ALGAS CAPACES DE PRODUCIR BIODIESEL

Las algas estn compuestas bsicamente por protenas,

carbohidratos, cidos nucleicos y cidos grasos. Los cidos grasos
se encuentran en las membranas, en los productos de
almacenamiento, metabolitos, etc. El porcentaje de cidos grasos
vara segn la especie, aunque hay especies cuyos cidos grasos
representan 40% de su peso seco. Estos son los cidos grasos que
luego son convertidos en biodisel. Para la produccin de estos se
buscan algas que contengan un alto contenido en lpido y que sean
fcilmente
cultivables.
los tipos de algas que tiene suficiente lipidos y que son facilmente
cultivables son las siguientes:

las

Scenedesmus obliquus Scenedesmus quadricauda

Chlamydomonas rheinhardii

Chlorella vulgaris

Chlorella pyrenoidosa

Spirogyra sp.

Dunaliella salina

Euglena gracilis

Prymnesium parvum

Tetraselmis maculata

Botryococcus braunii
especies

ma

utilizadas

son:

Scenedesmus dimorphus Esta es una de las preferidas por el

alto rendimiento de aceites para biodisel, pero uno de los
problemas es que produce gruesos sedimentos si al cultivo no se
lo
agita
con
frecuencia
Dunaliella tertiolecta Esta cepa produce cerca de 37 % de

aceites. Es una cepa que crece rpido lo que significa que tiene
una
alta
tasa
de
absorcin
de
CO2.
Bacilliarophyta (diatomea) Es una de las favoritas del ASP. El
problema es que necesita silicona en el agua, mientras que las
Clorofita
necesitan
nitrgeno
para
crecer
Chlorofita - Algas verdes tienden a producir almidn, en vez de
lpidos. Tienen tasas de crecimiento muy altas a 30 C con alta
intensidad de la luz agua de tipo en 55 mmho/cm.

Publicado por carmen fuentes en 10:51

g) Composicion de acidos grasos.

Muchos cultivos producen semillas oleaginosas cuya composicion en acidos
grasos no es la ideal para el uso al que se destinan. La aplicacion de
los metodos tradicionales de mejora, reforzados con la mutagenesis
quimica, ha permitido la obtencion de nuevas variedades con
alteraciones en la composicion de acidos grasos de la semilla, en
bastante especies. Son ejemplos destacables las nuevas variedades de
colza bajas en acido euricico y las reducciones en los niveles de acidos
grasos poli-insaturados en soja, girasol y lino (linaza). La mayor parte
de la variacion genetica en la composicion de acidos grasos en semilla
parece implicar la presencia de un alelo de un gen que rompe el
metabolismo normal de acidos grasos y conduce a la acumulacion de
productos intermedios en los lipidos de la semilla. Sin embargo, parece
probable que dadas las limitaciones geneticas de este abordaje, muchos
otros cambios deseables en la composicion de acidos grasos podrian

requerir la aplicacion directa de los metodos de ingenieria genetica.

Existen dificultades como por ejemplo las lagunas en el conocimiento de
la bioquimica y la regulacion del metabolismo de los lipidos (que se van
enmendando con los estudios exhaustivos en Arabidopsis thaliana ), y el
hecho de que muchas enzimas claves estan ligadas a membrana, por lo que
los intentos dirigidos a su solubilizacion y purificacion no han tenido
exito.

Se estan disen~ado varias estrategias encaminadas a modificar la

composicion en acidos grasos de semillas oleaginosas, basadas los
progresos en el conocimiento de la bioquimica y genetica de la sintesis
de los lipidos. A partir de los mutantes actualmente disponibles en
Arabidopsis
se puede profundizar en el conocimiento de que genes,
entre los actualmente disponibles provenientes de E. coli y de
mamiferos, juegan un papel mas importante en el metabolismo de los
acidos grasos, de cara a su aislamiento, clonaje e incorporacion al
genoma de las plantas cultivadas. Aunque la sintesis de acilgliceridos
participa de rutas relativamente complejas, el conocimiento de su
bioquimica y, en particular, los analisis con mutantes pueden ser de
gran utilidad en el disen~o de alteraciones del metabolismo lipidico con
fines de mejora.

TCNICAS BSICAS

1.- Recoleccin y almacenamiento de muestras.

2.- Extraccin de cidos nucleicos.
3.- Separacin de aann mediante electroforesis en gel.
4.- Modificacin enzimtica de aann (generalmente tratamiento con endonucleasas de restriccin)
5.- Inmovilizacin del aann mediante transferencia a soportes slidos.
6.- Preparacin de sondas marcadas.
7.- Hibridacin de las sondas con aann inmovilizados.
8.- Otras tcnicas: PCR, secuenciacin, clonacin de ADN.

EXTRACCIN Y CARACTERIZACIN DE ACIDOS NUCLEICOS

Las fuentes de cidos nucleicos son variadas:

1.- ADN celular total (cromosmico), en bacterias, clulas, tejidos,

2.- ADN plasmdico o extracromosmico.
3.- ADN de orgnulos: mitocondrias o cloroplastos. Primero se separa el orgnulo por centrifugacin y
despus extraer el ADN.
4.- ADN viral.
5.- ARN.
Para hacer la extraccin del ADN celular total el primer paso es la lisis celular, tiene que ser suave para que el
ADN no se degrade. Se puede utilizar un detergente como el SDS, utilizando un alcali o hirvindolo. Tenemos
un extracto que tiene el ADN y ms compuestos.
Para separar el ADN del resto de los compuestos se hace una centrifugacin concreta y tenemos un extracto
celular con cidos nucleicos y tambin otros contaminantes. Despus se hace un tratamiento enzimtico con
proteasas que degradan algunas protenas contaminantes.
El siguiente paso es la extraccin del cido nucleico por solubilizacin diferencial. Se basa en que los cidos
nucleicos tienen propiedades diferentes a las de las protenas. Tienen una carga negativa y son hidroflicos.
Las protenas son ms hidrofbicas, por eso aadimos al extracto un solvente orgnico, que suele ser el fenol,
mezclamos y en el fenol se quedan retenidas las protenas porque son hidrofbicas y los cidos nucleicos se
quedan en la fase acuosa, que se queda arriba. Debajo est la fase fenlica mas densa, donde estn las
protenas y hay una interfase donde hay protenas coaguladas.
Para la concentracin de los cidos nucleicos se aaden sales y etanol absoluto. El ADN precipita y forma una
maraa blanquecina. Con una varilla de vidrio se saca el ADN que tiene mucha afinidad por el vidrio. Se pone
en un tubo con agua y se vuelve a resuspender.
La extraccin del ARN es prcticamente igual.
Una vez extrados los cidos nucleicos se hace la caracterizacin de estos. Nos fijamos en tres cosas:
1.- En su concentracin.
2.- En su pureza.
3.- En su tamao.
Para la medida de la concentracin se mide la absorbancia a 260 nm. La absorbancia da idea de su
concentracin. La relacin es que a una absorbancia a 260 nm que sea igual a 1 le corresponde una cantidad
de ADN de cadena doble de 50 g/ml. Si es ADN de cadena simple o ARN este valor vara.
Para la medida de la pureza se mide la absorbancia a 260 nm y a 280 nm, y se calcula el cociente entre las
dos. Para un valor entre 1,8 y 2 es una muestra pura o con pocos contaminantes. Para valores menores de
1,8 indica que la muestra est contaminada por protenas. Y para valore mayores que 2 quiere decir que la
muestra est contaminada por ARN.
La absorbancia a 280 nm da una idea de las cantidades de protenas que hay en la muestra. A una relacin
de 1,5 le corresponde una contaminacin de protenas del 30%.
Para medir el tamao, se mide con la electroforesis.

ELECTROFORESIS EN GEL.

Las molculas de cidos nucleicos tienen carga negativa, y si se someten a un campo elctrico se mueven del
polo negativo al positivo, y este movimiento depende de dos factores:
1.- La forma de la molcula.
2.- La relacin carga/masa.
En solucin todas las molculas de ADN tienen la misma forma. La relacin carga/masa tambin es
equivalente entre todas las molculas. Se ponen molculas diferentes en solucin y se mueven todas igual y
no se pueden separar en tamaos.
Necesitamos un factor que nos permita que las molculas se separen en funcin a su tamao, o sea, una
matriz. Esta puede ser de Acrilamida o de Agarosa.
La acrilamida nos permite separar molculas de cidos nucleicos con pesos muy parecidos. La agarosa tiene
mayor resolucin para molculas ms grandes.
En una matriz el ADN migra en funcin de su forma, su relacin carga/masa y de su tamao.
La matriz de agarosa est formada por polmeros de arabinosa. Un vez que se gelifica se van quedando
poros, y por esos poros es por donde migra el ADN. Las molculas pequeas se mueven ms rpido que las
molculas ms grandes. Para poder ver el ADN hay que teir el gel con un colorante intercalar, es una
sustancia que se mete entre las dos hebras de cidos nucleicos (por eso son altamente cancergenos). Si no
hay cidos nucleicos no hay colorante. Estos colorantes se pueden excitar con luz ultravioleta y emiten
fluorescencia.
Para averiguar el tamao de la molcula hay que utilizar un marcador de peso molecular, que son soluciones
de ADN lineal de cadena doble que tienen tamao conocido.
Hay diferentes factores que afectan a la migracin del ADN:
Tamao de la molcula; la relacin que hay entre el tamao y la migracin no es lineal, la distancia es
inversamente proporcional al logaritmo del tamao de la molcula (y se hace lineal). Se calcula la grfica para
el marcador que hemos puesto en el gel con la muestra. Medimos la distancia que ha recorrido nuestra
muestra y en la grfica extrapolamos. Todo esto teniendo en cuenta que el marcador y la molcula muestra
tienen que ser del mismo tipo, porque hay otros factores que afectan a la migracin del ADN.
Concentracin de la agarosa; cuanto mayor es la concentracin de la agarosa los huecos que quedan
para que pase el ADN es mucho menor. Si est muy concentrado, las molculas muy pequeas se pueden
mover ms fcilmente que las grandes, de manera que nos permite mayor resolucin en las molculas ms
pequeas. Cuando la agarosa est muy diluida o si est muy concentrada no nos da una buena separacin.
La agarosa muy concentrada es para separar fragmentos mas pequeos, si est menos concentrada separan
fragmentos mas grandes.
Conformacin del ADN; una molcula de ADN puede ser lineal, circular y circular enrollada. Estas tienen el
mismo tamao y todas se deberan mover igual. En general se cumple que el ADN superenrrollado va mas
rpido que el ADN circular y este mas rpido que el lineal. Si la agarosa esta muy diluida puede ser que la
lineal sea ms rpida que la circular.
Presencia de colorantes intercalares; al meterse entre las hebras de ADN afectan a su movilidad en un gel
de agarosa. Normalmente primero se hace la electroforesis y despus se aade el bromuro.
Composicin del tampn de electroforesis; hay dos tampones bsicamente, el TAE y el TBE. El TBE tiene
mejor capacidad de tamponamiento, pero normalmente tiene ms inconvenientes. El TAE tiene mejor
resolucin en molculas de peso molecular bajo, en relacin al TBE que es mejor para molculas de mayor
tamao.

 Voltaje; si el voltaje es muy alto no se da tiempo a las molculas a que se separen en funcin de su
tamao. Para molculas de alto peso molecular hace falta voltajes muy pequeos.
Direccin del campo elctrico; hay veces en las que conviene ir cambiando la direccin del campo elctrico
y nos permite separar molculas de alto peso molecular.

APLICACINES DE LA ELECTROFORESIS EN GEL.

1.- Aplicacin analtica: para calcular el tamao de ADN por comparacin con un marcador de peso molecular
hay que correr el marcador junto con el ADN, se representa el tamao en relacin con la distancia recorrida
del marcador, y despus se compara con las distancias. Si se representa el logaritmo del tamao frente al
tiempo sale una recta.
2.- Averiguar la calidad de la muestra de ADN. Si est degradada, si est contaminada con ARN, como de
concentrada est, etc.
3.- Estudio de interacciones entre molculas de cidos nucleicos o entre cidos nucleicos y protenas. Si hay
interaccin de la protena con el ADN se pega a l y el ADN ya no migra igual, migrar mucho menos que las
molculas que no estn unidas a protenas, es el anlisis de retardo en gel de agarosa, que es para estudiar
este tipo de interacciones.
4.- Aislamiento de molculas de tamao determinado. Queremos separar de un plsmido un fragmento de
este que nos interesa, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina. Cortamos los fragmentos y lo
tenemos todo mezclado en un tubo de ensayo, hacemos electroforesis y cortamos el fragmento del gel que
nos interesa y hacemos una solucin.