UNIDAD 11: HISTOQUMICA

1. Lpidos y sus coloraciones

2. Hidratos de carbono o glcidos y sus coloraciones
3. Protenas. Histoqumica de protenas
3.1 Clasificacin de las protenas
4. Estudios de los aminocidos
5. Fijacin de protenas
5.1 Aplicacin de los mtodos de digestin enzimtica al estudio
histoqumico de las protenas
5.2 mtodos histoqumicos para la coloracin de las protenas
6. cidos nucleicos. Histoqumica de los cidos nucleicos
6.1 Estructura del ARN
7. Funciones de los cidos nucleicos
8. Extraccin de los cidos nucleicos
8.1 Procedimientos para la extraccin de cidos nucleicos
8.2 Tcnica histoqumicas que permiten separar el ADN de otras
estructuras
8.3 Tcnicas para distinguir el ARN del ADN: verde metilo-pironina
9. Minerales y pigmentos. Tcnicas para la identificacin y tincin de
pigmentos e iones metlicos

1. LPIDOS Y SUS COLORACIONES

GENERALIDADES SOBRE LOS LPIDOS
Los lpidos son biomolculas que se utilizan en su mayor parte para
aportar energa al organismo, pero tambin son imprescindibles para
otras funciones como son:
La absorcin de algunas vitaminas (las liposolubles)
La sntesis de hormonas
Como material aislante y de relleno de rganos internos.
tambin forman parte de las membranas celulares y de las vainas que
envuelven los nervios.

Estn presentes en los aceites vegetales (los cuales son ricos en

cidos grasos insaturados), y en las grasas animales (que son ricas en
cidos grasos saturados).
A pesar de que al grupo de los lpidos pertenece un grupo muy
heterogneo de compuestos, la mayor parte de los lpidos que
consumimos proceden del grupo de los triglicridos, los cuales estn
formados por una molcula de glicerol, o glicerina, a la que estn
unidos tres cidos grasos de cadena ms o menos larga.
Los cidos grasos
Los cidos grasos son molculas formadas por cadenas de carbono
que poseen un grupo carboxilo como grupo funcional. El nmero de
carbonos habitualmente es de nmero par. Los tipos de cidos grasos
ms abundantes en la Naturaleza estn formados por cadenas de 16
a 22 tomos de carbono.
La parte que contiene el grupo carboxilo manifiesta carga negativa en
contacto con el agua, por lo que presenta carcter acido. El resto de
la molcula no presenta polaridad (apolar) y es una estructura
hidrfoba. Como la cadena apolar es mucho ms grande que la parte
con carga (polar), la molcula no se disuelve en agua.
Los cidos grasos se clasifican en saturados e insaturados.
Saturados
Los enlaces entre los carbonos son enlaces simples, con la misma
distancia entre ellos (1,54 A) y el mismo ngulo (110o). Esta
circunstancia permite la unin entre varias molculas mediante
fuerzas de Van der Waals. Cuanto mayor sea la cadena (ms
carbonos), mayor es la posibilidad de formacin de estas
interacciones dbiles. Por ello, a temperatura ambiente, los cidos
grasos saturados suelen encontrarse en estado slido.
Insaturados
En ellos pueden aparecer enlaces dobles o triples entre los carbonos
de la cadena. La distancia entre los carbonos no es la misma que la
que hay en los dems enlaces de la molcula, ni tampoco los ngulos
de enlace (123o para enlace doble, 110o para enlace simple). Esto
origina que las molculas tengan ms problemas para formar uniones
mediante fuerzas de Van der Waals entre ellas. Por ello, a
temperatura ambiente, los cidos grasos insaturados suelen
encontrarse en estado lquido.
En los alimentos que normalmente consumimos siempre nos
encontramos con una combinacin de cidos grasos saturados e
insaturados.
cido graso Saturado
cido graso Insaturado

Los cidos grasos saturados son ms difciles de utilizar por el

organismo, ya que sus posibilidades de combinarse con otras
molculas estn limitadas por estar todos sus posibles puntos de
enlace ya utilizados o "saturados".
Esta dificultad para combinarse con otros compuestos hace que sea
difcil romper sus molculas en otras ms pequeas que atraviesen
las paredes de los capilares sanguneos y las membranas celulares.
Por eso, en determinadas condiciones pueden acumularse y formar
placas en el interior de las arterias (arteriosclerosis).
Por otro lado se encuentran los fosfolpidos, que incluyen fsforo en
sus molculas. Entre otras cosas, forman las membranas de nuestras
clulas y actan como detergentes biolgicos.
Tambin cabe sealar al colesterol, sustancia indispensable en el
metabolismo por formar parte de la zona intermedia de las
membranas celulares, e intervenir en la sntesis de las hormonas.
Los lpidos o grasas son la reserva energtica ms importante del
organismo en los animales (al igual que en las plantas son los
glcidos).
Esto es debido a que cada gramo de grasa produce ms del doble de
energa que los dems nutrientes, con lo que para acumular una
determinada cantidad de caloras slo es necesario la mitad de grasa
de lo que sera necesario de glucgeno o protenas.

3 TCNICAS DE TINCIN PARA LA IDENTIFICACION DE LPIDOS

Para estudiar las tinciones lipdicas es necesario clasificar este grupo
de biomolculas desde el punto de vista histoqumico. De esta forma
tenemos:
Lpidos homofsicos: son los que se encuentran en los tejidos o en las
clulas en estado puro, de modo que su determinacin histoqumica
es muy sencilla. Para su visualizacin se utilizan tcnicas de tincin
como: Sudn y Oil-Red-O. Ambos mtodos se basan en que el
colorante que se emplea es ms soluble en los lpidos que en el
propio disolvente en el que va contenido.
Lpidos heterofsicos: son los que se encuentran mezclados con otras
sustancias (por ejemplo: fosfolpidos); estos lpidos se encuentran
dispersos y su determinacin histoqumica resulta difcil. En este caso
para su visualizacin se utilizan las tcnicas de tincin del PAS entre
otros.
Procesamiento histolgico para la deteccin de lpidos

Las grasas son insolubles en agua, pero solubles en ciertos

disolventes orgnicos como: cloroformo, benceno, xileno, tolueno,
alcoholes, etc.
Por ello, en la tcnica histolgica habitual las grasas se disuelven en
los lquidos intermediarios propios de la inclusin de parafina,
quedando exclusivamente en el tejido los huecos donde estas se
encontraban.
Para evitar este problema, es necesario incluir los tejidos en gelatina
o polietilenglicol, a menos que se prefiera realizar cortes en
congelacin (microtomo de congelacin o criostato).
Para la fijacin previa del tejido el mejor fijador es el formol, que si
bien fija totalmente las grasas neutras, acta de manera variable
sobre el resto de las estructuras lipdicas (colesterol y derivados,
fosfolpidos, etc.).
El formol es aun mejor fijador de grasas si se emplea como formol
clcico que se prepara con formol al 10% (puede no estar tamponado)
y con cloruro clcico al 1%.
Otros fijadores que poseen la propiedad de insolubilizar grasas son el
tetrxido de osmio y los fijadores que en su composicin llevan cromo
(por ejemplo: Nelly, Zenker), que pueden emplearse en lugar del
formol.
Coloracin para las grasas neutras (lpidos homofsicos)
Son coloraciones por mecanismos fsicos de disolucin.
En general, los colorantes para grasas son ms solubles en las propias
grasas que en el medio en el que van disueltos. As, al baar la grasa
con la solucin del colorante ste tiende a disolverse en la grasa, que
se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes
siempre van en disolucin alcohlica o bien en una mezcla de
alcohol/acetona o alcohol/agua.
Todos estos mtodos producen coloraciones progresivas, es decir, que
a ms tiempo de exposicin al colorante mayor es la intensidad de
tincin.
La inestabilidad de las soluciones colorantes es el principal problema
de esta tcnica, pues la evaporacin de parte del disolvente provoca
la precipitacin del colorante sobre el tejido e induce a error de
interpretacin (falsos positivos).
Para evitar estos falsos positivos deben seguirse los siguientes pasos:
Almacenar el reactivo en lugar fresco y en recipientes cerrados
hermticamente.

Emplear, si es posible, soluciones diluidas filtradas, aunque estas

soluciones no pueden emplearse en muchas tcnicas que requieren
soluciones saturadas de colorante.
Teir los cortes flotantes antes de rescatarlos del agua, lo cual no es
difcil ya que su espesor oscila entre 15 y 20 micras.
No prolongar la tincin ms de 10 minutos.
Agitar con cierta frecuencia durante la coloracin.
En cuanto al montaje, se realizar con una mezcla de gelatina y
glicerina, lo cual evita el paso por los baos de xilol.
Las tinciones de lpidos ms destacables en el laboratorio de
Anatoma Patolgica son las siguientes:
Mtodo del Oil-Red-O.
Con esta tcnica lo que se pretende es distinguir grasas entre s o
frente a otras sustancias por una diferencia de solubilidad.
Resultados:
Las grasas aparecen con una coloracin en rojo de intensidad
variable.
Los ncleos celulares aparecen con una coloracin azulada.
tcnica del Sudn IV o Escarlata R
Para esta tcnica, los cortes tendrn que tener un espesor de unas 10
micras (m) por lo que se obtendrn con el criostato, con el tejido
previamente congelado. Ser preciso tambin tener mucho cuidado
con el colorante ya que es frecuente que se produzca precipitacin.
Resultados:
Los lpidos presentan una coloracin que va desde color rojo intenso o
naranja rojizo. Los ncleos aparecen de color azul.
tcnica del Sudn negro para lpidos.
Esta tcnica se basa en la adicin de diversas soluciones de
propilenglicol mezcladas con los colorantes Sudn Negro B y rojo
neutro al 1%.
Resultados:
o ncleos y citoplasmas: rojo.
o Lpidos: Negro. o Mielina: Negro.
coloracin con azul de Nilo: Mtodo de Lillie.
Se utiliza para diferenciar las sustancias grasas neutras de las acidas.
Siempre trabajaremos con una solucin de azul de Nilo que lleva
adicionada una proporcin de rojo Nilo del 2%.

La propiedad del azul de Nilo reside en que, al ser qumicamente

impuro, se encarga por un lado de disolver las grasas de carcter
cido (eso lo hace el azul de Nilo), mientras que por otro el rojo de
Nilo disuelve las grasas neutras. Esto es lo que permite la
identificacin de dos tipos de lpidos mediante una tcnica no
histoqumica.
Resultados:
o cidos Grasos: Azul oscuro.
o Grasas Neutras: de rosa a rojo.
INTRODUCCION AL ESTUDIO DE LOS GLUCIDOS
Son compuestos en los que el hidrogeno y oxigeno se encuentran en
la misma proporcin que en el agua (su frmula emprica sera
CnH2nOn) de ah su nombre clsico de hidratos de carbono.
La principal funcin de los glcidos es aportar energa al organismo.
De todos los nutrientes que se puedan emplear para obtener energa,
los glcidos son los que producen una combustin ms limpia en
nuestras clulas y dejan menos residuos en el organismo. De hecho,
el cerebro y el sistema nervioso solamente utilizan glucosa para
obtener energa. De esta manera se evita la presencia de residuos
txicos (como el amoniaco, que resulta de quemar protenas) en
contacto con las delicadas clulas del tejido nervioso.
Una parte muy pequea de los glcidos que ingerimos se emplea en
construir molculas ms complejas, junto con grasas y protenas, que
luego se incorporarn a nuestros rganos. Tambin utilizamos una
porcin de estos carbohidratos para conseguir quemar de una forma
ms limpia las protenas y grasas que se usan como fuente de
energa.
Tipos de glcidos
Una posible clasificacin es aquellas que los agrupa en tres tipos:
Almidones (o fculas):
Son los componentes fundamentales de la dieta del hombre. Son los
materiales de reserva energtica de los vegetales, que almacenan en
sus tejidos o semillas con objeto de disponer de energa en los
momentos crticos, como el de la germinacin.
Qumicamente pertenecen al grupo de los polisacridos, que son
molculas formadas por cadenas lineales o ramificadas de otras
molculas ms pequeas y que a veces alcanzan un gran tamao.
Para asimilarlos es necesario partir los enlaces entre sus
componentes fundamentales: los monosacridos. Esto es lo que se
lleva a cabo en el proceso de la digestin mediante la accin de
enzimas

2. HIDRATOS DE CARBONO O GLUCIDOS Y SUS COLORACIONES

especficos. Los almidones estn formados por el encadenamiento de
molculas de glucosa, y las enzimas que lo descomponen son
llamadas amilasas, que estn presentes en la saliva y los fluidos
intestinales. Para poder digerir los almidones es preciso someterlos a
un tratamiento con calor previo a su ingestin (coccin, tostado, etc.).
El almidn crudo no se digiere y produce diarrea. El grado de
digestibilidad de un almidn depende del tamao y de la complejidad
de las ramificaciones de las cadenas de glucosa que lo forman.
Azcares:
Se caracterizan por su sabor dulce. Pueden ser azucares sencillos
(monosacridos) o complejos (disacridos). Estn presentes en las
frutas (fructosa), leche (lactosa), azcar blanco (sacarosa), miel
(glucosa + fructosa), etc.
Los azucares simples o monosacridos: glucosa, fructosa y galactosa
se absorben en el intestino sin necesidad de digestin previa, por lo
que son una fuente muy rpida de energa. Los azucares complejos
deben ser transformados en azcares sencillos para ser asimilados.
El ms comun y abundante de los monosacaridos es la glucosa. Es el
principal nutriente de las celulas del cuerpo humano a las que llega a
traves de la sangre. No suele encontrarse en los alimentos en estado
libre, salvo en la miel y algunas frutas, sino que suele formar parte de
cadenas de almidon o disacaridos.
Entre los azcares complejos o disacaridos, destaca la sacarosa
(componente principal del azcar de caa o de la remolacha
azucarera) que est formada por una molecula de glucosa y otra de
fructosa. Esta unin se rompe mediante la accion de una enzima
llamada sacarasa, liberandose la glucosa y la fructosa para su
asimilacion directa. Otros disacaridos son la maltosa, formada por dos
unidades de glucosa y la lactosa o azcar de la leche, formada por
una molecula de glucosa y otra de galactosa. Para separar la lactosa
de la leche y poder digerirla en el intestino es necesaria una enzima
llamada lactasa. Normalmente este enzima est presente solo
durante la lactancia, por lo que muchas personas tienen problemas
para digerir la leche.
Fibra:
Est presente en las verduras, frutas, frutos secos, cereales integrales
y legumbres enteras. Son moleculas tan complejas y resistentes que
no somos capaces de digerirlas y llegan al intestino grueso sin
asimilarse.
El componente principal de la fibra que ingerimos con la dieta es la
celulosa. Es un polisacrido formado por largas hileras de glucosa
fuertemente unidas entre s.

Es el principal material de sostn de las plantas, con el que forman su

esqueleto. Se utiliza para hacer papel.
Otros componentes habituales de la fibra diettica son la
hemicelulosa, la lignina y las sustancias pecticas.
Practicamente la totalidad de los glcidos que consumimos son
transformados en glucosa y absorbidos por el intestino.
Posteriormente pasan al hgado donde son transformados a
glucogeno, que es una sustancia de reserva de energia para ser
usada en los periodos en que no hay glucosa disponible (entre
comidas).
7
Segn se va necesitando, el glucogeno se convierte en glucosa, que
pasa a la sangre para ser utilizada en los diferentes tejidos. Tambien
se almacena glucogeno en los msculos, pero esta reserva de energia
solo se utiliza para producir energia en el propio musculo ante
situaciones que requieran una rapida e intensa actividad muscular
(situaciones de huida o defensa).
El glucogeno se almacena hasta una cantidad maxima de unos 100
gr. en el higado y unos 200 gr. en los musculos. Si se alcanza este
limite, el exceso de glucosa en la sangre se transforma en grasa y se
acumula en el tejido adiposo como reserva energetica a largo plazo. A
diferencia de las grasas, el glucogeno retiene mucha agua y se
mantiene hinchado en el cuerpo. Al consumir el glucogeno, tras un
periodo de ayuno o ejercicio fisico intenso, tambien se pierde el agua
que retiene -1 kilo aproximadamente -, por lo que puede parecer que
se ha disminuido de peso. Esta agua se recupera en cuanto se vuelve
a comer.
Todos los procesos metabolicos en los que intervienen los glcidos
estn controlados por el sistema nervioso central, que a traves de la
insulina retira la glucosa de la sangre cuando su concentracion es
muy alta.
Existen otras hormonas, como el glucagon o la adrenalina, que tienen
el efecto contrario.
Los diabeticos son personas que, o bien han perdido la capacidad de
segregar insulina, o las celulas de sus tejidos no son capaces de
reconocerla. Los diabeticos no pueden utilizar ni retirar la glucosa de
la sangre, por lo que caen facilmente en estados de desnutricion
celular y estan expuestos a multiples afecciones.
COLORACIONES PARA EL GLUCGENO
Dentro de las tecnicas de tincion de carbohidratos, las mas
importantes son las que se destinan a la identificacion del glucogeno.

El glucogeno constituye la reserva energetica inmediata del

organismo, en tanto que las grasas son la reserva retardada de mas
dificil movilizacion.
Histologicamente el glucogeno se determinar por dos tecnicas:
No histoquimicas: Carmin de Best.
Histoquimicas: Reaccion del PAS.
Para la tincion de glucogeno se tienen que tener en cuenta una serie
de factores:
o No podemos utilizar soluciones que contengan demasiada agua, ya
que el glucogeno es soluble en ella. Normalmente emplearemos
soluciones de etanol al 80%, liquido de Carnoy (para visualizar
nucleos) o Bouin alcoholico. En ocasiones puede utilizarse el Bouin
normal, preferentemente enfriado a 4 C.
o En el proceso de hidratacion de los cortes hay que evitar la
disolucin del glucgeno para lo cual es recomendable realizar el
coloidinado de los portaobjetos con celoidina al 2% en alcohol eter.
Para ello introducimos las secciones de tejido en un coloidon elastico
que es permeable al agua y los colorantes pero impermeable al
glucogeno (debido a que su tamano molecular no permite su salida a
traves del coloidon). Con esto, por tanto, se conseguira la tincion de
la muestra sin que el componente diana, el glucogeno, escape del
tejido disuelto en agua.
Proceso tecnico de coloidonado:
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- Desparafinamos el corte en xilol
- Eliminamos el xilol con alcohol absoluto
- Bano de alcohol eter al 50%
- Sumergimos el porta en celoidina al 2%
- Endurecemos el coloidon adherido al porta pasandolo por alcohol al
70%

TECNICAS NO HISTOQUIMICAS
Carmin de best
Se utiliza para la deteccion de glucogeno en las biopsias de
endometrio, ya que si este esta presente o no podremos saber si se
ha iniciado o no la fase secretora post-ovulatoria.
Se trata de una coloracion de tipo regresiva, es decir, que primero se
sobrecolorea y luego se diferencia hasta alcanzar la tonalidad justa.

A veces esta tecnica puede ser no especfica y tenir otros elementos

por lo que para que esto no ocurra lo que hacemos es realizar
preparaciones control, que nos permitan saber si lo que se ha
coloreado es o no glucogeno.
En cuanto al procedimiento se procurar utilizar como fijador el Bouin
(alcoholico o normal), liquido de Carnoy y etanol al 80%.
Resultados:
Nucleos: Azul negruzco.
Glucogeno: Rojo.
Problemas que plantea la tecnica del carmin de best.
El carmin no es totalmente especfico del glucogeno sino que ademas
puede colorear el moco, la fibrina, los granulos de los mastocitos, etc.
Para solucionar este problema hay que realizar sistematicamente
preparaciones control.
Otra dificultad que presenta este metodo es el llamado fenomeno de
desplazamiento de sustancias, debido a la rapida penetracion de los
fijadores alcoholicos utilizados, que irrumpen bruscamente en el
interior de las celulas creando un gradiente de concentracion capaz
de desplazar al glucogeno del sitio donde originariamente se localiza,
provocando errores en la interpretacion.

9 COLORACIONES PARA LA MUCINA Y FIBRINA

La tecnica para mucina analizada en este capitulo tiene un interes
indudable porque es bastante especifica para el moco, aunque no
desvela su composicion exacta. Con ella se trata de identificar
globalmente la mucina ms que de conocer su naturaleza bioquimica,
para lo cual es imprescindible utilizar tecnicas histoquimicas.
Tcnica del mucicarmn de Mayer
Es una tecnica muy antigua (data de 1896) en la que se han ido
produciendo modificaciones con el paso del tiempo. En ella el
colorante fundamental es el carmin de origen natural.
Su mecanismo de actuacion es desconocido, pero se cree que al no
encontrarse puro el acido carmnico, sino estabilizado con sales de
magnesio y aluminio, estos cationes le conferiran caracter basico.
Dado que los mucopolisacridos acidos son componentes de las
mucinas, la coloracion sera posible por la interaccion de las cargas
negativas de los segundos con el carmin, que poseeria cargas
positivas (mecanismo electrostatico de tincion).
Resultados:

Mucina: Rojo.
Nucleos: Azul.
Cpsula del Criptococo: rojo.
Coloracion de la fibrina (segun Weigert)
La fibrina es el producto de la polimerizacion del fibrinogeno del
plasma sanguineo. En fases tempranas de formacion se observa como
delicada trama fibrilar o como masas amorfas intensamente
fucsinofilas con el tricromico de Masson.
En el curso de las colagenosis y enfermedades reumaticas se ha
observado en las paredes de los vasos sanguineos una sustancia
similar a la fibrina, que ha sido denominada fibrinoide, habiendose
postulado que se trata de fibrina en el ultimo estadio de su desarrollo.
Tanto la fibrina como el fibrinoide se colorean fuertemente de rojo con
la eosina y de amarillo con el Van Gieson, son moderadamente PAS
positivos y pueden demostrarse con la hematoxilina acida
fosfotngstica de Mallory.

FUNDAMENTO DE LA COLORACION DE WEIGERT PARA LA FIBRINA

La tcnica es una variable particular de la coloracion de Gram para
bacterias.
Como colorante se utiliza fundamentalmente el violeta de metilo o de
genciana. Este colorante es un derivado de la parafucsina y por lo
general contamina al verde de metilo.
El mecanismo de la coloracion no es bien conocido: al parecer, tras el
tratamiento con yodo que sigue a la aplicacion del colorante, se
constituiran abundantes enlaces disulfuro (S-S) a partir de los grupos
sulfhidrilos (-SH) adyacentes a la tirosina y el triptofano, a los cuales
se ligarian los restos de colorante atrapados en la malla fibrilar. La
utilizacion de un agente de diferenciacion tendria por objeto retirar el
violeta de genciana del tejido conjuntivo adyacente, donde podria
quedar retenido de forma semejante, todo ello procurando no
sobrediferenciar la fibrina mediante un control microscopico de la
coloracion.
La tcnica plantea otro problema aadido: su especificidad es muy
relativa, y puede colorear otras sustancias como la queratina o el
amiloide.
Resultados:
Fibrina y Bacterias Gram: Diversas tonalidades azules.
Restantes tejidos: de color rosado.

BASES HISTOQUMICAS DE LOS GLUCIDOS

Los hidratos de carbono o glcidos son polialcoholes oxidados
(polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas) que estan compuestos por
carbono, oxigeno e hidrogeno, estos dos en identica proporcion a la
del agua, es decir 2:1. Esta ltima condicion no es totalmente
indispensable puesto que algunas sustancias se clasifican hoy da
como hidratos de carbono en ausencia de ella y en base a su parecido
estructural con estos.
Los polisacaridos son glcidos de molecula muy voluminosa, formada
por la condensacion de muchas moleculas de monosacaridos (ms de
diez), con la correspondiente prdida de moleculas de agua y
constituyen el grupo de hidratos de carbono de mayor interes para el
tecnico de laboratorio. Entre ellos, y ademas de los polisacridos
simples como el glucogeno, destacan los polisacaridos complejos.
POLlSACRIDOS COMPLEJOS.
Se subdividen en tres grandes grupos: mucopolisacridos,
mucoprotenas y mucolpidos.
1- mucopolisacridos.
Los mucopolisacridos pueden dividirse en dos grupos:
Mucopolisacridos neutros.
Constituidos por un azcar (generalmente galactosa) y
acetilglucosamina, que con frecuencia se hallan unidos a una protena
formando glucoprotenas o mucoprotenas. Estas sustancias son PAS
positivas y, por lo anteriormente expuesto, se comportan de manera
semejante a las mucoprotenas.
Mucopolisacridos cidos.
Por hidrlisis originan siempre, adems de monosacridos,
hexosaminas (glcidos aminados), a veces cido urnico
(monosacrido con un grupo carboxlico en posicin 6, por ejemplo:
cido glucurnico, cido galacturnico, etc.) y casi siempre cido
sulfrico o fosfrico. El mucopolisacrido cido ms simple es el cido
hialurnico, que consta de unidades de disacrido
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polimerizadas (cido D-glucurnico y N-acetilglucosamina). Los
mucopolisacridos cidos (MPA) se clasifican, a su vez, en:
o MPA sencillos, carboximucopolisacridos o mucopolisacridos no
sulfatados. o MPA complejos o sulfatados (sulfomucopolisacridos).
2. Mucoprotenas

Son complejos de protenas y polisacridos en los que predomina el

primer componente. Son similares a las glucoprotenas, pero se
diferencian en su mayor contenido de hexosamina (superior al 4%).
Este tipo de sustancias pueden ser halladas en clulas beta de la
hipfisis, membranas basales, reticulina y fibras de colgena. Todas
ellas son PAS positivas y no experimentan metacromasia frente al
azul de toluidina.
3. Mucolpidos.
Son una mezcla de polisacridos y cidos grasos complejos que se
encuentran normalmente en forma de cerebrsidos y ganglisidos.
Suelen ser PAS positivos y se tien selectivamente con ciertas
coloraciones para grasas.
Reacciones histoqumicas basadas en la demostracin de grupos
carbonilo formados sobre los hidratos de carbono por oxidacin
previa: Tcnica del pas y de la plata metenamina
Reaccin del pas (Periodic Acid Schiff)
Es la reaccin ms comnmente utilizada en histoqumica debido a
que es de amplia aplicacin en el diagnstico histopatolgico
rutinario.
Puede colorear numerosos componentes bioqumicos (hidratos de
carbono o sustancias relacionadas con ellos).
Siendo una reaccin poco especfica, puede convertirse en
enormemente selectiva mediante los correspondientes controles.
FUNDAMENTO DE LA REACCION DEL PAS.
Consiste en oxidar los tejidos mediante el cido peridico para
incrementar el nmero de grupos carbonilos (aldehdos o cetonas, lo
que determina que el glcido sea aldosa o cetosa) presentes en ellos,
de forma que puedan ser demostrados posteriormente mediante el
reactivo de Schiff.
Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente
aislados, en una proporcin aproximada de uno por molcula de
monosacrido. Precisamente por ello es necesario oxidarlos con el fin
de incrementar dichos grupos, que slo pueden ser detectados por el
reactivo de Schiff si se
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encuentran situados en carbonos contiguos y delimitados por grupos
alcohlicos o amino.

Para los grupos aldehdos que aparecen en posicin 1,2 glicol estas
condiciones se cumplen exclusivamente tras la oxidacin de los
correspondientes radicales hidroxilo.
El agente oxidante es generalmente el cido peridico, aunque en
alguna variante puede utilizarse el cido crmico.
REACTIVO DE SCHIFF
Se obtiene a partir de la fucsina bsica, la cual es tratada con cido
sulfuroso, que hace desaparecer un doble enlace existente en el
centro de la molcula, transformndose en una sustancia incolora cido sulfofucsnico o reactivo de SchiffCuando el reactivo de Schiff reacciona con dos grupos aldehdicos
contiguos flanqueados por los correspondientes radicales -OH,
aparece de nuevo el doble enlace (grupo cromforo) y, con l, la
coloracin rojo-fucsia caracterstica.
Mediante estudios de espectrofotometra se ha podido concluir que,
para un correcto desarrollo de la reaccin, es necesario que ambos
grupos aldehdos se encuentren a una distancia cifrada entre 1 y 1.1
nm, similar a la que separa a los dos radicales bencnicos de la
fucsina.
Resultados:
Ncleos: Azul
Material PAS positivo: Rojo oscuro a magenta.
TCNICA DE LA PLATA METENAMINA
Radica en la reduccin que realiza los radicales carbonilo formados
por oxidacin previa de los hidratos de carbono, sobre las sales
complejas de plata, de forma que la plata metlica obtenida precipita
sobre las estructuras que se van a teir.
Como agentes oxidantes se emplean el cido crmico y el cido
perydico que, como es sabido, oxidan exclusivamente los enlaces
1,2 glicol y similares.
La sal de plata para reducir es el complejo metenamina argntica,
que es inestable y slo se mantiene como tal a pH alcalino entre 8.3 y
9.2; fuera de ste se disocia.
Por todo ello, la tcnica debe realizarse con un control continuo de
pH, de modo que la precipitacin de la plata metlica no ocurra
anticipadamente.
Por sus caractersticas especiales, est tcnica se emplea para
visualizar membranas basales, sobre todo en el rin
(glomerulonefritis), compuestas en gran medida por hidratos de
carbono del tipo

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glucoprotenas y que, por tanto, son adems PAS positivas.
Resultados: (mtodo Gomori modificado):
Glucgeno, mucinas: negro.
Hongos: negro
Membranas basales: negro
Fibras de reticulina y elsticas: negro.
3. PROTENAS. HISTOQUMICA DE PROTEINAS
Las protenas son las molculas que desempean un mayor nmero
de funciones en las clulas de todos los seres vivos. Por un lado,
forman parte de la estructura bsica de los tejidos (msculos,
tendones, piel, uas, etc.) y, por otro, desempean funciones
metablicas y reguladoras (asimilacin de nutrientes, transporte de
oxgeno y de grasas en la sangre, inactivacin de materiales txicos o
peligrosos, etc.). Tambin son los elementos que definen la identidad
de cada ser vivo, ya que son la base de la estructura del cdigo
gentico (ADN) y de los sistemas de reconocimiento de organismos
extraos en el sistema inmunitario.
Las protenas son molculas de gran tamao formadas por largas
cadenas lineales de sus elementos constitutivos propios: los
aminocidos.
Las protenas son macromolculas compuestas por C, H, O, N y a
veces otros elementos como S y P.
Confieren a cada especie su carcter gentico especfico.
Se han identificado 20 aminocidos que forman las protenas, de los
que 8 son esenciales o no sintetizables por el organismo humano
adulto: isoleucina, leucina, lisina, fenilalanina, treonina, metionina,
triptfano y valina. En los nios, adems, se incluye la histidina.
Se llama protena compleja, o de alto valor biolgico, a aquella que
contiene todos los aminocidos esenciales. Las de origen animal
tienen mayor calidad que las vegetales.
3.1 CLASIFICACIN DE LAS PROTENAS
Las protenas se dividen en:
Simples u holoprotenas: albminas, globulinas, fibrilares y
conjugadas. Las protenas simples producen nicamente aminocidos
cuando se hidrolizan.

Complejas o heteroprotenas: fosfoproteinas, glucoproteinas,

lipoprotenas, cromoproteinas, nucleoproteinas.
14
Las protenas simples u holoproteinas se clasifican en:
o Protenas filamentosas o escleroprotenas: tienen forma alargada, y
son insolubles en agua. Resisten la accin de enzimas proteolticos.
Las ms importantes son: colgeno, elastina, queratina.
o Protenas globulares: Son de forma esfrica, solubles en agua o en
disoluciones polares. Poseen una gran actividad biolgica.
Las protenas globulares ms importantes son:
- Albminas: Constituyen la fraccin principal de las protenas
plasmticas.
Regulan la presin osmtica de la sangre y constituyen la reserva
principal de protenas en el organismo.
Su capacidad para unirse reversiblemente con otras sustancias, hace
que desempeen un papel importante como transportadoras de
hormonas, cidos grasos, bilirrubina, etc. Entre ellas podemos
destacar la ovoalbmina de la clara de huevo, la seroalbmina y la
lactoalbmina de la leche.
Esta hormona aumenta en deshidrataciones y disminuye en
desnutricin y enfermedades hepticas.
- Globulinas: Poseen un elevado peso molecular. Incluyen las
seroglobulinas, entre las que cabe citar las -globulinas, -globulinas
y -globulinas, denominadas tambin anticuerpos.
4. ESTUDIOS DE LOS AMINOCIDOS
Los aminocidos son un conjunto de molculas que presentan la
caracterstica comn de tener un tomo de carbono al cual se unen
un radical amino (-NH2), un radical cido (-COOH), un hidrogeno (-H)
y un grupo R que puede ser mas o menos simple, lo que le da las
caractersticas a cada aminocido, as como su nombre. R puede ser
un hidrogeno como es el caso de la glicina, o un radical -CH3 como es
el caso de la alanina.
Existen muchos aminocidos pero los que forman parte de las
protenas son 20.
Dependiendo del grupo -R los aminocidos pueden ser hidrfobos o
no polares, es decir, no presentan carga elctrica o polares. Estos se
dividen, a su vez, en: sin carga o neutros, son mas solubles en agua
que los hidrfobos. Cargados positivamente, son aquellos que a pH 7
presentan carga positiva. Cargados negativamente, son aquellos que
a pH 7 presentan carga negativa.
15

El organismo cubre sus necesidades de aminocidos a travs de los

aportados en la dieta. Los aminocidos pueden ser esenciales y no
esenciales. Decimos que un aminocidos es esencial cuando el
organismo no es capaz de sintetizarlo, por lo que obligatoriamente
habr que ser aportado con la dieta, ya que su carencia da lugar a
determinadas enfermedades, y decimos que un aa es no esencial
cuando el organismo es capaz de sintetizarlo a partir de otros
componentes, lo cual hace cuando el aporte en la dieta es suficiente
Los aminocidos se unen unos a otros para formar la estructura
primaria de la protena, la forma de hacerlo es la unin del grupo
amino de un aminocidos con el grupo cido del siguiente, con
liberacin de una molcula de agua, y as sucesivamente,
presentando al final de la protena un
16
amino-terminal o N-termino y otro carboxi-terminal o C-termino.
Abreviadamente una protena podra estar compuesta de la siguiente
secuencia: Ala-Lys-Val-Leu-Cys-Cys-Trp-Cys-Met-Met-Pro-Ala
La estructura primaria as creada puede sufrir, respecto a su eje, una
rotacin dando una hlice, o puede plegarse haciendo un zig-zag,
como una hoja plegada; es lo que constituye la estructura secundaria.
Su disposicin espacial constituye la estructura terciaria.
Si nuestro ejemplar presentase otra u otras cadenas, la disposicin en
el espacio de una cadena con respecto a la otra constituira la
estructura cuaternaria, siendo su configuracin el aspecto global que
la protena proporciona.
La asociacin de protenas con otros tipos de biomolculas para
formar asociaciones supramoleculares dan lugar a la estructura
quinaria.
17
Una protena media est formada por unos cien o doscientos
aminocidos alineados, lo que da lugar a un nmero de posibles
combinaciones diferentes realmente abrumador (en teora 20200
combinaciones).
Y por si esto fuera poco, segn la configuracin espacial
tridimensional que adopte una determinada secuencia de
aminocidos, sus propiedades pueden ser totalmente diferentes.
Tanto los glcidos como los lpidos tienen una estructura
relativamente simple comparada con la complejidad y diversidad de
las protenas.
5. FIJACIN DE PROTENAS

Como el estudio histoqumico de las protenas suele realizarse sobre

material fijado e incluido en parafina, hay que tener en cuenta las
modificaciones que dichos mtodos pueden producir sobre las
cadenas polipeptdicas.
Podra pensarse, por ello; que la fijacin formlica est contraindicada
a causa de su accin reticularizadora sobre las cadenas polipeptdicas
y bloqueante de numerosos grupos activos. Sin embargo, no ocurre
as, ya que dichos bloqueos suelen ser reversibles tras el tratamiento
con alcoholes y lquidos intermediarios en el proceso de inclusin,
sobre todo cuando el tiempo de fijacin no se ha prolongado en
exceso.
Por el contrario el alcohol etlico, que fija las protenas por
precipitacin y mantiene intacto su potencial qumico, no es
aconsejable porque conserva muy pobremente la arquitectura tisular.
Los fijadores que contienen metales pesados como por ejemplo el
tetrxido de osmio, est igualmente contraindicado, pues bloquean
numerosos grupos qumicos activos de las protenas.
Las proteasas son enzimas susceptibles de realizar, en condiciones
adecuadas, la degradacin por va hidroltica de las molculas
proteicas a polipptidos ms sencillos. Estos suelen presentar mayor
proporcin de radicales qumicos libres que la molcula original, sobre
todo teniendo en cuenta que la fijacin reticulariza las cadenas y
enmascara total o parcialmente los grupos qumicos particulares de
cada uno de los aminocidos que constituyen la protena.
El empleo de la digestin enzimtica es, por tanto, de gran utilidad,
pues permite incrementar de forma notable la intensidad de la
reaccin de ciertos grupos especficos de las protenas, as como
desenmascarar determinantes antignicos ocultos en tejidos fijados e
incluidos en parafina.
Las principales proteasas utilizadas en histoqumica son:
PEPSINA: es la enzima proteoltica del jugo gstrico, segregada por las
clulas principales de las glndulas fndicas del estmago. Su pH de
actuacin ptimo se sita entre 1.5 y 2. Ataca a la mayor parte de las
protenas.
TRIPSINA: es la proteasa caracterstica del pncreas. Su pH ptimo de
actuacin es 7 -8. 18
5.1 APLICACIN DE LOS MTODOS DE DIGESTIN ENZIMTICA AL
ESTUDIO HISTOQUMICO DE LAS PROTEINAS
Acta sobre casi todas las protenas, aunque su efecto hidroltico
mejora si se encuentran previamente desnaturalizadas.
PRONASA: es una proteasa aislada del Streptomyces griseus, con
un espectro de actuacin semejante al de la tripsina, a la cual

sustituye con ventaja en la mayor parte de los procedimientos

tcnicos.
Desde la introduccin de los mtodos inmunohistoqumicos que
permiten caracterizar antignicamente a la mayor parte de las
protenas, todos los mtodos de coloracin puramente histoqumicos
para protenas cada vez son menos utilizados.
De forma genrica, las tcnicas histoqumicas para colorear protenas
pueden clasificarse en tres grupos:
Reacciones generales: pretenden colorear globalmente a las protenas
presentes en un tejido, identificndolas como tales. Por ejemplo se
realiza el tratamiento del tejido con sulfato de cobre muy diluido en
medio bsico (NaOH), donde se produce la aparicin de un color rosamalva, debido a la formacin de un complejo cupro-alcalino a nivel
del enlace peptdico.
Reacciones de grupo: pretenden caracterizar no la molcula proteica
globalmente, sino un corto nmero de grupos reactivos especficos de
dichas sustancias.
Reacciones especficas para grupos qumicos particulares, propios de
determinados aminocidos como grupos sulfhdrico, fenol, indol,
guanidil, etc. Cada uno de ellos puede estar presente o ausente en
una protena concreta, por lo que estas reacciones pueden ser
utilizadas para investigar su composicin exacta.
5.2 MTODOS HISTOQUMICOS PARA LA COLORACIN DE LAS
PROTENAS
19
Reacciones de grupo:
Como se ha sealado, tratan de establecer la naturaleza proteica de
una determinada sustancia a partir de la demostracin en ellas de
ciertos grupos qumicos, que se encuentran de forma casi exclusiva
en los polipptidos.
Las reacciones ms utilizadas son las de la ninhidrina-Schiff.
1- Reaccin de la Ninhidrina-schiff
Esta tcnica se basa en un proceso de desaminacin oxidativa de las
cadenas polipeptdicas provocado por la ninhidrina, por el cual los
grupos aminos de las cadenas son sustituidos por grupos carbonilos.
Tras este proceso se realiza la determinacin de los carbonilos
neoformados mediante el reactivo de Schiff, al igual que en la tcnica
del PAS.
Resultados:
Grupos aminos: rojo- prpura.

La historia de su conocimiento comienza en el ao 1869, cuando el

cientfico Frederick Miescher descubri en el ncleo de las clulas una
sustancia de carcter cido a la que llamo cido nuclico.
En los aos veinte, el qumico alemn Robert Feulgen, utilizando una
tincin especifica, descubri que el ADN estaba situado en los
cromosomas.
En 1944 Avery, McCleod y McCarty comprueban que el ADN es el
portador de la informacin gentica.
En 1953 Watson y Crick revelan la estructura del ADN como una doble
hlice complementaria que recuerda la estructura de una escalera de
caracol.
El ADN se considera como el cerebro celular que regula el nmero y la
naturaleza de cada tipo de estructura del organismo y composicin
celular, transmitiendo la informacin hereditaria y determinando la
estructura de las protenas, que a travs de las enzimas determinar
el resto de funciones celulares.
A finales del siglo pasado se descubri tambin la existencia de una
segunda clase de cido nuclico, denominado cido ribonucleico
(ARN). El ARN se encuentra tanto en el ncleo (nucleolo) como en el
citoplasma de las clulas.
Ambos tipos de cido nuclico, ADN y ARN, se encuentran
simultneamente en eucariota (clulas con membrana nuclear) y
procariotas (bacterias), y en virus slo encontramos una de las dos
cadenas.
6. CIDOS NUCLEICOS. HISTOQUMICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS
20
Los cidos nuclicos (ADN y ARN) estn constituidos por nucletidos.
Estructura de un nucletido simple:
En los nucletidos podemos hablar de la existencia de tres elementos:
Molcula de azcar:
o Ribosa, en el caso del ARN.
o Desoxirribosa, en el caso del ADN.
Base orgnica nitrogenada:
o Adenina, guanina (bases pricas), citosina y timidina (bases
pirimidnicas) en el caso del ADN. o Adenina, guanina, citosina y
uracilo, en el caso del ARN.
Grupos fosfatos:
Los nucletidos se unen formando cadenas cuyo esqueleto est
formado por la unin entre un azcar de un nucletido y el fosfato del
siguiente, quedando las bases nitrogenadas en la parte central,

unidas cada una al C1 del azcar. Estas bases son las que miden
especificad al cido nuclico.
Estructura del ADN.
Estructura primaria.
Viene dada por la secuencia de nucletidos.
Cuando se quiere representar la secuencia de un oligonucletido o de
un cido nuclico, se hace mediante la terminologa de cada una de
las bases.
Ejemplo:
5 - ATTACGGATTCCAACGTAACCGGTACTGAT-3
Esta secuencia representara un oligonucletido de 30 bases.
El orden de la secuencia es fundamental, ya que en ella reside la
informacin contenida en el cido nuclico; la orientacin viene dada
en el sentido 5 -3 o 3 -5 . El 5 representa el extremo terminal del
fosfato y el 3 el extremo final del tomo de carbono de la
desoxirribosa.
Estructura secundaria.
La estructura secundaria es la doble hlice antiparalela cuyo
esqueleto fundamental est formado por las cadenas de azcarfosfato, quedando en la parte central las bases, enfrentadas las de
una cadena con las de la otra complementaria y formando entre si
puentes de hidrgeno, factor que da la estabilidad a la doble hlice.
El enfrentamiento de bases es constante; la adenina siempre se
enfrenta con la timina y entre si se forman dos puentes de hidrgeno,
y la guanina con la citosina, formndose entre ambas tres puentes de
hidrgeno.
Esta caracterstica provoca que las dos cadenas sean
complementarias. Ambas tienen sentidos opuestos, mientras una va
en sentido 5 -3 , la otra lo hace en sentido 3 -5 . Por eso el ADN es
una hlice antiparalela.
Estructura terciaria y cuaternaria.
21
Teniendo en cuenta que la longitud de una hebra de ADN es de varios
metros, por necesidad debe adoptar otras estructuras para poder
estar en el interior celular. Estas estructuras, terciaria y cuaternaria,
permiten el empaquetamiento del ADN formando los cromosomas.
En las clulas eucariotas existen varios cromosomas, y las procariotas
existe un ADN empaquetado denominado seudocromosoma.
6.1 ESTRUCTURA DEL ARN

El ARN generalmente es unicatenario, es decir, formado por una sola

cadena de nucletidos, aunque existen algunos virus con cadena de
ARN bicatenaria.
Los cidos ribonucleicos no slo pueden tener la informacin propia,
sino que constituyen la herramienta para la conversin de la
informacin contenida en el ADN en protenas especficas.
7. FUNCIONES DE LOS CIDOS NUCLEICOS
ADN: su principal funcin consiste en la conservacin de la
informacin de la clula u organismo que lo contiene y la transmisin
de esta informacin al replicarse.
ARN: en algunos virus su funcin es contener y transmitir
informacin. Pero su trabajo ms importante consiste en la
conservacin de la informacin contenida en el ADN en protenas
especficas.
8. EXTRACCIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS
Existen muchos mtodos de extraccin de cidos nuclicos, y entre
ellos hay que seleccionar el ms apropiado.
Cualquier mtodo de extraccin de cidos nuclicos, para ser bueno
ha de cumplir las siguientes condiciones:
Rpido
Alto rendimiento.
Que implique la mnima manipulacin posible.
8.1 PROCEDIMIENTOS PARA LA EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS
EXTRACCION DEL ADN.
Suelen utilizarse la hidrlisis cida con cido perclrico o
tricloroactico. En el primer caso se emplea en concentracin del 5%
y a 70 oC durante 20 minutos, seguido de neutralizacin en carbonato
sdico al 1%
22
durante 5 minutos y lavado en agua corriente tambin durante 5
minutos. El cido tricloroactico se emplea al 5%, a 90 oC, durante 15
minutos; a continuacin se lava en agua corriente otros 5 minutos.
EXTRACCION DEL ARN.
Puede aplicarse la hidrlisis en cido perclrico al 5 % y a 4 oC
durante 4-18 horas, la cual extrae selectivamente el ARN preservando
al ADN, o bien la extraccin mediante ribonucleasa al 0.01% a 37 oC
durante 1 hora.

Estas tcnicas se aplican para visualizar el ncleo. El mtodo ms

utilizado es la REACCIN DE FEULGEN:
Este procedimiento de coloracin se realiza en dos fases
consecutivas: Hidrlisis cida del ADN:
Con ella se pretende, mediante la actuacin del cido clorhdrico,
romper la estructura del ADN por el lugar en que la pentosa se une a
la base nitrogenada, de forma que sobre cada molcula de azcar
reaparezca un grupo carbonilo. Estos grupos se encuentran situados
precisamente a una distancia de entre 1 y 1.1 nm.
Demostracin de los grupos carbonilos formados mediante el
reactivo de Schiff, de forma anloga a la descrita para la reaccin del
PAS.
El ARN no puede ser detectado por el reactivo de Schiff tras la
realizacin de una hidrlisis cida, puesto que los grupos carbonilos
no estn situados a una distancia de entre 1 y 1.1 nm y, por tanto, no
se produce la reaccin con el cido sulfofucsdico.
Resultados:
o ADN: rojo - prpura. o Citoplasmas: verde.
Problemas generales de la reaccin de Feulgen.
Hidrlisis excesiva
El cido clorhdrico es un cido fuerte y, si se prolonga excesivamente
el tiempo de hidrlisis disgrega la molcula de ADN en su totalidad
impidiendo su posterior deteccin, adems de romper los enlaces que
unen las bases nitrogenadas a la pentosa. Por ello el aspecto ms
importante de la tcnica es el tiempo de hidrlisis, que vara mucho
segn el fijador utilizado.
Envejecimiento del reactivo de Schiff
En condiciones normales, el reactivo de Schiff es incoloro; la aparicin
de una tonalidad rosada por liberacin de fucsina indica
envejecimiento y, por tanto, que debe desecharse, puesto que el
envejecimiento lo hace inservible para detectar grupos carbonilos.
8.2 TCNICAS HISTOQUMICAS QUE PERMITEN SEPARAR DEL ADN DE
OTRAS ESTRUCTURAS
23
8.3 TCNICAS PARA DISTINGUIR EL ARN DEL ADN: VERDE METILOPIRONINA
Desde que fue introducido por Unna en 1910, el mtodo del verde de
metilo-pironina ha experimentado numerosas modificaciones,

principalmente a causa de la gran irregularidad de la coloracin que

produce.
Este mtodo se utiliza para detectar clulas con gran capacidad de
sntesis de protenas y, por tanto, ricas en ARN ribosmico, como, por
ejemplo, las clulas plasmticas productoras de inmunoglobulinas y
sus precursores inmediatos.
El mecanismo de tincin radica en la atraccin electrosttica que se
produce entre los colorantes bsicos, verde metilo y pironina y los
cidos nuclicos, en unas condiciones adecuadas de pH (debe
realizarse a pH 5).
La tcnica de verde metilo-pironina posee un fundamento sencillo,
pero son difciles las preparaciones de sus componentes, el modo de
operar y la inconstancia de sus resultados. Es por ello que existen
distintas variantes como la de Brachet, la de Papenheim-Unna, la de
Lison y la de Jordan Barket.
Colorante Verde metilo-pironina.
Es especfico para el ADN en diversos tejidos.
La pironina, con la que se combina, no es totalmente especfica para
teir el ARN, por ello se controla el procedimiento utilizando la
ribonucleasa (en este caso el corte control se incuba en la solucin de
ribonucleasa, y el otro corte se sumerge en una solucin tampn sin
enzima).
El verde de metilo suele estar contaminado con violeta de metilo, y
pueden separarse dependiendo de la solubilidad, decantndose en
una solucin acuosa de cloroformo, ya que el cristal violeta es soluble
en ste y el verde de metilo no. Al utilizar esta tcnica el ADN da una
tonalidad verde azulada y el ARN se presenta de color rosa a rojo.
Se debe tener en cuenta, a la hora de la tincin:
El cuidado con la amortiguacin del color rojo de la pironina en el
momento de deshidratar los cortes, ya que el alcohol etlico disuelve
a la pironina.
El pH, que debe ser constante y prximo a 5.
Que el verde de metilo no es un colorante puro y est contaminado
con el violeta cristal,
debindose purificar por decantacin.
Resultados:
o Ncleos: Verde (ADN)
o Citoplasmas: rojo (ARN)
Controles en las tcnicas de verde de metilo-pironina

 Hidrlisis clorhdrica: pretende destruir los cidos nuclicos

mediante el cido clorhdrico,
con lo que se descartan los falso-positivos (sustancias que se
colorean sin corresponder a
24
cidos nuclicos).
Test de Brachet: digestin de ARN con ribonucleasa.
PIGMENTOS
Aunque los pigmentos son sustancias coloreadas que existen de
forma natural, es decir, que por s mismas tienen color, los tcnicos
de laboratorio deben realizar con frecuencia tcnicas especficas para
identificar un determinado pigmento detectado en una preparacin
histolgica teida con hematoxilina-eosina.
Tipos de pigmentos:
ARTEF ACTUALES
Son aquellos que aparecen a consecuencia de la aplicacin,
generalmente incorrecta, de determinadas tcnicas histolgicas, por
ejemplo: el pigmento formlico, depsitos de sales de mercurio,
depsitos de cromo, precipitados de plata, etc.
PIGMENTOS EXGENOS
Son aquellos que, procedentes del medio ambiental, penetran en el
organismo y originan una coloracin particular de los tejidos, que
puede acompaar o no a una patologa subyacente en ellos. Por
ejemplo: pigmentacin por inhalacin del humo del tabaco, polvo de
carbn, de metales, slice, etc.
En los dos primeros casos, la sustancia depositada se suele
denominar pigmento antractico.
Otros tipos de pigmentacin exgena ocurren por ingestin de
carotenos, que estn presentes en las zanahorias y verduras y a cuyo
grupo pertenece la vitamina A, responsable de la coloracin
amarillenta de la piel de los esquimales, indios, etc, o por accin de
ciertos agentes teraputicos como sales de oro, ciertas inyecciones
de extractos hepticos, etc. Los ejemplos ms corrientes de
pigmentacin exgena son los tatuajes.
PIGMENTOS ENDGENOS
Son sustancias coloreadas presentes en los tejidos y elaboradas por el
propio organismo a partir de materiales procedentes del catabolismo,
degradacin o sntesis de diferentes elementos.
Estos pigmentos pueden clasificarse en dos grupos:

 Pigmentos hemoglobingenos: proceden de la degradacin y

destruccin fisiolgica o patolgica de la molcula de hemoglobina,
estos son:
9. MINERALES Y PIGMENTOS. TCNICAS PARA LA IDENTIFICACIN Y
TINCIN DE PIGMENTOS E IONES METLICOS
25
o La propia hemoglobina. o hemosiderina.
o hemofucsina.
o hematoidina.
o bilirrubina.
Pigmentos no hemoglobingenos:
o Melanina.
o Lipofucsina. o Ceroide.
o Cobre.
El problema que plantean la mayor parte de los pigmentos, a
excepcin de la hemoglobina, es la similitud de su color, normalmente
pardo. Este hecho hace imprescindible su identificacin mediante
diferenciacin histoqumica.
TCNICAS PARA LA DETERMINACIN DE PIGMENTOS
HEMOGLOBINGENOS
HEMOGLOBINA
Es el pigmento de este grupo que aparece con mayor frecuencia en
los tejidos normales, principalmente en el interior de los hemates.
En condiciones patolgicas se observa en forma de granulaciones
amarillo-doradas, sobre todo formando parte de cilindros tubulares
del rin. Es soluble en agua y se diluye fcilmente en alcohol etlico.
Tcnicas histoqumicas para determinar hemoglobina: Tcnica de la
bencidina
Es tambin conocida con el nombre de reaccin pseudoperoxidsica
porque la hemoglobina se comporta de forma parecida a esta enzima.
Est basado en que la hemoglobina es capaz de liberar oxgeno a
partir de agua oxigenada, de forma que la hemoglobina oxida a la
bencidina incolora hacia benzo-purpurina de color verde.
En la actualidad, esta tcnica ha sido sustituida por el mtodo de la
diaminobencidina.
Resultados:
Ncleos: Azules.

Hemoglobina y eritrocitos: verde.

Mtodos hitoqumicos para la demostracin del hierro y pigmentos
que lo con tienen
(Hemosiderina)
HEMOSIDERINA
Es un pigmento proteico de color amarillo dorado o parduzco que
contiene hidrxido frrico y 26
aparece en forma de acmulos o granulaciones generalmente
situadas en el interior de macrfagos. Es soluble en cidos, incluso
tras su fijacin, e insoluble en lcalis, alcohol y agua.
En el interior de los tejidos el hierro puede depositarse de dos formas:
inica o formando sales ferrosas y frricas, por lo comn en forma de
cloruros o hidrxidos.
como hierro ligado a protenas o hierro enmascarado, este hierro no
puede detectarse directamente, por ello es necesario someterlo a un
proceso previo de desenmascaramiento mediante el cual lo
transformamos en hierro inico.
Entre los procedimientos para detectar hierro inico, hay que
destacar fundamentalmente tres tcnicas: tcnica de azul de Perls
para hierro frrico, Tcnica de azul de Turnbull para hierro ferroso y
Tcnica de Tirmann-Schmeltzer para ambos en general.
TCNICA PARA DETECTAR IONES FRRICOS
TCNICA DEL AZUL DE PERLS
Es la tcnica de mayor importancia para detectar hierro, ya que el
hierro frrico es el ms frecuente en los tejidos.
Se basa en la propiedad que tiene el ferrocianuro potsico para
transformarse, en presencia de hierro frrico (cloruro frrico o
similar), en ferrocianuro frrico o azul de Prusia, de color azul por
accin del cido clorhdrico que acta como desencadenante de la
reaccin.
Resultados:
Hierro frrico incluido la hemosiderina: Azul.
Ncleos: rojo.
TECNICA PARA DEMOSTRAR HIERRO FERROSO. TCNICA DEL AZUL DE
TURNBULL.
Es una tcnica que en la actualidad es de escasa utilidad.
Se basa en la reaccin que ocurre al poner en contacto el prusiato
rojo o ferricianuro potsico y el cido clorhdrico en contacto con el

cloruro ferroso existente en el tejido, de forma que se produce

ferricianuro ferroso o azul de Turnbull, tambin de color azul.
27
MTODO DE TIRMANN-SMELTZER
Consiste en transformar el hierro frrico, por accin del sulfuro de
amonio, en hierro ferroso para realizar despus la tcnica de Turnbull
y colorear simultneamente ambos iones.
Resultados:
Hierro inico total: Azul.
Ncleos: Rojo.
MTODOS PARA DETECTAR HIERRO LIGADO A PROTENAS.
Estas tcnicas se basan en desenmascarar el hierro mediante
tratamiento del tejido con cido sulfrico al 4% en etanol de 96%, de
30 minutos a 2 horas, de forma que el hierro ligado a las protenas
pasa a hierro frrico o ferroso, el cual puede ser determinado por
alguna de la tcnicas anteriores.
Tcnicas para la deteccin de hematoidina y bilirrubina
La hematoidina y la bilirrubina son dos pigmentos muy similares y,
por tanto, difciles de diferenciar, pero si es fcil separarlos
conjuntamente de los dems pigmentos.
La hematoidina es un pigmento derivado de la descomposicin de la
hemoglobina, no contiene hierro y es de color amarillo parduzco.
La bilirrubina procede de la desintegracin de la hematoidina y otros
pigmentos intermediarios producidos en la degradacin de la
hemoglobina, de la cual es resultado final.
El mtodo de coloracin ms simple para la determinacin conjunta
de ambos pigmentos es la tcnica de Gmelin.
Adems, la bilirrubina puede determinarse de forma especfica
mediante el mtodo de Hall.
Tcnica de Gmelin
Se fundamenta en hacer reaccionar la hematoidina o la bilirrubina con
cido ntrico para producir otros pigmentos diferentes: estos
pigmentos siguen la secuencia degradativa normal de los pigmentos
hemoglobingenos hasta producir bilicianina y biliverdina, que tienen
un color verde azulado caracterstico.
Resultados:

La bilirrubina y la hematoidina se van transformando y cambian de

color, de amarillo parduzco a
28
verde, azul y, finalmente, rojo-prpura.
Tcnica de Hall para la bilirrubina:
TCNICAS PARA LA DEMOSTRACIN DE PIGMENTOS NO
HEMOGLOBINGENO
Mtodo para determinar melanina
Tcnica de argentafinidad de Masson-Fontana.
Mtodos histoenzimticos que detectan la actividad de la enzima
DOPA-oxidasa (enzima de
los melanocitos).
Mtodos que emplean fluorescencia.
Tcnica de blanqueamiento de melanina: es la ms utilizada
Tcnica del blanqueamiento de la melanina.
Est basada en la propiedad que tienen los oxidantes fuertes para
decolorar el pigmento melnico. Como sustancias oxidantes se
utilizan el permanganato potsico y el agua oxigenada.
Tcnica histoenzimolgica de la DOPA-oxidasa.
Determina la actividad enzimtica de esta enzima en los
melanosomas, que son granulaciones
29
citoplasmticas que producen melanina.
En esta tcnica la presencia de actividad DOPA-oxidasa se detecta por
un color negro parduzco, mientras que los ncleos aparecen de color
rojo o verde.
Tcnicas para determinar lipofucsina y pigmento ceroide
La lipofucsina es un pigmento de desgaste presente en las clulas
envejecidas del miocardio, hgado, sistema nervioso perifrico,
testculos y glndulas suprarrenales.
El pigmento ceroide es dorado de consistencia crea que aparece en
algunos hgados cirrticos, sistema nervioso y msculo.
Para la coloracin de ambos pigmentos se utilizan las siguientes
tcnicas:

 Tcnica del PAS: la lipofucsina es PAS positiva, pues contiene restos

de hidratos de carbono.
Tcnica de Schmorl: esta tcnica no slo tie lipofucsina, se
colorean tambin la melanina, las clulas argentafines y cromafines y
el pigmento biliar. En este caso los resultados que se obtienen son,
lipofucsina, melanina, pigmento biliar, hematoidina, clulas
argentafines y cromafines y grupos sulfhdrilos, aparecen de distintos
tonos de azul.
Tcnicas de lpidos: sudn negro y azul de nilo. Esto es debido a que
la lipofucsina contienen lpidos en su composicin.
TCNICAS PARA DETERMINAR CALCIO
Las sales de calcio estn presentes normalmente en los huesos y
dientes, aunque en ocasiones tambin aparecen reas de
calcificacin en tejidos desprovistos de ellas.
En general, las sales que con mayor frecuencia se depositan son
carbonatos, oxalatos y fosfatos, cuya caracterstica comn es una
intensa apetencia por los hemalumbres que las colorean de azul.
Los mtodos especficos para la identificacin de sales de calcio,
consisten en la sustitucin de los iones de calcio sobre sus sales por
otros iones metlicos, esencialmente plata o cobalto (mtodos de Von
Kossa y del sulfuro de cobalto).
Mtodo de impregnacin argentica de Von Kossa para ines clcicos
Existen numerosas modificaciones de la tcnica clsica de Von Kossa
para la determinacin de calcio.
En general, todas ellas se basan en producir la sustitucin de los
iones clcicos intratisulares, en forma de fosfatos o carbonatos, por
iones de plata en solucin acuosa sometidos a un proceso simultneo
de exposicin a la luz solar.
La exposicin a la luz solar puede ser sustituida por una incubacin
con la solucin de plata en la oscuridad, para realizar despus una
severa reduccin externa con un agente qumico, de tal forma que se
deposita gran cantidad de plata metlica sobre los ncleos en forma
de precipitacin donde los
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iones argnticos han sustituido el calcio.
Debido a ello, los depsitos iniciales de calcio se colorean de negro.
Puede decirse, en consecuencia, que lo detectado mediante la tcnica
de Von Kossa son los iones fosfatos y carbonatos, que en el organismo
humano se encuentran ligados casi exclusivamente al calcio.

Las variantes que contemplan una reduccin qumica en lugar de la

producida por la radiacin solar acrecientan por lo general el depsito
de plata metlica cuando la cantidad de iones clcicos es mnima.
Por este motivo, el primer mtodo (Von Kossa original) se prefiere
para realizar la coloracin de tejido seo sin decalcificar, y el ltimo,
ms sensible, para la determinacin de microcalcificaciones.
Resultados:
Hueso mineralizado y calcificaciones: negro.
Osteoide y ncleo: rojo.
En el caso de la variante de Von Kossa en oscuridad los resultados
que se obtienen son los
siguientes:
Depsitos clcicos: negro.
Restantes tejidos: amarillo dorado.
Tcnica para determinar el cobre
Este metal se encuentra presente de forma casi exclusiva en el
hgado y otros rganos, fundamentalmente crnea y ganglios
nerviosos de pacientes con enfermedad de Wilson. En ocasiones se
encuentra presente en algunas cirrosis hepticas, aunque en muy
escasa proporcin.
Puede determinarse a travs de su unin con el cido rubenico, por
el que presenta gran apetencia.
Resultados:
Depsito de cobre: granulaciones verdes a negras.
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