Subsídio - Oxidação de Alfa Ácidos No Lúpulo - Envelhecimento Da Cerveja PDF

Msc.
Natlia Ellen Castilho de Almeida
Reatividade das lupulonas, terpenos, flavonoides prenilados e

compostos contendo grupos tiis livre frente aos radicais
formados durante o envelhecimento da cerveja
Tese apresentada ao Instituto de Qumica de So

Carlos da Universidade de So Paulo como parte dos
requisitos para a obteno do ttulo de doutor em
qumica.
rea de Concentrao:
Inorgnica.
Qumica
Analtica
Orientador: Prof. Dr. Daniel Rodrigues Cardoso
So Carlos
2014
Dedicatria
A minha av Maria (in memoriam) pelo

amor eterno, exemplo e incentivo.
Agradecimentos
AGRADECIMENTOS
Agradeo primeiramente a Deus e a Nossa Senhora de Ftima por estarem sempre ao
meu lado. O meu Deus o Deus do impossvel.
A minha famlia e ao meu marido Gustavo pela pacincia, amor e ajuda.
Ao Prof. Dr. Daniel R. Cardoso pela orientao, confiana e amizade.
Aos amigos Wendel e Mrcia por compartilharem momentos bons e difceis.
A Rafaela, Luiza e Leandro pelo companheirismo desde 2004 (Turma de Bacharelado
do IQSC-USP).
Aos colegas do Laboratrio de Qumica Analtica e Inorgnica, IQSC-USP, pela
convivncia, em especial ao tcnico Thiago (Fofo) e ao Dr. Willy pelo auxlio nos
experimentos e momentos de descontrao.
s bibliotecrias Eliana, Bernadete e Wilneide pelo carinho, auxlio e amizade.
s tcnicas de ensino Cidinha e Renatinha pela amizade.
A Dra. Inara Aguiar pela realizao dos clculos tericos.
Ao Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho pela realizao da anlise MALDI-TOFF (DQ
UFSCar).
Ao Prof. Dr. Jlio Csar Borges pelo auxlio no isolamento e purificao da protena
LTP1 (IQSC USP).
Ao Instituto de Qumica de So Carlos (IQSC), Universidade de So Paulo (USP) pela
infraestrutura e oportunidade.
A Universidade de Copenhagen, Dinamarca, pela disponibilidade na realizao do
doutorado-sanduiche. Em especial, ao Prof. Dr. Mogens L. Andersen e Marianne L. Lametsch
pela orientao.
A
FAPESP
pelos
auxlios
financeiros
(bolsa
doutorado
nacional
BEPE).
Epgrafe
"O que sabemos uma gota; o que ignoramos

um oceano"
(Galileu Galilei)
Resumo
RESUMO
A reatividade das lupulonas, terpenos, flavonoides prenilados e compostos contendo grupos
tiis livre foi avaliada frente ao radical 1-hidroxietila (HER) para melhor conhecer o balano
redox da cerveja. As constantes de velocidade aparentes (kap) para a reao entre HER e os
substratos supracitados foram obtidas via cintica de competio utilizando a armadilha
qumica 4-POBN como competidor e monitorando-se o aduto radical formado por RPE. A
partir dos valores obtidos de kap (108 L mol-1 s-1 para as lupulonas, 105 a 107 L mol-1 s-1 para
terpenos, 109 L mol-1 s-1 para os flavonoides prenilados, e 108 a 109 L mol-1 s-1 para tiis) e
pelas concentraes mdias destes compostos na cerveja, pde-se inferir que a extenso da
degradao trmica destes compostos na bebida aumenta na ordem: lupulonas > tiis >
flavonoides prenilados > terpenos. Os produtos de reao foram identificados por
espectrometria de massas, e atravs de investigaes eletroqumicas e clculos ab initio
empregando-se DFT se props um mecanismo de reao. Os produtos de degradao pela
reao com HER foram: derivados hidroxilados e compostos de adio do radical HER para
as lupulonas; derivados hidroxilados para os terpenos; derivados de adio do radical HER
para os flavonoides prenilados; e dissulfetos para os tiis. Em experimento similar foram
determinadas as kap para a reao entre metil steres derivados de cidos graxos insaturados e
esteris com o HER, cujos valores de kap variaram de (2,7 0,1) x 107 at (5,2 0,1) x 107 L
mol-1 s-1 para o metil docosahexanoato e ergosterol, respectivamente. Os dados cinticos aqui
obtidos contribuem para um melhor conhecimento da degradao trmica oxidativa da
cerveja, bem como sugerem que os polifenis prenilados podem conferir um significativo
efeito antioxidante ao organismo humano quando do seu consumo e absoro.
Abstract
ABSTRACT
The reactivity of lupulones, terpenes, prenilated flavonoids and thiol-containing compounds
was evaluated towards the 1-hydroxyethyl radical (HER) to provide a better knowledge of the
redox balance of beer. The apparent rate constants (kap) for the reaction between HER and the
substrates were obtained through a competitive kinetic approach using the spin-trap 4-POBN
as a competitor and by monitoring the radical adduct by EPR. From the obtained values of kap
(108 L mol-1 s-1 for lupulones, from 105 to 107 L mol-1 s-1 for terpenes, 109 L mol-1 s-1 for
prenylated flavonoids, and from 108 to 109 L mol-1 s-1 thiol compounds) and the average
concentrations of these compounds in beer, it is possible to infer that the extension of the
thermal degradation on the beverage is enhanced according to: lupulones > thiol compounds >
prenylated flavonoids > terpenes. The reaction products were identified by mass
spectrometry, and by electrochemical investigations and ab initio (DFT) calculation, a
reaction mechanism has been proposed. The degradation products for the reaction with HER
were: hydroxide derivatives and HER addition products for the lupulones; hydroxide
derivatives for terpenes; HER addition derivatives for prenylated flavonoids; and disulfides
for thiol cmpounds. In similar experiments it was determined the kap for the reaction among
methyl ester derivatives of unsaturated fatty acids and sterols with HER, with kap values
ranging from (2.7 0.1) x 107 to (5.2 0.1) x 107 L mol-1 s-1 for the methyl docosahexanoate
and ergosterol, respectively. The obtained kinetic data may contribute for a better knowledge
of the thermal oxidative degradation of beer, as well as may suggest that prenylated
polyphenols could present a significant antioxidant effect in the human body through its
consumption and absorption.
Lista de Figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma simplificado do processo industrial cervejeiro
17
Figura 2 - Representao da estrutura qumica das humulonas (a) e lupulonas (b): (a-i)
n-humulona, (a-ii) cohumulona, (a-iii) adhumulona, (b-i) n-lupulona, (b-ii) colupulona,
(b-iii) adlupulona
20
Figura 3 - Representao das estruturas qumicas dos principais terpenos presentes no

leo essencial derivado do lpulo: terpenos alcenos (a) -mirceno, (b) limoneno, (c)
terpinoleno, (d) p-cimeno, (e)1,8-cineole, (f) -pineno, (g) -pineno, (h) -humuleno, (i)
-cariofileno, (j) trans--farneseno; terpenos lcoois: (k) -citronelol, (l) geraniol, (m)
linalol, (n) -terpineol, (o) carvacrol, (p) timol, (q) -eugenol, (r) nerolidol
23
Figura 4 - Representao das estruturas qumicas dos flavonoides prenilados derivado

do lpulo: (a) xantohumol, (b) desmetilxantohumol, (c) isoxantohumol,
(d) 8-prenilnaringenina, (e) 6-prenilnaringenina
24
Figura 5 - Fluxograma do mecanismo de biossntese dos compostos contendo grupos

tiis livre pelas leveduras Saccharomyces
26
Figura 6 - Representao das estruturas qumicas dos compostos contendo grupos tiis
livre e bloqueados, e aminocidos: (a) cistena; (b) glutationa; (c) Cys-Gly; (d) cistena
metil ster; (e) His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp; (f) homocistena; (g) DTT; (h) Asn-Arg-CysSer-Gln-Gly-Gly-Ser-Cys-Trp-Asn; (i) cistina; (j) glutationa oxidada; (k) metionina;
(l) S-metil-L-cistena; (m) histidina; (n) serina; (o) triptofano; (p) lisina
39
Figura 7 - Representao das estruturas qumicas (a) colesterol, (b) ergosterol, (c) metil
oleato, (d) metil linoleato, (e) metil linolenato, (f) metil araquidonato, (g) metil
docosahexanoato, (h) metil linoleato conjugado (9E,11E)
41
Figura 8 - Espectros de RPE obtidos experimentalmente para a formao do aduto

radical com concentraes crescentes de isoxantohumol (mol L-1): (a) 2,6 10-5;
(b) 4,4 10-5, (c) 6,2 10-5. As reaes foram conduzidas em solues saturadas de Ar, a
temperatura de 25,0 0,2 oC
53
Figura 9 - Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] versus concentrao de isoxantohumol.

Experimentos realizados pela tcnica de spin-trapping RPE, a temperatura de
25,0 0,2 oC e tempo total de reao de 1 minuto
55
Figura 10 - Voltamogramas cclicos das lupulonas em sua forma molecular, em

acetonitrila contendo 0,2 mol L-1 de perclorato de tetrabutilamnio como eletrlito
suporte. Eletrodos: diamante dopado com boro (trabalho), platina (contra-eletrodo),
ferroceno (referncia interna). As velocidades de varredura foram (mV s-1): (a) = 10,
(b) = 50, (c) = 100, (d) = 200
57
Figura 11 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica contendo os produtos

decorrentes da reao das lupulonas e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a
temperatura de 25,0 0,2 oC, t = 1 minuto de reao. (b) Espectro de massas
(ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 18,7 min (eluato A). (c) Espectro
de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 19,1 min (eluato B). (d)
Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 20,1 min
(eluato C). (e) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em
tr = 20,8 min (eluato D). (f) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do
eluato em tr = 21,3 min (eluato E)
58
Lista de Figuras
Figura 12 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica deuterada (etanol-d6)

contendo os produtos decorrentes da reao das lupulonas e o radical HER, sob
atmosfera de Ar, a temperatura de 25,0 0,2 oC, t = 1 minuto de reao. (b) Espectro de
massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 18,7 min (eluato A). (c)
Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 19,1 min
(eluato B). (d) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em
tr = 20,1 min (eluato C). (e) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do
eluato em tr = 20,8 min (eluato D). (f) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio
do on do eluato em tr = 21,3 min (eluato E)
61
Figura 13 - Representao das possveis ligaes C-H envolvidas na abstrao do

tomo de hidrognio das lupulonas pelo radical HER
66

decorrentes da reao do terpinoleno e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a
(APCI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 20,0 min (eluato A). (c)
Espectro de massas (APCI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 9,0 11,4
min (eluato B)
70
Figura 15 - Representao das estruturas qumicas da (a) quercetina, (b) naringenina
75
Figura 16 - Representao das configuraes espaciais e das superfcies de contorno

dos orbitais moleculares de fronteira desocupados de menor energia (LUMO) e
ocupados (HOMO) de maior energia calculadas para os (a) xantohumol e
(b) isoxantohumol
77
Figura 17 - Representao das possveis ligaes C-H e O-H envolvidas na abstrao do

tomo de hidrognio dos flavonoides prenilados pelo radical HER. (a) xantohumol;
(b) isoxantohumol; (c) 6-prenilnaringenina; (d) 8-prenilnaringenina
78
Figura 18 - Diagrama de energia dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO dos

flavonoides prenilados e do orbital de fronteira SOMO do radical HER
80

decorrentes da reao do xantohumol e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a
(HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 18,2 min (eluato A). (c)
Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 21,0 min
(eluato B). (d) Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em
tr = 21,7 min (eluato C). (e) Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on
do eluato em tr = 23,0 min (eluato D)
82
Figura 20 - Representao das estruturas qumicas do (a) cinamaldedo e (b) cido

p-coumrico
87

decorrentes da reao do isoxantohumol e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a
(HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 16,0 min (eluato A). (c)
Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 18,6 min
(eluato B)
88
Figura 22 - Cromatograma resultante da etapa de isolamento da protena LTP1 por

cromatografia de troca catinica
90
Figura 23 - Gis de SDS-PAGE (18% - acrilamida) decorrentes da anlise das fraes

coletadas no processo de isolamento da protena LTP1. Anlise do padro de massa
molecular (1) e das fraes coletadas por processo de separao por cromatografia de
troca catinica (2-9)
91
Lista de Figuras
Figura 24 - Cromatograma resultante da etapa da purificao da protena LTP1 por

cromatografia de excluso molecular
91
Figura 25 - Gis de SDS-PAGE (18% - acrilamida) decorrentes da anlise das fraes

coletadas no processo de purificao da protena LTP1. Anlise do padro de massa
molecular (1) e das fraes coletadas por processo de separao por cromatografia de
excluso molecular (2-7)
92
Figura 26 - Espectro de Massas decorrente da anlise por MALDI-TOF-MS da protena

LTP1 isolada
93
Figura 27 - Estrutura quaternria da protena LTP1 oxidada65. Figura gerada a partir do

software Weblab Viewer Lite
95
Figura 28 - Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] versus concentrao de cistena (A) e

glutationa (B) em meio normal () e deuterado (). Medidas obtidas pela anlise das
reas dos espectros de RPE. T = 25,0 0,2 oC; 1 minuto de reao
96
Figura 29 - Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) da mistura reacional entre a glutationa

e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a 25,0 0,2 oC, 1 min de reao
98
Figura 30 - Cromatograma resultante da anlise de tiis presentes na cerveja #4. Bandas

de eluio A, em tr = 5,6 min, e B, em tr = 7,4 min, correspondem aos eluatos derivados
do sulfito; banda de eluio C, em tr = 11,2 min, corresponde ao eluato derivado dos
compostos contendo grupos tiis
101
Figura 31 - Cromatograma resultante da anlise de tiis totais contidos na cerveja #4.

Bandas de eluio A, em tr = 5,6 min, e B, em tr = 7,4 min, correspondem aos eluatos
derivados do sulfito; banda de eluio C, em tr = 14,9 min, corresponde ao eluato
derivado do excesso de TCEP adicionado; banda de eluio D, em tr = 18,2 min,
corresponde aos eluatos derivados dos compostos contendo grupos tiis
102
Figura 32 - Concentrao total de compostos contendo tiis livre em diferentes cervejas

versus concentrao de TCEP adicionado
102
Figura 33 - Curva de calibrao para (A) glutationa e (B) glutationa oxidada em tampo
Tris- (0,25 mol L-1, pH 7,5) aps a adio de diferentes concentraes de TCEP
(mol L-1): () 2,5 10-4; () 4,5 10-4
103
Figura 34 - Concentrao de tiis presentes (a) e totais (b) em diferentes cervejas versus
concentrao de protena total determinada pelo mtodo de Bradford
105
Figura 35 - Gerao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] medida por RPE aps o

perodo de induo em amostras da cerveja #4 submetidas a um envelhecimento
aerbico acelerado (60,0 0,2 oC).contendo diferentes concentraes de glutationa
(mol L-1): (--) 0,0; (--) 1,0 10-3; (--) 2,0 10-3
106
Figura 36 - Gerao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] analisado por RPE aps

o perodo de induo (lag phase) em amostras da cerveja #4 contendo diferentes
concentraes de TCEP (mol L-1): (a) 0,0; (b) 1,0 10-4; (c) 2,5 10-4 e (c) 5,0 10-4;
submetidas a um envelhecimento aerbico acelerado (60,0 0,2 oC)
107
Figura 37 - Gerao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] medida por RPE em

solues aquosas modelo contendo etanol (5,8% v/v), 4 mL de 4-POBN (3,2 10-3 mol L1
), 80 L de H2O2 (24,0 10-3 mol L-1), 20 L de FeSO4.7H2O (22,0 10-3 mol L-1) e
diferentes concentraes de TCEP (de 0,1 a 40,0 10-3 mol L-1)
108
Figura 38 - Formao do complexo [FeII(ferrozina)] pela adio de TCEP em diferentes

concentraes de FeCl3 (mol L-1): (a) 1,8 10-5; (b) 3,7 10-5; (c) 7,4 10-5
109
Figura 39 - Grfico das constantes de velocidade aparentes das reaes entre o radical
HER e steres derivados dos cidos graxos insaturados versus nmero de grupos
metilnicos (bis)allicos dos substratos
11
Lista de Figuras
Figura 40 - Voltamogramas cclicos do (a) metil linoleato conjugado e (b) ergosterol,

em acetonitrila contendo 0,1 mol L-1 de perclorato de tetrabutilamnio como eletrlito
suporte. Eletrodos: platina (trabalho e contra-eletrodo), ferroceno (referncia interna).
Velocidade de varredura = 100 mV s-1
112
Figura 41 - Diagrama de energia dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO do 1,3- e

1,4-hexadieno e do orbital de fronteira SOMO do radical HER
113

decorrentes da reao do metil linoleato e o radical HER, sob atmosfera de Ar, T = 25,0
0,2 oC, t = 1 minuto de reao. (b) Espectro de massas (HESI-II-(+)-MS) com
atribuio do on do eluato em tr = 19,0 min (eluato B). (c) Espectro de massas (HESI-II(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 20,9 min (eluato D)
115
Figura 43 - Espectro de absoro do transiente alusivo ao radical fenoxila. Soluo

irradiada em = 355 nm contendo di-tert-butil-perxido (70 % v/v) e fenol (0,1 mol L-1;
em acetonitrila), sob atmosfera de Ar e mantida a 25,0 0,2 oC
121
Figura 44 - Curva de decaimento exponencial de primeira-ordem referente ao transiente

alusivo ao radical fenoxila. Soluo irradiada em = 355 nm contendo di-tert-butilperxido (70 % v/v) e fenol (0,1 mol L-1; em acetonitrila), sob atmosfera de Ar e
mantida a temperatura de 25 0,2 oC; (leitura) = 390 nm
121
Lista de Esquemas
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1 - Reao de isomerizao trmica das humulonas trans- (a) e cisisohumulonas (b) durante o cozimento do mosto fermentado e adicionado de lpulo.
(a-i) trans-n-isohumulona, (a-ii) trans-co-isohumulona, (a-iii) trans-ad-isohumulona,
(b-i) cis-n-isolupulona, (b-ii) cis-co-isolupulona, (b-iii) cis-ad-isolupulona
20
Esquema 2 - Proposta de mecanismo antioxidante de protenas contendo grupo tiol

(Pr-SH) na cerveja. Adaptado de Rogers e Clarke
27
Esquema 3 - Representao da Reao de Fenton
28
Esquema 4 - Formao e reaes subsequentes do radical 1-hidroxietila (HER), em

destaque, e 2-hidroxietila em cerveja, de acordo com o proposto dor Andersen e
Skibsted
29
Esquema 5 - Reao de formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]
37
Esquema 6 - Ilustrao da reao de competio entre a armadilha qumica 4-POBN e

os compostos de interesse (lupulonas, terpenos, flavonoides prenilados, tiis e lipdeos)
pelo radical HER
38
Esquema 7 - Ilustrao da reao entre o cido sulfnico e a dimedona e formao do

aduto monitorado por espectrometria de massas
45
Esquema 8 - Mecanismo de reduo das pontes de dissulfeto pelo TCEP
48
Esquema 9 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre as lupulonas e o radical

HER
64
Esquema 10 - Ilustrao da formao dos possveis radicais durante a reao entre o

-pineno e o radical HER
68
Esquema 11 - Ilustrao da formao dos possveis radicais durante a reao entre o

-citronelol e o radical HER
68
Esquema 12 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o terpinoleno e o

radical HER
72
Esquema 13 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o xantohumol e o

radical HER
85
Esquema 14 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o isoxantohumol e o

radical HER
89
Esquema 15 - Mecanismo proposto para a reao entre o radical HER e os compostos

contendo grupos tiis livre
99
Esquema 16 - Mecanismo da reao de derivatizao do ThiolGlo-1 e sulfito e tiol

proposto por Abrahamsoon
100
Esquema 17 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o metil linoleato e o

radical HER
117
Esquema 18 - Ilustrao da reao de formao do radical fenoxila a partir da irradiao

do di-tert-butilperxido em = 355 nm
120
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Constantes de velocidade aparentes de reao entre o radical HER e terpenos
determinadas por spin-trapping RPE, em 1 minuto de reao e a temperatura de 25,0
0,2 oC
Tabela 2 - Constantes de velocidade aparentes para a reao entre o radical HER e
flavonoides prenilados determinadas por spin-trapping RPE, em 1 minuto de reao e a
temperatura de 25,0 0,2 oC
Tabela 3 - Propriedades eletrnicas dos flavonoides prenilados calculadas usando o
mtodo DFT e a base 6-311++g(2d,2p)
Tabela 4 - Constantes de velocidade aparentes das reaes entre o radical HER e os
compostos contendo grupos tiis livre e bloqueado, bem como aminocidos,
determinadas por spin-trapping RPE, em 1 min de reao e a temperatura de
25,0 0,2 oC
Tabela 5 - Constantes de velocidade aparentes das reaes entre o radical HER e
cistena e glutationa em meio normal (H2O/CH3CH2OH) e deuterado (D2O/CH3CH2OD)
determinadas por spin-trapping RPE, em 1 min de reao e a temperatura de
25,0 0,2 oC
Tabela 6 - Constantes de velocidade aparentes das reaes entre o radical HER e os
lipdeos determinadas por spin-trapping RPE, em 1 min de reao e a temperatura de
25,0 0,2 oC
67
74
76
94
97
110
Lista de Abreviaturas e Siglas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ArO
- Radical fenoxila
APCI
- Atmospheric-Pressure Chemical Ionization
BDE
- Bond Dissociation Energy
BSA
- Bovine Serum Albumin
ca.
- Concentrao analtica
CH+
- Concentrao hidrogeninica
- Comprimento de onda
DFT
- Density Functional Theory
DTT
- (2S,3S)-1,4-dimercaptobutano-2,3-diol
EHOMO
- Energia do Orbital Molecular de Fronteira HOMO
EHOMO
- Energia do Orbital Molecular de Fronteira LUMO
ENH
- Eletrodo Normal de Hidrognio
ESI
- Electrospray Ionization
- Coeficiente de absortividade molar

+1
Fec/Fec
- Par do on complexo ferroceno
HER
- 1-hydroxyethyl radical
HPLC
- High Performance Liquid Chromatography
HOMO
- Highest Occuped Molecular Orbital
HESI-II
- Heated Electrospray Ionization
IEF-PCM
- Integral Equation Formalism as Polarizable Continuum Model
kap
- Constante de velocidade aparente
LUMO
- Lowest Unocuupied Molecular Orbital
LTP1
- Lipid Transfer Protein 1
MALDI-TOF
- Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight
MS
- Mass Spectrometer
P.I.
- Pontencial de Ionizao
4-POBN
- -4-piridil-N-tert-butilnitrona-1-xido
RSSR
- Molcula de tiol oxidada (ponte de dissulfeto)
RSH
- Molcula de tiol livre
RPE
- Ressonncia Paramagntica de eltrons
SDS-PAGE
- Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SOMO
- Single Occupied Molecular Orbital
TCEP
- tris(2-carboxietil)-fosfina
UPLC
- Ultra Performance Liquid Chromatography
Sumrio
SUMRIO
Dedicatria
Agradecimentos
Epgrafe
Resumo
Abstract
Lista de Figuras
Lista de Esquemas
Lista de Tabelas
Lista de Abreviaturas e Siglas
1.
INTRODUO
17
2.
OBJETIVOS
32
3.
MATERIAL E MTODO
33
3.1. Reagentes
33
3.2. Isolamento, purificao e caracterizao qumica da protena LTP1
34
3.3. Investigao eletroqumica das lupulonas
35
3.4. Investigao eletroqumica do ergosterol e metil linoleato conjugado

(9E,11E)
36
3.5. Reatividade dos compostos de interesse frente ao HER
36
3.5.1. Gerao e deteco do radical HER

3.5.2. Determinao das constantes de velocidade aparentes decorrentes
das reaes dos compostos de interesse frente ao radical HER
36
38
3.6. Caracterizao qumica dos produtos das reaes
41
3.6.1. Reao entre o radical HER e as lupulonas
41
3.6.2. Reao entre o radical HER e os terpenos
43
3.6.3. Reao entre o radical HER e os flavonoides prenilados
43
3.6.4. Reao entre o radical HER e os compostos contendo grupos tiis
44
3.6.5. Reao entre o radical HER e lipdeos
45
livre
3.7. Clculos tericos ab initio empregando a Teoria de Densidade

Funcional (DFT)
46
Sumrio
3.8. Quantificao do teor de tiis presentes e totais contidos em

diferentes cervejas
3.9. Quantificao do teor de protena em diferentes cervejas
3.10. Investigao da estabilidade oxidativa conferida pelos compostos
contendo grupos tiis livre e adio de TCEP na cerveja
47
49
49
3.11. Ensaio na reao de Fenton conferido pelo TCEP
50
3.12. Ensaio de reduo do Fe(III) a Fe(II) pela adio de TCEP
51
3.13. Reatividade das isohumulonas, lupulonas, terpenos e flavonoides

prenilados frente ao radical fenoxila
51
4.
53
RESULTADOS E DISCUSSO
4.1. Reatividade dos compostos de interesse frente o radical HER
4.1.1. Investigao da reatividade das lupulonas frente ao radical HER
4.1.1.1. Estudo eletroqumico das lupulonas
4.1.1.2. Identificao dos produtos da reao e elucidao do

mecanismo da reao envolvendo as lupulonas e o radical HER
4.1.2. Investigao da reatividade dos terpenos frente ao radical HER
53
55
56
58
66

mecanismo da reao envolvendo os terpenos e o radical HER
69
4.1.3. Estudo da reatividade dos flavonoides prenilados frente ao radical
74
4.1.3.1. Clculos qunticos das molculas dos flavonoides prenilados
76
HER

mecanismo da reao envolvendo os flavonoides prenilados e o radical HER
81
4.1.4. Investigao da reatividade dos compostos contendo grupos tiis

livre frente ao radical HER
90
4.1.4.1. Isolamento, purificao e caracterizao qumica da protena
90
4.1.4.2. Reatividade dos compostos contendo grupos tiis livre frente

ao radical HER
93
4.1.4.3. Identificao dos produtos da reao entre os compostos

contendo grupos tiis livre e o radical HER
97
4.1.4.4. Quantificao do teor de tiis presente e total contidos em

diferentes cervejas
99
LTP1
4.1.4.5. Quantificao do teor de protena em diferentes cervejas
104
Sumrio
4.1.4.6. Investigao da estabilidade redox conferida pelos compostos

contendo grupos tiis livre e pela adio de TCEP na cerveja
105
4.1.4.7. Influncia do TCEP na reao de Fenton
107
4.1.4.8. Ensaio de reduo do Fe(III) a Fe(II) pela adio de TCEP
108
4.1.5. Investigao da reatividade de diferentes lipdeos frente ao radical 109

HER
4.1.5.1. Identificao dos produtos da reao e elucidao do 115
mecanismo da reao envolvendo os metil steres no-conjugados derivados dos
cidos graxos e o radical HER
4.2. Comparao entre a reatividade apresentada pelos compostos de 118
interesse frente o radical HER
4.3. Reatividade dos compostos de interesse frente ao radical fenoxila
5.
CONCLUSES
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
APNDICES
120
124
127
Introduo
1. INTRODUO
A cerveja , por definio, uma bebida carbonatada de baixo teor alcolico que tem
atrado consumidores h mais de cem anos por apresentar atributos sensoriais peculiares, tais
como o frescor, o aroma e o amargor caracterstico1. Por regulamentao, a cerveja
produzida a partir de gua de boa qualidade, malte de cevada, fermento e lpulo, podendo
ainda ser utilizadas outras fontes de carboidratos como coadjutos tais como o arroz, o milho e
o trigo1,2.
O processo industrial para a produo de cerveja ilustrado na Figura 1. O processo
se inicia pela moagem do malte de cevada juntamente com a gua, resultando em uma
suspenso a qual submetida ao aquecimento a temperatura de aproximadamente 60 oC.
Durante esta etapa de aquecimento, as enzimas amilase e protease degradam o amido e as
protenas do malte, formando uma mistura de glicose e aminocidos, tambm denominada de
mosto doce.
Figura 1 - Fluxograma simplificado do processo industrial cervejeiro.

Malte de cevada
gua
MOAGEM
FILTRAO
FERVURA
FERMENTAO
Lpulo ou extrato do lpulo

leveduras
MATURAO
FILTRAO
CO2
ENVASE
PASTEURIZAO
17
Introduo
Aps a etapa de filtrao do mosto doce, ocorre a adio do lpulo# e ento se inicia o
processo de fervura/cozimento do mosto doce atravs da aplicao de um gradiente de
temperatura, podendo chegar at a temperatura de 95 oC, durante aproximadamente uma hora.
Ao final deste processo de fervura, os materiais suspensos provenientes do lpulo so retidos
e a mistura ento resfriada para a adio das leveduras; dar-se- a fermentao. Esta etapa
dividida em dois estgios: aerbico e anaerbico. No estgio aerbico ocorre o crescimento
das leveduras na presena de oxignio, ao passo que no estgio anaerbico as leveduras
transformam a glicose em etanol e dixido de carbono, sendo este ltimo recuperado e
armazenado para o reaproveitamento ao final do processo.
Existem dois tipos de leveduras que so tipicamente utilizadas no processo cervejeiro,
Saccharomyces carlsbergensis e Saccharomyces cerevisiae, as quais conferem o tipo de
fermentao empregado. Utilizando leveduras do tipo Saccharomyces carlsbergensis tem-se
uma cerveja denominada de baixa fermentao, na qual as leveduras decantam durante a
produo de etanol. Por outro lado, uma cerveja tida como de alta fermentao quando so
empregadas leveduras do tipo Saccharomyces cerevisiae, as quais permanecem suspensas no
final do processo e suportam altas concentraes de etanol.
Ao final da fermentao, as leveduras so removidas, obtendo uma cerveja
denominada cerveja verde (do ingls green beer), a qual no adequada ao consumo
imediato por apresentar compostos de sabor e aroma indesejveis. Logo, um perodo
denominado de maturao requerido, no qual a cerveja mantida em torno de 0 oC por um
tempo relativamente grande podendo levar semanas para que tais compostos sejam
vagarosamente degradados, transformados ou evaporados at atingirem nveis de
concentrao abaixo de seus valores crticos limiares de percepo. Ainda, comumente
empregada, ao final do processo cervejeiro, uma correo do amargor da cerveja a ser
#
O lpulo pode ser adicionado ao processo cervejeiro atravs da adio direta de flores secas (in natura), pellets
ou extratos.
18
Introduo
envasada, isto ocorre pela adio de extrato de cidos amargos do lpulo pr-isomerizado. Por
fim, a cerveja segue para o envase, aps filtrao e adio de dixido de carbono, podendo
ainda passar ou no pelo processo de pasteurizao3,4.
A Lei da Pureza da Cerveja (do alemo Reinheitsgebot), promulgada pelo Duque
Guilherme IV da Baviera em 1516 e instituda na Alemanha, permite apenas o uso do malte
de cevada, gua, lpulo e fermento como ingredientes para a fabricao da cerveja3,5. Desta
forma, o uso do lpulo no processo de fabricao da cerveja foi reforado. Este ingrediente foi
introduzido na cervejaria durante a Idade Mdia pelos monges europeus que refinaram as
tcnicas de produo3,5. Inicialmente, o lpulo era adicionado como um preservativo de ao
bactericida de origem natural para que a cerveja pudesse ser estocada por longos perodos e
para que no ocorresse fermentao secundria durante o processo de fabricao3,5; porm,
passou a ser um agente de aroma essencial e singular da cerveja, responsvel pela distino
desta de qualquer outra bebida alcolica carbonatada.
O lpulo (Humulus lupulus) uma planta cuja composio qumica compreende uma
gama muito grande de metablitos secundrios localizados especialmente em suas glndulas
posicionadas atrs das brcteas da flor de lpulo3-6. Estas glndulas so cobertas com um p
resinoso de colorao amarelo chamado lupulina3,6. Atualmente, sabe-se que as propriedades
presentes na cerveja decorrentes da adio do lpulo no processo cervejeiro so conferidas
por uma classe especial de compostos contidos na resina de lupulina. Neste contexto, trs
classes de compostos so apontadas como sendo os principais metablitos secundrios do
lpulo, os quais compreendem os leos essenciais (0,5 5 % v/m), os compostos fenlicos
(3 6 % m/m) e os cidos amargos - e -cidos (4 30 % m/m), tambm denominados de
humulonas e lupulonas, Figura 2 (a) e (b), respectivamente3-6.
19
Introduo
Figura 2 - Representao da estrutura qumica das humulonas (a) e lupulonas (b): (a-i) n-humulona,
(a-ii) cohumulona, (a-iii) adhumulona, (b-i) n-lupulona, (b-ii) colupulona, (b-iii) adlupulona.
Os - e -cidos do lpulo consistem em uma classe de compostos cuja composio

majoritria compreende trs anlogos: (n)- (Figura 2 (i)), co- (Figura 2 (ii)) e ad- (Figura 2
(iii)), as quais so classificadas de acordo com a cadeia lateral acila (R)3,5. Apesar de no
possurem impacto direto nas propriedades sensoriais da cerveja, os -cidos so os
precursores dos iso--cidos, comumente chamadas por isohumulonas, responsveis pelo
amargor caracterstico e qualidade da espuma da cerveja7,8. Neste contexto, as humulonas,
pouco solveis em meio aquoso (solubilidade de 8 g mL-1; pKa ~ 5,5)9-11, so convertidas
espcies mais hidroflicas, as isohumulonas (solubilidade de 270 g mL-1;pKa ~ 3,0)9-11,
durante o processo de fervura segundo ilustrado no Esquema 1.
Esquema 1 - Reao de isomerizao trmica das humulonas trans- (a) e cis-isohumulonas (b)
durante o cozimento do mosto fermentado e adicionado de lpulo. (a-i) trans-n-isohumulona, (a-ii)
trans-co-isohumulona, (a-iii) trans-ad-isohumulona, (b-i) cis-n-isolupulona, (b-ii) cis-co-isolupulona,
(b-iii) cis-ad-isolupulona7.
20
Introduo
A ao antissptica conferida pelo lpulo tem sido foco de muitos estudos, os quais
apontam que esta propriedade devido a pronuncivel atividade bacteriosttica dos cidos
amargos resultante das interaes hidrofbicas das cadeias laterais prenila com a parede
celular das bactrias Gram-positivas3,8, 12-19. Logo, as lupulonas mostraram ser mais ativas que
as humulonas e isohumulonas, uma vez que os -cidos apresentam trs grupos prenila em
sua cadeia lateral, ao passo que os -cidos e seus derivados isomerizados contm apenas
duas dessas cadeias laterais14,20. Assim, as lupulonas atuam como ionforos contra bactrias
Gram-positivas ao impedir ou reduzir o seu crescimento12,17.
Na cerveja, os cidos amargos derivados do lpulo inibem o crescimento dos
Lactobacillus durante o processo de fervura sem interferir na fermentao8. No entanto,
diversas aplicaes tecnolgicas vm sendo desenvolvidas recentemente com a finalidade de
explorar a atividade bacteriosttica das lupulonas. Assim, o emprego das lupulonas no
controle da atividade antibacteriana durante o processo de extrao do acar da beterraba e
na produo de etanol combustvel tem se tornado uma prtica corriqueira, cujo objetivo
consiste no uso de bactericidas de origem natural em substituio aos antibiticos
convencionais tradicionalmente utilizados, como a penicilina3,7,20. Contudo, sabe-se que os
-cidos so susceptveis a sofrerem degradao oxidativa3,8, resultando na possvel perda de
sua atividade antimicrobiana e formao de compostos que apresentam caractersticas
organolpticas indesejveis.
Outra classe de compostos de suma importncia para a qualidade sensorial da cerveja
consiste nos terpenos, os quais conferem um peculiar aroma para a bebida21-25. Quimicamente
os terpenos so classificados com base no nmero de tomos de carbono em suas molculas e
podem ser divididos em nmero de unidades de isopreno (C5H8)n, sendo, portanto,
hidrocarbonetos contendo ou no o tomo de oxignio em suas estruturas qumicas, bem
como uma ou mais instauraes C=C25,26. Neste contexto, os terpenos so classificados como:
21
Introduo
monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30) e tetraterpenos

(C40)25-27.
Os terpenos so metablitos secundrios de plantas oriundos da rota do mevalonato e
produzidos, na maioria das vezes, como agentes de defesa contra microrganismos e
insetos26,27. Na cerveja, sabido que os terpenos advm do lpulo27 e contribuem para a
acuidade sensorial da bebida ao conferir uma caracterstica sensorial mpar para o produto
final21,22,24,27. No entanto, sabe-se que a composio qumica das variedades comerciais de
lpulo depende de fatores pedoclimticos, fato este determinante na maneira pela qual o
lpulo ser adicionado ao processo cervejeiro, conferindo amargor e acabamento sensorial
bebida24. Atualmente, a composio de leos essenciais vem sendo empregada na
caracterizao das variedades de lpulo e, desta forma, a identificao e quantificao dos
terpenos presentes no cone do lpulo tem se tornado uma prtica bastante importante para a
caracterizao da variedade e da origem geogrfica da planta de lpulo21,24,27.
Os terpenos majoritrios identificados na cerveja consistem nos terpenos lcoois
apresentados na Figura 3 (k) a (r), em especial o linalol, geraniol e -citronelol,22,28 os quais
so formados a partir da biotransformao de terpenos alcenos, Figura 3 (a) a (j), advindos
do lpulo. Anlogo cerveja, os terpenos lcoois esto presentes tambm no vinho, os quais
advm majoritariamente das uvas e contribuem para gerar as propriedades sensoriais da
bebida29-31. Contudo, alguns estudos tm reportado a suscetibilidade dos terpenos frente a
processos oxidativos iniciados principalmente pela presena de oxignio molecular e espcies
radicalares, tais como o radical hidroxila (OH), formando, ao final da reao, perxidos,
hidroperxidos e hidrxidos derivados26,32-34. Tal reatividade foi relacionada presena de
insaturaes na estrutura molecular dos terpenos, atravs da qual ocorre a abstrao de tomos
de hidrognio allico pelo radical oxidante26.
22
Introduo
Figura 3 - Representao das estruturas qumicas dos principais terpenos presentes no leo essencial
derivado do lpulo: terpenos alcenos (a) -mirceno, (b) limoneno, (c) terpinoleno, (d) p-cimeno,
(e)1,8-cineole, (f) -pineno, (g) -pineno, (h) -humuleno, (i) -cariofileno, (j) trans--farneseno;
terpenos lcoois: (k) -citronelol, (l) geraniol, (m) linalol, (n) -terpineol, (o) carvacrol, (p) timol, (q)
-eugenol, (r) nerolidol.
Outra classe de compostos que compem os principais metablitos secundrios

biosintetizados e acumulados na lupulina so os prenilflavonoides27. Esta classe de compostos
comumente dividida em duas subclasses: as chalconas e as flavanonas preniladas35. As
principais chalconas preniladas do lpulo incluem o xantohumol e o desmetilxantohumol,
Figura 4 (a) e (b), enquanto que as flavanonas majoritrias compreendem o isoxantohumol,
8-prenilnaringenina e 6-prenilnaringenina, Figura 4 (c) a (e). Sabe-se que as flavanonas
preniladas so decorrentes de reaes de isomerizao em consequncia do tratamento
trmico aplicado durante o processo de fervura empregado na fabricao da cerveja36,37.
Assim, o isoxantohumol resultado da isomerizao do xantohumol, sendo a 6- e
a 8-prenilnaringenina os ismeros derivados do desmetilxantohumol38.
23
Introduo
Figura 4 - Representao das estruturas qumicas dos flavonoides prenilados derivado do lpulo:
(a) xantohumol, (b) desmetilxantohumol, (c) isoxantohumol, (d) 8-prenilnaringenina,
(e) 6-prenilnaringenina.
A cerveja apontada como sendo a principal fonte de obteno de flavonoides

prenilados na dieta humana36. Embora o xantohumol seja a espcie majoritria de flavonoides
prenilados identificada no lpulo (podendo representar at 1% m/m do cone seco do lpulo35),
na cerveja, devido a sua baixa solubilidade em meio aquoso, a concentrao mdia de
xantohumol varia de (0,1 a 2,0) x 10-7 mol L-1
35,38
, sendo esta ainda menor para o
desmetilxantohumol38. Por outro lado, as flavanonas compem as principais espcies de

compostos fenlicos prenilados identificadas na cerveja, em especial o isoxantohumol, cuja
concentrao mdia identificada na bebida varia de (0,1 a 10,0) x 10-6 mol L-1 39.
Os flavonoides prenilados tm despertado grande interesse no mbito cientfico devido
s suas propriedades farmacolgicas15,35,36,40-43. Neste contexto, estudos in vitro destes
compostos tm revelado que o xantohumol apresenta um grande potencial para atuarem como
agentes quimiopreventivos contra diversos tipos de cncer15,39,44-46. Ainda, outros benefcios
relacionados com a ingesto do mesmo composto encontram-se reportados na literatura, tais
24
Introduo
como a inibio de inflamao e controle da obesidade36,47-49. Trabalhos recentes na literatura
tm sugerido que o isoxantohumol apresenta propriedades anti-inflamatrias35,50,51.
Outra aplicao relacionada ao consumo de flavonoides prenilados consiste no uso da
flavanona 8-prenilnaringenina no tratamento da menopausa por se tratar de um precursor de
fitoestrogeno natural de maior eficcia descrito at o presente momento15,35,36,45.
Adicionalmente, alguns estudos tm se voltado para a avaliao da atividade antioxidante dos
flavonoides prenilados, especialmente no meio biolgico, os quais tm se revelado como
antioxidantes em potencial, embora o mecanismo de ao seja ainda pouco conhecido15,52,53.
Sabe-se que o consumo dirio dos flavonides prenilados ingeridos pelo consumo
regular de cerveja cerca de 0,14 mg36, sendo este relativamente menor quando comparado
com o contedo de polifenis totais presentes na bebida (42 mg expresso em equivalentes de
catequina)36. Este fato torna a possvel atividade antioxidante dos flavonides prenilados
pouco significativa do ponto de vista de sua concentrao. Contudo, os polifenis diferem dos
prenilflavonoides pelo fato destes ltimos apresentarem caractersticas mais lipoflicas36, o
que os tornam potenciais antioxidantes em cervejas contendo alto teor alcolico, bem como
aptos a atuarem na preveno/minimizao da lipoxidao na membrana celular e tambm
aptos a uma maior absoro e transporte atravs da parede intestinal.
Outro grupo de compostos presentes na cerveja que tem despertado grande interesse
no meio cientfico e tecnolgico nos ltimos anos o on sulfito e os compostos contendo
grupos tiis livre. Neste aspecto, o on sulfito tem sido apontado como sendo um eficiente
antioxidante natural presente na cerveja54-56, o qual advm da assimilao do enxofre derivado
do on sulfato atravs da ao de certas enzimas durante a fermentao. O processo segue pela
converso do on hidrogeno sulfito (HSO3-) a homocistena, culminando na formao da
cistena e metionina, bem como demais compostos contendo grupos tiis, conforme ilustrado
na Figura 5 54,55,57-59.
25
Introduo
Figura 5 - Fluxograma do mecanismo de biossntese dos compostos contendo grupos tiis livre pelas
leveduras Saccharomyces54,57.
Sulfato (SO4-2)
ATP sulforilase
Adenilil-Sulfato
APS quinase
Fosfo-Adenilil-Sulfato
PAPS redutase
Hidrogeno Sulfito (HSO3-)

Sulfito redutase
Sulfeto (H2S)
Homocistena sintetase
Metionina
Homocistena
Cistena
Tiis
Kaneda e colaboradores58 estudaram o mecanismo da ao antioxidante do sulfito na

bebida, o qual foi correlacionado com o consumo das espcies reativas de oxignio e
nitrognio, e consequentemente, promovendo a inibio do progresso das reaes radicalares
ao formar ons sulfato inertes55,56,59,60. Clarke e colaboradores60,61 sugeriram que protenas
contendo grupos tiis livre presentes na cerveja, juntamente com o on hidrogeno sulfito,
esto envolvidas em um complexo sistema redox. Neste contexto, acredita-se que estas
protenas so oxidadas inicialmente pelo perxido de hidrognio (H2O2) formando cidos
sulfnicos (Pr-SOH), intermedirios reativos, que reagem prontamente com outras protenas
contendo o grupo tiol, gerando dissulfetos (Pr-SS-R) que por sua vez so regenerados a tiis
pelo on HSO3-, conforme ilustrado no Esquema 2.
26
Introduo
Esquema 2 - Proposta de mecanismo antioxidante de protenas contendo grupo tiol (Pr-SH) na

cerveja. Adaptado de Rogers e Clarke60-62.
Os dissulfetos formados podem ento ser reduzidos pelo on hidrogeno sulfito,

regenerando a protena contendo o grupo tiol e ento conferindo uma ao sinrgica entre tais
compostos61,62. Logo, compostos contendo grupos tiis livre, assim como o on sulfito, atuam
de forma positiva no balano redox da cerveja60.
Sabe-se que a concentrao de compostos contendo grupos tiis livre presentes na
cerveja varia de (1,3 a 4,6) x 10-5 L mol-1 equivalentes de glutationa62. De acordo com a
literatura61,62, as protenas majoritrias identificadas na cerveja pertencem a uma classe de
protenas denominadas como LTP1 (do ingls, Lipid Transfer Protein 1), as quais originamse do malte e contm oito resduos de cistena em sua estrutura molecular63-66. As protenas
LTP1 apresentam massas moleculares na faixa de 9-10 kDa e um pI (ponto isoeltrico) em
torno de 9, sendo caracterizadas pela sua estabilidade conferida pela presena de quatro
pontes de dissulfeto formadas a partir dos resduos de cistena63-66.
As anlises por eletroforese e espectrometria de massas sugerem que as protenas
LTP1 podem sofrer modificaes qumicas durante o processo de malteamento, tais como
reaes de acilao e glicosilao, ao reagirem com compostos decorrentes da reao de
Maillard63,66. Em estudo realizado por Wu e colaboradores61 foi reportado que a protena
LTP1 presente na cerveja fresca apresenta grupos tiis livre oito resduos de cistena o que
27
Introduo
evidencia o fato das protenas LTP1 participarem de forma significativa no balano redox da
bebida55,59,61.
Stoyanovsky e colaboradores67 reportaram que a glutationa (GSH) reage prontamente
com o radical 1-hidroxietila (HER), levando a formao do respectivo dissulfeto (GSSG).
Recentemente, Kreitman68 avaliaram as capacidades antioxidantes da glutationa e cistena na
capitao do radical HER, as quais foram iguais a 87 e 88%, respectivamente. De fato,
Andersen e Skibsted69 demostraram atravs de experimentos de spin-trapping e ressonncia
paramagntica eletrnica (RPE) que o radical HER a espcie radicalar predominante
identificada na cerveja, sendo o mesmo resultado obtido por Elias e Andersen70 analisando-se
amostras de vinho.
Na cerveja o radical HER proposto originar-se da reao entre o etanol (co-solvente;
ca. ~ 1,0 mol L-1) e o radical hidroxila (OH), o qual advm da Reao de Fenton69,71,
conforme ilustrado nos Esquemas 3 e 4. Sabe-se que a concentrao de radicais gerados
durantes o processo de envelhecimento natural da cerveja aumenta com o teor de oxignio
dissolvido, com elevadas temperaturas de armazenamento ou com o aumento das
concentraes de alguns metais de transio, tais como ons de ferro e cobre72. Entretanto,
devido alta reatividade (E0 = + 2,7 V versus ENH) e baixa seletividade apresentada pelo
radical hidroxila, este abstrai prontamente tomos de hidrognio das molculas do etanol com
uma elevada constante de velocidade, igual a 1,9 x 109 L mol-1 s-1 69.
Esquema 3 - Representao da Reao de Fenton69,71.
28
Introduo
Esquema 4 - Formao e reaes subsequentes do radical 1-hidroxietila (HER), em destaque, e

2-hidroxietila em cerveja, de acordo com o proposto dor Andersen e Skibsted69.
A abstrao de tomo de hidrognio ocorre preferencialmente (85%) no tomo de

carbono C1 da molcula do etanol, formando o radical HER, sendo a abstrao em menor
extenso no tomo de carbono C2 (13%), resultando na gerao do radical 2-hidroxietila69.
Sabe-se ainda que ambos os radicais formados durante a oxidao do etanol reagem
prontamente com o oxignio molecular (O2), formando o radical hidroperoxila (OOH) e, ao
final da reao, acetaldedo como produto principal69.
Apesar de o radical HER ser a espcie radicalar predominante na cerveja, outras
espcies radicalares so passveis de serem formadas concomitantemente durante o processo
de envelhecimento da bebida, e assim contribuindo tambm para a diminuio da estabilidade
oxidativa do produto. Neste aspecto, o radical fenoxila (ArO) representa um dos principais
radicais secundrios presentes na cerveja, uma vez que este origina-se de reaes de oxidao
envolvendo compostos fenlicos, os quais esto presentes na bebida em teores considerveis
(~ 460 mg L-1 expresso em equivalentes de cido glico)73-75.
29
Introduo
De fato, quimicamente a cerveja pode ser considerada uma soluo alcolica com
concentrao hidrogeninica (CH+) em torno de 10-4,2 mol L-1, contendo centenas de
substncias dissolvidas72. Entretanto, os constituintes de uma cerveja fresca recmengarrafada no esto em equilbrio qumico72. Termodinamicamente, uma garrafa de
cerveja um sistema fechado e ir empenhar-se para alcanar uma condio de menor energia
e mxima entropia. Logo, diversas converses de seus constituintes so termodinamicamente
possveis, sendo sua relevncia para a qualidade de cerveja determinada, em sua maioria,
pelas constantes de velocidades das reaes em condies prticas de armazenamento do
produto72.
Com o aumento da exportao da cerveja, principalmente devido globalizao do
mercado, problemas relacionados ao tempo de prateleira do produto (do ingls, shelf-life) se
tornam de extrema importncia para a indstria cervejeira. Sabe-se que a susceptibilidade da
cerveja a sofrer diversas reaes durante o seu armazenamento pode acarretar perdas no
frescor e no valor nutricional agregado ao produto, bem como culminar no desenvolvimento
de compostos que conferem aroma e sabor indesejveis72. Assim, o conhecimento dos
possveis mecanismos e das constantes de velocidade especficas das reaes que ocasionam
a perda da qualidade sensorial e nutricional da bebida pode auxiliar no desenvolvimento de
tcnicas e mtodos para a conservao do produto.
Logo, uma investigao mais apurada sobre a reatividade dos cidos amargos
derivados do lpulo, terpenos, flavonoides prenilados e compostos contendo grupos tiis livre
frente aos radicais HER e fenoxila torna-se de suma importncia para gerar um maior
entendimento sobre os possveis mecanismos de degradao destes compostos durante o
processo de envelhecimento da cerveja.
A velocidade de cada reao ir determinar a viabilidade de cada caminho e est intrinsecamente relacionada
constante de velocidade especfica da reao e ao teor dos reagentes presentes no produto.
Constante de velocidade especfica refere-se a constante de velocidade determinada por mtodos diretos.
30
Introduo
Adicionalmente, o radical HER foi identificado como sendo um dos principais

produtos formados na metabolizao do etanol pelo Citocromo-c P450-monoxigenase
microssomal do fgado76-78. Estudos in vivo utilizando armadilhas qumicas (do ingls, spintrap) em ratos submetidos administrao oral de altas concentraes de etanol tm
relacionado a formao do radical HER com o surgimento de leses hepticas no organismo
humano78-80. Neste contexto, o aumento na peroxidao lipdica, averiguado atravs do
aumento na formao de produtos advindos da oxidao lipdica, como os lipohidroperxidos,
e ocasionado pelo consumo crnico do lcool, foi associado ao surgimento de doenas
patolgicas no fgado, tais como necroses e inflamaes78-80. De fato, a intensificao da
oxidao de lipdeos foi, neste caso, acompanhada pelo decrscimo dos nveis de
antioxidantes glutationa e vitamina E nos tecidos celulares, sendo ambos os processos
oxidativos relacionados a possveis reaes desencadeadas pelo radical HER78.
No entanto, pouco se conhece sobre a extenso do processo oxidativo provocado pelo
radical HER a nvel celular. Logo, uma investigao sobre as possveis vias reacionais que o
radical preferencialmente reage quando este gerado no organismo torna-se fundamental para
um maior entendimento sobre a extenso dos danos celulares provocados pelo consumo
abusivo de bebidas alcolicas.
31
Objetivos
2. OBJETIVOS
Aparte do melhor conhecimento a respeito do processo de deteriorao oxidativa da
cerveja, os principais objetivos e metas do presente trabalho podem ser resumidos conforme
descrito a seguir:
- Investigao da reatividade das lupulonas, terpenos, flavonoides prenilados e
compostos contendo grupos tiis livre frente ao radical HER;
- Determinao dos produtos majoritrios decorrentes das reaes supracitadas;
- Propor as principais rotas de degradao dos substratos de interesse na cerveja;
- Investigao da estabilidade oxidativa conferida pelos compostos contendo grupos
tiis livre ao monitorar o radical HER em amostras de cerveja dopadas com os substratos e
submetidas condio de envelhecimento acelerado;
- Determinao da concentrao dos tiis presentes e totais em diferentes cervejas;
- Determinao da concentrao total de protenas presentes em diferentes cervejas;
- Investigao da reatividade dos substratos de interesse frente ao radical fenoxila;
Adicionalmente, props-se investigar a reatividade dos lipdeos frente ao radical HER

com a finalidade de inferir possveis correlaes com o efeito protetor que os flavonoides
prenilados podem conferir ao organismo humano contra os danos causados na membrana
celular pelo radical HER.
32
Materiais e Mtodos
3. MATERIAIS E MTODOS
3.1. Reagentes.
Acetonitrila, cido clordrico 36-38%, etanol, metanol e sulfito de sdio (Na2SO3)
foram obtidos da J. T. Baker; cido frmico grau espectromtrico, cloreto de ferro (II)
tetrahidratado
(FeCl2.4H2O),
sulfato
de
ferro
(II)
heptahidratado
(FeSO4.7H2O),
tris(hidroximetil)-aminometano (tris), L-cistena, N-acetil-L-cistena, L-serina, L-triptofano,

hidrxido de sdio e o perxido de hidrognio 30% foram obtidos da Merck;
-4-piridil-N-tert-butilnitrona-1-xido (4-POBN), ferroceno, etanol deuterado (CD3CD2COD
e
CH3CH2COD),
xido
de
deutrio
(D2O),
cido
trifluoractico
99%,
3-(2-piridil)-5,6-difenil-1,2,4-triazino-p-p-cido disulfnico (ferrozina), cloreto de ferro (III)

(FeCl3), cloreto de sdio, glicerol, perclorato de tetrabutilamnio, tris(2-carboxietil)-fosfina
(TCEP),
dimedona
L-homocisteina,
(5,5-dimetil-1,3-ciclohexanodiona),
S-metil-L-cisteina,
L-histidina,
Asn-Arg-Cys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Cys-Trp-Asn,
Cys-Gly,
L-cistina,
L-glutationa,
His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp,
xantohumol,
isoxantohumol,
6-prenilnaringenina, 8-prenilnaringenina, -pineno, -citronelol, geraniol, limoneno, linalol,

terpinoleno, -eugenol, cimeno, 1,8-cineole, -mirceno, -pineno, -humuleno, -cariofileno,
-farneseno, -terpineol, nerol, nerolidol, carvacrol, timol, colesterol, ergosterol, metil oleato
(C18:1), metil linoleato (C18:2), metil linolenato (C18:3), metil araquidonato (C20:4), metil
docosahexanoato (C22:6) e metil linoleate conjugado (9E,11E, C18:2) foram obtidos da
Sigma-Aldrich; reagente fluorescente de tiol ThiolGlo-1 foi obtido da Calbiochem; glutationa
oxidada (GSSG), L-metionina, hidrocloreto de cistene-metil-ster e L-lisina foram obtidas da
Fluka; (2S,3S)-1,4-dimercaptobutano-2,3-diol (DTT), cido actico e 1-octanol foram obtidos
comercialmente da AppliChem; reagente Bradford (corante para ensaio proteico), acrilamida,
dodecil sulfato de sdio, persulfato de amnia e azul de bromofenol foram obtidos da BioRad
Laboratories; BSA (do ingls, Bovine Serum Albumin) foi obtida comercialmente da
33
Materiais e Mtodos
Thermo Scientific; os gases argnio (5,0), hidrognio (4,5), hlio (5,0) e nitrognio (5,0)
foram obtidos da White Martins. As lupulonas (pureza de 67,8%) foram gentilmente cedidos
pela empresa Hopsteiner. A gua de alta pureza (18 M cm-1) utilizada foi previamente
destilada e purificada utilizando um sistema de purificao Milli-Q (Millipore). Todos os
reagentes utilizados foram de grau analtico e utilizados sem prvio tratamento. Os solventes
foram de grau cromatogrfico (HPLC do ingls, High Performance Liquid
Chromatography) utilizado sem prvio tratamento.
3.2. Isolamento, purificao e caracterizao qumica da protena LTP1.

Amostras de cerveja (12 garrafas; volume de 355 mL cada) foram desgaseificadas com
o auxlio de um banho ultrassnico e liofilizado por 72 horas. Em seguida, o slido foi
resuspendido em 60 mL de tampo Tris-HCl (ca. 25,0 x 10-3 mol L-1, pH = 7,4) / NaCl
(ca. 20,0 x 10-3 mol L-1) e a soluo resultante foi centrifugada a 15.000 rpm por 30 minutos a
4,0 0,5 oC. O sobrenadante foi ento removido e submetido a dilise por 12 a 16 horas
contra o tampo Tris-HCl (ca. 20,0 x 10-3 mol L-1, pH = 7,4) / NaCl (ca. 20,0 x 10-3 mol L-1),
a 4,0 0,2 oC. A soluo dialisada foi submetida purificao seguindo duas etapas de
separaes cromatogrficas. A primeira consistiu na utilizao de uma coluna catinica
Macro-prepTM High S Support resin (Bio Rad) acoplada ao sistema KTA Prime plus device
(Ge Healthcare). A coluna foi previamente equilibrada com tampo Tris-HCl (ca. 25,0 x 10-3
mol L-1, pH = 7,4) / NaCl (ca. 20,0 x 10-3 mol L-1), sendo a eluio da protena de interesse
realizada atravs da aplicao de um gradiente salino de NaCl (ca. de 20,0 x 10-3 a 0,5
mol L-1) em 100 mL, utilizando uma vazo da coluna cromatogrfica igual a 5 mL min-1.
Foram coletadas fraes a cada 5 mL, sendo as fraes que continham a protena LTP1
submetidas segunda etapa de separao cromatogrfica. Aqui, empregou-se uma coluna de
excluso molecular Hiload Superdex 75pg prep-grade 16/60 (Ge Healthcare) acoplada ao
34
Materiais e Mtodos
sistema KTA Prime plus device (Ge Healthcare). A eluio da protena foi realizada
empregando-se um tampo Tris-HCl (ca. 25,0 x 10-3 mol L-1, pH = 7,4) / NaCl (ca. 0,1
mol L-1), vazo da coluna cromatogrfica de 1 mL min-1, no modo isocrtico.
A eficcia de cada etapa de purificao foi checada atravs anlise das fraes de
interesse por SDS-PAGE 18% - acrilamida (do ingls, Sodium Dodecyl Sulfate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis), sendo a frao final, que continha a protena LTP1,
submetida dilise contra o tampo Tris-HCl (ca. 5,0 x 10-3 mol L-1, pH = 7,4), a 4,0 0,2 oC.
Aps 12 h sob dilise, a soluo foi ento liofilizada, sendo a protena LTP1 obtida ao final do
processo submetida caracterizao qumica por espectrometria de massas (MALDI-TOF
do ingls, Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight).
Eletroforese em SDS-PAGE 18% - acrilamida: as amostras coletadas foram diludas
em tampo Tris-HCl (ca. 50,0 x 10-3 mol L-1, pH = 6,8; DTT ca. 0,1 mol L-1; SDS 2%; azul de
bromofenol 0,1% e glicerol 10%) e em seguida submetidas, juntamente com padro de massa
molecular (PageRulerTM Unstained Protein Ladder Fermentas), anlise por eletroforese
em SDS-PAGE. As anlises por eletroforese foram realizadas empregando gis de
empacotamento e separao a 5 e 18% m/m de acrilamida, respectivamente, aplicando-se uma
voltagem constante de 200 V por 45 minutos. Em seguida, o gel foi corado por 10 minutos em
soluo de Coomassie Brilliant Blue R 0,2% em meio de metanol:cido-actico:gua 5:1:15
(v/v/v) e sendo empregado na descolorao do mesmo uma soluo contendo cidoactico:etanol:gua 3:2:35 (v/v/v).
3.3. Investigao eletroqumica das lupulonas.

Os experimentos eletroqumicos foram realizados em um potenciostato AUTOLAB
modelo PGSTAT100, utilizando-se o eletrodo de trabalho uma placa diamante dopado com
boro, fabricado pela Adamant Technologies S.A., Sua, com dopagem 8000 ppm de boro e
35
Materiais e Mtodos
rea superficial de 6,25 mm2. O contra eletrodo utilizado foi uma rede de platina, cuja rea
superficial de 15,0 mm2. O potencial eletroqumico das espcies foi checado tendo como
referncia o potencial padro do par do on complexo ferroceno (Fec/Fec+1). Neste caso, o
potencial calculado relatado contra o Eletrodo Normal de Hidrognio (ENH) usando a
converso de E0 = + 0,630 V versus ENH para o par redox Fec/Fec+1, em meio de
acetonitrila81.
As lupulonas (ca. 1,0 x 10-3 mol L-1) foram dissolvidas em uma soluo contendo o
eletrlito de suporte (perclorato de tetrabutilamnio ca. 0,2 mol L-1; em acetonitrila), sendo
as medidas conduzidas a temperatura ambiente (25,0 0,2 oC), sob atmosfera inerte (N2). A
velocidade de varredura foi variada de 10 mV s-1 a 200 mV s-1.
3.4. Investigao eletroqumica do ergosterol e metil linoleato conjugado (9E,11E).

Os experimentos eletroqumicos foram realizados em um potenciostato PAR 264A,
utilizando-se duas redes de platina (15,0 mm2) como eletrodo de trabalho e contra eletrodo. O
potencial eletroqumico das espcies foi obtido tendo como referncia interna o potencial
padro do par Fec/Fec+1. Os compostos (ca. 2,0 x 10-3 mol L-1 de ergosterol; ca. 5,0 x 10-3 mol
L-1 de metil linoleato conjugado) foram previamente dissolvidos em uma soluo contendo o
eletrlito de suporte (perclorato de tetrabutilamnio ca. 0,1 mol L-1; em acetonitrila), sendo
as medidas efetuadas a temperatura ambiente (25,0 0,2 oC), sob atmosfera inerte (Ar),
empregando-se a velocidade de varredura igual a 100 mV s-1.
3.5. Reatividade dos compostos de interesse frente ao HER.

3.5.1. Gerao e deteco do radical HER.
O radical HER foi gerado a partir do radical hidroxila (OH). Entretanto, em funo da
dificuldade na deteco direta da maioria dos radicais devido a seus baixos tempos de meia
36
Materiais e Mtodos
vida, o monitoramento do radical HER foi efetuado utilizando-se o 4-POBN como armadilha
qumica, o qual reage com a espcie radical, conforme ilustrado no Esquema 5, formando o
aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH], segundo a constante de velocidade especfica igual a
3,1 x 107 L mol-1 s-1 82.
Esquema 5 - Reao de formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH].
A reao foi conduzida adicionando-se 60 L de uma soluo de ons de Fe(II)

(ca. 2,0 x 10-3 mol L-1) levemente acidificada com cido frmico (pH ~ 4,5) a 1 mL de uma
soluo contendo o 4-POBN (ca. 3,2 x 10-3 mol L-1; a 6% (v/v) de etanol ca. 1 mol L-1). A
mistura reacional foi cuidadosamente desgaseificada com argnio (Ar) ou nitrognio (N2),
seguida do acrscimo de 80 L de soluo de H2O2 30% (ca. 5,9 x 10-2 mol L-1) para
promover a formao do radical HER e posterior gerao do aduto radical. Aps 1 minuto de
reao, a sonda qumica (aduto radical) foi ento monitorada atravs da tcnica RPE. A
concentrao analtica do perxido de hidrognio foi determinada atravs do seu espectro
eletrnico de absoro ( = 240 nm; 240 = 39,4 L mol-1 cm-1)83.
Parmetros instrumentais:
- RPE: Espectrmetro Bruker modelo EMX Plus operando na banda-X. Frequncia de
micro-ondas: ~ 9,76 GHz; potncia de micro-ondas: 1 mW; amplitude de modulao: 1 G.
37
Materiais e Mtodos
3.5.2. Determinao das constantes de velocidade aparentes decorrentes das
reaes dos compostos de interesse frente ao radical HER.
Para estimar a reatividade dos compostos de interesse frente ao radical HER,
determinou-se as constantes de velocidade aparentes das reaes empregando-se uma
abordagem de cintica de competio84,85. Neste contexto, a armadilha 4-POBN compete com
os substratos pela captao do radical HER formado, conforme ilustrado no Esquema 6.
Esquema 6 - Ilustrao da reao de competio entre a armadilha qumica 4-POBN e os compostos

de interesse (lupulonas, terpenos, flavonoides prenilados, tiis e lipdeos) pelo radical HER.
Desta forma, os compostos em estudo foram primeiramente dissolvidos em etanol,

com exceo do -mirceno, dissolvido em hexano, e dos compostos contendo grupos tiis,
dissolvidos em tampo acetato (pH = 4,5). A concentrao analtica das lupulonas foi
determinada atravs da leitura da absorbncia da soluo em = 280 nm
(280 nm = 14.600 L mol-1 cm-1)7.
Volumes diferentes da soluo dos compostos de interesse foram adicionados em 60
L de uma soluo aquosa de ons de Fe(II) (ca. 2,0 x 10-3 mol L-1) levemente acidificada
Constante de velocidade aparente refere-se constante de velocidade determinada por mtodos indiretos.
38
Materiais e Mtodos
com cido frmico (pH ~ 4,5) e 1 mL de uma soluo de 4-POBN (ca. 3,2 x 10-3 mol L-1; a
6% (v/v) de etanol ca. 1 mol L-1). Acrescentou-se ento 80 L da soluo de H2O2 30% (ca.
5,9 x 10-2 mol L-1). A reao foi conduzida em atmosfera inerte (Ar ou N2) e monitorada
depois de decorrido 1 minuto de reao atravs da leitura do sinal do aduto radical
[4-POBN/CH(CH3)OH] por RPE.
Como substratos, foram empregados as lupulonas, Figura 2, terpenos, Figura 3, e
flavonoides prenilados, Figura 4. Ainda, avaliou-se a reatividade frente ao radical HER de
compostos contendo grupos tiis livre, tais como cistena, glutationa, Cys-Gly,
His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp, Asn-Arg-Cys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Cys-Trp-Asn, homocistena,
cistena metil ster, N-acetilcistena e DTT, bem como para compostos contendo grupos tiis
bloqueados e pontes de dissulfeto, tais como metionina, S-metil-L-cistena, e cistina e
glutationa oxidada, respectivamente. Ainda, foi avaliada a reatividade dos aminocidos
histidina, serina, triptofano e lisina, os quais so reconhecidamente suscetveis oxidao86,87.
A Figura 6 apresenta as estruturas qumicas dos compostos contendo grupos tiis livre e
bloqueados, bem como dos aminocidos supracitados.
Figura 6 - Representao das estruturas qumicas dos compostos contendo grupos tiis livre e
bloqueados, e aminocidos: (a) cistena; (b) glutationa; (c) Cys-Gly; (d) cistena metil ster; (e) HisCys-Lys-Phe-Trp-Trp; (f) homocistena; (g) DTT; (h) Asn-Arg-Cys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Cys-TrpAsn; (i) cistina; (j) glutationa oxidada; (k) metionina; (l) S-metil-L-cistena; (m) histidina; (n) serina;
(o) triptofano; (p) lisina.
(continua na pgina 40)
39
Materiais e Mtodos
(concluso da Figura 6)
Aferiu-se tambm a reatividade da protena LTP1 isolada de uma cerveja comercial

frente ao radical de interesse, bem como para diferentes lipdeos, cujas estruturas qumicas
encontram-se representadas na Figura 7. Por fim, avaliou-se o efeito isotpico cintico das
reaes envolvendo a cistena e glutationa ao conduzir as reaes em meio deuterado (D2O e
CH3CH2OD).
40
Materiais e Mtodos
Figura 7 - Representao das estruturas qumicas (a) colesterol, (b) ergosterol, (c) metil oleato, (d)
metil linoleato, (e) metil linolenato, (f) metil araquidonato, (g) metil docosahexanoato, (h) metil
linoleato conjugado (9E,11E).
3.6. Caracterizao qumica dos produtos das reaes.

3.6.1. Reao entre o radical HER e as lupulonas.
Os produtos da reao entre as lupulonas e o radical HER foram tentativamente
caracterizados por HPLC-ESI-MSn. Neste contexto, a reao foi conduzida em atmosfera
41
Materiais e Mtodos
inerte (Ar) pela adio de 100 L da soluo de H2O2 (ca. 5,9 x 10-2 mol L-1; em gua
Milli-Q) em uma soluo contendo as lupulonas (ca. 2,4 x 10-4 mol L-1; em etanol ou etanol
deuterado-d6) e 80 L da soluo de FeCl2.4H2O (ca. 2,0 x 10-3 mol L-1; em soluo
levemente acidifica com cido frmico pH ~ 4,5). Aps 1 minuto de reao, a 25,0 0,2 oC,
a mistura reacional seguiu para anlise qumica.
-
HPLC-ESI-MSn:
sistema
HPLC
(do
ingls,
High
Performance
Liquid
Chromatography) Shimadzu Prominience LC20AD hifenado ao espectrmetro de massas de

mltiplo estgio do tipo on-trap Bruker modelo E4K utilizando-se interface de ionizao
por electrospray (ESI do ingls, Electrospray Ionization).
Coluna cromatogrfica: Agilent C-18 extended (5 m, 2,1 x 150 mm); vazo da
coluna cromatogrfica de 0,3 mL min-1; fase mvel: solvente A H2O/cido frmico
(99,9:0,1 v/v), solvente B Acetonitrila/cido frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 5 min:
0 30% de B em A, 5 15 min.: 30 70% de B em A, 15 - 50 min.: 70 90% de B em A,
50 55 min.: 90 90% de B em A, 55 60 min.: 90 0% de B em A.
Espectrmetro de Massas de mltiplos estgios (MSn do ingls, Mass
Spectrometer): utilizou-se um divisor de fluxo na interface electrospray (ESI) na proporo
1:3. Condies de nebulizao: presso 30 psi, fluxo do gs (N2) 9 L min-1; temperatura de
desolvatao de 365 oC, voltagem do capilar de 3500 V; modo de deteco de ons positivo.
Adicionalmente, os produtos da reao supracitada foram tentativamente identificados
empregando-se um espectrmetro de massas exata de ultra-alta resoluo LTQ Orbitrap Velos
FT-MS (Thermo Fischer Scientific, Bremen, Germany) equipado com interface electrospray
(HESI-II do ingls, Heated Electrospray Ionization). Neste contexto, a mistura reacional
foi introduzida no espectrmetro pela infuso direta da amostra na fonte de ionizao
electrospray aplicando-se um fluxo de 5 L min-1, operando no modo de deteco de ons
positivo.
42
Materiais e Mtodos
3.6.2. Reao entre o radical HER e os terpenos.

Os produtos da reao entre os terpenos e o radical HER foram tentativamente
identificados atravs da anlise da mistura reacional por UPLC-APCI-LTQ Orbitrap FT-MS.
A reao foi conduzida em atmosfera inerte (Ar) e iniciada pela adio de 100 L da soluo
de H2O2 (ca. 5,9 x 10-2 mol L-1; em gua Milli-Q) em uma soluo contendo o terpinoleno (ca.
9,5 x 10-5 mol L-1; em etanol) e 80 L da soluo de FeCl2.4H2O (ca. 2,0 x 10-3 mol L-1; em
soluo levemente acidifica com cido frmico pH ~ 4,5). Aps decorrido 1 minuto de
reao, a 25,0 0,2 oC, a mistura reacional seguiu para anlise qumica.
UPLC-APCI-LTQ Orbitrap FT-MS: sistema UPLC (do ingls, Ultra Performance
Liquid Chromatography) Thermo Scientific Accela 1250 hifenado ao espectrmetro de
massas exata de ultra-alta resoluo LTQ Orbitrap Velos FT-MS (Thermo Fischer Scientific,
Bremen, Germany) equipado com a interface de ionizao qumica presso atmosfrica
APCI (do ingls, Atmospheric-Pressure Chemical Ionization), operando no modo de
deteco positivo.
Coluna cromatogrfica: Hypersil Gold C-18 (1,9 m; 50 x 2,1 mm); vazo da coluna
cromatogrfica de 0,4 mL min-1; fase mvel: solvente A H2O/cido frmico (99,9:0,1 v/v),
solvente B Metanol/cido frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 2 min: 5 30% de B em A,
2 12 min.: 30 40% de B em A, 12 - 15 min.: 40 45% de B em A, 15 20 min.: 45 70%
de B em A, 20 22 min.: 70 80% de B em A, 22 24 min.: 80 90% de B em A, 24 26
min.: 90 90% de B em A (isocrtico), 26 28 min.: 90 5% de B em A, 28 30 min.:
5 5% de B em A (isocrtico).
3.6.3. Reao entre o radical HER e os flavonoides prenilados.

Os produtos da reao entre os flavonoides prenilados e o radical HER foram
tentativamente identificados empregando-se a tcnica UPLC-HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS.
43
Materiais e Mtodos
Aqui, utilizou-se o xantohumol (ca. 9,8 x 10-5 mol L-1) e isoxantohumol (ca. 1,1 x 10-4
mol L-1) como substratos, sendo a reao conduzida em atmosfera inerte (Ar) atravs da
adio de 100 L da soluo de H2O2 (ca. 5,9 x 10-2 mol L-1; em gua Milli-Q) em uma
soluo contendo os flavonoides e 80 L da soluo de FeCl2.4H2O (ca. 2,0 x 10-3 mol L-1;
em soluo levemente acidifica com cido frmico pH ~ 4,5). Aps 1 minuto de incubao,
a 25,0 0,2 oC , a mistura reacional seguiu para anlise qumica.
UPLC-HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS: Sistema UPLC Thermo Scientific Accela 1250
hifenado ao espectrmetro de massas exata de ultra-alta resoluo LTQ Orbitrap Velos FTMS (Thermo Fischer Scientific, Bremen, Germany) equipado com interface electrospray
HESI-II, operando no modo de deteco negativo.
solvente B Acetonitrila/cido frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 2 min: 0 10% de B em
A, 2 5 min.: 10 20% de B em A, 5 - 20 min.: 20 45% de B em A, 20 23 min.:
45 55% de B em A, 23 25 min.: 55 90% de B em A, 25 27 min.: 90 90% de B em A
(isocrtico), 27 30 min.: 90 0% de B em A.
3.6.4. Reao entre o radical HER e os compostos contendo grupos tiis livre.
Os produtos decorrentes da reao entre o radical HER e os compostos contendo
grupos tiis livre foram caracterizados pela infuso direta da mistura reacional no
espectrmetro de massas (HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS). Neste contexto, a reao foi
conduzida em atmosfera inerte (Ar) pela adio de 100 L da soluo de H2O2 (ca. 1,5 x 10-2
mol L-1; em gua Milli-Q) em uma soluo contendo glutationa (ca. 1,2 x 10-4 mol L-1; em
soluo levemente acidifica com cido frmico pH ~ 4,5 contendo 6 % (v/v) de etanol) e
80 L da soluo de FeCl2.4H2O (ca. 1,0 x 10-2 mol L-1; em soluo levemente acidifica com
44
Materiais e Mtodos
cido frmico pH ~ 4,5). Aps 1 minuto de reao, a 25,0 0,2 oC, a mistura reacional
seguiu para anlise utilizando-se um espectrmetro de massas de alta resoluo (HESI-II-LTQ
orbitrap FT-MS).
HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS: espectrmetro de massas exata de ultra-alta resoluo
LTQ Orbitrap Velos FT-MS (Thermo Fischer Scientific, Bremen, Germany) equipado com
interface electrospray HESI-II, operando no modo de deteco negativo, vazo de
5 L min-1.
Verificou-se ainda se houve a formao do intermedirio cido sufnico atravs da
adio da dimedona mistura reacional, a qual forma um aduto estvel com o cido sulfnico
segundo a reao ilustra no Esquema 7. A soluo final foi analisada por espectrometria de
massas exata de ultra-alta resoluo (orbitrap FT-MS).
Esquema 7 - Ilustrao da reao entre o cido sulfnico e a dimedona e formao do aduto

monitorado por espectrometria de massas.
3.6.5. Reao entre o radical HER e lipdeos.

Os produtos da reao entre o radical HER e os lipdeos foram tentativamente
identificados por UPLC-HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS. Neste contexto, a reao foi
conduzida em atmosfera inerte (Ar) pela adio de 100 L da soluo de H2O2 (ca. 5,9 x 10-2
mol L-1; em gua Milli-Q) em uma soluo contendo o metil linoleato (ca. 1,0 x 10-4 mol L-1;
em etanol) e 80 L da soluo de FeCl2.4H2O (ca. 2,0 x 10-3 mol L-1; em soluo levemente
acidifica com cido frmico pH ~ 4,5). Aps decorrido 1 minuto de reao, a 25,0 0,2 oC,
a mistura reacional seguiu para anlise qumica.
45
Materiais e Mtodos
UPLC-HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS: Sistema UPLC Thermo Scientific Accela 1250

hifenado ao espectrmetro de massas exata de ultra-alta resoluo LTQ Orbitrap Velos FTMS (Thermo Fischer Scientific, Bremen, Germany) equipado com interface electrospray
HESI-II, operando no modo de deteco positivo.
solvente B Metanol/cido frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 3 min: 40 40% de B em A
(isocrtico), 3 8 min.: 40 60% de B em A, 8 - 13 min.: 60 75% de B em A, 13 20 min.:
75 85% de B em A, 20 30 min.: 85 85% de B em A (isocrtico).
3.7. Clculos tericos ab initio empregando a Teoria de Densidade Funcional (DFT).

Para a determinao das configuraes espaciais mais estveis das molculas do
xantohumol, isoxantohumol, 6-preilnaringenina e 8-prenilnaringenina, bem como para o
clculo das entalpias de dissociao dos hidrognios BDE (do ingls, Bond-Dissociation
Enthalpy), potencias de ionizao (P.I.) e energia dos orbitais de fronteira HOMO (do ingls,
Highest Occupied Molecular Orbital) e LUMO (do ingls, Lowest Occupied Molecular
Orbital) foi utilizado o clculo de dinmica molecular por DFT (do ingls, Density
Functional Theory) com o mtodo B3LYP, base 6-311++g (2d,2p), otimizando em um
contnuo dieltrico simulado em etanol com o formalismo da equao integral como modelo
contnuo polarizado (IEF-PCM). Na determinao das entalpias de dissociao dos tomos de
hidrognio das molculas das lupulonas e do terpinoleno, bem como na obteno das energias
dos orbitais de fronteira SOMO (do ingls, Single Occupied Molecular Orbital) do radical
HER e HOMO e LUMO dos dienos 1,3- e 1,4-hexadieno, utilizou-se o clculo de dinmica
molecular por DFT com o mtodo B3LYP, base 6-311++g (2d,2p), otimizando em um
46
Materiais e Mtodos
contnuo dieltrico simulado em etanol para os -cidos, o terpeno, o radical HER e os dienos,
com o formalismo da equao integral como modelo contnuo polarizado (IEF-PCM).
3.8. Quantificao do teor de tiis presentes e totais contidos em diferentes

cervejas.
A quantificao do teor dos compostos contendo grupos tiis livre presentes em
diferentes cervejas foi obtida ao empregar a metodologia estabelecida por Abrahamsson
e colaboradores89. Construiu-se, primeiramente, curvas de calibrao para cada cerveja
estudada ao empregar a glutationa como padro interno e ThiolGlo-1 como agente
derivatizante. Neste contexto, 100 mL de cada amostra de cerveja foi previamente
desgaseificada pela adio de 10 L de 1-octanol sob agitao por 5 minutos. Em seguida, as
solues de cerveja foram diludas 10 vezes pela adio de 900 L de soluo tampo Tris(ca. 0,25 mol L-1, pH = 7,5) em 100 L de cada cerveja, sendo 20 L de cada soluo diluda
transferida para "vials" contendo diferentes concentraes de glutationa (ca. (0,2 a 1,0) x 10-6
mol L-1). A reao de derivatizao foi ento conduzida ao adicionar 100 L de ThiolGlo-1
(ca. 2,6 x 10-5 mol L-1; em soluo tampo Tris- ca. 0,25 mol L-1, pH = 7,5) em cada vial, e
aps decorridos 5 minutos, 10 L de HCl (ca. 12 mol L-1) foi adicionado. Os tiis derivados
foram analisados atravs de um sistema cromatogrfico HPLC equipado com um detector de
fluorescncia empregando-se o gradiente de eluio 1 (descrito abaixo).
Para a quantificao do teor de tiis totais contidos nas amostras de cerveja, foi
empregado, como agente redutor, o TCEP, o qual reduz as pontes de dissulfeto 90, conforme
ilustrado no Esquema 8. Assim, foram adicionado s amostras de cerveja desgaseificadas
diferentes concentraes de TCEP (em soluo tampo Tris- ca. 0,25 mol L-1, pH = 7,5) e,
aps 5 minutos de reao, o mesmo procedimento experimental supracitado para a
47
Materiais e Mtodos
quantificao do teor de tiis presentes nas cervejas foi aplicado, empregando, neste caso, o
gradiente de eluio 2 (descrito abaixo).
Esquema 8 - Mecanismo de reduo das pontes de dissulfeto pelo TCEP90.
Cromatografia Lquida (HPLC): todas as anlises cromatogrficas foram realizadas

atravs de um cromatgrafo Agillent 1100 Series equipado com sistema de injeo
automtico G1313A autosampler e detector de fluorescncia G1321A. As separaes foram
conferidas atravs da utilizao de uma coluna Jupiter C18 (150 por 2,0 mm, 5 m, 300,
Phenomenex, Torrance, CA) empregando-se, como fase mvel, gua (fase mvel A) e
metanol (fase mvel B), ambos acidificados com cido trifluoractico (ca. 1,0 x 10-2 mol L-1,
pH = 2,0). O volume de injeo foi de 20 L e a vazo da coluna cromatogrfica de 0,5
mL min-1. Na deteco dos tiis derivatizados, foram empregados os comprimentos de onda
() em 242 nm e 492 nm para a excitao e emisso, respectivamente.
O gradiente de eluio 1 foi iniciado no modo isocrtico em 25% de B em A e, aps
decorridos 8 minutos, este foi instantaneamente elevado a 95% de B em A, e assim mantido
por 6 minutos. Em seguida, a condio inicial (25% de B em A) foi imediatamente
reestabelecida e sustentada por 7 minutos.
48
Materiais e Mtodos
O gradiente de eluio 2 iniciou-se em 25% de B em A at os 3 primeiros minutos

(modo isocrtico), aplicando-se, em seguida, um gradiente de eluio linear at 30% de B em
A por 17 minutos e, subsequentemente, at 95% de B em A em 2 minutos. Um modo
isocrtico (95% de B em A) foi aplicado por 6 minutos, sendo, em seguida, reestabelecida
imediatamente a condio inicial (25% de B em A) e assim mantido por 2 minutos.
3.9. Quantificao do teor de protena em diferentes cervejas.

A quantificao do teor de protenas presentes em diferentes cervejas foi realizada ao
empregar o mtodo de Bradford91, no qual se utilizou a protena BSA (do ingls, Bovine
Serum Albumin) como padro (ca. (5,0 a 25,0) x 10-5 g mL-1). Primeiramente, as cervejas (40
mL) foram desgaseificadas pela adio de 4 L de 1-octanol sob agitao por 5 minutos. Em
seguida, 20 L de cada amostra de cerveja ou soluo de BSA foram transferidos para as
respectivas microcubetas e ento acrescido 1 mL de uma soluo diluda do reagente de
Bradford (10 mL da soluo de reagente de Bradford para 40 mL de gua Milli-Q). As
reaes foram conduzidas a 25,0 0,2 oC, e as concentraes aferidas pela leitura da
absorbncia das amostras em = 595 nm.
3.10. Investigao da estabilidade oxidativa conferida pelos compostos contendo

grupos tiis livre e adio de TCEP na cerveja.
Na investigao do real balano redox que os tiis exercem sobre o produto acabado,
amostras da cerveja #4 foram dopadas com glutationa e em seguida submetidas a um
envelhecimento acelerado (60,0 0,2 oC). A estabilidade oxidativa foi obtida atravs da
avaliao do tempo de induo (do ingls, lag-phase), conferida para cada amostra, de
Lag-phase ou perodo de induo consiste, neste caso, no perodo em que a concentrao da espcie
radicalar mantm-se no estado estacionrio. Aps este perodo, verifica-se um aumento exponencial na
concentrao do radical.
49
Materiais e Mtodos
acordo com o mtodo descrito por Uchida e colaboradores92. Trs alquotas de 100 mL da
cerveja #4 foram desgaseificadas pela adio de 10 L de 1-octanol sob agitao por 5
minutos, sendo duas das alquotas dopadas com diferentes concentraes de glutationa
(ca. (1,0 e 2,0) x 10-3 mol L-1). Em seguida, adicionou-se 100 L da soluo de 4-POBN
(ca. 3,2 x 10-3 mol L-1, em gua Milli-Q) e 300 L de etanol, sendo, em seguida, as amostras
incubadas a 60,0 0,2 oC. O radical aduto [4-POBN/CH(CH3)OH] foi ento monitorado por
RPE durante 3h50m, sendo as intensidades relativa do sinal referente ao aduto radical das
amostras calculadas com base na intensidade do sinal do marcador interno constitudo por um
monocristal de MgO dopado com ons de Mn(II).
Na investigao da estabilidade oxidativa conferida pela adio de TCEP nas cervejas,
empregou-se o mesmo mtodo descrito previamente utilizando diferentes concentraes de
TCEP (ca. (1,0, 2,5 e 5,0) x 10-4 mol L-1) em substituio a glutationa. Por fim, as
intensidades dos sinais referentes ao aduto radical formado foram normalizadas utilizando o
sinal do padro interno monocristal de MgO dopado com ons de Mn(II).
3.11. Ensaio na reao de Fenton conferido pelo TCEP.

Para avaliar o efeito da adio de TCEP na reao de Fenton, 50 L de diferentes
concentraes de TCEP (ca. 1,0 x 10-5 a 40,0 x 10-3 mol L-1; em soluo tampo Tris ca.
0,25 mol L-1, pH = 7,5) foram adicionados em uma soluo contendo 4 mL da soluo de
4-POBN (ca. 3,2 x 10-3 mol L-1; em gua Milli-Q contendo 5,8% (v/v) de etanol) e 20 L da
soluo de FeSO4.7H2O (ca. 2,2 x 10-2 mol L-1; em gua Milli-Q). A reao de gerao do
radical HER foi ento iniciada pela adio de 80 L da soluo de H2O2 (ca. 2,4 x 10-2
mol L-1; em gua Milli-Q) a mistura supracitada termostatizada a 25,0 0,2 oC. Aps
decorridos 2 minutos de reao, o radical aduto [4-POBN/CH(CH3)OH] foi monitorado por
50
Materiais e Mtodos
RPE, sendo o aumento da intensidade do sinal calculado em relao ao sinal verificado na

soluo controle (isenta do TCEP).
3.12. Ensaio de reduo do Fe(III) a Fe(II) pela adio de TCEP.

A habilidade do TCEP em reduzir o on Fe(III) a Fe(II) foi verificada empregando-se a
ferrozina como agente complexante de on de Fe(II), conforme reportado na literatura93. Neste
contexto, 100 L de gua Milli-Q foram adicionados em 25 L de diferentes solues
contendo diferentes concentraes de TCEP (ca. (0,0, 0,9, 1,8, 3,7 e 7,4) x 10-5 mol L-1; em
gua Milli-Q) e FeCl3 (ca. (1,8, 3,7 e 7,4) x 10-5 mol L-1; em gua Milli-Q). Adicionou-se
ento 100 L de ferrozina (ca. 5,0 x 10-4 L mol-1; em gua Milli-Q) em cada amostra
preparada previamente e, aps 1 minuto de reao, a leitura das absorbncias das amostras em
= 560 nm foram realizadas.
3.13. Reatividade das isohumulonas, lupulonas, terpenos e flavonoides prenilados

frente ao radical fenoxila.
A reatividade dos substratos de interesse frente ao radical fenoxila (ArO) foi avaliada
aplicando-se a metodologia estabelecida por Mortensen e Skibsted94. Neste contexto, o radical
fenoxila foi gerado a partir da irradiao, em comprimento de onde () igual a 355 nm, de
uma soluo contendo di-tert-butil-perxido (70% v/v) e fenol (ca. 0,1 mol L-1; em
acetonitrila), sob atmosfera inerte (Ar) e mantida a 25,0 0,2 oC.
Na avaliao da reatividade dos compostos de interesse (isohumulonas, lupulonas,
terpenos e flavonoides prenilados) frente ao radical fenoxila, os estudos cinticos foram
conduzidos ao monitorar as absores do transiente referente ao radical fenoxila em = 390
nm, empregando-se um espectrofotmetro de transientes - laser flash photolysis (LFP-112
Luzchem) - e usando o terceiro harmnico ( = 355 nm) de um laser Brio pulsado de
51
Materiais e Mtodos
Nd-YAG Brilhant Easy, com pulsos de 5,2 ns de durao e potencia de 13 mJ cm-2 por pulso.
As solues de trabalho foram mantidas a 25,0 0,2 oC, sob atmosfera de Ar, contendo
di-tert-butil-perxido (70% v/v), fenol (ca. 0,1 mol L-1; em acetonitrila) e diferentes
concentraes dos substratos (ca. 1,0 x 10-4 a 0,1 mol L-1; em acetonitrila). Por fim, as
constantes de velocidade da reao entre o radical fenoxila e os substratos foram determinadas
atravs do monitoramento do perfil de decaimento da banda de absoro do transiente
(absoro D-D) em condies de pseudo-primeira ordem.
52
Resultados e Discusso
4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1. Reatividade dos compostos de interesse frente o radical HER.
A formao do radical HER foi monitorada atravs do acompanhamento do aduto
radical [4-POBN/CH(CH3)OH] pela tcnica RPE. A partir da anlise do espectro de
ressonncia paramagntica de eltron obtido da mistura reacional, apresentado na Figura 8,
verifica-se a presena de um triplo dubleto, o qual decorre do acoplamento entre o spin do
eltron desemparelhado (S = ) com o spin nuclear do tomo de nitrognio (I = 1) e o
desdobramento deste tripleto em dubletos pelo acoplamento super hiperfino com o tomo de
hidrognio na posio beta (H) (I = ).
Figura 8 - Espectros de RPE obtidos experimentalmente para a formao do aduto radical com
concentraes crescentes de isoxantohumol (mol L-1): (a) 2,6 10-5; (b) 4,4 10-5, (c) 6,2 10-5. As reaes
foram conduzidas em solues saturadas de Ar, a temperatura de 25,0 0,2 oC.
Do espectro, obteve-se a constante de acoplamento hiperfina entre o eltron

desemparelhado e o ncleo do tomo de nitrognio aN = 15,6 G, bem como a constante de
acoplamento super hiperfina entre este mesmo eltron com o ncleo do tomo de hidrognio
53
aH = 2,6 G. Estas constantes de acoplamento e padro de desdobramento do sinal de RPE

esto de acordo com a literatura69 e corroboram com a existncia do aduto radical
[4-POBN/CH(CH3)OH].
A reatividade dos compostos de interesse das lupulonas, terpenos, flavonoides
prenilados, tiis e lipdeos frente o radical HER foi obtida pela determinao das constantes
de velocidade de segunda ordem das reaes de interesse, denominada constante de
velocidade aparente (kap) por se tratar de uma abordagem cintica de competio empregando
a armadilha qumica 4-POBN como competidor.
Desta forma, atravs da Equao 1:
F
* k2 * [4-POBN] = k2 * [SUBSTRATO]
(1)
1-F
possvel estimar as constantes de velocidade da reao entre o radical HER e os substratos.
Na expresso, (F) representa o percentual de captao do radical pelos substratos,
sendo [4-POBN] e [SUBSTRATOS] as concentraes da armadilha qumica 4-POBN e dos
substratos, respectivamente. O termo k2 representa a constante de velocidade especfica da
reao entre o radical e a armadilha qumica 4-POBN, ao passo que k2 consiste na constate
de velocidade aparente (kap) da reao envolvendo o radical e os substratos. A deduo para a
Equao 1 encontra-se no Apndice A.
Assim, variando-se a concentrao dos substratos e monitorando o decrscimo na
intensidade do sinal referente ao aduto radical conferido pelo aumento da concentrao de
substratos nas reaes, representado aqui pelo isoxantohumol na Figura 8, um grfico de
(F/F-1)*k2*[4-POBN] versus concentrao de substrato foi construdo, Figura 9. Atravs do
comportamento linear obtido, no qual cada ponto da curva foi resultado da anlise em
triplicata do sinal do aduto radical para cada concentrao utilizada de substrato, determinou-
54
se a constante de velocidade aparente (kap) pelo coeficiente angular da reta, conhecendo-se a

concentrao de 4-POBN empregada e o valor de k2 (3,1 x 107 L mol-1 s-1)82.
Figura 9 - Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] versus concentrao de isoxantohumol. Experimentos

realizados pela tcnica de spin-trapping RPE, a temperatura de 25,0 0,2 oC e tempo total de reao
de 1 minuto.
4.1.1. Investigao da reatividade das lupulonas frente ao radical HER.

Seguindo a metodologia descrita previamente, determinou-se a constante de
velocidade aparente da reao entre as lupulonas e o radical HER, cujo valor obtido para a
constante de velocidade foi de (2,9 0,1) x 108 L mol-1 s-1. Estudos recentes envolvendo a
reao entre as isohumulonas e o radical HER tm apontado que a reao governada
preferencialmente pela abstrao de tomo de hidrognio allico, presente na cadeia lateral
prenila, em detrimento reao de transferncia de eltrons95. De fato, este efeito pode ser
prontamente estendido para a reao envolvendo as lupulonas, uma vez que as estruturas
destas apresentam trs cadeias laterais prenila.
55
4.1.1.1. Estudo eletroqumico das lupulonas.

Sabe-se que o cromforo -tricarbonlico presente nas estruturas moleculares dos
cidos amargos derivados do lpulo suscetvel a sofrer oxidao por transferncia de
eltrons11. Este grupo contm um nmero significativo de eltrons em orbitais p,
deslocalizados em orbitais moleculares de tipo e compondo um sistema conjugado, o qual
composto por trs tomos de oxignio e quatro tomos de carbono. Desta forma, aparte dos
processos oxidativos verificados nas isohumulonas, a degradao destas via transferncia de
eltrons se deve pela oxidao do grupo -tricarbonlico11. Este fato pode ser extrapolado para
as lupulonas, pois estes compostos apresentam, em sua estrutura qumica, o cromforo
-tricarbonlico. No entanto, o potencial de oxidao das lupulonas no foi ainda relatado na
literatura.
Assim, o intuito principal do estudo eletroqumico foi determinar o potencial de
oxidao das lupulonas. Para tanto, o referido potencial foi obtido utilizando-se o eletrodo de
diamante dopado com boro como eletrodo de trabalho, visto que este eletrodo permite o
alcance de altos potenciais positivos, at + 2,8 V versus ENH em meio aquoso, sem que se
observe a evoluo de oxignio. Foram realizados experimentos de voltametria cclica em
uma janela de potencial de 0,2 a + 1,6 V versus ENH, obtendo voltamogramas em
diferentes velocidades de varredura (10, 50, 100 e 200 mV s-1), os quais se encontram
ilustrados na Figura 10. Neste contexto, verificou-se que o pico de oxidao para as
lupulonas foi igual a + 1,1 V versus ENH, sendo o voltamograma caracterizado pela presena
de um processo irreversvel atravs da ausncia da onda de varredura catdica.
56
Figura 10 - Voltamogramas cclicos das lupulonas em sua forma molecular, em acetonitrila contendo
0,2 mol L-1 de perclorato de tetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante dopado com
boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (referncia interna). As velocidades de varredura
foram (mV s-1): (a) = 10, (b) = 50, (c) = 100, (d) = 200.
Tambm, observou-se que os potenciais de pico deslocam com o aumento da

velocidade de varredura. Neste caso, atravs do grfico da intensidade da corrente de pico
andico (I) versus a raiz quadrada da velocidade de varredura (v1/2), presente na Figura 10,
constatou-se uma dependncia linear, cujo coeficiente linear igual a 0,9741. Desta forma, foi
evidenciado um processo difusional, no qual o transporte de massa na oxidao das lupulonas
controlado cineticamente pela transferncia heterognea de eltrons do substrato para o
eletrodo.
Assim, constatou-se que as lupulonas so mais suscetveis a sofrerem oxidao via
transferncia de eltron que as isohumulonas, cujos potenciais de oxidao so + 1,4 V versus
ENH95 para a forma aninica (desprotonada) e + 1,8 V versus ENH95 para a forma molecular
(protonada). Ainda, a partir do potencial de oxidao obtido, pode-se inferir que a oxidao
do cromforo -tricarbonlico das lupulonas pelo radical HER por transferncia de eltron
termodinamicamente inviabilizada. De fato, verifica-se que o potencial de reduo do radical
(E= + 0,98 V versus ENH)96 significativamente menor que o potencial de oxidao dos
57
compostos envolvidos. Logo, constata-se que a reao envolvendo as lupulonas e o radical

HER provavelmente governada pelo processo de oxidao via transferncia de tomo de
hidrognio das lupulonas para o radical.
4.1.1.2. Identificao dos produtos da reao e elucidao do mecanismo da reao

envolvendo as lupulonas e o radical HER.
Os produtos da reao entre as lupulonas e o radical HER foram tentativamente
identificados por HPLC-ESI-MSn, cujo cromatograma de on total resultante da anlise da
composio final da reao apresentado na Figura 11. Aqui, pode-se notar que as lupulonas
no foram completamente consumidas na reao, sendo o eluato F, em (tr) 28,8 minutos,
referente a eluio da co-lupulona, ao passo que a banda de eluio G refere-se a co-eluio
dos homlogos ad- e n-lupulona, em (tr) 32,0 minutos.
Figura 11 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica contendo os produtos decorrentes da
reao das lupulonas e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a temperatura de 25,0 0,2 oC, t = 1
minuto de reao. (b) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 18,7
min (eluato A). (c) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 19,1 min
(eluato B). (d) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 20,1 min
(eluato C). (e) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 20,8 min
(eluato D). (f) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 21,3 min
(eluato E).
(a)

58

(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
59
Ainda, do cromatograma de ons total respectivo mistura reacional, verificou-se o

aparecimento de cinco novas bandas de eluio, ento identificadas como A, B, C, D e E. O
fragmentograma do eluato A, em (tr) 18,7 minutos, revelou a presena do on quasi-molecular
[M+H]+ cuja razo m/z foi igual a 417, enquanto que os espectros de massas referentes aos
eluatos D e E, em (tr) 20,8 e 21,3 minutos, respectivamente, revelaram padres de
fragmentao similares, cujo on quasi-molecular [M+H]+ apresenta razo m/z de 431. Em
recentes estudos descritos na literatura, foi reportada a formao de compostos contendo o
grupo hidroxila junto cadeia lateral prenila das isohumulonas, os quais so decorrentes da
oxidao destas espcies na presena de espcies radicalares, tais como o radical HER1,95.
Nestes estudos, constatou-se ainda que o radical HER abstrai um tomo de hidrognio allico
da cadeia lateral prenila ou isohexenola das isohumulonas, formando, ao final da reao, os
derivados hidroxilados95.
Analogamente, verifica-se que os ons quasi-molecular [M+H]+ cuja razo m/z foi
igual a 417 e 431 so referentes molcula do anlogo co-lupulona e dos homlogos ad- e
n-lupulona contendo o grupo hidroxila adicionado, respectivamente. Por outro lado, do
espectro de massas referentes aos eluatos B e C, em (tr) 19,1 e 20,1 minutos, respectivamente,
verifica-se padres de fragmentao similares, cujo on quasi-molecular [M+H]+ identificado
apresenta razo m/z de 461. A partir da anlise dos espectros obtidos, estes sugerem a adio
do radical HER molcula dos homlogos ad- e n-lupulonas.
Para confirmar esta suposio, a reao foi ento processada em meio deuterado
(etanol-d6) e a mistura reacional foi analisada por HPLC-ESI-MSn, cujo cromatograma de ons
total encontra-se na Figura 12. Desta forma, verificou-se um perfil cromatogrfico similar ao
obtido quando a reao foi conduzida em etanol, bem como os espectros de massas referentes
eluatos A, D e E, Figura 11. Por outro lado, observa-se a presena do on quasi-molecular
[M+H]+ 465 m/z nos fragmentogramas obtidos a partir das bandas de eluio B e C, o qual
60
apresenta quatro unidades de massa adicionais ao on quasi-molecular ([M+H]+ = 461 m/z)
dos respectivos picos decorrentes da reao conduzida em etanol, Figura 11.
Figura 12 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica deuterada (etanol-d6) contendo os
produtos decorrentes da reao das lupulonas e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a temperatura de
25,0 0,2 oC, t = 1 minuto de reao. (b) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do
eluato em tr = 18,7 min (eluato A). (c) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do
eluato em tr = 19,1 min (eluato B). (d) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do
eluato em tr = 20,1 min (eluato C). (e) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do
eluato em tr = 20,8 min (eluato D). (f) Espectro de massas (ESI-(+)-MS) com atribuio do on do
eluato em tr = 21,3 min (eluato E).
(a)
(b)
(c)

61

(d)
(e)
(f)
De fato, estes os dados corroboram com a confirmao das estruturas qumicas

inerentes aos eluatos B e C, cujo on quasi-molecular [M+H]+ apresenta a razo m/z de 461,
Figura 11. Assim, pode-se inferir que, como produto da reao estudada, tem-se tambm a
formao de compostos contendo uma molcula do radical HER adicionada cadeia lateral
prenila das lupulonas.
Em um estudo abordando a reao das isohumulonas frente ao radical HER, foi
reportado que a BDE da ligao C-H referente ao tomo de hidrognio allico contido na
cadeia lateral prenila das isohumulonas igual a 316 kJ mol-1, indicando a possvel abstrao
do referido tomo de hidrognio pela espcie radicalar95. Este fato pode ser estendido para as
62
lupulonas, uma vez que as estruturas destes compostos apresentam trs cadeias laterais
prenila. Neste contexto, efetuou-se o clculo das BDEs das ligaes C-H indicadas na Figura
13, cujos valores so 317 kJ mol-1 (C-Hpren(1)), 342 kJ mol-1 (C-Hpren(2)) e 330 kJ mol-1
(C-Hpren(3)). Atravs dos valores de entalpia de dissociao das ligaes supracitadas, pode-se
inferir que a abstrao do tomo de hidrognio (bis)allico, presente na cadeia lateral
C-Hpren(1), preferencial em detrimento transferncia dos tomos de hidrognio allicos
contidos nas demais cadeias laterias, C-Hpren(2) e (C-Hpren(3).
Figura 13 - Representao das possveis ligaes C-H envolvidas na abstrao do tomo de

hidrognio das lupulonas pelo radical HER.
Logo, a partir deste conjunto de dados, props-se o mecanismo da reao envolvendo

as lupulonas e o radical HER, o qual se encontra ilustrado no Esquema 9. Neste contexto, a
reao inicia-se pela abstrao do tomo de hidrognio (bis)allico presente no grupo prenila
das lupulonas. Esta abstrao se d pelo radical HER, resultando na formao de um radical
tercirio estabilizado por ressonncia. Existem, no entanto, trs caminhos pelos quais a reao
pode seguir a partir da formao do radical tercirio. Os caminhos 1 e 2 foram previamente
relatados na literatura e sintetizam a reao entre o radical HER e as isohumulonas63.
Analogamente, estas duas vias reacionais podem ser aplicadas para descrever a formao dos
derivados das lupulonas contendo o grupo hidroxila adicionado sua cadeia lateral.
63
Esquema 9 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre as lupulonas e o radical HER.
64
O caminho 1 resume a reao do radical tercirio com o oxignio molecular. Sabe-se

que a concentrao de oxignio residual dissolvido na cerveja (garrafa) gira em torno de
0,1 mg L-1
72
, o qual responsvel por causar diversas reaes de degradao da bebida
durante a sua estocagem. Desta forma, o oxignio molecular (tripleto) reage com o radical
tercirio supracitado gerando o radical peroxila, o qual posteriormente abstrai um tomo de
hidrognio do meio reacional, culminando na formao dos hidroperxidos. Ainda, a presena
de traos de ons metlicos, tais como Fe(II), conduz a clivagem dos grupos
hidroperxidos1,95 e, aps a abstrao de mais um tomo de hidrognio do meio reacional, os
hidrxidos so formados (compostos (b i-iii), Esquema 9).
O caminho reacional 2, sintetiza a reao entre o radical hidroxila, gerado
constantemente na soluo, e o radical tercirio derivado das lupulonas. Como resultado,
temos a formao direta dos hidrxidos identificados (compostos (b i-iii), Esquema 9). Este
mecanismo suportado pelo fato da constante de velocidade da reao entre os radicais
supracitados ser prxima ao limite da difuso em meio aquoso (i.e. ~ 1010 L mol-1 s-1).
Por fim, o caminho 3 descreve a terminao radicalar promovida pela reao entre o
radical HER e o radical tercirio derivado das lupulonas, resultando na formao dos
compostos contendo o radical adicionado na cadeia lateral das lupulonas (compostos (c i-iii),
Esquema 9). Logo, tem-se como resultado que a constante de velocidade aparente obtida para
a reao envolvendo as lupulonas e o radical HER resultante da somatria das constantes de
velocidade das reaes que envolvem o radical supracitado, as quais esto indicadas no
Esquema 9 como k1 e k2.
A ttulo de confirmao do mecanismo de reao proposto, os produtos da reao em
estudo foram qualitativamente identificados por espectrometria de massas exata de ultra-alta
resoluo (HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS) pela infuso direta da mistura reacional. Desta
forma, a partir dos espectros de massas apresentado no Apndice B, os compostos (b i-iii) do
65
Esquema 9 foram identificados pela presena dos ons quasi-moleculares [M + H]+
417,26317 m/z (compostos (b i), Esquema 9, erro de 0,9 ppm calculado para
[C25H36O5 + H]+ = 417,26355) e 431,27886 m/z (compostos (b ii-iii), Esquema 9, erro de
0,8 ppm calculado para [C26H38O5 + H]+ = 431,27920). Analogamente, os compostos (c i-iii)
do Esquema 9 foram identificados pela presena dos ons quasi-moleculares [M + H]+
445,29446 m/z (compostos (c i), Esquema 9, erro de 0,9 ppm calculado para
[C27H40O5 + H]+ = 445,29485), e 459,310212 e 461,32579 m/z (compostos (c ii-iii), Esquema
9, erro de 0,8 ppm calculado para [C28H42O5 + H]+ = 459,3105 e [C28H44O5 + H]+ =
461,32615).
Como um todo, os resultados aqui apresentados corroboram com o mecanismo de
reao proposto no Esquema 9.
4.1.2. Investigao da reatividade dos terpenos frente ao radical HER.

Anlogo s lupulonas, reatividade dos terpenos, cujas estruturas qumicas esto
apresentadas nas Figuras 3, foi determinada. As constantes de velocidade aparentes obtidas
para as reaes aqui inseridas esto reportadas na Tabela 1. Conforme pode ser observado da
anlise das constantes de velocidades aparentes obtidas, os terpenos apresentam reatividades
distintas, fato este conectado possivelmente presena de diferentes stios reacionais contidos
nas molculas dos terpenos.
66
Tabela 1 - Constantes de velocidade aparentes de reao entre o radical HER e terpenos determinadas
por spin-trapping RPE, em 1 minuto de reao e a temperatura de 25,0 0,2 oC.
Substratos
-Pineno
-Pineno
Limoneno
Terpinoleno
-Mirceno
-Humuleno
-Cariofileno
-Farneseno
Cimeno
1,8-Cineole
-Citronelol
Geraniol
Nerol
Linalol
-Terpineol
-Eugenol
Carvacrol
Timol
Nerolidol
kap (L mol-1 s-1)

(4,0 0,2) x 105
(2,2 0,2) x 105
(2,1 0,1) x 106
(1,5 0,2) x 107
(1,6 0,3) x 106
(1,3 0,2) x 107
(2,3 0,1) x 106
(5,4 0,1) x 106
(5,4 0,1) x 105
N.R.*
(4,2 0,2) x 105
(3,6 0,1) x 106
(3,5 0,2) x 106
(4,2 0,2) x 105
(4,1 0,2) x 105
(6,8 0,3) x 106
(5,5 0,3) x 105
(5,3 0,1) x 105
(3,7 0,2) x 106
* N.R.: No Reativo.
Alguns estudos recentes apontaram que as reaes de oxidao de terpenos

promovidas pela presena de espcies radicalares so preferencialmente governadas via
abstrao de tomos de hidrognio allicos e (bis)allicos presentes nas estruturas dos
terpenos25,32. Este fato pode ser sustentado no presente trabalho, uma vez que no foi
observada reatividade do radical HER com o 1,8-cineole, o qual no apresenta insaturao em
sua estrutura.
Ainda, ao comparar a constante de velocidade aparente de um terpeno alceno com a
obtida para um terpeno lcool contendo o mesmo nmero de tomos de hidrognio allicos,
como, por exemplo, o -pineno e o -citronelol, respectivamente, constata-se que estes
compostos apresentam a mesma reatividade frente ao radical, uma vez que as constantes de
velocidade aparentes obtidas para ambos os compostos so estatisticamente iguais (p = 0,05).
Desta forma, pde-se inferir que o grupo funcional hidroxila, presente nos terpenos lcoois,
67
no representa o stio reacional envolvido na reao em estudo, sendo, portanto, o mecanismo

da reao governado pela abstrao de tomos de hidrognio allicos e (bis)allicos dos
terpenos pelo radical HER. Logo, de acordo com o mecanismo da reao proposto, aqui
representado para o -pineno e -citronelol, Esquemas 10 e 11, respectivamente, verifica-se
que as constantes de velocidade aparentes obtidas para ambos os compostos so resultantes da
somatria de trs constates (k1, k2 e k3) decorrentes de trs caminhos reacionais.
Esquema 10 - Ilustrao da formao dos possveis radicais durante a reao entre o -pineno e o
radical HER.
Esquema 11 - Ilustrao da formao dos possveis radicais durante a reao entre o -citronelol e o
radical HER.
68
Constatou-se ainda uma maior reatividade por parte dos terpenos que contm tomos
de
hidrognio
(bis)allicos
em
suas
estruturas,
tais
como
terpinoleno
-humuleno, cujas constantes de velocidade obtidas so na ordem de 107 L mol-1 s-1. De fato,
o valor verificado para a BDE da ligao C-H envolvendo o hidrognio (bis)allico do
terpinoleno (302 kJ mol-1) foi significativamente menor que os valores obtidos para os outros
tomos de hidrognios allicos do composto (de 318 a 323 kJ mol-1), refletindo assim o
favorecimento na abstrao do tomo de hidrognio (bis)allico do terpinoleno pelo radical
HER em detrimento abstrao dos respectivos tomos de hidrognios allicos.
A partir do conjunto de dados aqui inseridos, pde-se inferir que a constante de
velocidade est diretamente relacionada com o nmero de tomos de hidrognios allicos e
(bis)allicos presentes nas estruturas moleculares dos terpenos. Tal constatao sustentada
ao se comparar a constante de velocidade obtida para terpenos de mesma funo orgnica,
como, por exemplo, os terpenos lcoois geraniol e -citronelol, os quais, por apresentarem
diferentes nmeros de tomos de hidrognio allicos, exibiram reatividades distintas. Assim,
verifica-se que quanto maior nmero de tomos de hidrognio allicos e (bis)allicos presentes
na estrutura molecular do terpeno, maior ser a extenso da reao de oxidao promovida
pelo radical HER.

envolvendo os terpenos e o radical HER.
Os produtos decorrentes da oxidao dos terpenos mediante a presena do radical
HER foram tentativamente identificados atravs da tcnica UPLC-APCI-LTQ Orbitrap FTMS, cujo cromatograma obtido ilustrado na Figura 14 (a).
69
reao do terpinoleno e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a temperatura de 25,0 0,2 oC, t = 1
minuto de reao. (b) Espectro de massas (APCI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 20,0
min (eluato A). (c) Espectro de massas (APCI-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 9,0
11,4 min (eluato B).
(a)
(b)
(c)
Do cromatograma de ons total e fragmentogramas obtidos, constatou-se que o eluato

B, em (tr) 20,0 minutos, referente ao terpinoleno remanescente da reao, cujo on quasimolecular [M + H]+ apresenta a razo m/z de 137,2423 (erro de 2,2 ppm calculado para a
frmula [C10H16 + H]+ = 137,2420 m/z), Figura 14 (c). Os eluatos contidos na regio
70
denominada por A no cromatograma, em (tr) de 9,0 a 11,4 minutos, referem-se aos produtos
de oxidao do terpinoleno formados. Conforme pode ser notado, no foi possvel obter uma
separao analtica adequada dos produtos. Porm, pela anlise dos fragmentogramas obtidos
a partir destes analitos, observou-se um mesmo padro de fragmentao, aqui representado
pelo espectro de massas apresentado na Figura 14 (b).
Ainda, padres de fragmentogramas similares foram obtidos para os produtos de
oxidao formados e para o terpinoleno, precursor da reao, conforme apresentado na
Figura 14 (b) e (c). De fato, o on base (137,2416 m/z) do espectro de massas decorrente da
anlise dos produtos da reao, Figura 14 (b), consiste no on fragmento formado a partir da
perda de uma molcula de gua do on quasi-molecular [M + H]+ cuja razo m/z igual a
155,2566, o qual no foi detectado no referido espectro de massas. Vale ressaltar que a
mesma perda de massa foi verificada nos espectros de massas obtidos nas anlises dos
padres de terpeno lcoois. Desta forma, a partir da anlise dos produtos de oxidao dos
terpenos gerados pela presena do radical HER, verificou-se a formao de ismeros
contendo um grupo hidroxila ligado molcula do precursor inicial. O mesmo
comportamento foi verificado tanto para os terpenos alcenos como para os terpenos lcoois
aqui investigados.
A partir da diferena nas reatividades apresentadas pelos terpenos frente ao radical
HER, somada caracterizao dos produtos da reao, o mecanismo da reao foi proposto
para o terpinoleno, conforme ilustrado no Esquema 12. Neste contexto, a reao iniciada
pela abstrao dos tomos de hidrognio allicos e (bis)allico da molcula do terpinoleno pelo
radical HER, gerando diversas espcies radicalares ressonantes. Estes radicais primrios e
secundrios, formados inicialmente, culminam na formao de radicais tercirios
estabilizados por ressonncia. Desta forma, tem-se, como intermedirios da reao, a
coexistncia de radicais primrios, secundrios e tercirios.
71
Esquema 12 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o terpinoleno e o radical HER.
72
Anlogo ao exposto para o mecanismo envolvendo o radical HER e as lupulonas, a

reao pode seguir por dois caminhos reacionais para descrever a formao dos hidrxidos
derivados dos terpenos. O caminho 1 sintetiza as reaes envolvendo os radicais
intermedirios com o oxignio molecular (O2), o qual encontrado em concentraes
apreciveis na cerveja72. Logo, pela reao do oxignio com os radicais, tem-se a gerao dos
radicais peroxila que abstraem prontamente tomos de hidrognio do meio reacional,
culminando na formao dos hidroperxidos. Sabe-se que a presena de ons metlicos de
Fe(II) conduzem clivagem dos grupos hidroperxidos derivados dos terpenos97. Logo, pela
clivagem dos hidroperxidos, seguida da abstrao do tomo de hidrognio do meio
reacional, so formados os hidrxidos identificados (compostos (b) (n), Esquema 12).
A segunda via reacional consiste na reao direta entre o radical hidroxila e os radicais
intermedirios gerados inicialmente no processo, culminando na formao dos hidrxidos
(compostos (b) a (n), Esquema 12). Como resultado, tem-se que a constante de velocidade
global da reao envolvendo o terpinoleno e o radical HER resultante da somatria das
constantes de velocidade referentes s diversas reaes de abstrao dos tomos de hidrognio
do substrato pelo radical (indicadas no Esquema 12 como k1 a k6). Contudo, esperado uma
maior contribuio para a constante de velocidade global por parte da constante inerente
reao envolvendo o tomo de hidrognio (bis)allico (k6), uma vez que esta ligao C-H
apresenta um valor de BDE relativamente menor quando comparada s ligaes C-H
abrangendo os tomos de hidrognio allicos.
Ao analisar a estabilidade qumica dos radicais intermedirios gerados durante o
processo de oxidao supracitado, pode-se inferir que as espcies majoritrias formadas e
identificadas ao final da reao so os hidrxidos advindos dos radicais tercirios. Ainda, pela
avaliao das estruturas dos produtos identificados, verifica-se que estes podem sofrer reaes
de oxidao subsequentes e assim estender o processo de deteriorao seguindo o mesmo
73
mecanismo relatado, e contribuindo, desta forma, na somatria das constantes de velocidade

para a reao. No entanto, estes diferentes poli-hidrxidos, contendo dois ou mais grupos
hidroxilas ligados molcula do terpeno precursor, no foram identificados, o que
possivelmente est relacionado a fatores cinticos envolvidos nas reaes subsequentes; ou
seja, o tempo de reao aplicado antes de efetuar as anlises pode no ter sido suficiente para
que tais compostos tenham sido gerados em concentraes apreciveis, necessrias para a sua
deteco.
4.1.3. Estudo da reatividade dos flavonoides prenilados frente ao radical HER.

A partir das constantes de velocidade aparentes obtidas para a reao envolvendo os
flavonoides prenilados e o radical HER, apresentadas na Tabela 2, verificou-se que as
constantes de velocidade, da ordem de 109 L mol-1 s-1, esto prximas ao limite da difuso em
meio aquoso, no qual as constantes de velocidade so da ordem de 1010 L mol-1 s-1, sendo o
encontro das espcies em soluo suficiente para que a reao se processe. Ainda, mediante a
leitura das constantes de velocidade obtidas, verifica-se que o xantohumol (kap = (3,6 0,1) x
109 L mol-1 s-1) consiste na espcie mais reativa frente ao radical HER dentre os flavonoides
prenilados aqui investigados, sendo os valores das constantes obtidas para a reao
envolvendo as flavanonas isoxantohumol (kap = (1,8 0,1) x 109 L mol-1 s-1),
6-prenilnaringenina (kap = (1,5 0,2) x 109 L mol-1 s-1) e 8-prenilnaringenina (kap = (1,7 0,1)
x 109 L mol-1 s-1) estatisticamente iguais (p = 0,05).
Tabela 2 - Constantes de velocidade aparentes para a reao entre o radical HER e flavonoides
prenilados determinadas por spin-trapping RPE, em 1 minuto de reao e a temperatura de
25,0 0,2 oC.
Substratos
Xantohumol
Isoxantohumol
6-Prenilnaringenina
8-Prenilnaringenina
kap (L mol-1 s-1)

(3,6 0,1) x 109
(1,8 0,1) x 109
(1,5 0,2) x 109
(1,7 0,1) x 109
74
Marfak e colaboradores73 estudaram a reatividade de flavonoides, tais como algumas
flavanonas, flavonas e catequinas, frente ao radical HER atravs de experimentos de radilise
de pulso com deteco de absoro de transientes. Neste trabalho, os autores verificaram que
alguns flavonoides, como a quercetina, Figura 15 (a), mostraram-se reativos frente ao radical
HER, ao passo que certos flavonoides, como a naringenina, Figura 15 (b), no o so. De fato,
a degradao de flavonoides pela presena do radical HER est diretamente relacionada com a
presena do grupo hidroxila na posio 3-OH e dupla ligao C=C adjacente, Figura 15 (a).
Logo, o mecanismo para a reao supracitada foi proposto por iniciar-se pela reao de
abstrao do tomo hidrognio do grupo hidroxila (3-OH) pelo radical HER.
Figura 15 - Representao das estruturas qumicas da (a) quercetina, (b) naringenina.
Analogamente, pde-se inferir que um possvel e nico stio reacional dos flavonoides
isoxantohumol, 6- e 8-prenilnaringenina consiste no tomo de hidrognio (bis)allico da
ligao C-H contida na cadeia lateral prenila, uma vez que as estruturas qumicas da 6- e
8-prenilnaringenina diferem da molcula da naringenina somente pela presena da cadeia
lateral. Por outro lado, a molcula do xantohumol apresenta um provvel segundo stio de
reao adicional em sua estrutura qumica, uma vez que a constante de velocidade aparente
obtida para este substrato praticamente o dobro das constantes de velocidade determinadas
para os demais polifenis prenilados.
75
4.1.3.1. Clculos qunticos das molculas dos flavonoides prenilados.

Para um maior entendimento do mecanismo envolvido neste tipo de reao,
principalmente no que se refere diferena de reatividade verificada entre os xantohumol e
demais flavonoides prenilados aqui inseridos, efetuou-se clculos qunticos ab initio com as
estruturas qumicas dos compostos supracitados com o intuito de determinar as propriedades
eletrnicas e estruturais dos mesmos. Desta forma, os dados obtidos encontram-se
apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 - Propriedades eletrnicas dos flavonoides prenilados calculadas usando o mtodo DFT e a
base 6-311++g(2d,2p).
EHOMO (eV)
ELUMO (eV)
PI
(kJ mol-1)
Entalpia de
Dissociao
da Ligaes
(BDE)
(kJ mol-1)
C-Hpren
O-H(2)
O-H(4)
O-H(7)
O-H(5)
O-H(4)
Xantoh.
- 6,2
- 2,6
Isoxantoh.
- 6,2
- 1,8
6-Prenilnaring.
- 6,3
- 2,1
8-Prenilnaring.
- 6,3
- 2,1
551
563
574
568
307
380
336
----367
308
----352
--336
313
----362
379
347
309
----361
382
348
Adicionalmente, a Figura 16 apresenta as configuraes espaciais mais estveis para

as molculas do xantohumol (a) e isoxantohumol (b), bem como os respectivos orbitais
moleculares de fronteira de maior energia ocupado (HOMO) e de menor energia desocupado
(LUMO). Vale ressaltar que as configuraes espaciais para as demais flavanonas, 6- e
8-prenilnaringenina, bem como as respectivas superfcies de contorno de orbitais de fronteira
HOMO e LUMO so similares s apresentadas pelo isoxantohumol, sendo, portanto, este o
representante desta classe de compostos.
PI: Potencial de Ionizao.
76
Figura 16 - Representao das configuraes espaciais e das superfcies de contorno dos orbitais
moleculares de fronteira desocupado de menor energia (LUMO) e ocupado de maior energia (HOMO)
calculadas para os (a) xantohumol e (b) isoxantohumol.
(a)
LUMO
HOMO
(b)
LUMO
HOMO
Da anlise das superfcies de contorno dos orbitais moleculares HOMO para as

estruturas e geometrias otimizadas do xantohumol e isoxantohumol, verifica-se praticamente
uma contribuio dos mesmos tomos para o orbital HOMO, estando estes localizados
majoritariamente sobre o anel aromtico adjacente cadeia lateral prenila. Ainda, avaliando
os valores obtidos para as energias destes orbitais, constata-se que estes no diferem entre si
de forma significativa e, consequentemente, no explicam a diferena na reatividade
77
verificada para a reao envolvendo o xantohumol quando comparada com a reatividade

obtida para os demais compostos da srie. O mesmo feito tambm no justificado ao
analisar os valores dos potenciais de ionizao (PI) dos substratos aqui inseridos, pois estes
apresentam praticamente o mesmo PI. Assim, pode-se inferir que a reao entre os
flavonoides prenilados e o radical HER provavelmente no governada via transferncia de
eltron.
Outro parmetro que inviabiliza a transferncia de eltron das molculas dos
flavonoides prenilados para o radical HER consiste na comparao entre os valores de PI
obtidos para os substratos com os respectivos valores de BDEs das ligaes C-Hpren e O-H
destacadas na Figura 17. De fato, os valores de PI so pelo menos 169 kJ mol-1 maiores que
os valores das BDEs, refletindo assim o no favorecimento da reao de transferncia de
eltron frente reao de abstrao de tomo de hidrognio.
Figura 17 - Representao das possveis ligaes C-H e O-H envolvidas na abstrao do tomo de
hidrognio dos flavonoides prenilados pelo radical HER. (a) xantohumol; (b) isoxantohumol;
(c) 6-prenilnaringenina; (d) 8-prenilnaringenina.
Pela leitura das BDEs obtidas para as ligaes C-Hpren e O-H, Tabela 3, constata-se
que a ligao C-Hpren apresenta um menor valor de entalpia de dissociao quando comparada
78
com as entalpias associadas dissociao das ligaes O-H. Ainda, ao considerar as possveis
ligaes de hidrognio que os grupos hidroxila esto suscetveis a fazerem com o meio
reacional (etanol), verifica-se que, de fato, os tomos de hidrognios dos referidos grupos
ficam menos acessveis abstrao pelo radical. Desta maneira, a abstrao do tomo de
hidrognio (bis)allico pertencente cadeia lateral prenila mais favorvel que a abstrao
dos tomos de hidrognios pertencentes aos grupos hidroxilas, sendo este um forte indcio de
que a reao em estudo seja governada pela abstrao do tomo de hidrognio (bis)allico da
prenila. Contudo, os valores de BDEs das ligaes C-Hpren ainda no esclarecem a diferena
na reatividade observada para o xantohumol frente s flavanonas isoxantohumol, 6- e
8-prenilnaringenina, uma vez que estes dados no diferem significativamente entre si.
Comparando os valores obtidos para as energias dos orbitais moleculares de fronteira
HOMO e LUMO dos flavonoides prenilados com a energia verificada para o orbital SOMO do
radical HER, Figura 18, verifica-se praticamente um mesmo intervalo de energia (E) entre
os orbitais HOMO dos flavonoides prenilados com relao ao orbital SOMO do radical. Por
outro lado, a energia do orbital LUMO do xantohumol (- 2,6 eV) a que mais se aproxima da
energia do referido orbital do radical (- 4,5 eV), cuja diferena energtica de 183 kJ mol-1,
sendo este intervalo (E) significativamente maior para os demais flavonoides analisados
(260 kJ mol-1 para o isoxantohumol e 232 kJ mol-1 para a 6- e 8-prenilnaringenina).
79
Figura 18 - Diagrama de energia dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO dos flavonoides prenilados
e do orbital de fronteira SOMO do radical HER.
A partir da escala energtica apresentada na Figura 18, constata-se praticamente um

mesmo intervalo de energia entre os orbitais SOMO-HOMO e SOMO-LUMO do radical HER
e do xantohumol, respectivamente, podendo, portanto, haver tanto uma reao de adio
nucleoflica quanto uma reao de adio eletroflica por parte do radical molcula do
xantohumol. No entanto, ao analisar as superfcies de contorno obtidas para os orbitais
moleculares de fronteira LUMO do xantohumol e isoxantohumol, Figura 16, constata-se que,
apesar de ambos apresentam carter antiligante (*), estes se encontram localizados em
regies distintas nas molculas. De fato, uma maior contribuio para o orbital LUMO situase sobre os tomos de carbono, hidrognio e oxignio contidos no grupo carbonila
,-insaturada para a molcula do xantohumol, ao passo que para a molcula do
isoxantohumol e demais flavanonas os referidos orbitais de fronteira esto centrados
majoritariamente sobre os tomos pertencentes aos anis A, B e C dos compostos.
Logo, a partir dos dados apresentados, pode-se inferir que a presena da carbonila
,-insaturada na molcula do xantohumol pode resultar em um stio de reao adicional, uma
vez que os orbitais de fronteira envolvidos na reao em questo (LUMO do xantohumol e
80
SOMO do radical) apresentam energias e simetrias compatveis para que a reao se processo,
pois ambos os orbitais exibem carter . Neste contexto, o sistema conjugado composto pela
carbonila e pela dupla ligao adjacente atua como um eficiente grupo atraente de eltrons, no
qual a interao entre os orbitais SOMO-LUMO do radical e do xantohumol, respectivamente,
facilitada pela aproximao energtica entre os orbitais supracitados. Esta interao faz o
radical HER comportar-se como um bom nuclefilo, culminando na reao de adio deste
carbonila ,-insaturada da molcula do xantohumol e assim ocasionando um aumento na
velocidade da reao expresso pela constante de velocidade aparente obtida.

envolvendo os flavonoides prenilados e o radical HER.
Os produtos decorrentes da reao entre os flavonoides prenilados e o radical HER
foram tentativamente identificados empregando-se como substratos o xantohumol e
isoxantohumol. Neste contexto, as misturas reacionais foram analisadas pela tcnica
UPLC-HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS, cujos cromatogramas obtidos esto representado nas
Figuras 19 e 21.
81
reao do xantohumol e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a temperatura de 25,0 0,2 oC, t = 1
minuto de reao. (b) Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr =
18,2 min (eluato A). (c) Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr =
21,0 min (eluato B). (d) Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr =
21,7 min (eluato C). (e) Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr =
23,0 min (eluato D).
(a)
(b)
(c)

82

(d)
(e)
Do cromatograma de ons total resultante da anlise da mistura reacional contendo o

xantohumol e radical HER, Figura 19 (a), constata-se que o flavonoide no foi
completamente consumido na reao, sendo o eluato D, em (tr) 23,0 minutos, referente
eluio do xantohumol, cujo on quasi-molecular [M H]- apresenta a razo m/z de 353,3886
(erro de 0,6 ppm calculado para [C21H22O5 H]- = 353,3884 m/z). Os eluatos A, B e C
referem-se aos produtos da reao aqui inserida, cujos (tr) so 18,2, 21,0 e 21,7 minutos,
respectivamente. O espectro de massas da banda de eluio A, Figura 19 (b), revelou a
presena do on quasi-molecular [M H]- cuja razo m/z igual a 441,4944 (erro de 2,0 ppm
calculado para [C25H30O7 H]- = 441,4935 m/z), o qual foi relacionado com a formao de
um composto contendo duas molculas do radical HER ligadas molcula do xantohumol.
Por outro lado, verificou-se a formao de dois ismeros contendo uma molcula do
radical adicionada estrutura do substrato, cujos ons quasi-moleculares [M H]83
apresentaram razes m/z iguais a 397,4417 (erro de 1,8 ppm calculado para [C23H26O6 H]- =
397,4410 m/z; eluato B), Figura 19 (c), e 397,4415 (erro de 1,2 ppm calculado para
[C23H26O6 H]- = 397,4410 m/z; eluato C), Figura 19 (d). A partir dos produtos da reao
obtidos, e somando-se o conjunto de informaes eletrnicas e estruturais do xantohumol
descritas anteriormente, o mecanismo da reao envolvendo o xantohumol e o radical HER
foi elucidado, o qual se encontra ilustrado no Esquema 13.
Neste contexto, a reao segue por dois caminhos. Na primeira via reacional, a reao
iniciada pela abstrao de um tomo de hidrognio (bis)allico pertencente cadeia lateral
prenila do xantohumol (composto (a), Esquema 13). De fato, esta abstrao realizada pelo
radical HER, culminando na formao de um radical secundrio, o qual rapidamente
convertido a um radical tercirio estabilizado por ressonncia. Este radical tercirio reage por
recombinao radical com o radical HER, formando assim um derivado do xantohumol
contendo uma molcula do radical ligada sua estrutura (composto (b), Esquema 13). A este
produto adicionada uma segunda molcula do radical HER atravs de uma 1,4-adio
conjugada na carbonila ,-insaturada, resultando na formao do radical alcoxila, o qual
prontamente reduzido pelos ons de Fe(II) presentes no meio reacional, formando, ao final
desta via, o derivado do xantohumol contendo duas molculas do radical HER adicionadas
(composto (c), Esquema 13).
84
Esquema 13 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o xantohumol e o radical HER.
85
O outro caminho de reao inicia-se pela formao do outro ismero que contem uma
molcula do radical HER ligada molcula do xantohumol (composto (d), Esquema 13), o
qual gerado a partir da 1,4-adio conjugada do radical carbonila ,-insaturada do
substrato, seguido da reduo do radical alcoxila pelos ons metlicos de Fe(II). Anlogo
iniciao da primeira via reacional, a segunda molcula do radical HER adicionada ao
ismero intermedirio (composto (c), Esquema 13) atravs da abstrao do tomo de
hidrognio presente na cadeia lateral prenila e posterior recombinao do radical tercirio
com outra molcula do radical HER.
Como resultado, tem-se que a constante de velocidade aparente obtida para a reao
envolvendo o xantohumol e o radical HER decorrente da somatria das constantes de
velocidade das reaes sucessivas que envolvem o radical, as quais esto indicadas no
Esquema 13 como k1 a k6. No entanto, uma maior contribuio para a constante de
velocidade global da reao esperada por parte das constantes de velocidade inerentes aos
processos envolvendo a recombinao entre radicais e a abstrao de tomo de hidrognio,
uma vez que a constante de velocidade aparente obtida na abstrao do tomo de hidrognio
(bis)allico pertencente cadeia lateral prenila das lupulonas da ordem de 108 L mol-1 s-1 95.
A constante de velocidade para a reao envolvendo o radical HER e o grupo
carbonila ,-insaturada foi obtida empregando-se como substrato o cinamaldedo, cuja
estrutura qumica encontra-se representada na Figura 20 (a). Neste contexto, verificou-se
uma constante de velocidade aparente igual a (7,4 0,1) x 107 L mol-1 s-1, a qual decorre da
reao de 1,4-adio conjugada do radical HER ao grupo carbonila ,-insaturada.
Adicionalmente a este fato, encontra-se reportado na literatura a constante de velocidade
aparente da reao entre o radical em estudo e o cido p-coumrico, Figura 20 (b), cujo valor
igual a1,0 x 107 L mol-1 s-1 95.
86
Figura 20 - Representao das estruturas qumicas do (a) cinamaldedo e (b) cido

p-coumrico.
Logo, a partir do conjunto de dados apresentados, pode-se inferir que a magnitude da

constante de velocidade inerente a reao de adio do radical HER carbonila
,-insaturada, indicada no Esquema 13 como k3 e k4, igual a 107 L mol-1 s-1. Como
consequncia, tem-se que a constante de velocidade aparente obtida para a reao envolvendo
o xantohumol e o radical HER fruto da somatria das constantes k1
k5, resultantes da
abstrao de tomos de hidrognio do substrato, e k2 e k6, as quais so decorrentes da

recombinao entre radicais, conforme indicado no mecanismo proposto.
Atravs da apreciao do cromatograma de ons total decorrente da anlise da mistura
reacional contendo o isoxantohumol e o radical HER, observa-se a presena de apenas duas
bandas de eluio, indicados na Figura 21 como eluatos A e B. O eluato B, em (tr) 18,6
minutos, refere-se eluio do substrato isoxantohumol, cujo on quasi-molecular [M H]apresenta a razo m/z de 353,3891 (erro de 2,0 ppm calculado para [C21H22O5 H]- =
353,3884 m/z). Por outro lado, o espectro de massas do eluato A, em (tr) 16,0 minutos,
revelou a presena do on quasi-molecular [M H]- cujas razo m/z igual a 397,4421 (erro
de 2,8 ppm calculado para [C23H26O6 H]- = 397,4410 m/z), o qual foi relacionado com a
formao do produto contendo uma molcula do radical HER ligada estrutura qumica do
isoxantohumol.
87
reao do isoxantohumol e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a temperatura de 25,0 0,2 oC, t = 1
minuto de reao. (b) Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr =
16,0 min (eluato A). (c) Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) com atribuio do on do eluato em tr =
18,6 min (eluato B).
(a)
(b)
(c)
Vale ressaltar que os cromatogramas e padres dos espectros de massas obtidos nas
anlises das misturas reacionais contendo a 6- e 8-prenilnaringenina como substratos foram
similares ao apresentado pelo isoxantohumol, uma vez que estes compostos apresentam
estruturas qumicas similares e, portanto, reatividades similares. Logo, diante dos dados
88
coletados, props-se o mecanismo para a reao envolvendo o radical HER e as flavanonas

preniladas, aqui representadas pelo isoxantohumol no Esquema 14.
Anlogo ao caminho 1 descrito para a reao envolvendo o xantohumol, Esquema 13,
a degradao do isoxantohumol (composto (a), Esquema 14) inicia-se pela abstrao do
tomo de hidrognio (bis)allico pertencente cadeia lateral prenila, culminando na formao
de um radical tercirio estabilizado por ressonncia. O radical tercirio, por sua vez,
recombina prontamente com outra molcula do radical HER para formar o produto final
contendo uma molcula do radical ligada molcula do precursor da reao (composto (b),
Esquema 14). Desta forma, verifica-se que para as flavanonas preniladas somente uma via
reacional plausvel.
Esquema 14 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o isoxantohumol e o radical HER.
Assim, tem-se que as constantes de velocidade aparentes obtidas para as reaes

envolvendo as flavanonas e o radical HER consistem na somatria das constantes de
velocidade inerentes s reaes consecutivas de abstrao do tomo de hidrognio e
recombinao radicalar, conforme ilustrado no Esquema 14 como k1 e k2, respectivamente.
89
4.1.4. Investigao da reatividade dos compostos contendo grupos tiis livre frente ao
radical HER.
4.1.4.1. Isolamento, purificao e caracterizao qumica da protena LTP1.
Conforme descrito no item 3.2., a protena LTP1 foi isolada e purificada empregandose dois processos cromatogrficos: cromatografia de troca catinica e cromatografia de
excluso molecular. Assim, do cromatograma obtido no primeiro processo de separao,
Figura 22, observa-se a eluio da protena de interesse em 0,17 mol L-1 de NaCl ao aplicar o
gradiente de separao salino.
Figura 22 - Cromatograma resultante da etapa de isolamento da protena LTP1 por cromatografia de

troca catinica.
A presena de protena LTP1 foi confirmada atravs da anlise do gel de SDS-PAGE

de 18% acrilamida pela presena das bandas prximas ao padro de massa molecular igual a
14,4 kDa, a qual estava contida nas fraes de 2 a 4, Figura 23. No entanto, devido
presena de impurezas, as fraes 2-4, contendo a protena de interesse, foram submetidas a
um novo processo de separao cromatogrfica.
90
Figura 23 - Gis de SDS-PAGE (18% - acrilamida) decorrentes da anlise das fraes coletadas no
processo de isolamento da protena LTP1. Anlise do padro de massa molecular (1) e das fraes
coletadas por processo de separao por cromatografia de troca catinica (2-9).
A protena LTP1 foi ento purificada atravs de uma coluna de excluso molecular,
cujo cromatograma resultante encontra-se apresentado na Figura 24. As fraes aqui
coletadas, decorrentes de trs injees subsequentes, foram analisadas em gel de 18%
acrilamida, SDS-PAGE, e ento se constatou que, de fato, a protena LTP1 foi devidamente
purificada, apresentando um elevado grau de pureza, Figura 25.
Figura 24 - Cromatograma resultante da etapa da purificao da protena LTP1 por cromatografia de

excluso molecular.
91
Figura 25 - Gis de SDS-PAGE (18% - acrilamida) decorrentes da anlise das fraes coletadas no
processo de purificao da protena LTP1. Anlise do padro de massa molecular (1) e das fraes
coletadas por processo de separao por cromatografia de excluso molecular (2-7).
Ainda, caracterizou-se quimicamente a protena LTP1 isolada por espectrometria de

massas MALDI-TOF (do ingls Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of
Flight), cujo espectro obtido revela a presena majoritria de quatro ons moleculares,
indicados na Figura 26 por A, B, C e D. Os compostos referentes aos ons moleculares A, B e
C foram atribudos s diferentes formas conferidas protena LTP1, as quais apresentam
massas moleculares variando entre 9 a 10 kDa e advm de diversas fontes de cereais
adicionados, tais como trigo, malte e cevada63,66. Por outro lado, ao composto cuja massa
molecular identificada foi 10,8 kDa (D) foi atribudo a forma glicosilada da protena
resultante da reao entre os acares redutores decorrentes da reao de Maillard,
aminocidos do N-terminal e resduos de lisina na estrutura proteica63,66.
92
Figura 26 - Espectro de Massas decorrente da anlise por MALDI-TOF-MS da protena LTP1 isolada.
4.1.4.2. Reatividade dos compostos contendo grupos tiis livre frente ao radical
HER.
A reatividade dos compostos contendo grupos tiis livre frente ao radical HER foi
determinada atravs da obteno das constantes de velocidade aparentes das reaes
supracitadas, as quais se encontram na Tabela 4. Nota-se que os valores das constantes de
velocidade (de 108 a 109 L mol-1 s-1) obtidas para os compostos contendo grupos tiis livre
esto prximas ao limite de difuso em meio aquoso, o que deixa patente a alta reatividade
destes compostos frente ao radical HER.
93
Tabela 4 - Constantes de velocidade aparentes das reaes entre o radical HER e os compostos
contendo grupos tiis livre e bloqueado, bem como aminocidos, determinadas por spin-trapping
RPE, em 1 min de reao e a temperatura de 25,0 0,2 oC.
Substratos
Cistena
Glutationa
Cys-Gly
His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp
Asn-Arg-Cys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Cys-Trp-Asn
N-acetilcistena
Homocistena
Cistena metil ster
DTT
Cistina
Glutationa oxidada
Metionina
S-metil-L-cistena
LTP1 (isolada)
LTP1 reduzida (adio de TCEP)
Histidina
Serina
Triptofano
Lisina
kap (L mol-1 s-1)

(1,0 0,3) x 109
(7,1 0,2) x 108
(9,0 0,2) x 108
(4,9 0,2) x 108
(1,7 0,3) x 109
(8,7 0,1) x 108
(1,4 0,2) x 109
(1,3 0,1) x 109
(2,7 0,1) x 109
N.R.*
N.R.*
N.R.*
N.R.*
N.R.*
(6,1 0,2) x 109
(7,5 0,3) x 104
(8,8 0,3) x 104
(6,7 0,1) x 105
(4,4 0,1) x 105
* N.R.: No Reativo.
Paralelamente, testou-se a reatividade dos compostos contendo os grupos tiis

oxidados ou bloqueados, como pontes de dissulfeto e radicais orgnicos ligados ao tomo de
enxofre, frente ao radical HER, os quais se mostraram no reativos, o que deixa evidente que
a reao est diretamente conectada ao grupo tiol. Por outro lado, os aminocidos histidina,
serina, triptofano e lisina, presentes na estrutura proteica da LTP1 e reconhecidamente
suscetveis aos processos oxidativos86,87, apresentaram constantes de velocidade aparentes na
ordem de 104 a 105 L mol-1 s-1, indicando que a extenso da reao maior para os
compostos/aminocidos contendo grupos tiis livre. Por fim, a reatividade da protena LTP1
isolada foi avaliada, no sendo observada reao. Este fato indica que possivelmente a
protena est em sua forma oxidada; ou seja, a protena LTP1 contem quatro pontes de
dissulfeto, as quais se encontram ilustradas (destacadas em verde) na Figura 27.
94
Figura 27 - Estrutura quaternria da protena LTP1 oxidada65. Figura gerada a partir do software
Weblab Viewer Lite.
De fato, a oxidao dos grupos RSH pode ter ocorrido durante o processo de
isolamento e purificao da protena ou mesmo durante o processo de armazenamento da
cerveja utilizada. Adicionou-se ento 4,5 equivalentes de TCEP para promover a reduo das
pontes de dissulfeto e, aps decorridos 30 minutos para promover a reduo, avaliou-se a
reatividade da mesma em sua forma reduzida frente ao radical HER. Neste caso, a protena
LTP1, em sua forma reduzida, mostrou-se altamente reativa, cuja constante de velocidade
aparente obtida foi igual a (6,1 0,2) x 109 L mol-1 s-1 a 25,0 0,2 oC.
Tambm foi avaliada a interferncia do TCEP oxidado, formado durante a reao de
reduo dos tiis oxidados, nos experimentos cinticos. Para tanto, utilizou-se como reagentes
na reao de reduo a cistina e a glutationa oxidada, a qual foi promovida pela adio de 1,5
equivalentes de TCEP. Depois de decorridos 30 minutos de reao, as cinticas foram
conduzidas, obtendo, ao final, constantes de velocidade aparentes iguais a (1,1 0,2) x 109
L mol-1 s-1 e (6,9 0,2) x 108 L mol-1 s-1 a 25,0 0,2 oC para a cistena e glutationa reduzidas
in situ, respectivamente. De fato, as constantes de velocidade aqui obtidas so estatisticamente
iguais (p = 0,05) s constantes apresentadas na Tabela 4, as quais se referem aos mesmos
substratos, porm, aplicando-os diretamente, em suas formas reduzidas, nas reaes cinticas.
95
Logo, constata-se que o produto decorrente da oxidao do TCEP no interfere nos resultados
dos experimentos cinticos.
Com a finalidade de investigar o mecanismo da reao envolvendo o radical HER e os
compostos contendo grupos tiis livre, avaliou-se o efeito isotpico cintico ao conduzir a
reao em meio deuterado (D2O/CH3CH2OD). Neste contexto, utilizou-se como substratos a
cistena e a glutationa e ao comparar os comportamentos lineares obtidos em ambos os meios,
normal e meio deuterado, Figura 28, verificou-se um decrscimo nas inclinaes das retas
referentes ao meio deuterado.
Figura 28 - Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] versus concentrao de cistena (A) e glutationa (B) em

meio normal () e deuterado (). Medidas obtidas pela anlise das reas dos espectros de RPE.
T = 25,0 0,2 oC; 1 minuto de reao.
(a)
(b)
96
Como resultado, tem-se um decrscimo acentuado na captao do radical pelos

substratos em meio deuterado, resultando na diminuio das respectivas constantes de
velocidade aparentes obtidas, conforme consta na Tabela 5.
Tabela 5 - Constantes de velocidade aparentes das reaes entre o radical HER e cistena e glutationa
em meio normal (H2O/CH3CH2OH) e deuterado (D2O/CH3CH2OD) determinadas por spin-trapping
RPE, em 1 min de reao e a temperatura de 25,0 0,2 oC.
Substratos
Cistena
Glutationa
kap (kH) (L mol-1 s-1)

H2O/Etanol
(1,0 0,3) x 109
(7,1 0,2) x 108
kap (kD) (L mol-1 s-1)

D2O/Etanol-d1
(4,6 0,1) x 108
(3,1 0,2) x 108
kH/kD
2,2
2,3
Assim, a partir da anlise entre as constantes de velocidade aparentes obtidas em

ambos os meios, verificou-se que a razo entre estas (kH/kD) foi de 2,2 e 2,3 para a cistena e
glutationa, respectivamente. Logo, os dados remetem a um efeito isotpico cintico primrio,
no qual a troca do tomo de hidrognio pelo istopo deutrio no grupo tiol confere um
aumento na energia de ativao para a abstrao do tomo pelo radical. Portanto, conclui-se
que a reao governada pela abstrao do tomo de hidrognio do grupo tiol pelo radical
HER.
4.1.4.3. Identificao dos produtos da reao entre os compostos contendo grupos tiis
livre e o radical HER.
Os produtos da reao entre a glutationa e o radical HER foram tentativamente
identificados por espectrometria de massas (HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS) pela infuso
direta da mistura reacional. Neste contexto, o espectro de massas resultante da anlise da
composio final da reao encontra-se apresentado na Figura 29. Aqui, nota-se, pela
presena do on quasi-molecular [M H]- cuja razo m/z igual a 306,0769 (erro de 1,1 ppm
calculado para [C10H17O6N3S H]- = 306,0759 m/z), que a glutationa no foi completamente
consumida na reao. Analogamente, observou-se a presena do on quasi-molecular [M H]97
em 661,1454 m/z (erro de 2,9 ppm calculado para [C20H32O12N6S2 H]- = 611,1441 m/z), o
qual refere-se formao do dissulfeto alusivo glutationa oxidada (GSSG). De fato, a
formao da glutationa oxidada na reao em estudo encontra-se previamente reportada na
literatura67,68; contudo, a formao do intermedirio cido sulfnico no foi detectado pela
adio da armadilha dimedona mistura reacional.
Figura 29 - Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) da mistura reacional entre a glutationa e o radical

HER, sob atmosfera de Ar, a 25,0 0,2 oC, 1 min de reao.
Logo, a partir deste conjunto de dados, pde-se inferir uma proposta para o
mecanismo da reao, o qual se inicia pela abstrao do tomo de hidrognio do grupo tiol
pelo radical HER, culminando na formao do radical tiila (RS ), que, ao recombinar-se com
outro radical tiila, forma o respectivo dissulfeto derivado do tiol inicial (RSSR), Esquema 15.
98
Esquema 15 - Mecanismo proposto para a reao entre o radical HER e os compostos contendo
grupos tiis livre.
4.1.4.4. Quantificao do teor de tiis presente e total contidos em diferentes

cervejas.
A quantificao da concentrao dos compostos contendo grupos tiis livre presentes
em sete tipos de cerveja foi efetuada utilizando a metodologia estabelecida por Abrahamsoon
e colaboradores89 ao empregar como agente derivatizante o ThiolGlo-1, o qual reage com o
on sulfito e tiis para formar adutos altamente fluorescentes, conforme ilustrado no Esquema
16. De acordo com o mecanismo da reao supracitada, o sulfito adiciona-se ao grupo
maleimida do ThiolGlo-1 via adio de Michael formando, aps uma hidrlise, dois ismeros,
compostos (a) e (b), Esquema 16. O composto (c), Esquema 16, refere-se ao aduto formado
na reao entre os tiis e o ThiolGlo-1.
99
Esquema 16 - Mecanismo da reao de derivatizao do ThiolGlo-1 e sulfito e tiol proposto por

Abrahamsoon89.
Assim, de acordo com o perfil cromatogrfico resultante da anlise do teor de tiis

presentes na cerveja #4, apresentado na Figura 30, verifica-se a presena de trs bandas de
eluio majoritrias, os quais esto indicados como eluatos A, B e C no cromatograma. Neste
contexto, verificou-se que os dois primeiros eluatos, cujos (tr) so 5,6 e 7,4 minutos para os
eluatos A e B respectivamente, correspondem eluio dos adutos derivados do sulfito, ao
passo que o ltimo eluato (C), em (tr) igual a 11,2 minutos, refere-se coeluio dos adutos
derivados dos tiis presentes na bebida.
100
Figura 30 - Cromatograma resultante da anlise de tiis presentes na cerveja #4. Bandas de eluio A,
em tr = 5,6 min, e B, em tr = 7,4 min, correspondem aos eluatos derivados do sulfito; banda de eluio
C, em tr = 11,2 min, corresponde ao eluato derivado dos compostos contendo grupos tiis.
Para a quantificao do teor de tiis totais nas cervejas, primeiramente adicionou-se

TCEP nas amostras, o qual, ao reduzir as pontes de dissulfeto dos tiis oxidados (RSSR),
conferiu um aumento no nvel de tiis livre no produto. Em seguida, as amostras foram
derivatizadas pela adio de ThiolGlo-1. Assim, pela anlise do cromatograma resultante da
adio do agente redutor, contido na Figura 31, observa-se a presena majoritria de quatro
bandas de eluio, denominados como A, B, C e D, as quais so referentes aos ismeros
derivados do sulfito, eluatos A e B em (tr) iguais a 5,6 e 7,4 minutos, respectivamente,
derivados do excesso de TCEP adicionado, eluato C em (tr) igual a 14,9 minutos, e derivados
dos tiis, eluato D em (tr) igual a 18,2 minutos. Ainda, ao comparar o cromatograma obtido na
ausncia de TCEP com o perfil cromatogrfico resultante da adio de TCEP, nota-se um
aumento expressivo do pico referente coeluio dos derivados dos tiis, o que reflete o
aumento no teor dos mesmos nas amostras. Por outro lado, verifica-se que a adio de TCEP
nas cervejas no interfere na quantificao de sulfito, uma vez que as bandas de eluio A e B
mantm-se constantes.
101
Figura 31 - Cromatograma resultante da anlise de tiis totais contidos na cerveja #4. Bandas de
eluio A, em tr = 5,6 min, e B, em tr = 7,4 min, correspondem aos eluatos derivados do sulfito; banda
de eluio C, em tr = 14,9 min, corresponde ao eluato derivado do excesso de TCEP adicionado; banda
de eluio D, em tr = 18,2 min, corresponde aos eluatos derivados dos compostos contendo grupos
tiis.
A Figura 32 apresenta o teor de tiis totais obtidos pela adio de TCEP em diferentes
cervejas. Do grfico possvel observar que a concentrao ideal de adio de TCEP para a
reduo dos tiis oxidados especfica para cada cerveja, sendo esta proporcional
concentrao de tiis livre presentes inicialmente nas amostras.
Figura 32 - Concentrao total de compostos contendo tiis livre em diferentes cervejas versus
concentrao de TCEP adicionado.
102
No entanto, observou-se, em algumas amostras, um decrscimo no teor dos tiis em

condies onde a concentrao de TCEP adicionada foi elevada. Assim, para avaliar o efeito
da adio de TCEP na quantificao dos compostos contendo tiis livre, bem como a
eficincia da reao de reduo, solues modelos contendo glutationa e glutationa oxidada
foram preparadas em tampo Tris- (ca. 0,25 mol L-1, pH = 7,5) e a estas adicionadas
diferentes concentraes de TCEP (ca. (2,5 e 4,5) x 10-4 mol L-1; em tampo Tris- ca. 0,25
mol L-1, pH = 7,5). Atravs do monitoramento das concentraes de tiis presentes nas
solues por HPLC, aps a derivatizao das amostras pela adio de ThiolGlo-1, construiuse uma curva de calibrao para a glutationa e glutationa oxidada, Figura 33 (a) e (b).
Figura 33 - Curva de calibrao para (A) glutationa e (B) glutationa oxidada em tampo Tris- (0,25
mol L-1, pH = 7,5) aps a adio de diferentes concentraes de TCEP (mol L-1):
() 2,5 10-4; () 4,5 10-4.
(a)
(b)
103
Da anlise do grfico contido na Figura 33 (a), verifica-se que de fato o excesso de

TCEP adicionado em relao concentrao de tiol presente no interfere na quantificao do
mesmo, resultando em um coeficiente linear da curva de calibrao prximo zero.
Analogamente, constatou-se a eficincia do TCEP na reduo de tiis oxidados pelo
comportamento linear da curva de calibrao obtida utilizando-se a glutationa oxidada,
Figura 33 (b), cujo coeficiente linear prximo zero. Ainda, verificou-se que o coeficiente
angular da curva de calibrao utilizando a glutationa oxidada, Figura 33 (b), guarda uma
relao de duas vezes o valor do coeficiente angular da curva obtida a partir da glutationa,
Figura 33 (a). Esta relao est intrinsecamente relacionada com a estequiometria da reao
de reduo, na qual uma molcula de tiol oxidado (RSSR) gera, ao final da reao de reduo,
duas molculas de tiis livre (RSH). Logo, este conjunto de dados corrobora com o fato de
que o TCEP reduz de forma eficaz os tiis oxidados e que o excesso de TCEP no interfere na
quantificao dos tiis livre.
4.1.4.5. Quantificao do teor de protena em diferentes cervejas.

Quantificou-se o teor de protena nas cervejas estudadas empregando o mtodo de
Bradford91. Os teores proteicos obtidos foram correlacionados com a concentrao dos
compostos contendo grupos tiis livre, presentes e totais, obtendo assim um comportamento
linear em ambos os casos, Figura 34 (a) e (b), respectivamente. Assim, contata-se que o teor
de protena e a concentrao de tiis, presentes e totais, contidos nas amostras de cerveja,
guardam uma relao direta, remetendo ao fato de que as protenas majoritrias presentes nas
cervejas so fontes de tiis. Alm disso, verifica-se que os interceptos na ordenada das curvas
obtidas a partir da regresso linear dos pontos no cruza o zero. Isto reflexo da limitao do
mtodo de Bradford, o qual detecta protenas com massas moleculares acima de 5 kDa91. Com
104
efeito, as protenas que apresentam massas moleculares abaixo de 5 kDa no foram

detectadas, sendo, portanto, sua concentrao subestimada.
Figura 34 - Concentrao de tiis presentes (a) e totais (b) em diferentes cervejas versus concentrao
de protena total determinada pelo mtodo de Bradford91.
(b)
(a)
Portanto, fica evidente que as protenas presentes nas cervejas constituem uma
importante fonte de tiis na bebida, visto que o aumento na concentrao das protenas
acarreta invariavelmente no aumento da concentrao de tiis. Assim, as protenas mostramse como fontes importantes de tiis, o que pode refletir no equilbrio redox do produto.
4.1.4.6. Investigao da estabilidade redox conferida pelos compostos contendo

grupos tiis livre e pela adio de TCEP na cerveja.
Avaliou-se a estabilidade redox conferida pelos compostos contendo grupos tiis livre
na cerveja atravs dopagem da mesma pela adio de glutationa reduzida (ca. (1,0 e 2,0) x
10-3 mol L-1). Neste contexto, a formao do radical HER foi acompanhada ao monitorar-se o
sinal do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] por RPE em amostras da cerveja #4
submetidas ao envelhecimento acelerado (60,0 0,2 oC). Assim, a partir da anlise do grfico
contido na Figura 35, no se observou nenhum efeito antioxidante dos tiis na bebida, uma
105
vez que o perodo de induo (do ingls, lag-phase) na soluo controle (sem aditivo) foi
exatamente o mesmo verificado nas amostras dopadas com glutationa.
Figura 35 - Gerao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] medida por RPE aps o perodo de
induo em amostras da cerveja #4 submetidas a um envelhecimento aerbico acelerado
(60,0 0,2 oC), contendo diferentes concentraes de glutationa (mol L-1): (--) 0,0; (--) 1,0 10-3;
(--) 2,0 10-3.
Isto provavelmente se deve ao fato de que as medidas no foram conduzidas em

atmosfera inerte e, portanto, sabe-se que a presena de oxignio molecular dissolvido no meio
reage prontamente com o radical HER, culminando na formao de acetaldedo com constante
de velocidade k2 = 1,0 x 1010 L mol-1 s-1 69. Logo, a reao entre o radical e o oxignio
favorecida em detrimento da reao com a glutationa (kap = (7,1 0,2) x 108 mol L-1).
A estabilidade redox conferida pela adio de TCEP na cerveja foi tambm averiguada
ao dopar-se amostras da cerveja #4 com diferentes concentraes do agente redutor (ca.
(1,0, 2,5 e 5,0) x 10-4 mol L-1) e submet-las ao envelhecimento acelerado (60,0 0,2 oC).
Analisando as intensidades relativas do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] das amostras,
Figura 36, constata-se que a adio de TCEP culmina na diminuio da estabilidade redox da
bebida refletida pela diminuio do perodo de induo.
106
Figura 36 - Gerao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] analisado por RPE aps o perodo de
induo (lag-phase) em amostras da cerveja #4 contendo diferentes concentraes de TCEP
(mol L-1): (a) 0,0; (b) 1,0 10-4; (c) 2,5 10-4 e (c) 5,0 10-4; submetidas a um envelhecimento aerbico
acelerado (60,0 0,2 oC).
Logo, os dados aqui apresentados sugerem que a adio de TCEP colabora para a
intensificao da formao do radical HER, a qual poder estar ocorrendo via reao do tipo
Fenton.
4.1.4.7. Influncia do TCEP na reao de Fenton.

Para avaliar a influncia da adio de TCEP na reao de Fenton, solues modelo
contendo a armadilha qumica 4-POBN, H2O2, Fe(II) e etanol foram dopadas com diferentes
concentraes de TCEP e em seguida acompanhou-se a formao do radical HER pelo
monitoramento do sinal do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] via RPE. Assim,
considerando a intensidade do sinal de uma soluo controle (sem adio de TCEP) como
referncia, nota-se, atravs da Figura 37, um aumento gradativo na intensidade do sinal a
partir de 1,0 x 10-4 mol L-1 de TCEP adicionado. Logo, constata-se que a adio do TCEP
intensifica a gerao do radical hidroxila (OH ), o qual reage com o etanol em soluo
(k2 = 1,7 x 109 L mol-1 s-1)69, culminando no aumento da formao do radical HER.
107
Figura 37 - Gerao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] medida por RPE em solues aquosas
modelo contendo etanol (5,8% v/v), 4 mL de 4-POBN (3,2 10-3 mol L-1), 80 L de H2O2
(24,0 10-3 mol L-1), 20 L de FeSO4.7H2O (22,0 10-3 mol L-1) e diferentes concentraes de TCEP
(de 0,1 a 40,0 10-3 mol L-1).
4.1.4.8. Ensaio de reduo do Fe(III) a Fe(II) pela adio de TCEP.

Uma possvel via reacional para gerao do radical hidroxila pela adio de TCEP
consiste na reduo do Fe(III) a Fe(II), o qual ir reagir com o perxido de hidrognio e ento
formar o radical supracitado. De fato, constata-se que termodinamicamente o TCEP, cujo
potencial de oxidao 0,045 V versus ENH98, pode reduzir o on de Fe(III) a Fe(II)
(E0 = + 0,77 V)99. Assim, para avaliar a habilidade do TCEP em reduzir o on de Fe(III),
adicionou-se a ferrozina em solues modelo contendo diferentes concentraes de TCEP e
ons de Fe(III). A reao dos ons Fe(II) com a ferrozina leva a formao do complexo
[FeII(ferrozina)], o qual absorve em = 560 nm93. Desta forma, a partir do grfico
apresentado na Figura 38, observa-se um aumento na intensidade da absorbncia em 560 nm,
o que reflete a formao do complexo supracitado e, consequentemente, comprova a reduo
do on Fe(III) a Fe(II) pelo TCEP.
108
Figura 38 - Formao do complexo [FeII(ferrozina)] pela adio de TCEP em diferentes
concentraes de FeCl3 (mol L-1): (a) 1,8 10-5; (b) 3,7 10-5; (c) 7,4 10-5.
4.1.5. Investigao da reatividade de diferentes lipdeos frente ao radical HER.

A reatividade dos lipdeos frente ao radical HER foi determinada atravs da obteno
das constantes de velocidade aparentes ao empregar uma abordagem cintica de competio e
os substratos contidos na Figura 7, conforme descrito no item 3.5.2. A Tabela 6 resume os
valores das constantes de velocidade aparentes obtidas, entre as quais se destaca a constante
obtida para a reao envolvendo o metil docosahexanoato, cujo valor de (2,7 0,1) x107
L mol-1 s-1. Por outro lado, nenhuma reao foi observada para a reao entre o radical e o
metil oleato, o qual contm apenas uma instaurao em sua estrutura e, portanto, no
apresenta tomos hidrognio (bis)allicos.
109
Tabela 6 - Constantes de velocidade aparentes das reaes entre o radical HER e os lipdeos
determinadas por spin-trapping RPE, em 1 min de reao e a temperatura de 25,0 0,2 oC.
Substratos
Colesterol
Ergosterol
Metil oleato
Metil linoleato conjugado
Metil linoleato
Metil linolenato
Metil araquidonato
Metil docosahexanoato
BDE C-H
(kJ mol-1)
328 (C7H)100
296 (C14H)101
331 (C8H)102
326 (C8H)101
294 (C11H)102
293 (C11H)102
288 (C10H)103
267 (C12H)103
Nmero de
hidrognios
(bis)allicos
0
0
0
0
1
2
3
5
kap
(L mol-1 s-1)
(2,7 0,1) x 106
(5,2 0,1) x 107
N.R.*
(1,3 0,2) x 107
(3,7 0,1) x 106
(7,6 0,1) x 106
(1,5 0,1) x 107
(2,7 0,1) x 107
* N.R.: No Reativo.
De acordo com os dados obtidos, a reatividade dos steres derivados dos cidos graxos
poli-insaturados no-conjugados frente ao radical HER mostrou-se estar diretamente
conectada habilidade dos substratos em doar tomos de hidrognio (bis)allicos para a
espcie radicalar. De fato, esta capacidade dos metil steres no-conjugados em doar tomos
de hidrognio (bis)allicos refletida pelo decrscimo dos valores das BDEs das ligaes C-H
envolvendo os referidos tomos de hidrognios.
Conforme pode ser observado na Figura 39, as constantes de velocidade aparentes das
reaes envolvendo os steres derivados dos cidos graxos poli-insaturados no-conjugados
guarda uma relao direta e linear (R2 = 0,989) com o nmero de grupos metilnicos
(bis)allicos suscetveis a oxidao presentes nas molculas dos substratos aqui inseridos.
Logo, constata-se que a reatividade dos referidos metil steres frente ao radical HER
governada pelo fator entrpico, uma vez que constantes de velocidade aparentes obtidas
apresentaram uma maior dependncia com relao ao nmero de tomos de hidrognio
(bis)allicos presentes nas molculas dos substratos do que em relao aos respectivos valores
de BDE das ligaes C-H envolvendo tais tomos de hidrognio.
110
Figura 39 - Grfico das constantes de velocidade aparentes das reaes entre o radical HER e steres
derivados dos cidos graxos insaturados versus nmero de grupos metilnicos (bis)allicos dos
substratos.
De acordo com a literatura102, os metil steres derivados dos cidos graxos oleico,
linoleico e linolnico apresentam os seguintes potenciais de oxidao (Eox) + 2,12, + 2,06 e
+ 2,05 V versus ENH, respectivamente. Ainda, conforme pode ser verificado atravs da
leitura dos voltamogramas contidos na Figura 40, o metil linoleato conjugado e o ergosterol
apresentaram picos de oxidao em + 1,95 e + 1,40 V versus ENH, Figuras 40 (a) e (b),
respectivamente, sendo ambos os voltamogramas caracterizados pela presena de processos
irreversveis assinalados pela ausncia da onde de varredura catdica. Logo, pode-se inferir
que o processo de oxidao lipdica pelo radical em estudo via transferncia de eltron , de
fato, termodinamicamente inviabilizada, uma vez que o potencial de reduo do radical HER
(E= + 0,98 V versus ENH)96 significativamente menor que os potenciais de oxidao
obtidos para os diferentes lipdeos.
111
Figura 40 - Voltamogramas cclicos do (a) metil linoleato conjugado e (b) ergosterol, em acetonitrila
contendo 0,1 mol L-1 de perclorato de tetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: platina
(trabalho e contra-eletrodo), ferroceno (referncia interna). Velocidade de varredura = 100 mV s-1.
(a)
(b)
(*) Impureza.
Portanto, constata-se que a reao entre o radical HER e os metil steres derivados dos
cidos graxos poli-insaturados no-conjugados e esteris provavelmente governada pelo
processo de oxidao via transferncia de tomo de hidrognio (bis)allico dos substratos para
o radical.
Surpreendentemente, o metil linoleato conjugado (9E,11E) apresentou uma elevada
reatividade (kap = (1,3 0,2) x 107 L mol-1 s-1) frente ao radical HER em relao reatividade
apresentada pela srie dos lipdeos em estudo. De fato, a reatividade do metil ster conjugado
112
derivado do cido linoleico no pode ser atribuda reao de transferncia de eltrons do

substrato para a espcie radicalar, pois o lipdeo aqui inserido apresenta um potencial de
oxidao (Eox = + 1,95 versus ENH) significativamente mais positivo que o potencial de
reduo do radical HER (E= + 0,98 V versus ENH)96. Por outro lado, a reao supracitada
tambm no pode ser governada pela reao de transferncia de tomo de hidrognio
(bis)allico, uma vez que o lipdeo em estudo no apresenta grupos metilnicos (bis)allicos
susceptveis a oxidao.
Com a finalidade de obter as energias dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO dos
metil steres conjugados e no-conjugados, suas estruturas qumicas foram mimetizadas s
molculas do 1,3- e 1,4-hexadieno e ento efetuou-se os clculos ab initio utilizando o
mtodo DFT. Assim, a partir da comparao entre as energias dos orbitais de fronteira HOMO
e LUMO dos dienos e a energia do orbital SOMO do radical, Figura 41, verifica-se uma
menor diferena de energia (E = 174 kJ mol-1) entre os orbitais HOMO e SOMO do dieno
conjugado e do radical, respectivamente.
Figura 41 - Diagrama de energia dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO do 1,3- e 1,4-hexadieno e
do orbital de fronteira SOMO do radical HER.
113
De fato, este menor intervalo energtico (E) possivelmente resulta em uma maior
facilidade na interao entre os orbitais HOMO-SOMO do lipdeo e do radical,
respectivamente, e confere ao radical HER um carter eletroflico, culminando em uma reao
de adio eletroflica do radical ao sistema conjugado do metil ster derivado do cido
linoleico.
Pela leitura das constantes de velocidade aparentes apuradas para a reao envolvendo
os diferentes lipdeos na capitao do radical HER, verifica-se que a reatividade apresentada
pelos esteris diverge do comportamento linear apresentado pelos olefinas acclicas
no-conjugadas, pois, apesar de ambos os esteris colesterol e ergosterol no apresentarem
tomos de hidrognios (bis)allicos em suas estruturas, estes exibiram uma reatividade
elevada frente espcie radicalar. Esta diferena na reatividade possivelmente est associada
ao arranjo conformacional que as ligaes C-H allicas assumem na estrutura cclica, o qual
confere uma menor rotao entre as ligaes qumicas da estrutura e permite uma
sobreposio mais efetiva entre os orbitais do alceno e o orbital p do radical gerado do
cicloalceno104.
Com respeito reatividade dos esteris frente ao radical HER, o ergosterol mostrou-se
ser 19 vezes mais reativo que o colesterol. Estudos tm apontado uma maior suscetibilidade a
processos oxidativos por parte do cicloalceno insaturado contendo duplas ligaes
conjugadas, tais como o ergosterol, a qual foi atribuda aos efeitos na estabilidade
conformacional conferidos pela ressonncia presente na molcula103,104. De fato, a
estabilidade na conformao promovida pela ressonncia da molcula acarreta em uma maior
estabilizao do estado de transio e permite uma abstrao dos tomos de hidrognio
allicos mais efetiva103,104.
114

envolvendo os metil steres no-conjugados derivados dos cidos graxos e o radical HER.
Os produtos da reao entre os lipdeos e o radical HER foram tentativamente
identificados empregando-se como substrato o metil linoleato, sendo a mistura reacional
analisada pela tcnica UPLC-HESI-II-LTQ Orbitrap FT-MS. A partir da leitura do
cromatograma de ons total apresentado na Figura 42 (a), nota-se a presena de quatro bandas
de eluio decorrentes da reao, os quais esto identificados como A, B, C e D.
reao do metil linoleato e o radical HER, sob atmosfera de Ar, T = 25,0 0,2 oC, t = 1 minuto de
reao. (b) Espectro de massas (HESI-II-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 19,0 min
(eluato B). (c) Espectro de massas (HESI-II-(+)-MS) com atribuio do on do eluato em tr = 20,9 min
(eluato D).
(a)
(b)

115

(c)
Os trs primeiros eluatos, cujos (tr) so 18,8, 19,0 e 19,6 minutos para as bandas de
eluio A, B e C, respectivamente, referem-se aos produtos formados na oxidao primria do
ster derivado do cido linoleico, os quais apresentaram um mesmo padro de
fragmentograma, representado na Figura 42 (b) pelo espectro de massas obtido a partir do
eluato B. Neste contexto, nota-se a presena do on quasi-molecular [M + H]+ cuja razo m/z
de 311,4787 (erro de - 2,2 ppm calculado para [C19H34O3 + H]+ = 311,4794 m/z), o qual
indica a formao de hidrxidos derivados do metil linoleato. Por outro lado, o espectro de
massas obtido do eluato D, em (tr) igual a 20,9 minutos, Figura 42 (c), revelou a presena do
on quasi-molecular [M + H]+ em 295,4796 m/z (erro de - 1,3 ppm calculado para
[C19H34O2 + H]+ = 295,4800 m/z), o qual refere-se aluio do substrato inicial, indicando
que o metil ster no foi completamente consumido na reao.
O estudo sistemtico dos mecanismos que descrevem as principais vias de oxidao
dos cidos graxos insaturados tem sido o foco de muitos trabalhos cientficos ao longo de
cinquenta anos, os quais constataram a formao dos derivados hidroperxidos, perxidos
cclicos e hidrxidos105-107. Logo, com base nos dados aqui observados e os que se encontram
reportados na literatura, props-se o mecanismo de reao que rege a oxidao primria do
metil linoleato ocasionada pela presena do radical HER, o qual pode ser extrapolado para os
demais metil steres poli-insaturados no-conjugados e esteris aqui inseridos.
116
Conforme apresentado no Esquema 17, a reao inicia-se pela abstrao do tomo de

hidrognio (bis)allico do metil linoleato (composto (a), Esquema 17) pelo radical HER,
formando trs radicais secundrios estabilizados por ressonncia, os quais seguem reagindo
por dois caminhos.
Esquema 17 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o metil linoleato e o radical HER.
O caminho 1 resume a reao entre as espcies radicalares intermedirias e os

oxignio molecular, a partir da qual tem-se a formao dos radicais peroxilas que
eventualmente abstraem tomos de hidrognios do meio reacional, culminando na formao
117
dos hidroperxidos. A presena de ons metlicos de Fe(II) conduz a clivagem dos grupos
hidroperxidos63,66 ao formar radicais alcoxila, que, aps a abstrao de mais um tomo de
hidrognio do meio reacional, gera os hidrxidos identificados (composto (b), Esquema 17).
Por outro lado, o caminho 2 descreve a formao dos hidrxidos derivados do metil linoleato
(composto (b), Esquema 17) pela recombinao direta entre os radicais intermedirios,
provenientes do metil ster, e os radicais hidroxila.
4.2. Comparao entre a reatividade apresentada pelos compostos de interesse frente o

radical HER.
A partir das constantes de velocidade aparentes determinadas para a reao do radical
HER com as lupulonas ((2,9 0,1) x 108 L mol-1 s-1), com os terpenos ((2,2 0,2) x 105
L mol-1 s-1 para o -pineno, e (1,5 0,2) x 107 L mol-1 s-1 para o terpinoleno), com os
flavonoides prenilados ((1,5 0,2) x 109 L mol-1 s-1 para a 6-prenilnaringenina, e (3,6 0,1) x
109 L mol-1 s-1 para o xantohumol) e com os compostos contendo grupos tiis livre
((4,9 0,2) x 108 L mol-1 s-1 para His-Cys-Lys-Phe-Trp-Trp, e (6,1 0,2) x 109 L mol-1 s-1
para a protena LTP1), aliada s demais constantes de velocidade reportadas na literatura
envolvendo o radical HER e outros compostos presentes na cerveja, pde-se inferir sobre a
extenso da reao de degradao trmica conferida durante o envelhecimento da bebida.
Neste contexto, de Almeida e colaboradores23,30 demonstraram que o radical HER reage
prontamente com as isohumulonas, em especial com os diastereoismeros trans-, cuja
constante de velocidade aparente de 9,2 x 109 L mol-1 s-1
95
. Encontram-se tambm
reportadas na literatura as constantes de velocidade especficas para a reao envolvendo

compostos fenlicos, tais como quercetina e kaempferol, as quais so da ordem de
104 L mol-1 s-1 73.
118
Sabe-se que as concentraes das isohumulonas e compostos contendo grupos tiis

livre presentes na cerveja varia entre (0,4 a 2,2) x 10-4
108
e (1,3 a 4,6) x 10-5 mol L-1
62
respectivamente. Adicionalmente, encontra-se reportada na literatura74 a concentrao

conferida aos compostos fenlicos presentes na bebida, a qual foi estimada como sendo igual
a 2,4 x 10-3 mol L-1 expressa em equivalentes de cido glico. Pode-se, ainda, assumir as
concentraes do isoxantohumol ((0,1 a 9,7) x 10-6 mol L-1)39 e do linalol (~ 2,0 x 10-7
mol L-1)28,109 como sendo as concentraes dos flavonoides prenilados e terpenos presentes na
cerveja, respectivamente, uma vez que estes so os constituintes majoritrios dos
prenilflavonoides e terpenos identificados na bebida.
Assim, considerando as concentraes dos constituintes utilizados neste trabalho e
comparando as respectivas constantes de velocidade aparentes obtidas para a reao
envolvendo estes compostos e o radical HER, conclui-se que, apesar das substncias fenlicas
estarem presentes em concentraes superiores, a extenso da reao de oxidao trmica na
cerveja maior para os cidos amargos do lpulo (lupulonas e isohumulonas), seguida pela
reao envolvendo os compostos contendo grupos tiis livre, flavonoides prenilados e
terpenos.
Com respeito reatividade apresentada pelos diferentes lipdeos avaliados frente ao
radical HER, conclui-se que, de fato, os flavonoides prenilados podem conferir um
significativo efeito antioxidante no organismo, em especial no fgado, devido s suas
caractersticas lipoflicas. Desta forma, considerando uma absoro eficiente dos compostos
polifenlicos prenilados pelo organismo humano, estes podem prontamente proteger a
membrana celular contra possveis danos ocasionados pelo radical HER gerado como
consequncia do consumo abusivo de bebidas alcolicas.
119
4.3. Reatividade dos compostos de interesse frente ao radical fenoxila.

A partir do mtodo descrito no item 3.13, a formao do radical fenoxila (ArO) se deu
a partir da abstrao de um tomo de hidrognio do grupo hidroxila da molcula do fenol pelo
radical tert-butoxila (t-BuO), o qual foi gerado pela irradiao do di-tert-butilperxido em
= 355 nm, conforme ilustrado no Esquema 18.
Esquema 18 - Ilustrao da reao de formao do radical fenoxila a partir da irradiao do di-tertbutilperxido em = 355 nm.
Pela leitura do espectro de diferena de absoro eletrnico de transientes obtido nas

condies experimentais, apresentado na Figura 43, nota-se a presena de duas bandas, uma
mais intensa centrada em 390 nm e outra de menor intensidade centrada em 600 nm. De fato,
estas bandas so decorrentes das absores do transiente alusivo ao radical fenoxila e esto de
acordo com os relatos da literatura110.
120
Figura 43 - Espectro de absoro do transiente alusivo ao radical fenoxila. Soluo irradiada em

= 355 nm contendo di-tert-butil-perxido (70 % v/v) e fenol (0,1 mol L-1; em acetonitrila), sob
atmosfera de Ar e mantida a 25,0 0,2 oC.
Atravs do monitoramento da diferena de absorbncia do transiente em 390 nm,

apresentado na Figura 44, obteve-se o tempo de meia vida (t1/2) do radical ArO, cujo valor
estimado foi igual a 7 s.
Figura 44 - Curva de decaimento exponencial de primeira-ordem referente ao transiente alusivo ao

radical fenoxila. Soluo irradiada em = 355 nm contendo di-tert-butil-perxido (70 % v/v) e fenol
(0,1 mol L-1; em acetonitrila), sob atmosfera de Ar e mantida a temperatura de 25 0,2 oC; (leitura) =
390 nm.
O valor de t1/2 obtido experimentalmente superior ao valor reportado na literatura,

cujo valor 2,4 s determinado em meio aquoso110. Esta diferena entre os valores de t1/2
121
possivelmente est relacionada aos diferentes meios empregados (solventes prticos e

aprticos), uma vez que em solventes aprticos (neste caso, acetonitrila) a espcie radical
tende a apresentar-se mais estvel.
Empregando-se diferentes concentraes dos substratos de interesse (lupulonas,
isohumulonas, terpenos e flavonoides prenilados), a reatividade destes frente ao radical
fenoxila foi estimada. Nenhuma reatividade foi observada empregando-se os cidos amargos
derivados do lpulo, uma vez que a constante de velocidade de decaimento do radical
inalterada pela presena do substrato.
O estudo da reatividade envolvendo o radical fenoxila frente a compostos orgnicos
foi o foco de diversos estudos94,111,112. Neste contexto, diversos trabalhos sugerem que o
mecanismo envolvido neste tipo de reao governado via transferncia de eltron dos
substratos pelo radical supracitado111. Sabe-se que o potencial de oxidao das lupulonas de
+ 1,1 V versus ENH, ao passo que os potenciais verificados para as isohumulonas, em suas
formas aninica e molecular, so + 1,4 e + 1,8 V versus ENH 95, respetivamente. Ainda, da
literatura, tem-se que o potencial de reduo de um eltron do radical fenoxila derivado do
fenol igual a + 0,8 versus ENH113. Logo, verifica-se que o potencial de reduo do radical
significativamente menor que os potenciais de oxidao obtidos para os cidos amargos
derivados do lpulo. Portanto, a inercia destes substratos frente ao radical fenoxila pode ser
explicada com base nos respectivos potenciais redox, uma vez que a reao via transferncia
de eltron termodinamicamente inviabilizada.
O mesmo feito foi observado para os terpenos em estudo. Analogamente, Cardoso e
colaboradores74 tambm no observaram nenhuma reatividade dos terpenos frente
desativao do estado tripleto excitado da riboflavina. A partir deste achado, pode-se inferir
que o potencial de oxidao dos terpenos significativamente diferente e superior ao
potencial de reduo da riboflavina tripleto (+ 2,2 V versus ENH)74. Desta forma, a reao
122
entre os terpenos e o radical fenoxila inviabilizada termodinamicamente pela diferena

marcante entre os potencias redox das espcies envolvidas.
No foi possvel avaliar a reatividade dos flavonoides prenilados xantohumol e
isoxantohumol pela metodologia empregada, uma vez que, pelo espectro de absoro
eletrnica destes, verifica-se que os substratos supracitados absorvem na regio de 280 a 440
nm e 260 a 360 nm, respectivamente114. No entanto, as demais flavanonas no se mostraram
reativas frente ao radical aqui inserido. Desta forma, anlogo ao exposto anteriormente,
provavelmente as diferenas entre os potenciais de oxidao destes substratos e o potencial de
reduo do radical fenoxila so acentuadas; logo, a reao entre estes invivel.
123
Concluses
4.
CONCLUSES
A partir das constantes de velocidade aparentes determinadas para as reaes
envolvendo o radical HER e as lupulonas, os terpenos, os flavonoides prenilados e os

compostos contendo grupos tiis livre, constatou-se que estes substratos so prontamente
oxidados na presena do radical HER. Observa-se que os cidos amargos do lpulo
apresentam a maior reatividade frente ao radical HER, seguido pelos compostos contendo
grupos tiis livre, flavonoides prenilados e terpenos.
Como produtos da reao envolvendo as lupulonas, foram identificados compostos
contendo um grupo hidroxila ligados cadeia lateral prenila, bem como compostos
decorrentes da adio de uma molcula do radical HER na cadeia lateral. Estes compostos so
decorrentes de reaes de oxidao das lupulonas seguindo um mecanismo conduzido por
espcies radicalares, tais como o radica HER e o radical hidroxila, na presena de traos de
oxignio e ons de metais de transio de Fe(II). Analogamente, foi identificado, como
produtos majoritrios formados na oxidao trmica dos terpenos, uma vasta gama de
ismeros hidroxilados contendo uma molcula do radical hidroxila ligada molcula do
precursor inicial. Estes produtos foram propostos serem formados a partir de uma mecanismo
iniciado pelo radical HER, seguido por reaes subsequentes envolvendo o oxignio
molecular, ons de metais de transio de Fe(II) e radicais hidroxila.
Por outro lado, para a reao envolvendo os flavonoides prenilados e o radical HER,
verificou-se mecanismos de reao distintos para a chalcona xantohumol e para as flavanonas
isoxantohumol, 6- e 8-prenilnaringenina. No primeiro caso, constatou-se a formao
majoritria de trs produtos, sendo dois destes ismeros posicionais contendo uma molcula
do radical HER adicionado molcula do precursor; ao passou que o terceiro produto
apresentou duas molculas do radical HER adicionada molcula. Para a reao envolvendo
o isoxantohumol, apenas um composto foi identificado, o qual apresentou uma molcula do
124
Concluses
radical HER ligada estrutura do precursor. De fato, a diferena na reatividade observada

para estes compostos foi relacionada presena da carbonila ,-insaturada na molcula do
xantohumol, a qual confere um stio de reao adicional ao composto. O mecanismo de
reao proposto para estes substratos resumem os processos de oxidao iniciados pela
presena do radical HER, o qual abstrai um tomo de hidrognio (bis)allico da cadeia lateral
prenila, bem como adiciona-se nucleofilicamente carbonila ,-insaturada na molcula do
xantohumol.
Para a reao entre os compostos contendo grupos tiis livre e o radical HER
constatou-se a formao do dissulfetos decorrentes da recombinao radicalar entre os
radicais tiila. Contudo, no se observa reao envolvendo os cidos amargos do lpulo, os
terpenos e as flavanonas 6- e 8-prenilnaringenina frente ao radical fenoxila. Logo, os
resultados aqui apresentados contribuem para um maior entendimento sobre as principais vias
de degradao oxidativa que esto inseridos na degradao trmica da cerveja.
Atravs da quantificao dos teores de tiis presentes e totais contidos em diferentes
amostras de cerveja, bem como pela quantificao da concentrao de protenas presente na
bebida, observa-se uma correlao direta entre os teores destes componentes e uma maior
estabilidade trmica para as cervejas com maiores teores de protenas e tiis reduzidos.
Quanto a oxidao lipdica desencadeada pelo radical HER, constatou-se que a reao
iniciada pela abstrao dos tomos de hidrognio (bis)allicos dos metil steres derivados
dos cidos graxos poli-insaturados no-conjugados e pela transferncia de tomo de
hidrognio allico provindo dos esteris para a espcie radicalar. Neste contexto, os ismeros
hidroxilados foram identificados, como produtos decorrentes da oxidao primria dos metil
steres de cidos poli-insaturados.
Como um todo, considerando as caractersticas lipoflicas dos flavonoides prenilados,
bem como o fato destes serem aptos absoro e ao transporte atravs da parede intestinal,
125
Concluses
conclui-se que os polifenis prenilados podem, de fato, conferir um significativo efeito

antioxidante no organismo humano, em especial no fgado, onde o radical HER
reconhecidamente
promove
hepatotoxicidade.
Assim,
os
prenilflavonoides
podem
prontamente proteger a membrana celular contra possveis danos gerados pelo radical HER
em consequncia do consumo abusivo de bebidas alcolicas.
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138
Apndice
Apndice A
Primeiramente, assume-se que os processos cinticos das reaes abaixo (1 e 2) so
majoritrios durante a captao do radical HER.
Pode-se assumir as seguintes equaes no consumo do radical HER:
- d[H3CHCOH] = k2 * [4-POBN] * [H3CHCOH]

dt
(3)
d[H3CHCOH]
= k2 * [IAA] * [H3CHCOH]
dt
(4)
Quando a captao do radical pelos substratos igual a 50% tem-se que as taxas de
consumo do radical HER (3) e (4) se igualam. Logo, a equao abaixo pode ser escrita, a qual
expressa a relao entre as constantes de velocidade das duas reaes envolvidas (k2 e k2).
k2 * [4-POBN] = k2 * [SUBSTATO]
Esta equao pode ser generalizada para qualquer percentual de captao do radical:
F
* k2 * [4-POBN] = k2 * [SUBSTRATO]
1-F
Assim, a porcentagem de captao do radical (F) obtida atravs do experimento de
controle,
qual
apresenta
um
sinal
analtico
referente
do
aduto
radical
[4-POBN/CH(CH3)OH], e de experimentos variando a concentrao de substratos, no qual

verifica-se uma reduo do sinal analtico referente ao aduto radical.
Apndice
Apndice B
Figura B1. Alargamento (417 419 m/z) do espectro de massas (orbitrap HESI-II-FT-MS) da mistura
reacional entre os -cidos e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a 25,0 0,2 oC, 1 min de reao.
Figura B2. Alargamento (430,8 432,6 m/z) do espectro de massas (orbitrap HESI-II-FT-MS) da
mistura reacional entre os -cidos e o radical HER, sob atmosfera de Ar, a 25,0 0,2 oC, 1 min de
reao.
Apndice
reao.
reao.
Apndice
reao.

Subsídio - Oxidação de Alfa Ácidos No Lúpulo - Envelhecimento Da Cerveja PDF

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Subsídio - Oxidação de Alfa Ácidos No Lúpulo - Envelhecimento Da Cerveja PDF

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Msc.

Natlia Ellen Castilho de Almeida

Reatividade das lupulonas, terpenos, flavonoides prenilados e

Tese apresentada ao Instituto de Qumica de So

Orientador: Prof. Dr. Daniel Rodrigues Cardoso

A minha av Maria (in memoriam) pelo

"O que sabemos uma gota; o que ignoramos

Figura 3 - Representao das estruturas qumicas dos principais terpenos presentes no

Figura 4 - Representao das estruturas qumicas dos flavonoides prenilados derivado

Figura 5 - Fluxograma do mecanismo de biossntese dos compostos contendo grupos

Figura 8 - Espectros de RPE obtidos experimentalmente para a formao do aduto

Figura 9 - Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] versus concentrao de isoxantohumol.

Figura 10 - Voltamogramas cclicos das lupulonas em sua forma molecular, em

Figura 11 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica contendo os produtos

Figura 12 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica deuterada (etanol-d6)

Figura 13 - Representao das possveis ligaes C-H envolvidas na abstrao do

Figura 14 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica contendo os produtos

Figura 15 - Representao das estruturas qumicas da (a) quercetina, (b) naringenina

Figura 16 - Representao das configuraes espaciais e das superfcies de contorno

Figura 17 - Representao das possveis ligaes C-H e O-H envolvidas na abstrao do

Figura 18 - Diagrama de energia dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO dos

Figura 19 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica contendo os produtos

Figura 20 - Representao das estruturas qumicas do (a) cinamaldedo e (b) cido

Figura 21 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica contendo os produtos

Figura 22 - Cromatograma resultante da etapa de isolamento da protena LTP1 por

Figura 23 - Gis de SDS-PAGE (18% - acrilamida) decorrentes da anlise das fraes

Figura 24 - Cromatograma resultante da etapa da purificao da protena LTP1 por

Figura 25 - Gis de SDS-PAGE (18% - acrilamida) decorrentes da anlise das fraes

Figura 26 - Espectro de Massas decorrente da anlise por MALDI-TOF-MS da protena

Figura 27 - Estrutura quaternria da protena LTP1 oxidada65. Figura gerada a partir do

Figura 28 - Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] versus concentrao de cistena (A) e

Figura 29 - Espectro de massas (HESI-II-(-)-MS) da mistura reacional entre a glutationa

Figura 30 - Cromatograma resultante da anlise de tiis presentes na cerveja #4. Bandas

Figura 31 - Cromatograma resultante da anlise de tiis totais contidos na cerveja #4.

Figura 32 - Concentrao total de compostos contendo tiis livre em diferentes cervejas

Figura 35 - Gerao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] medida por RPE aps o

Figura 36 - Gerao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] analisado por RPE aps

Figura 37 - Gerao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] medida por RPE em

Figura 38 - Formao do complexo [FeII(ferrozina)] pela adio de TCEP em diferentes

Figura 40 - Voltamogramas cclicos do (a) metil linoleato conjugado e (b) ergosterol,

Figura 41 - Diagrama de energia dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO do 1,3- e

Figura 42 - (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica contendo os produtos

Figura 43 - Espectro de absoro do transiente alusivo ao radical fenoxila. Soluo

Figura 44 - Curva de decaimento exponencial de primeira-ordem referente ao transiente

Esquema 2 - Proposta de mecanismo antioxidante de protenas contendo grupo tiol

Esquema 3 - Representao da Reao de Fenton

Esquema 4 - Formao e reaes subsequentes do radical 1-hidroxietila (HER), em

Esquema 5 - Reao de formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

Esquema 6 - Ilustrao da reao de competio entre a armadilha qumica 4-POBN e

Esquema 7 - Ilustrao da reao entre o cido sulfnico e a dimedona e formao do

Esquema 8 - Mecanismo de reduo das pontes de dissulfeto pelo TCEP

Esquema 9 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre as lupulonas e o radical

Esquema 10 - Ilustrao da formao dos possveis radicais durante a reao entre o

Esquema 11 - Ilustrao da formao dos possveis radicais durante a reao entre o

Esquema 12 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o terpinoleno e o

Esquema 13 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o xantohumol e o

Esquema 14 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o isoxantohumol e o

Esquema 15 - Mecanismo proposto para a reao entre o radical HER e os compostos

Esquema 16 - Mecanismo da reao de derivatizao do ThiolGlo-1 e sulfito e tiol

Esquema 17 - Mecanismo de reao proposto para a reao entre o metil linoleato e o

Esquema 18 - Ilustrao da reao de formao do radical fenoxila a partir da irradiao

Lista de Abreviaturas e Siglas

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Figura 9 - Grfico (F/F-1)k2[4-POBN] versus concentrao de isoxantohumol.

Figura 28 - Grfico (F/F-1)k2[4-POBN] versus concentrao de cistena (A) e