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Introduccin
Las lipasas (acilhidrolasa triacilglicerol, EC 3.1.1.3) se definen como hidrolasas de ster de glicerol
que catalizan la hidrlisis de los triglicridos a cidos grasos libres y glicerol, y actan en la
interfase entre el aceite y el agua ( Treichel et al., 2010 ). Como enzimas de superficie, su actividad
est muy influenciada por la zona interfacial ( Talukder et al., 2006 ). En entornos no acuosos
lipasas pueden revertir la reaccin para sintetizar triacilglicrido a partir de glicerol y cido graso
libre. Por lo tanto, las lipasas pueden catalizar una amplia gama de reacciones tales como
hidrlisis, interesterificacin, esterificacin, alcoholisis, acidlisis, y aminolisis ( Joseph et al.,
2008 ). Las lipasas son un importante grupo de enzimas con aplicaciones de la biotecnologa
pertinentes en las industrias de alimentos, lcteos, detergentes y productos farmacuticos.En la
industria alimentaria lipasas comerciales se utilizan para mejorar el sabor de los productos lcteos
y elaboracin de carne, verduras, zumos de fruta, etc. ( Singh y Mukhopadhyay 2012 ). A medida
que son indispensables para la bioconversin de los lpidos en la naturaleza, hay un mayor inters
para aplicaciones tcnicas establecidas de lipasas, as como para el completo nuevas reas de
aplicacin.
Aunque el metabolismo del carbono de los microorganismos se basa principalmente en hidratos de
carbono, la presencia de lipasas permite muchos microorganismos de utilizar fuentes de carbono
lipdicas. Como lpidos pueden membranas celulares no pasivamente transversales, que tienen
que ser degradados en cidos grasos libres fuera de la clula antes de cidos grasos libres son
absorbidos por la clula. Este proceso requiere que las lipasas microbianas son excretados en el
medio donde se hidrolizan los lpidos (Najjar et al., 2011 ). Muchos microorganismos secretan
lipasas incluyendo bacterias, hongos y levaduras se han aislado de ambientes ricos en lpidos. Sin
embargo, la produccin de lipasa a partir de levaduras permaneci un rea mucho ms descuidado
en comparacin con bacterias u hongos ( Ali et al., 2010 ).
Debaryomyces hansenii es una no patgena, osmotolerante y levadura oleaginosa lpidos
acumulando.Levaduras oleaginosas acumulan lpidos y contribuyen al metabolismo de los
lpidos. Por lo tanto la capacidad de D. hansenii para sintetizar, acumular y almacenar lpidos es
ventajoso para los procesos biotecnolgicos ( Breuer y Harms, 2006 ). Por otra
parte, D. hansenii es una levadura halfilas, a medida que crece ptimamente a 3-5% de sal (v /
w), y es capaz de crecer en concentraciones de cloruro de sodio hasta 2,5 M ( Breuer y Harms,
2006 y Prista et al., 2005 ) . La produccin de lipasa por D. hansenii ha sido escasamente
explorado ( Tak y Sengel, 2010 ). El incidense de D. hansenii en ambientes salinos y el
comportamiento peculiar de
Gnolevures D.hansenii para
consorcio seleccionado
genoma,
disponible
negro, se coloca en depsitos de hormign en capas con cloruro de sodio grueso en una
proporcin de hasta el 40% y gradualmente pierden agua y oleuropena (el compuesto fenlico que
hace que el sabor amargo de oliva). En 30 a 60 das, las aceitunas se convierten desamargada,
arrugada y comestible. La microflora del producto se compone de levaduras ( Panagou et al.,
2002 ).
Metodologa de superficie de respuesta (RSM) es una tcnica estadstica til para la investigacin
y optimizacin de procesos complejos. Es una coleccin de tcnicas matemticas y estadsticas, y
se utiliza ampliamente en diferentes procesos biotecnolgicos para estudiar los efectos de varios
factores que influyen en las respuestas variando simultneamente y llevar a cabo un nmero
limitado de experimentos.Diseo compuesto central (CCD) es un diseo de superficie de respuesta
muy utilizado cuando la regin experimental se define por los lmites superior e inferior de cada
factor y no se extendieron ms all de ellos (Neter et al., 1996 ). Una combinacin de factores
genera una cierta respuesta ptima se puede identificar.Adems, las interacciones significativas
entre las variables pueden ser identificados y cuantificados por esta tcnica. El proceso de
produccin de lipasa por Rhizopus delemar fue optimizado por RSM ( Aikel et al., 2010 ).
El presente trabajo tuvo como objetivo la optimizacin de los componentes del medio que mejoran
la produccin de lipasa por D. hansenii asla con la ayuda de RSM. Un CCD se emple para
optimizar las fuentes de carbono y de carbono lipdicas, as como el valor de pH del medio de
produccin, que tienen una influencia significativa en la produccin de lipasa y los resultados
fueron analizados por RSM.
2. Materiales y mtodos
2.1. El aislamiento y la deteccin de la produccin de lipasa levaduras
Las cepas de levadura con actividad lipoltica se aislaron a partir de aceitunas saladas secas de la
variedad de Tasos. Las muestras de 20 g de aceitunas obtenidos despus de la eliminacin de la
fosa se homogeneizaron durante 60 s con 180 ml de solucin salina estril (0,85 g / L NaCl) que
contena Tween 80 (1 ml / L) usando un Stomacher Lab-Blender 400 (Seward Medical, Londres,
Reino Unido). Diluciones apropiadas de los homogeneizados de muestras se inocularon en YMPG
(levadura-malta-peptona-glucosa) medio de agar (Difco, Becton Dickinson y Company, Sparks,
MD, EE.UU.) suplementado con oxitetraciclina y sulfato de gentamicina (Oxoid) como agentes
selectivos para las levaduras y incubados hasta 5 das a 27 C. Se seleccionaron un total de 97
colonias que muestran variaciones en la apariencia en agar YMPG (relativas superficie, textura,
forma, margen y dimetro) y se purific en el medio anterior. Los cultivos puros se observaron bajo
un microscopio de contraste de fase (Nikon Eclipse 50i, Japn) para distinguir la morfologa
celular. Para el mantenimiento y almacenamiento de los cultivos puros se utiliz YMPG agar, se
incubaron a 27 C y se almacen a 4 C.
Se estudiaron los 97 aislamientos para la actividad lipasa mediante el mtodo de agar de aceite de
oliva rodamina ( Kouker
donde Y representa la respuesta predicha, es decir, actividad de la lipasa (LA) liberado en el medio
de cultivo se expresa en U / ml, 0 es el intercepto, i coeficiente de primer orden, ii segundo
coeficiente de orden, ij el coeficiente de efecto de interaccin y x i , x j los niveles codificados de
las variables X i yX j investigado en experimentos. La variable X i se codific como x i de acuerdo
con la ecuacin: x i = ( Xi - X 0 ) / X i , donde x i es el valor de la variable codificada X i (sin
dimensiones), X 0 es el valor de X ien el nivel de punto central y el cambio de ritmo valor X i =
(nivel alto - bajo nivel) / 2. Se requiere la codificacin ya que los factores se expresan en unidades
distintas ( Tabla 1 ).
CCD es un diseo til para adquirir datos para encajar el polinomio anterior. A 2 3 diseo factorial
completo con seis repeticiones en el punto central que resulta en 20 experimentos se utiliz para
investigar las tres variables seleccionadas (es decir, glucosa, aceite de oliva y pH) para la
determinacin de los componentes del medio de produccin para la produccin de lipasa. Los
niveles de las variables ( Tabla 1 ) fueron elegidos despus de una serie de experimentos
preliminares. Los experimentos fueron diseados utilizando el paquete de software Statistica
(Statsoft, Tulsa, OK). El diseo experimental se presenta en la Tabla 2 . El diseo experimental se
repiti en tres repeticiones.
incubadas
en
un
incubador
agitador
rotatorio
como
se
describe
3. Resultados y discusin
3.1. El aislamiento, la identificacin y seleccin de la produccin de lipasa
levaduras
Aceitunas salados secos de variedad Tasos se han seleccionado como un biotopo para el
aislamiento de la produccin de lipasa levaduras debido a que el producto cumple con los
siguientes requisitos: las cepas tienen una larga tradicin como levaduras de grado alimenticio, ya
que son parte de la microflora de un alimento tradicional del producto y la enzima producida puede
ser generalmente reconocidos como seguros (GRAS), que es particularmente atractivo para la
lipasa utilizada en la industria cosmtica alimentos, productos lcteos, y farmacutica.
Un total de 97 colonias de levaduras se aislaron a partir de muestras de olivo, incluidos los
representantes de todos los tipos de colonias visto. De las 97 cepas evaluadas, 20 cepas de
levaduras mostraron una mayor actividad de la lipasa en rodamina agar de aceite de oliva. Las
cepas anteriores se realizarn las pruebas de 32 caracteres morfolgicos y fisiolgicos e
identificados como D. hansenii (Kotzekidou de 1997 , Psani y Kotzekidou de 2006 y Suzuki et al.,
2011 ). Las caractersticas bioqumicas y tecnolgicas de los 20 aislamientos con aumento de la
actividad de la lipasa caracterizado como D.hansenii se presentan en la Tabla 3 . Una
caracterstica importante de las 20 cepas aisladas es la capacidad de adaptarse a condiciones
ambientales rigurosas, es decir, baja temperatura (las cepas fueron capaces de crecer a 4 C), y
alta concentracin de sal. Las principales caractersticas de la D.hansenii son que el
microorganismo crece ms rpido en presencia de hasta 1 M de NaCl debido al aumento en la
fluidez de la membrana de plasma como consecuencia del aumento de insaturacin de los cidos
grasos a concentraciones de NaCl superiores en comparacin con menor concentracin de sal
( Turk et al., 2007 ).
La cepa de levadura que forma el ms intenso de halo fluorescente naranja alrededor de las
colonias en agar rodamina de aceite de oliva (es decir, D. hansenii YLL29) fue seleccionado para
experimentos de optimizacin de la produccin de lipasa. Los resultados preliminares mostraron
que las condiciones de crecimiento tales como la disponibilidad de fuentes de carbono y nitrgeno,
la presencia de agentes tensioactivos, la temperatura de incubacin, pH, nivel de inculo y la
aireacin influir en la produccin de la lipasa extracelular.
donde LA es la lipasa producida por ml del medio de produccin como una funcin de la
concentracin de glucosa y aceite de oliva (en g / L) y el valor pH.
La bondad de ajuste de la ecuacin de regresin se evalu mediante el coeficiente de correlacin
( R ) y el coeficiente de determinacin ( R 2 ). El modelo de segundo orden anterior es adecuado
predictor de los resultados experimentales como el valor de R
(0,96)
indica que el modelo de respuesta puede explicar el 96% de las variaciones totales. El valor del
coeficiente de determinacin ajustado (
,X
,X
) Mostr un efecto
X 1 X 2 y X 2 X 3 ) indicaron un
observaciones anteriores, como se muestra en la Fig. 1 el efecto cuadrtico del valor de pH tuvo
una influencia positiva significativo sobre la actividad de la lipasa lo que significa que una pequea
variacin en el pH se altera la produccin de lipasa en una medida considerable. La produccin de
lipasa por Pichia lynferdii Y-7723 aument proporcionalmente con el pH hasta el valor ptimo (pH
7,0) y se redujo drsticamente a partir de entonces ( Kim et al., 2010 ).Efectos lineales de glucosa y
aceite de oliva son altamente significativa para la produccin de lipasa porD. hansenii YLL29 ( Fig.
1 ) y explican que pueden actuar como una limitacin de nutrientes y la variacin sutil en sus
concentraciones alterar la produccin de lipasa. El hecho de que la barra para la interaccin de la
glucosa y pH ( X 1 X 3 ) se mantuvo dentro de la lnea de referencia, y el coeficiente ms pequeo
para este trmino en comparacin con los otros trminos de la ecuacin. (1) , indic que este
trmino contribuy al menos en la prediccin de la produccin de lipasa por D. hansenii YLL29.
de glucosa y de aceite de oliva tuvo influencia positiva en la produccin de lipasa hasta que el valor
ptimo; mientras que el aumento de las concentraciones de los constituyentes anteriores tenido
influencia significativamente negativo en la produccin de lipasa.
Los niveles ptimos predichos de las variables de la prueba, a saber, glucosa, aceite de oliva y el
pH se obtuvieron mediante la aplicacin de anlisis de regresin de la Ec. (1) . Los niveles ptimos
para D.hansenii YLL29 fueron los siguientes: glucosa 13,1 g / L, aceite de oliva 19 g / L, pH 6,4 con
la actividad de la lipasa correspondiente 7,59 U / ml. Verificacin del valor predicho se llev a cabo
mediante el uso de condiciones ptimas en experimentos de inoculacin. Tres experimentos
repetidos se realizaron bajo las condiciones ptimas previstas. El valor medio de la actividad de
lipasa fue 7,44 U / ml, que es en excelente acuerdo con el valor predicho (7,59 U /
ml). Optimizacin result en aumento de 2,28 veces en la produccin de lipasa en comparacin
con las condiciones no optimizadas ( Tabla 2 , funcionamiento 1: 3,27 U / ml).
Con el fin de comparar visualmente los datos predichos y observados, los valores predichos
representan frente a los valores observados como se muestra en la Fig. 3 . Los resultados
corroboraron la validez del modelo tal como tambin lo indica el factor de sesgo calculado ( B f =
1.00) que es una medida del acuerdo general entre los valores pronosticados y observados ( Ross,
1996 ). El modelo se puede considerar bastante fiable para predecir la produccin de lipasa
de D. hansenii YLL29.
Para las 20 cepas de D. hansenii aislado a partir de aceitunas saladas en seco de la variedad
Thassos dotado con alta produccin de lipasa en rodamina agar de aceite de oliva, se utiliz el
medio optimizado para la lipasa y la produccin de biomasa en cultivos en matraz de agitacin
durante 72 horas a 30 C.Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 4 . No hubo
diferencias estadsticamente significativas entre la D. hansenii aislados sobre la actividad de la
lipasa y la produccin de biomasa.Aunque las cepas YLL3, YLL17, YLL19, YLL21, YLL29, YLL30,
YLL31, YLL33, YLH91 no difirieron significativamente en la produccin de lipasa, hubo diferencias
estadsticamente significativas ( p <0,05) entre las cepas anteriores sobre la produccin de
biomasa ( Tabla 4 ). La cepa D. hansenii YLL29 mostr tanto la ms alta produccin de lipasa y
tambin el ms alto de la biomasa en comparacin con las otras cepas que indican que la
produccin de lipasa se asocia crecimiento. La actividad de la lipasa ms bajo de las cepas
investigadas era 6,00 U / ml y el ms alto 7,44 U / mL. Actividad lipoltica bajo se obtuvo por
un D. hansenii cepa aislada a partir de residuos de una industria lechera ( Prista et al., 2005 ).La
actividad de la lipasa ms alto detectado utilizando Candida cylindracea NRRL Y-17506 creciendo
sobre aguas residuales de oliva molino suplementado con NH 4 Cl (2,4 g / L) y aceite de oliva (3,0 g
/ L) fue 9,23 U / ml ( D'Annibale et al. , 2006 ). En un medio de la incorporacin de suero de queso,
un co-producto de cervecera, extracto de levadura, extracto de malta, Tween 80 y aceite de oliva
una actividad de lipasa de 20,2 U / ml se logr por Candida rugosa ( Tommaso et al., 2011 ). Como
lipasas son diseadas por la naturaleza para la hidrlisis de los enlaces ster en trigliceroles en la
presencia de exceso de agua sus usos industriales son enormes ya que contribuyen a ahorrar
energa y minimizar la degradacin trmica durante la hidrlisis.
4. Conclusin
Diseo y anlisis de superficie de respuesta compuesto central eran tiles para determinar los
niveles ptimos de las variables de proceso que influyen significativamente en la produccin de
lipasa por D.hansenii aislado de aceitunas saladas secas de la variedad de Tasos. La produccin
mxima de la lipasa era una funcin de la estrecha interaccin entre la concentracin de glucosa y
aceite de oliva y el pH inicial del medio. Los resultados corroboraron la validez y la eficacia del
modelo, como los enfoques estadsticos demostraron ser adecuados en la prediccin de la
composicin del medio de produccin ptima para la mxima produccin de lipasa. El
20 D. hansenii aislamientos mostraron una mayor actividad de la lipasa que crecen en el medio
optimizado. La cepa D. hansenii YLL29 mostr tanto la ms alta de la lipasa y la produccin de
biomasa que indica que es una cepa adecuada para los estudios de escalado para alcanzar una
explotacin comercial del proceso por lotes.