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TCNICAS DE DESINFESTACIN Y SIEMBRA in vitro DE EMBRIONES

MADUROS DE FALSO PEYOTE (Ariocarpus fissuratus var. fissuratus


(Eng.) Shumann), (Cactaceae).
A. Medel-Narvez1; A. Flores-Hernndez1; S. Armendriz-Erivez1 y E. Santamara-Csar1.
1

Unidad Regional Universitaria de Zonas ridas. Universidad Autnoma Chapingo. Apartado Postal 8. Bermejillo, Dgo. 35230, Mxico.
moncho08@yahoo.com

RESUMEN
La cactofilia ha provocado que Ariocarpus fissuratus var. fissuratus est en la lista de especies en peligro de extincin. Existen
inconvenientes para propagar esta especie, por lo que se pretende buscar nuevas alternativas para incrementar su nmero y evitar su
desaparicin. El objetivo fue obtener una tcnica para propiciar la rpida emergencia de plntulas en condiciones aspticas. Para ello se
evaluaron 8 variantes de desinfestacin de la semilla, cinco medios de cultivo utilizando arena como sustrato y MS-62 en diferentes
concentraciones (0, 25, 50 y 100 %) y dos tipos de siembra. Se evalu la incidencia de contaminantes, rapidez y porcentaje de germinacin.
El anlisis de varianza en ambas pruebas mostr que solo hay significancia entre los factores tcnica de desinfeccin y tipo de siembra,
pero no en los medios de cultivo. Se adopt la tcnica de desinfestacin con ms xito, la siembra de embriones maduros y la utilizacin de
arena como medio de soporte para inducir la germinacin de la especie.
Palabras clave: Cactceas, contaminacin, germinacin.

SUMMARY
The extensive use of cactus as ornament plants has caused that some species, such as A. fissuratus var. fissuratus are in great risk of
extinction. A. fissuratus has several problems to be propagated. Therefore, it is important to explore alternative ways that allow increase its
abundance and avoid its disappearance. The objective of this study was to obtain a method for inducing fast emergence of seedlings under
aseptic conditions. Eight seed disinfestations methods, five MS-62-derived culture media (0, 25, 50 and 100%), and two sowing techniques
(embryo and seeds) were tested. Rate and percentage of germination and incidence of contaminant agents were measured. The analysis of
variance showed significant differences for disinfestation and sowing methods. The best disinfestation method for mature embryos cultured
in sand were adopted to induce germination of this species.
Key words: Cactus, contamination, germination.

INTRODUCCIN
Las cactceas por la hermosura de sus
flores y formas bizarras, han sido objeto de una
nefasta cactofilia. Desde el siglo pasado los
traficantes extranjeros en plantas, las han
arrancado de su hbitat exportndolas por
toneladas para su venta. El saqueo ha sido tan
brutal que muchas especies como Ariocarpus
fissuratus var. fissuratus estn siendo amenazadas
(Franco, 1997) y muchas mas estn en peligro de
extincin (Bravo-Hollis, 1997).
Esta especie se ha catalogado como
endmica del estado de Coahuila (Bravo y
Snchez, 1991), pero se ha encontrado una colonia
de esta especie en las sierras de Bermejillo, al

Noreste del estado de Dgo.; razn por la que se


pretende dar a conocer la existencia de A.
fissuratus var. fissuratus en este estado.
La tcnica de desinfestacin de la semilla
para la siembra de embriones maduros es una
tcnica
prometedora
para
inducir
rpida
germinacin y plntulas libres de patgenos,
adems de tener bajos costos y estar al alcance de
los viveristas.
Los cactus pueden ser reproducidos de
muy distintas maneras incluyendo la reproduccin
sexual y diversas formas asexuales, como la
propagacin por injertos, hijuelos y de ms reciente
uso las tcnicas in vitro. La reproduccin vegetativa
es el nico medio para obtener plantas que no

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tienen flores, que dan flores estriles. De este


modo, las cactceas de desarrollo anormal,
monstruosas, o de lento crecimiento solo se
reproducen de este modo, ya que las plantas
provienen de mutaciones genticas y no pueden
reproducirse normalmente por semillas (Nessmann,
1994).
La reproduccin de cactceas constituye
uno de los principales mecanismos para contribuir a
su conservacin; entendida esta como el logro de la
preservacin de las especies que integran esta
familia y su uso racional en la actividad econmica
(Snchez, 1991).
Actualmente el gnero Ariocarpus se
propaga por medio de semillas y por injertacin, de
esta segunda modalidad se pierde gran nmero de
especies, por que el xito de prendimiento del
injerto no es del 100 %, adems de que se pueden
degenerar las especies o morir.

de una plntula y estudiar los aspectos metablicos


y bioqumicos de la germinacin, los cuales son
difciles de estudiar cuando el embrin se encuentra
dentro de la semilla, en donde existe interferencia
de los tejidos adyacentes(Lpez, 1985).
El primer trabajo de cultivo de embriones in
vitro se llev a cabo en 1904, y fue obtenido de
embriones maduros extirpados de semillas y no
inmaduros, la razn es por que el embrin en las
semillas se encuentra totalmente desarrollado en
una estructura bipolar, la cual contiene un
meristemo en cada polo, adems de los
cotiledones. Por esto, al momento de cultivar al
embrin, este contiene clulas que potencialmente
estn preparadas para efectuar la divisin,
alargamiento y diferenciacin, permitiendo el
desarrollo progresivo de la raz y los brotes axilares
de la plntula. De esta manera los requerimientos
nutricionales son mnimos (Lpez, 1985).
MATERIALES Y MTODOS

El xito del cultivo in vitro de plantas como


un mtodo de propagacin para estudios
morfogenticos,
mejoramiento
gentico
y
crecimiento de clulas para diversos tipos de
estudio, morfolgicos, fisiolgicos, bioqumicos y
otros, est muy influenciado por la composicin
qumica de los medios de cultivo utilizados, y otros
parmetros ambientales (Lpez, 1985).
Para cultivar clulas, semillas, tejidos u
rganos in vitro se siguen una serie de principios
bsicos simples. En primer lugar es necesario
seleccionar y separar de la planta el material con el
que se va a trabajar. El siguiente paso consiste en
eliminar los microorganismos que se encuentran
contaminando el material vegetal. Por ltimo, se
debe proporcionar a las clulas, tejidos u rganos
un medio ambiente apropiado a travs de medios
de cultivo sintticos y condiciones de incubacin
adecuada. Tanto la aspsia como la incubacin del
material vegetal se lleva a cabo en ambiente estril
(Ochoa, 1985).
La excisin de embriones provenientes de
vulos y semillas, y su cultivo en un medio nutritivo
definido, permite investigar los factores que influyen
en el crecimiento embrionario bajo condiciones
controladas y adems definir qumicamente el
medio ambiente del saco embrionario el cual
alimenta al embrin (Lpez, 1985).
El cultivo in vitro de embriones facilita
experimentos para determinar los factores que
regulan el crecimiento de los rganos primordiales

La presente investigacin se realiz en el


Laboratorio de Biotecnologa del rea de Sistemas
Agrcolas de la Unidad Regional Universitaria de
Zonas ridas (URUZA) de la Universidad Autnoma
Chapingo (UACh), localizada a en el paralelo 25
52 28 latitud Norte y 103 37 07 longitud Oeste
del Meridiano de Greenwich, con una altitud de
1119 msnm. Ubicada a 3 Km de la ciudad de
Bermejillo, Dgo.
Las semillas de la especie fueron
colectadas de la parte Norte de la Sierra de
Bermejillo, municipio de Mapim, Dgo.; donde se
encontr una sola colonia en un rea de 1 km2 por
el rumbo a una presa, la fecha de colecta fue el da
24 mayo de 1999.
Las plantas se encontraban en un proceso
de marchitamiento por la extrema sequa que
asolaba en los ltimos dos aos a la colecta, esto
fue notable por que en la colonia muchas de ellas
estaban muertas, en su mayora las ms jvenes,
otras tenan una tonalidad rojiza que toman cuando
existe excesiva insolacin y escasez de agua, las
que se encontraban debajo de arbustos y en medio
de piedras son las de mejor coloracin verde.
La semilla se seleccion utilizando con la
prueba de flotacin en agua, descartndose las
semillas que flotaron, ya que representan semillas
vanas o secas. Se seleccionaron 600 semillas y se
colocaron en 200 ml de agua destilada con
detergente, para eliminar los restos de tricomas y

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suciedad que cubran a las semillas dentro de las


axilas de la planta.
Se colocaron en una malla de tela de 9 cm2
amarradas para evitar el maltrato en la parrilla de
agitacin. Todos los enjuagues utilizados en las
tcnicas de desinfestacin se realizaron con agua
destilada estril. En las primeras 7 tcnicas se
utilizaron en cada morralito 120 semillas, en la
siguiente 120 semillas para la siembra de semillas y
160 para la siembra de embriones. Para el caso de
la siembra de embriones se procede a realizar la
tcnica de eliminacin de la testa.
El trabajo se dividi en dos etapas:
Etapa I. Se realizaron pruebas de desinfestacin
que consisti en un diseo completamente al azar
con un arreglo factorial de 8 x 2, se evaluaron 16
tratamientos de naturaleza factorial considerando a
8 tratamientos de desinfestacin como Factor A y
dos tipos de medio (0MS y 100%MS 1MS-) como
Factor B, esto con el fin de evaluar la incidencia de
patgenos en los diferentes medios, se tuvo como
unidad experimental a una semilla sembrada en un
frasco.
La exposicin de las semillas con los
reactivos fue a travs de una parrilla de agitacin,
despus de la utilizacin de cada reactivo se
realizaron enjuagues con agua destilada estril. Las
tcnicas de desinfestacin utilizadas se muestran a
continuacin,
Tcnica 1.
a) Agua con jabn por 2 horas.
b) En la campana de flujo laminar: 2 min con
alcohol 70 %.
c) 20 min en una solucin de hipoclorito de sodio al
20 %.
Tcnica 2.
a) Agua con jabn por 2 horas.
b) En la campana de flujo laminar: 2 min con
alcohol 70 %.
c) 20 min en una solucin de hipoclorito de sodio al
20 % + Tween 20 al 0.2 %.
Tcnica 3.
a) Agua con jabn por 2 horas.
b) Solucin de Captn PH 0.002 g litro-1 por 20
min.
c) En la campana de flujo laminar: 2 min con
alcohol 70 %.
d) 20 min en una solucin de hipoclorito comercial
al 20 % + Tween 20 al 0.2 %.

Tcnica 4.
a) Agua con jabn por 2 horas.
b) Se agitan por 2 min en alcohol 70 %.
c) Solucin de Captn PH 0.002 g litro-1 + Tween
20 al 0.3 % por 20 min.
d) En la campana de flujo laminar: 2 min En alcohol
70 % por 5 min.
e) 20 min. en una solucin de hipoclorito de sodio
al 20 % + Tween 20 al 0.2 %.
Tcnica 5.
a) Agua con jabn por 2 horas.
b) Se agitan por 5 min. en alcohol 70 %.
c) Solucin de Captn PH 0.002 g litro-1 + Tween
20 al 1 % por 1 h.
d) En la campana de flujo laminar: por 2 min. en
alcohol 70 %
e) 30 min en una solucin de hipoclorito de sodio al
20 % mas Tween 20 al 0.2 % en agitacin.
Tcnica 6.
a) Agua con jabn por 2 horas.
b) En la campana de flujo se limpia el hilium de la
semilla con una aguja de diseccin.
c) Solucin de Captn PH 0.002 g litro-1 + Tween
20 al 0.5 % por 30 min.
d) En la campana de flujo laminar: 2 min en alcohol
70 %.
e) 20 min en una solucin de hipoclorito de sodio al
20 % + Tween 20 al 0.2 %.
Tcnica 7.
a) Agua con jabn por 2 horas.
b) En la campana de flujo laminar se limpia el
funculo de la semilla con una aguja de
diseccin.
c) Solucin de Captn PH 0.002 g litro-1 + Tween
20 al 1 % por 2 h.
d) En la campana de flujo: alcohol 70 % por 4 min.
e) 30 min en una solucin de hipoclorito de sodio al
20 % + Tween 20 al 0.2 %.
Tcnica 8.
a) Agua con jabn por 2 horas en agitacin.
b) Se colocan en una solucin de 1 g de Captn
PH en 500 ml de agua con Tween 20 al 1 % por
6 h.
c) En la campana de flujo laminar: alcohol 70 %
por 5 min.
d) 20 min en una solucin de hipoclorito de sodio al
100 % mas Tween 20 al 1 % en agitacin.

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Cuadro 1. Tratamientos utilizados con diferentes tcnicas


para el establecimiento del cultivo asptico en
dos medios de cultivo.
Tratamiento
Factor A
Factor B
Tcnica
Medios
T1
1
0MS y 1MS
T2

0MS y 1MS

T3

0MS y 1MS

T4

0MS y 1MS

T5

0MS y 1MS

T6

0MS y 1MS

T7

0MS y 1MS

T8

0MS y 1MS

Etapa II. Consisti en utilizar la tcnica 8 de


desinfestacin como condicin nica, teniendo un
diseo completamente al azar con un arreglo
factorial de 2 x 5, se evaluaron 10 tratamientos de
naturaleza factorial considerando dos tipos de
siembras, de semilla y de embriones (estos se
obtienen por la eliminacin de la testa) como
Factor A y cinco tipos de medio de cultivo con sales
de MS-62 (0, 0.25, 0.5 y 100 %) y arena esterilizada
como Factor B, se tuvo como unidad experimental a
una semilla y a un embrin sembrado en un frasco.
el tipo siembra en

Tratamiento

Factor A
Tipo de siembra
Embrin

Factor B
Medios
0 MS, 0.25 MS,

T9

y semilla

0.5 MS,
1 MS y arena

se

sembraron

b) ndice de contaminacin por bacterias.

Las pruebas de germinacin consistieron


en
colocar las semillas y embriones en los
siguientes medios para su germinacin:

En estas las pruebas se obtuvo el anlisis


de varianza de incidencia de contaminacin por
hongos, bacterias y oxidacin de la semilla y
cuando result pertinente se utiliz el agrupamiento
de medias Tukey.

Las semillas
siguientes medios:

a) ndice de contaminacin por hongos.

c) ndice de oxidacin.

Las pruebas de contaminacin consistieron


en evaluar el ndice de contaminacin de las
semillas en los diferentes medios de cultivo, las
evaluaciones se realizaron cada 24 h por diez das
a las 12 p.m.

Cuadro 2. Tratamientos para evaluar


cinco medios de cultivo.

Los parmetros evaluados fueron:

en

los

a) Medio 0MS.- Agar 0.6 % (6 g litro-1).


b) Medio 1MS.- Agar 0.6 % (6 g litro-1) + 100% de
la concentracin del sales MS.

a) Medio 0MS. Agar 0.6 % (6 g litro-1).


b) Medio 0.25MS. Agar 0.6 % + de
concentracin de sales MS.
c) Medio 0.5MS. Agar 0.6 % + de concentracin
del sales MS.
d) Medio 1MS. Agar 0.6 %
+ 100% de
concentracin del sales MS.
e)
Medio Arena. Limpia esterilizada cribada en
malla de 2 mm2
Las evaluaciones se realizaron cada 24 h
durante 15 das a partir de la primer semilla o
embrin germinado. Se consider germinada
cuando present una radcula de 2 mm de longitud.
Parmetro evaluado:
a) Velocidad y porcentaje de germinacin (valor
germinativo).
Los datos que arrojaron los tratamientos
fueron evaluados usando un anlisis de varianza
haciendo comparaciones del valor germinativo
(VG).
Este valor es una medida de la calidad de
germinacin como resultado de combinar y
ponderar la capacidad germinativa (% final de
germinacin), velocidad germinativa (tiempo
transcurrido desde la siembra hasta un punto
arbitrario sobre la curva de germinacin) y
uniformidad germinativa (magnitud de las
diferencias de tiempo de germinacin de las
semillas individuales de una muestra).
Se obtuvo un solo valor numrico, de
acuerdo a la suma acumuladas de los cocientes
obtenidos de dividir el porcentaje de germinacin
sencillo alcanzado en cada conteo, entre los das
transcurridos desde la siembra de acuerdo a la
siguiente frmula:
VG = C * Gi/Di
Donde :

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C = Constante de transformacin porcentual, se


calcula mediante la frmula:
C = 100 / No. de semillas utilizadas como tamao
de muestra por repeticin.
G = Semillas germinadas en la evaluacin el da
que indica el subndice i.
D = Das transcurridos desde la siembra hasta el
da evaluado que indica el subndice i.
Para detectar diferencias entre las medias,
se aplic la prueba de Tukey con un nivel de
significancia de = 0.01 (Camacho y Morales,
1987).

La prueba Tukey muestra cul de las ocho


diferentes tcnicas fue significativa para las
diferentes variables estudiadas, se observa con
respecto a la incidencia de hongos que la tcnica 8
la agrupa sola por presentar medias muy inferiores
al resto, la mejor tcnica para la eliminacin de
bacterias fue la 3 y para baja incidencia de
oxidacin las mejores tcnicas son la 2, 3, 4, 5, 6 y
7, pero para poder inducir el desarrollo de plntulas
solo la tcnica 8 es la idnea. Esto se relaciona con
la incidencia de hongos, a menor incidencia de
hongos hay ms posibilidades de que germine una
plntula. Al iniciarse la presencia de hongos llega a
matar a la semilla evitando su germinacin.

RESULTADOSY DISCUSION
Pruebas de germinacin
Pruebas de desinfestacin
En esta prueba se aprecia que el factor
tcnica fue altamente significativo con respecto a
los otros factores en cuanto a las variables
estudiadas; se observa, dentro de las tcnicas que
la significancia de los cuadrados medios de la
presencia de hongos est influenciada mayormente
por el tipo de tcnica utilizada, las otras variables,
esto confirma que dependiendo de la tcnica de
desinfestacin utilizada ser el grado de incidencia
de hongos que se tengan en las semillas. (Cuadro 3
y 4)
Cuadro 3. Cuadrados medios y significancia estadstica en
el anlisis de varianza para las variables
incidencia de hongos (H), bacterias (B),
oxidacin (O) y plntulas (P), en pruebas de
desinfestacin

Factor
Tcnica
Medio
Tc*Med
Error

Cuadrados
H
B
5.01**
1.04**

O
1.84**

P
0.07**

0.14NS

0.14NS

0.03NS

0.03NS

0.14NS

0.29NS

0.01NS

0.01NS

0.10

0.16

0.06

0.01

G.L.
7

432

Medios

Cuadro 4. Pruebas Tukey ( = 0.01) del factor tcnica para la


incidencia de hongos (H), bacterias (B), oxidacin
(O) y plntulas (P).
H
Tcnica

B
Tcnica

O
Tcnica

P
Tcnica
8a

1a

7a

7a

4a

1 ab

6b

1b

3a

6 abc

5b

4b

2a

8 abc

8b

3b

5 ab

2 bc

1b

5b

6 bc

4 bc

2b

2b

5 bc

3b

7b

3 c

4b

6b

En estas pruebas se observa que la


presencia de hongos, bacterias, plntulas y el valor
germinativa de las mismas esta influenciada
significativamente por el tipo de siembra. No se
realiz el anlisis para la variable oxidacin ya que
no se detect su presencia (Cuadro 5 y 6).
Cuadro 5. Cuadrados medios y significancia estadstica en
el anlisis de varianza para las variables
incidencia de hongos (H), bacterias (B),
plntulas (P) y valor germinativo (VG) en las
pruebas de germinacin.

Factor

G.L.

Cuadrados
B

Medios
P

0.45**

0.31**

Medio

0.15NS

0.03NS

0.029NS

72.88NS

Tc*Med

0.10NS

0.03NS

0.050NS

75.96NS

0.08

0.03

0.084

50.19

Error

253

42.21**

VG

Siembra

16391.28**

Cuadro 6. Media (Med.) y Desviacin Estndar (D.S) para la


incidencia de plntulas (P), proliferacin por
hongos (H) y bacterias (B).
Tipo de
siembra
Embriones

Obs
123

Med.
0.894

P
D. S.
0.308

Med.
0.048

H
D. S.
0.216

Med.
0.000

B
D. S.
0.000

Semillas

140

0.078

0.270

0.128

0.335

0.071

0.258

El Cuadro 6 muestra para el caso de


presencia de plntulas la siembra por embriones
presenta medias ms altas respecto a las semillas,
y viceversa, para la presencia de hongos y
bacterias es donde se obtuvieron medias mas
bajas, y es de esperarse, por que la testa es fuente
de acumulacin de contaminantes, y al eliminarse,
los
ndices
de
contaminacin
bajan
considerablemente.

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Cuadro 7. Medias de Mnimos Cuadrados del Valor


Germinativo.
Tipo de siembra
Embriones

Medias
16.950

Semillas

0.6335

Existe una gran diferencia entre las medias,


que indican un alto valor germinativo para las
plntulas germinadas a partir de embriones.
Contaminacin
Se han desarrollado diferentes tcnicas
para la desinfestacin de semilla de cactceas que
se pueden considerar estndares, sin embargo las
tcnicas descritas (Elas, 1997; Martn Del Campo,
1997 y Ojeda, 1993) no se adaptaron a las
necesidades requeridas para la desinfestacin de
las semillas de la especie estudiada, por ello se
opt por realizar una modificacin a la tcnica
descrita por Villavicencio (1998), y modificar la
concentracin de hipoclorito de sodio del 20 % al
100 %.
Los resultados del anlisis de varianza
demuestran que a mayor concentracin de
hipoclorito de sodio menor es el ndice de
contaminacin por hongos y bacterias, ms no por
la incidencia de oxidacin.
No fue significativa la presencia de
contaminantes con respecto a los diferentes medios
de cultivo y la arena utilizados, se esperaba que en
los medios en donde la concentracin de sales y
nutrientes
fuera
mayor,
hubiera
mayor
contaminacin.
Germinacin
El alto valor significativo obtenido en el
anlisis
de
varianzas
de
las
variables
contaminantes con respecto a los factores tipo de
siembra se debe precisamente a la presencia de
testa, an teniendo altas concentraciones de
hipoclorito de sodio existe presencia de los agentes
en el medio, y es que la estructura externa de las
semillas es tan verrucosa, que es una fuente de
hospedaje para dichos contaminantes.
En las tcnicas 6 y 7 se describe un
proceso de limpieza del funculo de la semilla, se
observ que es una estructura que alberga
patgenos que originan la contaminacin, por ello
se opt por su limpieza, pero no se tuvieron
resultados favorables por lo complicado de esta

operacin, por lo que se decidi por eliminar toda la


testa para dicho fin, as se elimin casi en la
totalidad la contaminacin detectada en los
anteriores tratamientos
Este suceso propici un proceso de
escarificacin a la semilla, y eso lo demuestran los
datos del anlisis de varianza, los cuales indican
una germinacin cercana al 90 por ciento de los
embriones, mientras que de las semillas solo el 7
por ciento.
Los anlisis de varianzas utilizados en la
presencia de contaminantes muestran no
significancia entre los diferentes medios de cultivo,
mas bien por los dos tipos de siembra, la de
semillas y embriones.
No se tienen datos del periodo en que una
semilla de esta especie germine, solo se cuenta
con informacin que en semillas de otras especies
como A. retusus que germina de 11 a 40 das, A.
agavoides de 10 a 23 das (Raya y Nava, 1997);
Mammillaria candida de 6 a los 21 das (Elas,
1997), y Astrophytum myriostigma de 5 a 6 das
(Martn Del Campo, 1997).
El tiempo de germinacin en semillas de
esta especie fue a partir del da 11 de la
germinacin y hasta el da 21 solo haban
germinado el 9.8 % del total. Sin embargo, la
germinacin de embriones empez a partir del
segundo da despus de la siembra y para el da 21
haba germinado el 94 % del total.
Los resultados presentados en este trabajo
indican que es posible generar plntulas de
especies en peligro de extincin a travs de la
metodologa descrita utilizando tcnicas de cultivos
in vitro.
CONCLUSIONES
La mejor tcnica de desinfeccin consiste en
mantener la semilla en agitacin por 2 h en agua
con jabn, 6 h en captan (2g/l), 4 min. En alcohol
70%, 20 min. en hipoclorito de sodio 100%.

La tcnica de desinfeccin anterior es efectiva


solo si se elimina la cubierta o testa de la semilla,
prosperando en cualquier medio de cultivo
ensayado e incluso en arena lavada y desinfectada.

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LITERATURA CITADA
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