Rev. Microbiol. Ind. San et Environn.

Vol 5, N2, p : 23-38

Ouartsi et al., 2011

CARACTERISATION PRELIMINAIRE DES RHIZOBIA ISOLEES

A PARTIR DES NODOSITES DE CICER ARIETINUM L.
CULTIVE DANS LE NORD-EST ALGERIEN
A. OUARTSIa & D. CHEKIREBa
a

Laboratoire de Microbiologie. Facult des Sciences. Universit Badji Mokhtar

Annaba- Algrie.
E-mail : ouartsiakilazohra @yahoo.fr ; E-mail : djchekireb@gmail.com
Auteur pour correspondance : Dr. Akila OUARTSI

RESUME
Dans cette tude nous nous sommes intresss au rhizobia nodulant Cicer
arietinum L. (FLIP 90-13) cultiv dans la wilaya de Guelma (Algrie). Des quarante
cinq isolats obtenus partir de nodosits effectives de Cicer arietinum L, neuf ont
nodul leur plante hte et deux de ces souches ont nodul Medicago sp. Les
dendrogrammes obtenus aprs analyse numrique des rsultats des tests API 20NE et
API 50CH montrent une diversit de ces rhizobia et permet dapparenter la souche
CAO08 au genre Sinorhizobium. Dautres caractres biochimiques comme la
production dacide ou dalkali et la production du 3-cto-lactose ainsi que la rsistance
au stress salin, aux antibiotiques et la variation de la temprature ont t tests. Les
rsultats obtenus indiquent que la quasi-totalit des souches acidifie le milieu YEMA en
prsence de BTB et quaucune dentre elles ne produit le 3-cto-lactose. Toutes les
souches testes peuvent croitre en prsence de 2% de NaCl et sont capables de pousser
une temprature de 42C. Dautre part, ces souches montrent une rsistance des
concentrations de kanamycine (100g/ml) et de pnicilline G (60g/ml).
Mots clefs: rhizobia; nodulation; Cicer arietinum L.; Medicago sp; Sinorhizobium sp.

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SUMMARY
The objective of this study was to isolate and to characterize rhizobia from root
nodule of chickpea, Cicer arietinum L. (cultivar FLIP 90-13) grown in fields of Guelma
(Algeria). Forthy-five rhizobia strains from effective root nodules of Cicer arietinum L.
were isolated. Nine rhizobia isolates induce nodules in chickpea plants and two isolates
induce nodules in Medicago sp. The dendrograms were constructed based on results
from test API 20NE and API 50CH, showing a diversity of these rhizobia and indicating
that strain CAO08 could be assigned to the genus Sinorhizobium. Others biochemical
characteristics were detected including acid or alkali production, 3-keto-lactose
production and also resistance to salt, resistance to antibiotics and temperature variation.
The results indicated that almost rhizobia strains could produce acid on YEMA and
dont produce 3-keto-lactose. All strains could tolerate NaCl stress at 2% and all could
grow at 42 degrees C. On the other hand, the rhizobia noduling could tolerate
concentration of kanamycin (100g/ml) and penicillin G (60g/ml).
Key-words: rhizobia; nodulation; Cicer arietinum L.; Medicago sp.; Sinorhizobium sp.

INTRODUCTION
Les lgumineuses alimentaires constituent une source trs importante de
protines vgtales qui peuvent corriger le dficit en protines animales. En plus, de
leur rle socio-conomique, elles revtent une importance particulire dans les systmes
de rotations assolement avec les crales contribuant ainsi la fertilit du sol. Ceci est
d en grande partie leur aptitude tablir une symbiose avec des bactries du sol
fixatrices dazote appeles collectivement rhizobia.
En Algrie, le pois chiche est, aprs la fve (Vicia faba L.) lespce de
lgumineuse la plus produite. En effet, le climat mditerranen du pays rend possible la
culture de cette plante dans de vastes rgions du Nord allant des zones sublittorales aux
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hautes plaines en passant par la chaine du Tell (Maatougui, 1998). Dans le Nord-Est du
pays le semis dhiver, cultivar FLIP 90-13 est cultiv dans trois wilayas : Guelma,
Annaba et Skikda.
Le pois chiche a t considr comme une lgumineuse ayant un spectre dhte
troit principalement parce quil ne peut pas tre nodul par des rhizobia large spectre
dhte (Broughton et Perret, 1999 ; Perret et al., 2000). Deux espces ont dabord t
identifies comme des symbiontes spcifiques du pois chiche : Mesorhizobium ciceri
(Nour et al., 1994) et Mesorhizobium mediterraneum (Nour et al., 1995). Nanmoins,
des travaux ont montr que Sinorhizobium medicae pouvait noduler le pois chiche mais
que cette symbiose tait ineffective (Aouani et al., 2001). Plus rcemment, des tudes
ont montr que le pois chiche est capable dtablir des symbioses avec plusieurs espces
de Mesorhizobium : M. amorphae, M. loti et M. tianshanense, ces espces possdent des
gnes symbiotiques (nod C et nif H) identiques ceux ports par M. ciceri et M.
mediterraneum (Rivas et al., 2007 ; Laranjo et al., 2008).
Lobjectif de notre tude est disoler et de caractriser du point de vue
phnotypique les rhizobia nodulant Cicer arietinum L. varit hivernale FLIP 90-13
cultiv dans la rgion de Guelma.

MATERIELS ET METHODES
1- Site dchantillonnage
Les plants ont t collects partir dun champ dexprimentation de lInstitut
Technique des Grandes Cultures (ITGC) de la wilaya de Guelma dun sol argileux sous
un climat humide subhumide avec une pluviomtrie comprise entre 450-600mm/an.

2- Souches bactriennes et conditions de culture

Les souches ont t isoles partir de nodosits effectives de plants de Cicer
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arietinum L. Le broyat nodulaire obtenu aprs strilisation de la surface des nodosits

est ensemenc sur milieu YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar) contenant (g L-1) :
mannitol, 10 ; glutamate de sodium, 0,5 ; K2HPO4, 0,5 ; MgSO4, 7 H2O, 0,2 ; NaCl,
0,05 ; CaCl2, 0,04 ; FeCl3, 0,004 ; extrait de levure, 1 ; pH : 6,8 additionn de rouge
Congo 0,0025 % (Vincent, 1970). Aprs 3 5 jours dincubation 28C, les colonies
obtenues sont purifies par repiquages successifs, examines au microscope pour leur
puret et gardes sur tubes 4C. Ces isolats sont dsigns par CAO.
3- Test de nodulation
Les isolats obtenus ont t tests pour leur capacit noduler leur plante hte
Cicer aritinum L. L'tude de la nodulation a t effectue en pots avec un support
sable/terre (4/1) strile, en condition bactriologique contrle. L'irrigation des plants
est effectue avec une solution nutritive strile dpourvue d'azote selon Rigaud et Puppo
(1975). Un tmoin non inocul (T0) a t inclus. Aprs 8 semaines, les nodules sont
observs et compts. Le test de nodulation croise avec Medicago sativa et M. ciliaris a
t men dans les mmes conditions mais arros avec solution nutritive Fahraus
modifie (Barker et al. 2006).

4- Tests phnotypiques
Toutes les souches nodulantes ont t examines sur milieu YEMA additionn de
rouge Congo pour le temps de croissance, la forme, la couleur et laspect des colonies.
La production dacide ou dalcali en prsence de bleu de bromothymol (BTB) (Jordan,
1984) ainsi que la production du 3-cto-lactose (Bouzar et al. (1995) ont t tudies.

4.1. Tolrance la temprature : la tolrance de ces souches la temprature a

t ralise sur milieu solide YEMA aux tempratures de 28, 37, 42 et 45C.
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4.2. Tolrance au NaCl : la capacit

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des souches crotre diffrentes

concentrations de NaCl a t teste sur milieu solide YEM contenant 2%, 4%, 5%, 6%
et 7% de NaCl (p/v). Aprs 3 jours dincubation 28C, la croissance est compare au
tmoin sans NaCl.
4.3. Rsistance intrinsque aux antibiotiques : la rsistance lampicilline, la
pnicilline G et la kanamycine a t teste aux concentrations suivantes : 20, 60 et
100g/ml respectivement selon Alexandre et al., (2006 ); Wei Ge-Hong et al., (2008).
4.4. Capacit dassimilation de substrats carbons : les souches slectionnes
ont t testes laide de micro-galeries API 20NE et API 50CH (BioMrieux, France)
selon le protocole prconis par Kersters et al. (1984).

5- Analyse numrique
Les rsultats du test des API 20NE et API 50CH sont codifis sous forme binaire et
un dendrogramme est tabli selon la mthode UPGMA de Palomo et al. (2006).

RESUTATS
La caractrisation phnotypique est base sur les aspects morphologiques,
physiologiques ou biochimiques et dans le cas des membres de la famille des
Rhizobiaceae sur la compatibilit symbiotique avec la plante hte.
1- Caractres symbiotiques
Neuf isolats ont nodul la plante hte, Cicer arietinum L. et deux souches (CAO01
et CAO08) ont nodul Medicago sativa et M. ciliaris respectivement (tableau I). Aucun
nodule na t observ sur les racines des plants non inoculs (T0) montrant que les
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conditions de strilit ont t maintenues durant lexprience. Linfectivit des isolats

vis--vis de la plante hte est varie. Les nodosits sont toutes localises au niveau des
racines secondaires du pois chiche mais prsentent des formes diverses et une taille
allant de 2 25mm (tableau I et figure 1). Laspect des nodosits induites par la souche
CAO01 sur M. sativa L. est prsent dans la figure 2. Leffectivit des isolats t
estime visuellement par la prsence de la couleur rouge due la leghmoglobine sur
des coupes transversales de nodosits.

Tableau I: forme, frquence et localisation racinaire des nodosits.

nodosits

localisation

plante

souches nodulantes

racinaire
forme

frquence

racine Iaire racine IIaire

Cicer arietinum L. lobe

arrondie

CAO01 CAO09

allonge
Medicago sativa L.

lobe

**

CAO01

Medicago ciliaris L.

arrondie

**

CAO08

*1-6 nodules; ** 5-10 nodules; +: prsence; - : absence.

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02

1cm

Figure 1: nodosits induites par la souche CAO02 au niveau des racines de

Cicer arietinum
01

200m

Figure 2 : nodosit induite par la souche CAO01 au niveau des racines de

Medicago sativa observ la loupe binoculaire (x 20).
2- Caractres culturaux et morphologiques
Des quarante-cinq isolats obtenus partir de nodosits effectives de Cicer
arietinum L. cultiv lITGC de Guelma, neuf nodulent leur plante hte. Ces rhizobia
sont Gram-, catalase + et se prsentent sous forme de courts btonnets. Les colonies
sont circulaires, convexes, translucides et gommeuses. Elles nabsorbent pas ou trs peu
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le rouge Congo sur milieu YEMA comme dcrit par Jordan (1984). La majorit dentre
elles acidifient le milieu en prsence de BTB et aucune souche ne produit le 3-ctolactose, caractre distinctif du genre Agrobacterium biovar1 (Bouzar et al., 1995). Le
tableau II rsume certains de ces caractres.

3- Caractrisation phnotypique
3-1.Tolrance la temprature
Sur le plan de la tolrance la temprature, toutes les souches testes prsentent
une bonne croissance 42C (voir tableau III). On notera que les souches CAO03,
CAO04 et CAO05 ne peuvent pas croitre 45C.
3-2. Tolrance au NaCL
Nos rsultats montrent que les souches CAO exhibent une large variation
concernant le stress salin. Le profil de rsistance au NaCl des ces souches, reprsent
dans la figure 3 rvle que toutes les souches ont une bonne croissance sur milieu
YEMA additionn de 2% de NaCl et que plus de la moiti dentre elles tolrent la
prsence de 5% de NaCl. Seuls 11% de ces souches continuent de crotre une
concentration de 7% (figure 3).
3-3. Rsistance intrinsque aux antibiotiques
Concernant la rsistance intrinsque aux antibiotiques des rhizobia, il a t
rapport que les souches croissance rapide sont plus sensibles aux antibiotiques que
les souches croissance lente (Jordan, 1984, Elkan 1992). Dans notre tude, la quasitotalit des bactries nodulant le pois chiche montrent une rsistance la kanamycine de
100g/ml et la pnicilline de 60g/ml (voir tableau III). Seule la souche CAO02 est
sensible la kanamycine la concentration utilise. La rsistance la kanamycine, la
pnicilline et lampicilline des rhizobia isoles des nodosits de Cicer arietinum dans la
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rgion mditerranenne a t rapporte (Laranjo et al., 2004 ; Alexandre et al., 2006).

Maatallah et al., (2002) dcrivent que la majorit des souches tudies montrent une
rsistance la kanamycine alors que seulement 25% sont rsistantes 50g/ml
dampicilline.
Tableau II: caractres culturaux et microscopiques des souches nodulantes
aprs 3 jours dincubation 28C.
Souches

Colonies sur milieu

Taille des

Raction sur

Coloration

YEMA + rouge

colonies

YEMA + BTB

Gram

2mm

acide

ngative

1,5mm

acide

ngative

2mm

acide

ngative

2,5mm

acide

ngative

1,5mm

alcaline

ngative

2mm

acide

ngative

1,5mm

acide

ngative

2mm

acide

ngative

2mm

acide

ngative

Congo

CAO 01
CAO 02
CAO 03

CAO 04

CAO05

CAO 06

CAO 07
CAO 08

CAO 09

rose, circulaire,
mucilagineuse
blanche, circulaire,
mucilagineuse
lgrement rose,
circulaire
mucilagineuse
lgrement rose,
circulaire,
mucilagineuse
lgrement rose,
circulaire,
mucilagineuse
lgrement rose,
circulaire,
mucilagineuse
blanche, circulaire,
mucilagineuse
lgrement rose,
circulaire,
mucilagineuse
lgrement rose,
circulaire,
mucilagineuse

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Tableau III: profil de rsistance la temprature des souches tudies.

Temprature (C)
Isolats

28

37

42

45

CAO 01

+++

+++

+++

+++

CAO 02

+++

+++

++

CAO 03

+++

+++

++

CAO 04

+++

+++

++

CAO 05

+++

+++

++

CAO 06

+++

+++

+++

++

CAO 07

+++

++

++

++

CAO 08

+++

++

++

++

CAO 09

+++

+++

++

+++ : trs bonne croissance, ++ : bonne croissance ; + : faible croissance ; - : aucune

croissance

Figure 3: profil de rsistance au stress salin aux concentrations de : 2, 4, 5, 6 et 7%

de NaCl.
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Tableau IV: rsistance intrinsque aux antibiotiques.

Taux de rsistance la
kanamycine
(100g/ml)

Taux de rsistance la
pnicilline G
(60g/ml)

Taux de rsistance la
lampicilline
(20g/ml)

90%

100%

100%

3-4. Analyse du phnogramme

Lanalyse de 22 caractres phnotypiques par la mthode UPGMA a permis
dtablir un dendrogramme (figure 4). Ce dendrogramme prsente 3 groupes distincts.
La souche CAO08 du groupe 1 sapparente la souche Sinorhizobium sp.NGR234
symbionte large spectre dhte. En effet, dans cette tude, 2 souches CAO01 et
CAO08 ont nodul les lgumineuses Medicago sativa et M. ciliaris respectivement (voir
tableau I et figure 2) mais elles ont induit des nodosits inefficientes au niveau des
racines de Cicer arietinum L. Ces rsultats suggrent que les deux souches seraient des
membres du genre Sinorhizobium.
DISCUSSION
Dans cette tude, neuf souches de rhizobia nodulant le pois chiche cultivar FLIP
90-13 ont t caractrises du point de phnotypique. Le dendrogramme obtenu (figure
4) montre une diversit de ces rhizobia rparties en 3 groupes et permet dapparenter la
souche CAO08 (groupe 1) au genre Sinorhizobium. Lanalyse numrique ralise
partir de 71 caractres (API 20NE et 50CH) des souches du groupe 1 et 3 montre que la
souche CAO08 forme un mme groupe avec la souche Sinorhizobium sp. NGR234 et
suggre galement lappartenance de la souche CAO08 au genre Sinorhizobium (voir

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figure 5). Des auteurs ont mentionn lexistence de souches du genre Sinorhizobium

CAO 09
CAO 08

1
S. sp NGR 234
CAO 06
CAO 04

2
CAO 03
CAO 05
CAO 07

3 02
CAO
0

20

40

60

80

100

120

(Dlink/Dmax)*100

Figure 4: dendrogramme (UPGMA) des caractres phnotypiques aprs analyse

numrique des rsultats des tests API 20NE.
comme symbiontes du pois chiche (Matallah et al. 2002). Des travaux raliss par
Aouani et al. (2001) ont montr que Cicer arietinum L. tait nodul par Sinorhizobium
medicae. S. medicae a t dcrite comme symbionte spcifique des espces de
Medicago (Rome et al, 1996). Nos rsultats concordent avec ceux de la littrature cite.
Cependant une tude complmentaire portant sur le profil plasmidique de nos souches
serait ncessaire pour confirmer la position taxonomique de CAO08 qui a nodul
Medicago sp. Nanmoins, il est remarquer que les rsultats obtenus soulignent que le
pois chiche cultiv dans la rgion Nord-Est de lAlgrie peut-tre galement nodul par
le genre Sinorhizobium.
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CAO 02

3
CAO 07

CAO 08

1
S. sp. NGR234

CAO 09

CAO 03

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

(Dlink/Dmax)*100

Figure 5 : dendrogramme (UPGMA) des caractres phnotypiques aprs analyse

numrique des rsultats des tests API 20NE et API 50CH.
Par ailleurs, les rhizobia que nous avons testes apparaissent tre bien adaptes
la variation de temprature, elles rsistent toutes une temprature de 42C. On notera
quune majorit des isolats du groupe 2 (figure 4) se caractrise par une absence de
croissance 45C. Le maximum de temprature pour la croissance des rhizobia
nodulant le pois chiche rapport par Nour et al. (1994, 1995) est de 40C. Dautre part,
Matallah et al. (2002) dcrivent une temprature maximale comprise entre 30-37C
pour les rhizobia de Cicer arietinum L. Gnralement, il est connu que les souches les
plus thermo-tolrantes montrent une efficience symbiotique faible (Laranjo et al. 2002).
Il a t dcrit que le stress salin pouvait dcroitre lefficience de la symbiose rhizobia35

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legumineuse en inhibant des vnements symbiotiques prcoces comme par exemple le

chimiotactisme et la colonisation des racines interfrant ainsi sur la formation des
nodules (Hashem et al., 1998). Les rhizobia symbiotiques nodulant le pois chiche
tolrent une concentration de 2% de NaCl (Nour et al. 1994, 1995 ; Zahran, 1999). En
accord avec ceci, nos rsultats montrent que toutes les souches poussent bien une
concentration de 2% de NaCl. Notons que les souches du groupe 3 (CAO02 et CAO07)
ne poussent pas en prsence dune concentration de NaCl suprieure 2%.

CONCLUSION
Dans ce travail, lapproche phnotypique a permis dindiquer lexistence dune
diversit des souches CAO nodulant Cicer arietinum L. et de donner une indication de
la position taxonomique de certaines dentre elles. Deux souches CAO01 et CAO08 ont
nodul leur plante hte et Medicago sp. et pourraient tre assignes au genre
Sinorhizobium. Cependant, une tude portant sur la dtermination des caractres
gnotypiques (profil plasmidique) permettrait de confirmer cette suggestion.

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