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AISLAMIENTO E

IDENTIFICACIN
DE SHIGELLA SPP

Apartados de este ejercicio

A. Caractersticas generales de Shigella


B. Material
C. Medios de cultivo y reactivos
D. Fases del aislamiento e identificacin de Shigella
E. Fase 1.-Filtracin de Membrana y Preenriquecimiento en medio lquido lquido
F. Fase 2.-Aislamiento diferencial en medios slidos selectivos
G. Fase 3.-Identificacin Bioqumica
H. Expresin de los resultados
I. Resumen
J. Introduccin del comentario
K.- Envo al servidor de los resultados del ejercicio

A. Caractersticas generales de Shigella.


Shigella es un gnero bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias de forma bacilar,
no esporuladas, inmviles, pero animados de movimiento pendular (oscilacin) in situ.
Son gramnegativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la glucosa sin produccin
de gas; no obstante, se han encontrado algunos biotipos que producen gas de la glucosa. No decarboxilan la lisina. No
fermentan la lactosa. No utilizan el citrato como nica fuente de carbono. No crecen en el medio cianuro potsico. Su
actividad bioqumica es muy reducida.
El gnero Shigella se divide en cuatro especies: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei.

B. Material

Matraces Erlenmeyer.

Pipetas estriles de 10 mL y 1 mL.

Gradillas. Tubos de ensayo de 16 x 160 mm.

Asa de cultivo.

Placas de Petri de 90 mm.

Estufa de cultivo.

Bao Maria.

C. Medios de cultivo y reactivos

Caldo de cultivo pH 8

Agar Salmonella-Shigella (S-S)

Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD)

Agar MacConkey

Agar lisina hierro (Lysine Iron Agar: LIA)

Agar TSI Kligler

Caldo Urea

D. Fases del aislamiento e identificacin de Shigella

1.

Filtracin de Membrana y Preenriquecimiento en medio lquido.

2.

Aislamiento diferencial sobre medios slidos selectivos.

3.

Confirmacin bioqumica de las colonias sospechosas.

E. Fase 1.-Filtracin de Membrana y Preenriquecimiento en medio lquido lquido (Ver vdeo de Filtracin y
Preenriquecimiento)
Se utiliza la filtracin de membrana para concentrar las bacterias existentes en 100 mL de agua.

En condiciones aspticas, se utiliza un filto de membrana


de 0,45 m de tamao de poro que se coloca en el
portafiltros de la rampa de filtracin de vaco.

Se coloca el embudo del filtro previamente esterilizado.

Se inicia la filtracin de los 100 mL de agua.

Una vez finalizado, se recoge el filtro con unas pinzas


estriles y se coloca dentro de un matraz con Caldo de
Cultivo pH 8.

Se incuba el matraz a 37C durante 1-5 das.

F. Fase 2.-Aislamiento diferencial en medios slidos selectivos (Ver vdeo Aislamiento Diferencial)
En esta etapa se utilizan medios de cultivo diferenciales que por su composicin permiten que las colonias de Shigella crezcan con
un aspecto caracterstico en cada uno de ellos (colonias tpicas)

A partir del cultivo obtenido en el preenriquecimiento


sembrar, por duplicado, con asa de cultivo sobre:
Agar Salmonella-Shigella (S-S)

Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine


Desoxycholate: XLD)

Agar MacConkey

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (S-S): CRECIMIENTO CARACTERSTICO


(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Las colonias sospechosas de Shigella crecidas en


Agar Salmonella-Shigella son transparentes,
translcidas u opacas y suelen ser lisas. En este medio
las colonias de otros microorganismos que fermentan
la lactosa (coliformes) son colonias rojizas y en
muchos casos mucoides.

COLONIAS SOSPECHOSAS
AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO (XLD): CRECIMIENTO
CARACTERSTICO (Hacer clic sobre cada placa para aumentar)
Las colonias sospechosas de Shigella crecidas sobre
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) son
transparentes y del mismo color que el medio de
cultivo (rojo).
Este gnero bacteriano al no fermentar la xilosa, la
lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo
el rojo fenol. Como tampoco decarboxilan la lisina, no
se produce color rojo prpura alrededor de las
colonias, al no haberse producido cadaverina.

COLONIAS SOSPECHOSAS
AGAR MAC CONKEY: CRECIMIENTO CARACTERSTICO (Hacer clic sobre cada placa
para aumentar)

Las colonias sospechosas de Shigella en Agar


MacConkey son incoloras y transparentes. En este
medio las colonias de otros microorganismos que
fermentan la lactos (coliformes) son colonias rojizas.

COLONIAS SOSPECHOSAS
Le aconsejamos que se ejercite en la interpretacin de las imgenes comprobando su correcta interpretacin haciendo clic en cada
pregunta en la letra azul que antecede a la opcin que le parezca correcta.
Debe selecionar las placas de los distintos medios selectivos en las que observe un crecimiento tpico de Shigella.
Ejemplo 1

Ejemplo 2

Ejemplo 3

Agar XLD

Agar MacConkey

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Agar S-S
(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

En este caso:

a) Placa seleccionada
b) Placa no selecionada

En este caso:

a) Placa seleccionada
b) Placa no selecionada

En este caso:

a) Placa seleccionada
b) Placa no selecionada

Ejemplo 4

Ejemplo 5

Ejemplo 6

Agar XLD

Agar MacConkey

Agar XLD

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

En este caso:

En este caso:

a) Placa seleccionada
b) Placa no selecionada

a) Placa seleccionada
b) Placa no selecionada

En este caso:

a) Placa seleccionada
b) Placa no selecionada

Lectura de resultados sobre agar Salmonella-Shigella del supuesto prctico


Se trata de interpretar los resultados obtenidos en las siembras sobre agares selectivos en busca de colonias sospechosas de Shigella.
Para ello:
1. Observe las placas buscando colonias sospechosas de Shighella
1. Observe tambin las placas buscando colonias no sospechosas de Shigella
2. Conteste a las preguntas

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (S-S)


(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Placa S-S1

Placa S-S2

Placa S-S3

Placa S-S4

Contestacin a las preguntas


1. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de "agar Salmonella-Shigella":
a) S-S4

b) S-S3, S-S2

c) S-S6, S-S4, S-S5

2. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Salmonella-Shigella:


a) S-S1, S-S4

b) S-S1, S-S2, S-S3

c) S-S3

AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO (XLD)


(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Placa XLD1

Placa XLD2

Placa XLD3

Placa XLD4

Contestacin a las preguntas


3. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Xilosa-Lisina-Desoxicolato:
a) XLD4, XLD3

b) XLD1, XLD2

c) XLD1

4. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Xilosa-Lisina-Desoxicolato:


a) XLD1

b) XLD2, XLD3, XLD4

c) XLD4, XLD3

AGAR MAC CONKEY

(Hacer clic sobre cada placa para aumentar)

Placa Mac1

Placa Mac2

Placa Mac3

Placa Mac4

Contestacin a las preguntas


5. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de MaConkey:
a) Mac2, Mac3, Mac4

b) Mac2

c) Mac2, Mac4

6. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas deMaConkey:


a) Mac1

b) Mac4, Mac2

c) Mac4, Mac3, Mac1

G. Fase 3.-Identificacin Bioqumica


Esta identificacin se suele realizar en 2 subfases:
Subfase 4A: Identificacin bioqumica inicial con unas pruebas determinadas: Generalmente, fermentacin de glucosa y
lactosa (TSI), descarboxilacin de la lisina (LIA) y utilizacin de la urea.
Subfase 4B: Identificacin bioqumica final con un sistema multipruebas: Generalmente con las 20 pruebas de la galera
API20E. Esta subfase slo se realiza con las cepas seleccionadas en la subfase anterior.

Subfase 4A. Identificacin bioqumica inicial (Ver vdeo Identidficacin Bioqumica Inicial)
Aislar, como mnimo, dos colonias con aspecto tpico de Shigella de cada uno de los medios de aislamiento selectivo utilizados.

Sembrar cada colonia en Agar Hierro Triple Azcar


(TSI), con aguja de cultivo, primero en el fondo por
picadura y luego, en la superficie inclinada por estra.

Sembrar, por picadura en el fondo y por estra en la


superficie inclinada del medio Agar Lisina Hierro
(LIA).

Sembrar, con asa de siembra en Caldo Urea.

Incubar los tubos de TSI y Urea a 37 C durante 24


horas y los de agar LIA a 37 C durante 24-48 horas.

REACCIONES POSITIVAS DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS:


AGAR TRIPLE-AZUCAR-HIERRO

Shigella da la siguiente reaccin sobre TSI:


- Alcalina (rojo) en la superficie inclinada.
- cida (amarillo) en el fondo.
- Sin produccin de SH2 (sin ennegrecimiento del
fondo del tubo).

Lactosa (-), Glucosa (+), SH2 (-) con o sin gas

AGAR LISINA-HIERRO
Shigella da la siguiente reaccin sobre LIA:
- Alcalina (color prpura) en la superficie inclinada.
- cida (amarillo) en el fondo.
- Sin Produccin de SH2 (ennegrecimiento del fondo
del tubo).

LCD (-), SH2 (-)

CALDO UREA

Las Shigella no son capaces de utilizar urea.

REACCIN NEGATIVA

El medio urea continen contiene un indicador de pH


que vira a color rosa fuerte cuando la reaccion es
positiva.
La reaccin debe ser negativa: urea (-).
Permanece el mismo color que antes de la incubacin

REACCIN POSITIVA

Seleccionar todos los cultivos que muestren


crecimiento caracterstico de Shigella sobre agar TSI,
se correspondan o no con la reaccin de dichos
cultivos en agar LlA.

Caso 1

Caso 2

Caso 3

Caso 4

TSI

Tpico

Tpico

Atpico

Atpico

LIA

Tpico

Atpico

Tpico

Atpico

No desechar los cultivos atpicos sobre agar TSI


cuando la reaccin sobre agar LIA es tpica.
Desechar los cultivos que no se correspondan con el
crecimiento tpico de las Shigella sobre agar TSI ni
con el de agar LIA.

Seleccionar

Seleccionar Seleccionar Desechar

Desechar todos los cultivos que den urea positivos

TSI

LIA

Urea

Caso 1

Tpico

Tpico

Negativo

Seleccionar

Caso 2

Tpico

Tpico

Positivo

Desechar

Caso 3

Tpico

Atpico

Negativo

Seleccionar

Caso 4

Tpico

Atpico

Positivo

Desechar

Caso 5

Atpico

Tpico

Negativo

Seleccionar

Caso 6

Atpico

Tpico

Positivo

Desechar

Caso 7

Atpico

Atpico

Negativo

Desechar

Caso 8

Atpico

Atpico

Positivo

Desechar

Le aconsejamos que se ejercite en la interpretacin de las imgenes comprobando su correcta interpretacin haciendo clic en
cada pregunta en la letra azul que antecede a la opcin que le parezca correcta.
Debe selecionar los tubos de las distintas prubas bioqumicas en las que observe una reaccin tpica de Shigella.
Ejemplo 1

Agar TSI

En este caso:

a) Tubo seleccionado
b) Tubo no selecionado
Ejemplo 4

Ejemplo 2

Ejemplo 3

Agar TSI

Agar TSI

En este caso:

a) Tubo seleccionado
b) Tubo no selecionado
Ejemplo 5

En este caso:

a) Tubo seleccionado
b) Tubo no selecionado
Ejemplo 6

Ejemplo 4

Agar TSI

En este caso:

a) Tubo seleccionado
b) Tubo no selecionado

Agar LIA

Agar LIA

En este caso:

En este caso:

a) Tubo seleccionado
b) Tubo no selecionado

a) Tubo seleccionado
b) Tubo no selecionado

Agar LIA
En este caso:

a) Tubo seleccionado
b) Tubo no selecionado

Agar LIA
En este caso:

a) Tubo seleccionado
b) Tubo no selecionado

Lectura de resultados de la confirmacin bioqumica inicial del supuesto prctico

Colonias

TSI

LIA

Urea

Contestacin
Preguntas

7. Esta colonia debe ser:


Seleccionada
Colonia 1
Desechada

8. Esta colonia debe ser:


Seleccionada
Colonia 2
Desechada

9. Esta colonia debe ser:


Seleccionada
Colonia 3
Desechada

10. Esta colonia debe ser:


Seleccionada
Colonia 4
Desechada

11. Esta colonia debe ser:


Seleccionada
Colonia 5
Desechada

12. Esta colonia debe ser:


Seleccionada
Colonia 6
Desechada

13. Esta colonia debe ser:


Seleccionada
Colonia 7
Desechada

Subfase 4B. Identificacin bioqumica final (Ver vdeo galera API)


Con las colonias seleccionadas en la identificacin bioqumica inicial se efecta lo siguiente:

A partir de los tubos positivos de TSI o LIA, sembrar una


galera de identificacin bioqumica partiendo de los cultivos
seleccionados.

Habitualmente se hace una galera API 20E que consiste en


20 pruebas bioqumicas y que permite identificar el
microorganismo al menos a nivel de Gnero y en muchos
casos tambin a nivel de Especie.

Lectura de resultados de la confirmacin bioqumica final del supuesto prctico

Cepas

API20E
Ayuda Interpretacin Resultados

Contestacin preguntas

14. La codificacin corresponde a:


Seleccionada
1

0104140 Shigella flexneri


0104521 Yersinia enterocolitica
2504752 Salmonella spp.
3005573 Enterobacter cloacae
0776000 Proteus mirabilis.

Ver perfiles numricos

5044124 Vibrio cholerae


5306761 Serratia marcescens
6504750 Salmonella spp.

7704752 Salmonella spp.


1104112 Shigella sonnei

15. La codificacin corresponde a:


0104452 Salmonella paratyphi A
1104112 Shigella sonnei
4104100 Salmonella gallinarum
4504010 Salmonella pullorum
5100100 Yersinia ruckeri

Seleccionada
2

0676001 Proteus vulgaris


5306761 Serratia marcescens

Ver perfiles numricos

5704552 Salmonella arizonae


6004540 Salmonella typhi
0104140 Shigella flexneri

16. La codificacin corresponde a:


5044560 Escherichia coli
1104112 Shigella sonnei
7004743 Klebsiella ozaenae
0206042 Acinetobacter calcoaceticus
0104452 Salmonella paratyphi A

Seleccionada
3

0774000 Proteus mirabilis


0676001 Proteus vulgaris
0104140 Shigella flexneri
Ver perfiles numricos
5204024 Pseudomonas cepacea
6704752 Salmonella sp

17. La codificacin corresponde a:


5044560 Escherichia coli
0104140 Shigella flexneri
7004743 Klebsiella ozaenae
0104452 Salmonella paratyphi A
1104112 Shigella sonnei

Seleccionada
4

0774000 Proteus mirabilis


0676001 Proteus vulgaris
5346761 Serratia marcescens

Ver perfiles numricos

5204024 Pseudomonas cepacea


6704532 Salmonella sp

H. Expresin de los resultados


Expresion final delos resultados de la investigacin de Salamonelas en la muestra
Criterios

Si la confirmacin bioqumica ha resultado positiva para


alguna de las cepas :

Contestacin a las preguntas

18. El aislamiento e investigacin de Shigella en la muestra del


supuesto prctico ha dado como resultado:
a) Presencia de Shigella en 100 mL de agua

Expresar los resultados como


Presencia de Shigella en 100 mL de agua
En casi contrario, expresar los reultados como:

b) Ausencia de Shigella en 100 mL de agua

Ausencia de Shigella en 100 mL de agua

I. Resumen

1 Filtracin de Membrana y Preenriquecimiento en medio


lquido

100 mL de agua + 100 mL de Caldo de Cultivo pH 8


Incubar 37C/1-5 das
- Agar Salmonella-Shigella (S-S)

2 Aislamiento diferencial sobre medios slidos selectivos.

- Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine


Desoxycholate: XLD)
- Agar MacConkey
Seleccionar colonias tpicas

3 Confirmacin Bioqumica

- Agar TSI. Incubar 37C/24 horas


- Agar LIA. Incubar 37C/24 horas

- Citrato de Urea
Si dan resultados tpicos de Shigella, realizar Galeria API 20E.
Expresar los resultados como:

4 Expresin de los resultados

Presencia de Shigella en 100 mL de agua


Ausencia de Shigella en 100 mL de agua

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