaritmo de su masa molecular e
n un
intervalo considerable de masas moleculares, pueden graficarse dichos valores pa
ra una
determinada columna de filtracin con gel empleando macromolculas de masas
moleculares conocidas y as determinar la masa molecular de una sustancia desconoc
ida
por su posicin en la curva. La precisin de esta tcnica depende de la validez de la
hiptesis implcita de que las macromolculas, la conocida y la desconocida, tienen fo
rma
idntica.

Desalado de protenas: una protena precipitada, por ejemplo, con sulfato de amonio
puede liberarse con facilidad de la sal por disolucin del precipitado en un volum
en
mnimo de buffer adecuado y sembrando esta solucin en una columna de gel con un
lmite de exclusin inferior al de la masa molecular de la protena. As, por elucin de l
a
columna, la protena preceder al sulfato de amonio pudiendo as separarlos.
Purificacin de macromolculas: esta tcnica es til durante la etapa final de los proce
sos
de purificacin de protenas, por ejemplo.
Separacin de sustancias de diferentes pesos moleculares.

Bibliografa:
. Biochemistry Voet-Voet
. Principios de Bioquimica Lehninger

Integrantes: Almeyda Daiana, Boccadelli Barbara, Buzzatto Micaela, Dinni Florenc

ia,
Echeverria Carla, Jimenez Elisa, Nabaes Mercedes, Nacir Amira, Peucelle Carla, P
once
Eliana, Rodriguez Catherine, Valdez Joaqun.