Universidade de Lisboa

Faculdade de Cincias
Departamento de Biologia Animal

Efeito da poliploidia no desenvolvimento inicial e

epigentica no complexo pisccola Squalius
alburnoides
Joana Filipa de Oliveira Mateus

Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento

2011

Universidade de Lisboa
Faculdade de Cincias
Departamento de Biologia Animal

Efeito da poliploidia no desenvolvimento inicial e

epigentica no complexo pisccola Squalius
alburnoides
Joana Filipa de Oliveira Mateus

Dissertao orientada por:

Doutora ngela Incio
Doutor Gabriel Martins

Mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento

2011

ndice
NDICE

AGRADECIMENTOS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUO

1.1 - POLIPLOIDIA
1.1.1 - CAUSAS DA POLIPLOIDIA
1.1.2 - TOLERNCIA POLIPLOIDIA NA NATUREZA
1.2 - COMPLEXO SQUALIUS ALBURNOIDES
1.3 - DESENVOLVIMENTO INICIAL
1.4 - EPIGENTICA
1.4.1 - MODIFICAO DE HISTONAS
1.4.2 - PROTENA DA HETEROCROMATINA 1 (HP1)

9
9
10
10
12
13
14
14

2. MATERIAIS E MTODOS

15

2.1 - DESENVOLVIMENTO INICIAL EM SQUALIUS ALBURNOIDES

2.1.1 - AMOSTRAGEM, IDENTIFICAO, MANUTENO, ESTIMULAO HORMONAL DE SQUALIUS

15

15
16
17
18
18
19
Seces de barbatana e fgado
19
Cultura de fibroblastos
20
Sangue
20
Embries
20
2.3 ANLISE DE IMAGENS
21
2.3.1 DETERMINAO DA QUEBRA DE SINCRONIA MITTICA (TRANSIO MATERNO-ZIGTICA - MBT) 21
2.3.2 DETERMINAO DOS RCIOS NCLEO-CITOPLASMA (NCR)
23
2.3.3 ANLISE DOS PADRES DE HETEROCROMATINIZAO
24
2.3.4 ANLISE ESTATSTICA
25
ALBURNOIDES ADULTOS E DETERMINAO DA CONSTITUIO GENMICA
2.1.2 - CRUZAMENTOS E OBTENO DE EMBRIES
2.1.3 - OBSERVAO DO DESENVOLVIMENTO INICIAL
2.2 - ESTUDO DO SILENCIAMENTO GNICO ATRAVS DE HISTONAS MODIFICADAS
2.2.1 - OBTENO DE AMOSTRAS
2.2.2 - IMUNOHISTOQUMICA PARA DETECO DE SILENCIAMENTO GENTICO

3. RESULTADOS

26

3.1 DESCRIO DO DESENVOLVIMENTO INICIAL EM S. ALBURNOIDES

26
3.1.1 DESCRIO DOS ESTDIOS E COMPARAO COM ESTDIOS MODELO DE DANIO RERIO
26
3.1.2 DETERMINAO DA MBT
28
3.1.3 DETERMINAO DE RCIOS NCLEO-CITOPLASMA (NCR)
33
3.2 MODIFICAO DE HISTONAS - ANLISE DA INTENSIDADE E HETEROGENEIDADE DAS MARCAES
36
3.2.1 CULTURA DE FIBROBLASTOS
36
3.2.2 CREBRO
38
3.2.3 SANGUE
39
3.2.4 EMBRIES PR E PS-MBT
40
4. DISCUSSO

42

5. BIBLIOGRAFIA

45

Agradecimentos
Em primeiro lugar quero agradecer aos meus orientadores ngela Incio e
Gabriel Martins (Psre) pela pacincia e apoio em todos os momentos durante a
realizao deste projecto, principalmente nos de maior aflio e stress.
Um dos meus maiores agradecimentos vai para a Isa Matos, a minha coorientadora sem ela este trabalho tinha sido quase impossvel. Obrigado por toda a
motivao e ajuda que me deste ao longo deste ano.
Agradeo aos meus dois grupos Biologia do Desenvolvimento e Gentica
Evolutiva: Ana Catarina, Ana Rita, Andr, Isa, Joana, Lus, Maria Ana, Marianne,
Miguel Machado, Mnica, Patrcia, Raquel Vaz, Raquel Jacinto, Rifes e Tiago por
toda a ajuda prestada e opinies dadas durante os Labmeeting que me ajudaram
bastante.
Ao grupo de citogentica: Carla, Catarina, Josefina, Max e Miguel Santos por
estarem sempre disponveis. Obrigado Max pelo o ensinamento de culturas e cedncia
de clulas. Miguel obrigado pelas ajudas no citmetro e pacincia quando perguntava
as diferenas entre formas.
Patrcia (a minha amiga PA), Raqueis e Catarina por me terem ajudado
nos maus momentos e em tudo o que precisei (a nvel laboratorial e pessoal).
Obrigado Joana Pinho pelas conversas e discusses que tivemos ao longo
destes 2 anos de mestrado, mal ns sabamos que aps a mtica primeira aula de DE
amos ficar to prximas (vs conseguimos!).
Maria Fernandes por todo o apoio (desde da Holanda) e ajuda em obter os
to desejados papers.
s Professoras Gabriela Rodrigues, Slveig Thorsteinsdttir, Manuela Coelho
e Maria Joo Collares-Pereira por estarem sempre disponveis para qualquer dvida e
ajuda.
Professora Manuela Silva do Instituto Superior de Agronomia, pela ajuda e
cedncia de anticorpos para teste.
Um grande agradecimento Professora Lia Ascenso, pela disponibilidade e oferta do
reagente de Schiff.
D. Branca, por ter sempre mais um cantinho para o meu material ir a
autoclavar em cima da hora. E pelas inmeras conversas que tivemos e que me
souberam sempre to bem.
Telma Laurentino por me ter ajudado nas lavagens dos aqurios e dar
comida dos peixinhos enquanto eu no podia. Ao Joo por me ter cedido informaes
teis para este trabalho.
Ana Margarida Rodrigues por me ensinar o mtodo de Feulgen e a ter
cuidado com o reagente de Schiff.
Obrigado a todos os que frequentaram a sala da microscopia e que sofreram
com o frio devido manuteno dos meus bebs.

s minhas amigas Andreia, Isabel, Mariline e Sofia (as minhas amoras!) por
entenderem as minhas inmeras ausncias nos to desejados encontros s as 5.
Mariline obrigado por me teres feito companhia nas longas horas de recolhas
de embries para no estar sozinha (viva ao skype!).
Sofia obrigado por acreditares sempre em mim, por toda a fora, ajuda e
motivao que sempre me deste nestes ltimos 6 anos.
Quero tambm agradecer a um dos melhores professores que tive na vida, que
para alm de um excelente professor, um grande amigo. Obrigado Professor/amigo
Joo Ramalho Santos por todo o apoio e ajuda sempre que precisei.
E no me posso esquecer da Dr. Ana Barbosa, por tudo o que me ensinou e
por nunca se ter esquecido de mim, sem dvida um orgulho em a ter conhecido.
Aos meus Pais por tudo o que fizeram para me ver feliz e me terem apoiado
sempre em todas as minhas decises (e me ouvirem sempre que precisava de
reclamar!), e claro por terem pago todos estes anos de estudos.
minha mana (que sempre acreditou em mim!) e cunhado pelo apoio que
sempre me foi dado.
minha sobrinha Carlota por ter sempre aquele sorriso gigante quando me v
e por ver em mim um dolo.
Aos meus avs, a quem muitas vezes me esquecia de ligar para mandar um
beijinho e dizer que os adoro.
Obrigado aos meus tios e primos (no vou colocar os nomes, so imensos e vocs
sabem quem so!).
Ao Pedro por me mostrares sempre uma melhor maneira de ver as coisas que
no so sempre to ms como parecem e por estares ao meu lado em todos os
momentos.
Teresa e Miguel por terem aceite a ideia de viver na sua casa em Lisboa e
estarem sempre disponveis para ajudar, e por me receberem sempre to bem.
Aos meus cunhados Paulo e Cludia pelas boas visitas e momentos bons e
diferentes que proporcionaram. Ao Mateus, meu sobrinho mais novo. E claro
obrigado ao Joo Francisco, o meu irmo.
No posso deixar de agradecer a mim mesma, pois todo o trabalho existe por algum
motivo. Sem mim que era totalmente impossvel.
A todos um grande obrigado!

Resumo
A poliploidia um processo proeminente em plantas e embora menos
frequente, tem sido importante na histria evolutiva de alguns vertebrados. Ao
contrrio do que acontece nas plantas o conhecimento das razes que possibilitam o
sucesso evolutivo da poliploidia em vertebrados permanece pouco explorado.
A poliploidia pode ter consequncias em diversos processos celulares, como
por exemplo no desenvolvimento inicial e na regulao da expresso gnica. Um dos
grupos de vertebrados onde a poliploidia mais tolerada em peixes, sendo um
exemplo o complexo Squalius alburnoides. Este um excelente organismo modelo
para estudar o efeito da poliploidia no desenvolvimento e epigentica em vertebrados,
pois alm de ser um exemplo de sucesso evolutivo tambm um complexo que
apresenta diferentes ploidias (2n, 3n e 4n).
Alguns estudos (Newport&Kirschner, 1982; Edgar, 1986) sugerem que
organismos com diferentes quantidades de material gentico apresentam diferenas no
desenvolvimento podendo mesmo afectar estdios importantes durante o
desenvolvimento inicial, tal como divergncias temporais na ocorrncia da transio
materno-zigtica (MBT) e o aparecimento dos diversos rgos. Esses mesmos estudos
sublinham que o mecanismo que poder controlar essa transio seja baseado no rcio
ncleo-citoplasma (NCR), mas tal no foi formalmente demonstrado.
Como os organismos poliplides contm mais DNA, e assumindo que o
tamanho do citoplasma igual entre ploidias (quer no zigoto, blastmeros ou clulas
adultas), o primeiro objectivo deste trabalho foi testar se os embries poliplides
exibem uma MBT mais precoce.
Devido ao facto de existirem poucos vertebrados poliploides na natureza,
neste trabalho tentmos tambm compreender o sucesso evolutivo do Squalius
alburnoides e abundncia das formas triploides. Um estudo anteriormente realizado
neste complexo, concluiu a existncia de um mecanismo de compensao de dosagem
o qual reduz a quantidade de transcritos nas formas triploides para o observado em
formas diploides. Levando a outro objectivo neste trabalho o de compreender que tipo
de mecanismo de silenciamento gnico lhe poder estar associado. Para isso, estudouse o padro heterocromtico no ncleo de diferentes ploidias atravs da marcao do
DNA nuclear (DAPI/ToPro3) e de dois marcadores tpicos de represso gnica, a
protena da heterocromatina 1 (Hp1) e a histona modificada qual se associa, a H3K9
tri-metilada. Este trabalho pretendeu esclarecer alguns aspectos da epigentica deste
complexo, como por exemplo perceber se a heterocromatinizao e/ou modificao
de histonas est envolvida no silenciamento gnico em triploides em vrios tecido
analisados e em que fase do desenvolvimento inicial surge.
As diferenas encontradas apontam para diferentes nveis de
heterocromatinizao nos triploides, o que presumivelmente est associado a
silenciamento gentico. Foi interessante verificar tambm que estas diferenas so
visveis em blastmeros apenas depois da MBT.
Nos triploides as citocineses mostraram um atraso quando comparadas com as
os diploides hbridos e a MBT foi atingida precocemente, facto observado pela quebra
de sincronia das citocineses e cariocineses precoce em triploides. No entanto os
nossos dados preliminares no nos permitem estabelecer uma relao entre a
ocorrncia precoce da MBT e o NCR dos blastmeros.
Palavras-chave: Squalius alburnoides, poliploidia, rcio ncleo-citoplasmtico,
transio-mdia-da-blstula, heterocromatina

Abstract
Polyploidy occurs prominently in plants and though less frequent, it has been
important in the evolutionary history of some vertebrates. The reasons that allow the
evolutionary success of some polyploid vertebrates remain poorly understood.
However, polyploidy can be surprisingly stable given the apparent polyploid ancestry
of many eukaryotic genomes. The diploid-polyploid complex Squalius alburnoides is
an excellent non-model organism to study polyploidy and its effects in cellular
processes.
Previous studies suggest the existence of a nucleo-cytoplasmic ratio(NCR)
effect controlling timing of early cleavages and mid-blastula transition in other
organisms. We explored the S. alburnoides complex, to test this. The results clearly
show that triploid embryos reach mid-blastula transition earlier than diploid embryos,
though a clear relationship between estimated NCRs and times of MBT could not
be established. In fact, though triploids have an estimated 50% increase in DNA
content/cell, the average zygote volume and blastomere size at MBT are nearly twice
those of diploids. We also found no significant differences in NCRs from adult
tissues, and in the case of blood evidence or a larger cytoplasm, but less than the
expected 50% increase. Analysis of heterochromatinisation patterns did reveal
significant differences between triploids and diploids, in adult tissues. Interestingly,
we did find evidence that HP1 may appear only after MBT.
This work allowed us to analyze the complex phenomena of early development
and epigenetics in this interesting species complex and provided further evidence that
alterations of DNA contents can affect the pace of early development. However
further analysis to support some of the preliminary observations are necessary.
Keywords: Squalius alburnoides, polyploid, ncleo-cytoplasmatic ratio, mid-blastula
transition, heterochromatin

1. Introduo
1.1 - Poliploidia
A poliploidia resulta de uma alterao gentica na qual ocorre um aumento do
nmero de cromossomas para um mltiplo de n, mas diferente de 2n (Moisieniak et
al., 2010).
Os organismos eucariotas so geralmente diploides (2n) (Storchova&Pellman,
2004), no entanto a poliploidia comum em plantas, com uma frequncia estimada
entre 30 e 80% (Masterson, 1994) e ocorre esporadicamente em vertebrados
sobretudo nos inferiores, como rpteis, anfbios e peixes (Lewis, 1980).
Os organismos poliploides podem ser classificados em duas categorias:
autopoliplides ou alopoliplides. No caso dos autopoliplides h multiplicao do
mesmo genoma, enquanto que os alopoliplides so hbridos.
Contudo um processo que pode ser surpreendentemente estvel, havendo
evidncias de que muitos genomas eucariotas tm poliploidia ancestral (Comai,
2005).
1.1.1 - Causas da poliploidia
Uma causa possvel para a poliploidia a poliespermia, aqui o ocito
fertilizado por mais do que um espermatozoide, podendo ocorrer tanto em plantas
como em animais, sendo uma das vias que mais leva a ocorrncia de triploides
humanos (Uchida et al., 1985). A ausncia de citocinese provoca tambm uma
duplicao do genoma, podendo ocorrer durante as primeiras divises do zigoto ou
mais tarde em tecidos adultos, resultando em mosaicos.
A ausncia de reduo meitica uma das causas mais frequentes da
poliploidia. Neste caso, os gmetas no reduzidos ficam com o dobro do genoma
esperado e quando fertilizados por um gmeta reduzido ocorre a formao de um
zigoto com maior ploidia. Se ocorrer a fertilizao por outro gmeta tambm no
reduzido o nvel de ploidia do zigoto ainda maior. Nos casos de alopoliploidia os
hbridos produzem uma taxa elevada de gmetas no reduzidos (Ramsey&Schemske,
2002). Aqui, a hibridao apresenta um papel importante na evoluo das plantas e
animais (Mallet, 2007), particularmente em peixes. Neste grupo a hibridao um
processo generalizado, existindo vrios factores que explicam esta incidncia tais
como, fertilizao externa, mecanismos de isolamento comportamental fracos,
abundncia desigual das duas espcies parentais, competio pelo habitat de desova,
diminuio de complexidade do habitat e susceptibilidade a contacto entre as
diferentes espcies (Chvez & Turgeon 2007, Scribner et al. 2001).

1.1.2 - Tolerncia poliploidia na natureza

A maioria dos vertebrados superiores no toleram a poliploidia como se
verifica, por exemplo, nos humanos em que cerca de 10% de abortos espontneos lhes
esto associados (Eiben et al., 1990) e os fetos apresentam mltiplas mal formaes
(Sonnesen et al., 2009). No entanto, a elevada incidncia de poliploides em alguns
taxa (plantas, peixes e anfbios) dever ser justificada por alguma vantagem evolutiva
como por exemplo a importante fonte de variabilidade gentica e de adaptao.
Contudo, apesar das vantagens so necessrios mecanismos de tolerncia
estando j descritos vrios em plantas com efeitos na dosagem gentica como por
exemplos rearranjos cromossmicos e remodelaes nos padres epigenticos
(Chen&Ni 2006; Chen, 2007).
Curiosamente, estudos recentes indicam que muitas das espcies que so
actualmente diploides, incluindo humanos, derivaram de ancestrais poliploides (Van
de Peer & Meyer, 2005).
1.2 - Complexo Squalius alburnoides
O complexo pisccola Squalius alburnoides (Steindachner, 1866) foi
inicialmente descrito por Collares-Pereira (1983, 1984), com base nas caractersticas
morfolgicas e citogenticas. A sua origem deve-se hibridao entre uma fmea
Squalius pyrenaicus (Genoma P) (Alves et al., 1997) e um macho ancestral
relacionado com Anaecypris hispanica (Genoma A) (Gromicho et al., 2006).
O complexo Squalius alburnoides endmico da Pennsula Ibrica, existindo
em Portugal em simpatria com trs espcies bissexuais do gnero Squalius: o
ancestral materno Squalius pyrenaicus (Gnther, 1868) nas bacias do sul (Tejo, Sado,
Guadiana e Quarteira), Squalius carolitertii (Doadrio, 1988) nos rios do norte (Douro
e Mondego) e Squalius aradensis (Coelho, Bogutskaya, Rodrigues & CollaresPereira, 1998) numa bacia do sul independente (Quarteira).
Este complexo constitudo por diferentes ploidias (Sousa-Santos et al.,
2006), incluindo formas diploides (2n=50), triploides (3n=75) e tetraploides (4n=100)
sendo a forma triplide a mais comum (Cunha et al., 2008). Para cada ploidia
podemos ter variadas constituies genmicas com diferentes propores dos
genomas parentais (Collares-Pereira & Coelho, 2010). Relativamente s populaes
do sul o complexo S. alburnoides em simpatria com S. pyrenaicus, apresenta
constituies genmicas com formas diploides PA, triploides PAA (e PPA raras) e
formas tetraploides PPAA (podendo ocorrer tambm tetraploides de genomas no
equilibrados (PAAA e PPPA) (Sousa-Santos et al. 2007). O complexo possui tambm
uma forma diploide no hbrida com DNA mitocndrial (DNAmt) de S. pyrenaicus
mas de genoma nuclear prximo de Anaecypris (genoma AA). Estes indivduos so
geralmente todos machos existindo excepes reportadas apenas para duas fmeas
(Carmona 1997, Sousa-Santos et al. 2006b). A presena do DNAmt de S. pyrenaicus
nesta forma diploide AA indica que esta forma nuclear no hbrida foi formada
atravs de hbridos, descartando assim a hiptese de serem verdadeiros descendentes
do ancestral extinto (Alves et al. 2002). Ainda no Sul, na bacia de Quarteira, ocorrem

10

cruzamentos interespecficos entre S. alburnoides e S. aradensis (QQ) levando ao

aparecimento do genoma Q no complexo. Nas bacias do Norte S. carolitertii (CC)
participa tambm activamente na dinmica reprodutiva do S. alburnoides. Como
resultado destas interaces surgem as mesmas composies genmicas referidas para
a interaco com S. pyrenaicus, mas em que genoma P substitudo pelo genoma Q
ou C (com excepo das formas AA que no existem no Norte).
O complexo hbrido Squalius alburnoides apresenta variados modos de
reproduo sexuada e assexuada sendo diferentes para cada forma, produzindo
gmetas com genomas e mecanismo hereditrios distintos (Alves et al., 1998, 1999,
2001, 2004; Gromicho & Collares-Pereira, 2004; Pala & Coelho, 2005; Crespo-Lpez
et al., 2006; Sousa-Santos et al., 2007b).
Os modos de reproduo exibidos pelas fmeas diploides e triploides incluem a
produo de ovos no reduzidos, podendo existir a ocorrncia de ginognese nas
fmeas diploides, no entanto essa ocorrncia baixa (<3%) (Crespo-Lpez et
al.,2006). Quanto hibridognese meitica, as fmeas triploides PAA excluem o
genoma heteroespecfico e fazem uma meiose normal com os genomas
homoespecficos (mais frequente) ou ento aps a excluso no reduzem (menos
frequente) levando formao de gmetas A ou AA, respectivamente. De notar que
entre machos, os diploides PA produzem esperma no reduzido, enquanto que as
outras ploidias reduzem (Alves et al. 1998, 1999) (Figura 1).

Figura 1. Representao da composio genmica e gmetas formados para fmeas (esquerda) e

machos (direita) das formas mais comuns de S. alburnoides de genoma P. De notar, que o macho de
genoma PP pertence espcie S. pyrenaicus e os machos triploides como so raros no se encontram
representados no esquema.

Sendo que o conhecimento dos processos gamticos e modos de reproduo para

fmeas e machos so importantes para se saber a proporo dos genomas P e A
na progenia possvel antever a constituio genmica da descendncia com alguma
confiana (Tabela I).

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Tabela I. Representao dos vrios cruzamentos e respectivas descendncias. A

cinzento esto representadas as formas mais provveis tendo em conta a frequncia de
gmetas formados para cada composio genmica.
Fmeas
PA
Ovos
Esperma
Machos

PP

PAA

PPA

PPAA

PA

AA

PP

PA

PPA

PA

PAA

PP

PPP

PPA

AA

PAA

AA

AAA

PA

PPA

PAA

PA

PA

PPAA

PAA

PAAA

PPA

PPPA

PPAA

PPAA

PA

PPAA

PAA

PAAA

PPA

PPPA

PPAA

1.3 - Desenvolvimento inicial

O desenvolvimento inicial comea na maioria do animais da mesma forma:
caracterizado por uma rpida e sncrona sequncia de divises celulares (Kraeussling
et al.,2011; Kane&Kimmel,1993; Newport&Kirschener, 1982;). O ciclo celular dos
primeiros blastmeros constitudo apenas pelas fases S (Sntese) e M (Mitose),
havendo um bypass das fases G (crescimento). Eventualmente estas divises tornamse assncronas e lentas, e o ciclo celular torna-se mais semelhante ao de clulas
adultas, incluindo fases G (crescimento) durante as quais j ocorre transcrio do
genoma zigtico. A esta transio d-se o nome genrico de transio mdia da
blstula (mid-blastula transition MBT), frequentemente tambm conhecida como
transio materno-zigtica, por coincidir com o inicio da expresso de genes
zigticos. Mas como que os blastmeros resultantes das primeiras divises rpidas e
sincronizadas determinam o momento desta
transio?
Newport e Kirschner (1982), realizaram
uma experincia para tentar perceber que factores
determinam esta transio. Para isso analisaram
vrios fenmenos associados a esta alterao, tais
como o estudo da assincronia celular, activao da
transcrio e mobilidade celular. Usaram
embries de Xenopus e fizeram uma constrio no
citoplasma de modo a provocar a formao de
gmeos siameses (Figura 2), sendo que um dos
gmeos herdava mais ncleos que o outro.
Repararam que no gmeo que herdava mais Figura 2. Esquema da formao de
ncleos essa transio era mais rpida, gmeos siameses para manipulao do
NCR (Newport and Kirschner, 1982)
demonstrando que o tempo da MBT no seria
dependente de um mecanismo de contagem de
divises celulares ou do tempo aps a fertilizao. Sugerindo que, de alguma forma,
os blastmeros so capazes de avaliar a quantidade de DNA por citoplasma usando

12

essa medida para determinar a MBT, um conceito conhecido genericamente por

rcio ncleo-citoplasma (NCR)
Outra experincia que sugere esta relao entre NCR e MBT foi realizada por Edgar
(1986), o qual utilizou embries de Drosophila diplides e haplides resultantes do
cruzamento de adultos mutantes, e verificou que a MBT ocorria em tempos diferentes.
A observao de ambos os embries demonstrou que os embries haplides faziam a
MBT aps mais um ciclo de cariocinese, indicando assim que algum factor estaria a
influenciar esse acontecimento. Ambas as experincias sugerem que o mecanismo que
controla a MBT possa ser baseado no NCR. No entanto, o funcionamento deste
mecanismo ainda no foi formalmente demonstrado, no sentido em que a ocorrncia
da MBT mais precoce em indivduos com mais quantidade de genoma se deva
realmente a uma mudana no rcio ncleo-citoplasma. Tambm no existem
evidncias sobre o mecanismo molecular envolvido.
Uma vez que os organismos poliplides contm mais DNA, e assumindo que
o tamanho do citoplasma no muda entre ploidias (quer no zigoto, blastmeros e
clulas adultas), embries poliplides de S. alburnoides devero apresentar um NCR
mais elevado e por inferncia, devero apresentar uma MBT mais precoce.
1.4 - Epigentica
Em organismos poliplides a existncia de mais do que dois alelos para cada
gene potencia uma alterao nos padres de expresso com possveis consequncias
deletrias quer no desenvolvimento quer na homeostase. Contudo, existem evidncias
de que as clulas poliplides usam mecanismos epigenticos para regular a sua
dosagem, nomeadamente por silenciamento gnico. Um estudo, demonstrou que nas
formas triplides de S. alburnoides existe silenciamento gnico (Pala et al., 2008),
embora ainda no tenha sido possvel determinar qual o mecanismo envolvido.
Os mecanismos mais frequentes associados ao silenciamento gnico ocorrem
por mecanismos de regulao pr-transcricionais e/ou ps-transcricionais. No caso da
regulao ps-transcricional os transcritos so degradados ou impedidos de serem
traduzidos via outros RNAs no codificantes (Halbeisen et al., 2007). Para os
mecanismos pr-transcricionais destacam-se a metilao de DNA e/ou remodelao
da cromatina nomeadamente atravs de histonas modificadas (Corry et al., 2009). A
metilao de DNA envolve a adio de um grupo metil, geralmente ao anel de
pirimidina de citosina resultando na represso da expresso gnica. A modificao de
histonas pode ocorre por acetilao, metilao e fosforilao, podendo levar
activao ou silenciamento gnico dependendo do tipo de modificao. Estas
modificaes podem ser herdadas ou removidas sem mudar a sequncia original do
DNA e so por isso um fenmeno de regulao epigentica (Berger et al., 2009).

13

1.4.1 - Modificao de Histonas

A cromatina composta por DNA e protenas, maioritariamente histonas.
Existem diferentes tipos de histonas H2A, H2B, H3 e H4 que formam o nucleossoma e
a H1 que une os nucleossomas e estabiliza o seu enrolamento com o DNA. O DNA
compactado de forma a ocupar menos espao, mas tambm a permitir a represso da
expresso gnica. Existindo dois tipos de cromatina, a eucromatina e heterocromatina.
Tradicionalmente na eucromatina o DNA est transcripcionalmente activo e na
heterocromatina est inactivo.
Uma das formas de inactivao por
heterocromatinizao envolve modificaes pstranducionais das histonas. As histonas contm
um domnio NH2 terminal que sofre
modificaes
ps-traducionais.
Estas
modificaes ocorrem maioritariamente nas
Figura 3. Representao da
histonas H3 e H4. A histona H3 metilada pode ligao da protena HP1 histona
activar (H3K4) ou reprimir a transcrio (H3K9). H3K9
De facto, a histona H3K9 metilada est
frequentemente associada ao silenciamento gnico (He and Lehming, 2003),
tornando-se crucial para o estudo dos padres de heterocromatinizao.
A protena da heterocromatina 1 (do ingls: heterochromatin Protein 1-HP1),
geralmente um marcador de heterocromatina (Festensteins et al., 1999) e associa-se
H3K9 tri-metilada (Figura 3) .
1.4.2 - Protena da heterocromatina 1 (HP1)
A Hp1 no uma histona mas foi descrita inicialmente em Drosphila
associada a heterocromatina e silenciamento gnico (Eissenberg et al., 1990) sendo
um dos maiores componentes existentes da heterocromatina e contribuindo na
represso transcricional de genes eucromticos .
Diversos outros estudos reforaram este seu papel em muitos organismos,
incluindo fungos e animais. Estudos moleculares demonstraram que a Hp1
filogeneticamente conservada estando presente em muito eucariotas (Wang et al.,
2000). A sua capacidade de se ligar a lisina 9 di- ou tri- metilada da histona H3
refora o conceito da sua aptido como marcador epigentico associado represso da
expresso gnica (Bannister et al., 2001).
Um estudo em Danio rerio comprovou a eficcia da protena HP1
associao represso da expresso gnica (Anelli et al., 2009), confirmando assim a
eficcia da mesma para o estudo em causa.

14

2. Materiais e Mtodos
2.1 - Desenvolvimento inicial em Squalius alburnoides
2.1.1 - Amostragem, identificao, manuteno, estimulao hormonal de
Squalius alburnoides adultos e determinao da constituio genmica
A amostragem para todas as formas de Squalius alburnoides foi efectuada em
diversas bacias do sul (Tejo e Guadiana), enquanto que a amostragem de Squalius
pyrenaicus foi efectuada numa bacia isolada (Cheleiros, Sintra) e tambm numa bacia
do sul (Almargem). Para a sua captura foi utilizada a pesca elctrica, que consiste no
uso de corrente elctrica para atordoar os peixes e assim facilitar a sua captura,
poucos minutos aps a descarga os peixes voltam ao seu comportamento normal.
Os peixes foram mantidos em aqurios de vidro de 60 l expostos a um ciclo de
14 horas de luz e 10 horas de escurido, a uma temperatura constante de 20C. A
alimentao foi base de flocos e foi enriquecida com Artemia salina e Daphnia
congeladas, cerca de 4 vezes ao dia.
Foi realizada estimulao hormonal atravs de injeco de um anlogo da
hormona gonodotropina (Ovaprim, Western Chemical), para promover a maturao e
desova, que depois se fez por instigao da ovulao e espermiao em peixes
maduros. A injeco foi administrada na cavidade abdominal a uma concentrao de
0,5 l por grama, de acordo com instrues do fabricante e ao longo de quatro
semanas, antes e depois da poca de cruzamento (Dezembro-Janeiro e Julho) com o
objectivo de antecipar e prolongar a mesma.
A ploidia dos peixes capturados foi determinada por citometria de fluxo atravs
do protocolo Prspero & Collares-Pereira (2000), executada com recurso a barbatanas
ou sangue dos indivduos em questo.
A determinao da constituio genmica dos peixes capturados foi realizada
atravs de um PCR quantitativo conforme descrito em Incio et al., 2010. Neste caso,
o DNA genmico utilizado foi obtido a partir de cortes de barbatana utilizando o
mtodo de extraco com recurso a solventes orgnicos descritos por Miller et al.,
1998. Nos casos em que no foi possvel a extraco logo aps o corte, as barbatanas
foram armazenadas em etanol 100%.
Durante o corte da barbatana os peixes foram fotografados, de forma a
possibilitar o seu posterior reconhecimento atravs do padro de escamas especfico
para cada individuo (Morgado-Santos et al., 2010).

15

2.1.2 - Cruzamentos e obteno de embries

Com recurso foto-identificao foi possvel escolher as fmeas e machos
cujas constituio genmicas eram j conhecidas e assim antever o genoma e ploidia
da descendncia. Antes da fertilizao humedeceu-se uma caixa de petri com algumas
gotas de gua, seguidamente seleccionaram-se as fmeas e foi executada uma presso
abdominal no sentido da barbatana caudal, com o propsito de obter os ocitos. O
mesmo mtodo foi aplicado aos machos para adquirir esperma, mas neste caso o
esperma foi colocado por cima dos ocitos, previamente recolhidos para uma caixa de
Petri.
No decorrer do trabalho verificmos que para obter sucesso nas fertilizaes o
tempo entre a mistura do esperma e ovos no podia ultrapassar um minuto aps a
recolha dos ovos. Nos cruzamentos em que esse tempo foi ultrapassado, verificmos
mais tarde que apesar dos ovos terem um aspecto normal e mostrarem sinais de
activao, no completaram as clivagens iniciais. Estes ocitos no fertilizados
foram tambm filmados e as observaes so descritas mais abaixo.
Os embries includos neste estudo foram: AA, PA, PAA e PAAA, obtidos a
partir dos cruzamentos descritos na Tabela II. Os embries foram mantidos para
observao por time-lapse e para recolhas em intervalos de tempo regulares, conforme
descrito em baixo.
Tabela II. Cruzamentos realizados ao longo deste trabalho e xito dos mesmos. Este
sucesso/insucesso (xito) apenas representativo para os cruzamentos que foram
usados na realizao do trabalho.
Cruzamento

Ploidia

Descendncia

xito

QAA* (fmea) x PP (macho)

2n

PA

PP (fmea) x AA (macho)

2n

PA

PAA (fmea) x PP (macho)

2n

PA

PA (fmea) x AA (macho)

3n

PAA

PAA (fmea) x PA (macho)

3n

PAA

QAA (fmea) x PA (macho)

3n

PAA

QAA (fmea) x PAA (macho)

4n

PAAA

PAA (fmea) x AA (macho)

2n

AA

PP (fmea) x PP (macho)

2n

PP

Embora no previsto inicialmente, no decorrer do estudo usmos tambm uma

fmea triploide (QAA) frtil, que apesar de conter um genoma diferente dos propostos
inicialmente (P e A), foi tambm utlizada devido a produzir, gmetas de genoma A e
descendncia pretendida para este estudo (PA ou PAA) quando cruzada com machos
diplides.

16

2.1.3 - Observao do desenvolvimento inicial

Para observao de embries vivos, alguns foram recolhidos e montados numa
caixa de Petri com agarose (2% - Low melting agarose) na qual foi criada uma
concavidade para imobilizar os embries durante a observao. A caixa de Petri foi
montada numa lupa Zeiss STEREO-Lumar na qual estava acoplada uma Axiocam e
ambas controladas pelo software Axiovision v4.7, numa sala aclimatizada e mantida a
20C durante o tempo de observao. Foram obtidas imagens em campo claro com
luz transmitida, em intervalos de 1 minuto durante as primeiras 6-7h de
desenvolvimento; aps este tempo e at s 24 horas foram adquiridas imagens apenas
de alguns estdios representativos do desenvolvimento at ecloso.
Os restantes embries foram mantidos numa caixa de Petri sem tampa numa
incubadora a 20C. Todos os embries tinham gua (gua engarrafada do
engarrafada do Caramulo) de pH~6,3 e esta gua era mudada duas horas aps a
fertilizao e seguidamente reposta todos os dias at ecloso. Aps a ecloso foram
retirados todos os crions da gua para a manter limpa e ao fim de duas semanas os
embries passaram para um aqurio de 10L onde foram alimentados com comida
especializada para alevins.
Destes embries e com o propsito de posteriormente verificar estdios
relevantes do desenvolvimento inicial foram efectuadas recolhas, de acordo com a
tabela III. Os embries recolhidos foram fixados em PFA 4% a 4C, tendo sido
posteriormente desidratados numa srie crescente de metanol (25%,50%,75% e
100%) durante 10 minutos em cada fase. Depois foram preservados a -20C.
Para anlise, os embries recolhidos foram re-hidratados numa srie
decrescente de metanol (100%, 75%, 50% e 25%) durante 10 minutos cada passagem
seguidas de lavagens em PBT (2x10min). Aps isto realizou-se o mtodo de Feulgen
para marcao de cidos nucleicos que possibilitou a identificao em detalhe das
diferentes fases do ciclo celular nas clulas do embrio com recurso microscopia
confocal. Os outros mtodos para marcao do DNA foram tambm experimentados,
como a marcao com ToPro3 (Molecular Probes) e Draq5 (BioStatus), no entanto o
mtodo de Feulgen produziu uma marcao mais reprodutvel e facilmente detectvel,
apesar de termos verificado uma considervel marcao citoplasmtica inespecfica
que por vezes dificultou a identificao das figuras mitticas.
O mtodo de Feulgen inicou-se com lavagens em gua destilada (2x5min),
lavagem em cido clordrico (HCl) (20Cx3min) seguidas de colocao numa placa
quente a 60C durante 8 minutos (com agitao). Depois, foram efectuadas novas
lavagens em gua destilada (3x5min) e s depois a colocao de reagente de Schiff
(2:12, Merck) durante 90 minutos.
Por fim executou-se uma nova lavagem em gua destilada e uma rpida
desidratao (10 minutos metanol 100%) colocando seguidamente metilsalicilato
(Sigma) para melhor observao das amostras por microscopia confocal (Martins, et
al. 1998).

17

Com recurso ao microscpio confocal Leica SPE adquiriam-se as imagens dos

diferentes estdios e ploidias.
As imagens foram analisadas e as reconstrues 3D produzidas com recurso
aos softwares ImageJ v1.4x e Amira v5.3.3, como descrito mais abaixo. Estas imagens
foram usadas para determinar o sincronismo dos ciclos celulares dos blastmeros prMBT e ps-MBT.
2.2 - Estudo do silenciamento gnico atravs de histonas modificadas
2.2.1 - Obteno de amostras
O silenciamento gnico foi estudado em culturas de fibroblastos, em tecidos
de peixes adultos tais como, fgado, crebro, barbatana e sangue e em embries antes
e depois da MBT.
Para a obteno de fgado e crebro foram sacrificados dois peixes diploides
(PP e PA) e um triploide (PAA), todos provenientes da bacia do Almargem. Para os
estudos de imunohistoqumica foi necessrio fixar os tecidos em PFA 4 % durante a
noite.
A recolha de sangue foi feita com recurso uma seringa (Terum Myjector U100 insulin) impregnada em heparina (Sigma-Aldrich H3149-50Ku) em trs
indivduos diploides (PAA, AA, PP) e um triploide (PAA). As amostras foram fixadas
em suspenso com PFA 1% cerca de 15 minutos sendo depois realizada a
imunohistoqumica. Para determinar a rea do ncleo e citoplasma calculando assim o
rcio ncleo-citoplasma (NCR) foi realizado um esfregao com clulas de sangue
fixadas e observadas num microscpio Olympus BX-60 com uma cmara Olympus
DP50.
Durante a aquisio da barbatana o pedao cortado foi mantido em PFA 4%
durante a noite antes de ter incio o protocolo de imunohistoqumica, aproveitando-se
estas clulas para medir o seu NCR. Neste caso, foram obtidas amostras apenas de
peixes em reas da barbatana que no tivessem sido anteriormente intervencionadas
de forma a evitar alteraes de sinais nos padres epigenticos devido a um corte
recente (Stewart et al., 2009).
Para a cultura de fibroblastos utilizaram-se fragmentos de barbatanas cortados
de S. alburnoides (PAA) e de S. pyrenaicus (PP). Aps o corte as barbatanas foram
embebidas em meio de cultura (Leibovitz L-15). De seguida, em ambiente estril
seguiu-se o protocolo de Rodrigues & Collares-Pereira (1996). As culturas foram
mantidas a 27C e controladas quanto sua confluncia e quando necessrio as
clulas foram passadas para um novo frasco atravs de lavagens com PBS e adio de
Tripsina-EDTA 10x (Sigma-T4174) a 37C.
Para a anlise dos embries, foram escolhidos embries com de 5 e 9 h psfertilizao com o intuito de obter embries pr e ps-MBT, respectivamente, para
posterior anlise atravs de imunohistoqumica.

18

2.2.2 - Imunohistoqumica para deteco de silenciamento gentico

Os tecidos adultos (fgado e crebro) conservados em metanol 100%, foram
re-hidratados numa srie decrescente de metanol (100%, 75%, 50% e 25% ) e feitas
duas lavagens em PBT, 10 minutos cada. Enquanto que no caso da barbatana, esta foi
adquirida e depois fixada em PFA 4% durante a noite a 4C.
Efectuaram-se lavagens em PBS (3x5 min) antes de colocar Triton 2%, cerca
de 5 horas, para uma melhor permeabilizao dos tecidos.
Foi ento utilizado o anticorpo primrio Anti-HP1 1:100 (Clone 42s2
mouse monoclonal IgG1, Millipore), durante a noite a 4C. Numa fase inicial do
projecto usmos tambm o anticorpo primrio H3K9me3 (07-442; Upstate, Billerica,
MA) e apenas foi testado na cultura de fibroblastos, por no haver mais em stock. No
caso do fgado, o anticorpo primrio Hp1 usado foi diferente (gentilmente cedido pela
Professora Manuela Silva do Instituto Superior de Agronomia) e no funcionou
podendo dever-se ao facto de ter estado muito tempo armazenado. Aps a incubao
com os anticorpos fizeram-se lavagens em PBS 1% (3x5min) e iniciou-se a incubao
em anticorpo secundrio contra ratinho conjugado com o flurocromo Alexa 488
(Molecular Probes) diludo a 1:400, ao qual se adicionou tambm um corante nuclear
ToPro3 1:500 (Molecular Probes) e RNAse (10L/mL, Sigma -R6513) 1:50 durante a
noite a 4C.
Seces de barbatana e fgado
Inicialmente re-hidrataram-se os tecidos numa srie decrescente de metanol
(100%, 75%,50% e 25%), seguida de duas lavagens de 10 minutos em PBT. Os
tecidos foram depois preparados e conservados a -80C para mais tarde se efectuar os
cortes no criostato (marca). Os cortes no cristato foram feitos de forma a obter
seces com cerca de 14 m. No caso da barbatana este procedimento no foi
realizado com sucesso, possivelmente por os raios da barbatana serem demasiado
duros para um corte de espessura to fina; os cortes mais espessos no aderiram
eficazmente lamela e foram perdidos. Com o fgado os cortes tivemos mais sucesso
na obteno dos cortes nos quais seguimos depois para o protocolo de
imunohistoqumica. No entanto, tal como descrito previamente o anticorpo utilizado
no produziu a marcao desejada. Sendo que quando conseguimos sucesso com o
anticorpo, j no havia amostras de fgado disponveis para uma nova
imunohistoqumica,
In toto em tecidos adultos (Crebro e barbatana)
Devido ao facto dos cortes no terem decorrido como previsto, foi efectuada a
imunohistoqumica in toto. Colocou-se os tecidos em eppedorfs 1,5ml para a
realizao das lavagens em PBS e durante a incubao com o anticorpo primrio e
secundrio os tecidos foram colocadas numa cmara hmida em gota suspensa
durante a noite para o anticorpo primrio e 6 horas para o anticorpo secundrio.

19

Aps a realizao da imunohistoqumica adquiriu-se imagens no microscpio

confocal Leica SPE para medir a intensidade do sinal de HP1. Aproveitou-se as
imagens da barbatana para medir o NCR das diferentes formas (AA, PA, PAA e PP).
Cultura de fibroblastos
Aps o protocolo de cultura de fibroblastos para S. alburnoides (PAA) e S.
pyrenaicus (PP) e manuteno das mesmas, efectuaram-se duas lavagens com PBS
1%, seguidamente adicionou-se Tripsina-EDTA 10x (Sigma-T4174) para remover as
clulas aderidas ao frasco (5 minutos-37C) a aco da tripsina foi depois parada
adicionando-se 750L de meio de cultura. Aps isto adicionaram-se 10ml de novo
meio de cultura e retirou-se 1l para a superfcie de uma lamela que permaneceu
dentro de uma caixa de petri onde se criou uma cmara hmida. Aps isto fixaram-se
as clulas com PFA 4% durante 20 minutos, aplicando em seguida o protocolo de
imunohistoqumica.
Posteriormente, foram adquiridas imagens com recurso ao Olympus BX-60 e
uma cmara DP50. Iniciaram-se, entretanto, novas culturas para as restantes formas
do complexo mas sem sucesso devido a recorrentes contaminaes. Por esta razo os
resultados apresentado com culturas so apenas para PAA e PP.
Sangue
Aps a recolha, o sangue foi fixado numa soluo de PFA 1%, durante 15
minutos a 4C, seguido do protocolo de imunohistoqumica que sofreu algumas
alteraes nos tempos de incubao dos anticorpos, sendo de 30 minutos para ambos.
Seguidamente, foram adquiridas imagens com recurso ao Olympus Bx-60 para
clculo de NCR em eritrcitos e a obteno de imagens no (Cmara do Lumar?) para
medies de intensidade de sinal de Hp1 das diferentes formas.
Embries
Para esta tarefa foram utilizados embries que tinham sido recolhidos durante
o estudo do desenvolvimento inicial. Para a realizao da imunohistoqumica os
embries das 5 e 9 h ps-fertilizao foram re-hidratados numa srie decrescente de
metanol (100%,75%, 50%,25%) e descorionados com a ajuda da proteinase K
(Roche) cerca de 30 segundos para simplificar, visto que o crion dos embries de S.
alburnoides aparentam ser mais espessos comparativamente aos de Danio rerio.
Durante este processo foram perdidos muitos dos embries recolhidos. Utilizando os
embries que resistiram durante este processo o protocolo de imunohistoqumica foi
realizada in toto em gota suspensa numa cmara hmida e o tempo de incubao para
ambos os anticorpos foi de 48 horas a 4C. Posteriormente foi efectuada a aquisio
de imagens no microscpio confocal Leica SPE.

20

2.3 Anlise de imagens

2.3.1 Determinao da quebra de sincronia mittica (Transio maternozigtica - MBT)
A anlise da MBT consistiu em dois tipos de observao: primeiro recorreu-se
aos vdeos obtidos por time-lapse na lupa, e atravs do Image J reconstruiu-se um
cimograma (Figura 4) para cada embrio. Permitindo determinar com maior preciso
os tempos de durao de cada clivagem. Neste cimogramas possvel ver a expanso
do citoplasma das clulas que ocorre no momento que antecede cada citocinese
(Figura 4; Filme 1- Primeiras clivagens em material suplementar). Quando j no
era possvel identificar visualmente o momento da citocinese considerou-se que havia
quebra de sincronia. Houve casos em que devido a movimentos bruscos durante a
filmagem, como o adicionar de gua Petri, no foi possvel determinar a MBT para
esses embries mas nos tempos das primeiras clivagens e assim aumentou-se a
amostragem de observao para essas mesmas clivagens. Os tempos mdios de cada
clivagem para cada ploidia esto representados na seco dos resultados.

Figura 4. Anlise das clivagens. A) Cimograma representando a alterao da forma da

superfcie da blastoderme que ocorre durante as clivagens sncronas (A). Alguns exemplos de
imagens da sequncia temporal esto representados em B-D. No cimograma (A) Alguns
exemplos de imagens da sequncia temporal esto representados em B-D. No cimograma (A)
o eixo dos YY representa a linha traada nas imagens da sequncia temporal (visveis em BD) e o eixo dos XX representa o tempo desde do incio da filmagem. Cada pico no
cimograma (setas) representa o momento em que os blastmeros assumem uma forma mais
esfrica o que acontece sincronizadamente sempre que se inicia uma nova citocinese.
Enquanto as citocineses so sncronas toda blastoderme muda de forma ritmadamente;
quando essas pulsaes deixam de ser visveis considerou-se que ocorreu quebra de
sincronia mittica (Filme 1, material suplementar).

21

Apesar de terem sido recolhidos embries tetraplides a observao do seu

desenvolvimento mostrou anomalias significativas com frequentes perdas da adeso
entre blastmeros pelo que no se procedeu anlise dos ritmos mitticos nesta
forma. Das restantes formas, foram analisados um total de 21 embries triploides
(PAA), 6 diploides (PA) e 4 diploides (AA). Durante a aquisio das imagens em
embries triploides verificou-se um individuo no fertilizado (Filme 2, material
suplementar), tambm demonstrava oscilaes semelhantes aos dos embries
fertilizados esses ritmos foram tambm medidos (Tabela III, seco resultados).
Nestas imagens foi possvel tambm medir o dimetro mdio de cada embrio, e esses
dados foram usados para estimar o NCR dos blastmeros nas diferentes ploidias
(seco resultados).
A determinao da assincronia das cariocineses foi determinada a partir de
reconstrues 3D de embries observados ao microscpio confocal. Para isso
concentraram-se as observaes nas horas principais a que a MBT podia ocorrer (5h,
5,5h e 6h) e realizou-se uma reconstruo 3D no Amira de forma a visualizar,
simultaneamente, vrios ncleos dos blastmeros a cada tempo pr-definido e
determinar se estavam em sincronia ou assincronia. Esta anlise foi feita atravs da
identificao para cada ncleo visvel das fases mitticas (Figura 5), ou seja, se foi
apenas visualizada uma fase da mitose em todas as clulas observadas ento foi
considerado que todo o embrio se encontrava sincronizado, caso isso no se
verificasse considerou-se que j havia ocorrido assincronia. Depois de identificada
cada figura mittica foi colocada uma esfera colorida a representar esse ncleo de
acordo com a classificao dada na figura 5. Para poder identificar correctamente as
diferentes fases mitticas foi necessrio usar ampliaes que no permitiam ver o
embrio completo, sendo assim esta anlise foi feita apenas com base nos blastmeros
visveis ao microscpio confocal, que variou entre 20-405 clulas dependendo do
volume visvel, da ampliao e do estdio embrionrio.
Para esta anlise apesar de terem sido recolhidos 5-10 embries para cada
estdio e ploidia, o sucesso na recuperao de embries aps os testes com diferentes
marcadores nucleares e a marcao de Feulgen s permitiu uma observao com
sucesso de 1-3 para cada estdio nas principais horas onde a MBT poderia ocorrer
(ver seco de resultados) em cada ploidia. A identificao das figuras mitticas e a
sua distribuio permitiu computar para cada embrio um ndice de assincronia de
acordo com a seguinte frmula:
[(contagem da fase menos frequente) (contagem da mais frequente)]
ndice assincronia (IA) = 1 - ---------------------------------------------------------------------------------------nmero total de blastmeros observados

Quando todas as figuras mitticas identificadas esto na mesma fase, os valores do IA

aproximam-se de 1, e quando h uma distribuio aleatria das diferentes fases esse
valor aproxima-se de 0.

22

Figura 5. Relao das fases mitticas com as cores de cada esfera durante a marcao na
reconstruo 3D.

2.3.2 Determinao dos Rcios ncleo-citoplasma (NCR)

O NCR foi estimado a partir de medidas do dimetro dos embries filmados,
obtidas usando o software ImageJ v1.44: para estimar o dimetro do zigoto (incluindo
vitelo), optou-se por medir o dimetro mximo no momento da primeira clivagem
(Figura 6.A), uma vez que antes da primeira clivagem ocorrem variaes no dimetro
devidas entrada de gua aps a fertilizao. Usando o dimetro do zigoto estimou-se
o volume da seguinte forma:
VOLzig = 4/3 * * ((dimetro zigoto)/2)3
A segunda estimativa do tamanho do embrio foi feita no momento da MBT
medindo o dimetro da blastoderme conforme a figura 6. Uma vez que, ao contrrio
do zigoto, a blastoderme no tem uma forma esfrica, para estimar o tamanho dos
blastmeros optou-se pelo clculo de um ndice de tamanho celular (ITC) de acordo
com a seguinte frmula:
ITC = Dimetro blastoderme na MBT / nmero estimado de clulas
O Volume estimado do zigoto e o ITC foram depois usados para computar um
valor abstracto de NCR da seguinte forma:
NCRzig=ncromossomas/VOLzig
NCRMBT=ncromossomas/ITC

Figura 6. Representao da medio do dimetro do vitelo na I clivagem (A) e da

blastoderme na MBT(B)). Estes valores foram utilizados para estimar NCRs.

23

Fizeram-se tambm observaes do tamanho mdio celular em clulas de

tecidos adultos (sangue, barbatana e fibroblastos), para saber se eventuais alteraes
do NCR de embries se reflectiam tambm em tecidos adultos. Para tal fizeram-se
medies do ncleo e do citoplasma para as diferentes ploidias (Figura 7. A.B.C).

Figura 7. Demonstrao do procedimento do clculo NCR, medio do ncleo utilizando um

ROI (A), seleco da clula (B) e por fim a rea do citoplasma obtida atravs da subtrao
(XOR) da rea do ncleo clula (C)

Para estimativa dos NCRs a partir de clulas adultas usei imagens obtidas ao
microscpio medi as reas (de projeco) dos ncleos e citoplasmas desenhando uma
ROI (Region Of Interest) volta do ncleo e da clula (Figura 7.A), tendo depois
sido excluda a rea do ncleo rea total da clula usando a funo XOR para
obter a rea de projeco do citoplasma, conforme a figura 7.C. As estimativas do
NCR assim obtidas consistiram no rcio entre as duas reas; um aumento do NCR
corresponderia a um aumento do ncleo (cujo tamanho est presumivelmente
relacionado com a ploidia) sempre maior do um possvel aumento do citoplasma.
Uma anlise semelhante foi feita para fibroblastos, no entanto como no foi
possvel obter culturas de confluncias equivalentes e como a confluncia afecta a
rea total da clula no reportmos as medies do citoplasma, apenas as do ncleo
pois a sua rea no alterada pela confluncia.
O NCR foi estimado tambm a partir de medies de clulas de barbatana in
toto observadas no microscpio confocal. Sempre que foi possvel identificar clulas
isoladas (o que diminuiu drasticamente o nmero de clulas medidas) foi medida a
ROI do seu ncleo e citoplasma apenas numa das fatias pticas visveis.
2.3.3 Anlise dos padres de heterocromatinizao
Para a quantificao da marcao do anticorpo para a heterocromatina das
diferentes ploidias e tecidos utilizou-se o software ImageJ 1.44K. Primeiro
seleccionou-se uma ROI nuclear contornando o ncleo e obteve-se a intensidade
mdia da fluorescncia para cada marcador de heterocromatinizao (Figura 8.A),
Para normalizar esse valor (de forma a compensar diferenas devidas a variaes na
marcao que ocorrem de amostra para amostra), alargou-se a ROI nuclear de

24

forma a abranger uma poro do citoplasma 1 m fora do ncleo e depois subtraiu-se

a rea do ncleo para obter a intensidade mdia do citoplasma circundante (Figura
8.B e .C). Os valores reportados representam a intensidade mdia do ncleo
normalizada para a intensidade mdia do citoplasma circundante. Para o ncleo
obtiveram-se tambm medidas da heterogeneidade da marcao, expressas como o
desvio padro dos nveis de cinzento dentro da ROI nuclear.

Figura 8. Procedimento para medio da intensidade mdia dos marcadores de

heterocromatinizao. Inicialmente delimitou-se o ncleo (ROI nuclear representada pela
linha amarela em A). Para normalizar os valores de intensidade mdios fez-se uma expanso
automtica da ROI de 1 m, subtrai-se a ROI nuclear e obteve-se a rea de citoplasma
circundante (B) da qual se calculou a intensidade mdia para normalizao.

2.3.4 Anlise estatstica

Para a realizao da anlise estatstica foi sempre determinada a normalidade
das amostras em causa com um teste estatstico no-paramtrico KolmogorovSmirnov e caso se verificasse, procedeu-se anlise da homogeneidade das amostras
que foi realizada atravs do teste de Levene.
Se ambos os pressuspostos se verificassem realizou-se uma ANOVA de 1 via,
e testmos a hiptese nula (H0) de no existncia de diferenas entre as formas; o
valor de significncia usado for de 0.05. Ento realizou-se um teste no paramtrico
de Newman-Keuls para averiguar se a nossa H0 era aceite ou no. No caso de rejeio
da H0 realizou-se um teste Pos hoc para saber entre cada formas havia diferenas,
neste caso o teste utilizado foi o de Tukey.

25

3. Resultados
3.1 Descrio do desenvolvimento inicial em S. alburnoides
3.1.1 Descrio dos estdios e comparao com estdios modelo de
Danio rerio
De uma forma geral foi possvel identificar os estdio tipo j descritos por
Kimmel et al. (1995), apesar do desenvolvimento de S. alburnoides ser notoriamente
mais lento, uma vez que ambos se desenvolvem a temperaturas muito diferentes (28C
para D. rerio, e 20C para S. alburnoides). Embora no tenhamos feito uma anlise
das condies ptimas de cultura de S. alburnoides, durante a realizao de um
cruzamento foram testados 30 embries para diferentes temperaturas (20, 22 e ~25)
e a temperatura ptima rondou entre 20-22, pois foi onde houve menor taxa de
mortalidade. Optou-se por manter os embries mesma temperatura a que foram
mantidos os aqurios 20C. Devido escassez de amostras e a mortandade verificada
durante as filmagens no foi possvel recolher exemplos de todos em estdios.
A anlise dos tempos de clivagens foi alvo de uma anlise mais detalhada e
est relatada na seco determinao da MBT tabela III. No foram observadas
diferenas bvias nos estdios de desenvolvimento posteriores MBT nas diferentes
formas. A gastrulao (50% epibolia) foi identificada s 15.4 h, quer em PAA quer
em PA e AA (~10 h de atraso relativamente ao Danio rerio). A formao de primeiro
smito foi identificada num PAA s 30h, o surgimento de 10 smitos ocorre em todas
as formas por volta das 37h e antes da ecloso (tal como em Danio rerio) o estdio
observado Long Pec, que ocorre por volta das 68h e a ecloso ocorre ~72 h (maior
detalhe na Tabela V). O vitelo parece durar mais tempo em S. alburnoides, na fase
Protruding mouth o volume do vitelo maior que o equivalente estdio em D. rerio.
O aparecimento de melancitos tambm diferente, em D. rerio comeam a ser
visveis s 33h (Kimmel et al., 1995), enquanto em S. alburnoides s foi detectado no
incio do 5 dia, apenas um embrio amostrado. Na figura 13 podemos verificar as
diferenas temporais entre os diferentes estdios tipo de D. rerio comparativamente
com S. alburnoides
A descrio de estdios tipo proposta por Kimmel pode ser usada para
identificar estdios em S. alburnoides, com as devidos ajustes (Figura 9) para os
tempos de ocorrncia assim como a diferena no tamanho e durao do vitelo, e
aparecimento de melanforos.

26

Figura 9. Durao dos estdios representativos do desenvolvimento em Danio rerio em

comparao com o complexo S. alburnoides.

27

3.1.2 Determinao da MBT

Durante as primeiras clivagens observaram-se movimentos citoplasmticos
durante a formao do blastodisco (1 blastmero; Figura 4.A), que se sucederam
ritmicamente a cada nova clivagem. Estes movimentos parecem resultar do transporte
massivo de citoplasma do vitelo para os primeiros blastmeros em formao, e depois
a um alterao da forma dos blastmeros que se tornam mais esfricos nos momentos
que antecedem cada citocinese. Os movimentos podem ser vistos nos filmes como
uma aparente expanso da superfcie dos blastmeros/blastoderme, acompanhado de
uma regresso (contraco) antes de cada nova citocinese (Filme1- material
suplementar).
Nas primeiras 3-4 clivagens no ocorre uma separao entre os citoplasmas
dos blastmeros e do vitelo (i.e, no ocorre celularizao), o que torna mais difcil a
identificao do fim dessas clivagens. No entanto, pelos movimentos de expanso
citoplasmtica conseguimos determinar o ritmo de cada diviso; uma forma
particularmente til de visualizar estas ondas de expanso citoplasmtica foi a
anlise de cimogramas (ver material e mtodos). A tabela III resume a anlise dos
cimogramas e a determinao dos tempos mdios para cada clivagem nas diferentes
ploidias e formas.
Curiosamente, estas ondas de expanso/contraco citoplasmtica foram
observadas tambm em ocitos activados e no fertilizados, o que sugere que o
mecanismo da sua formao independente da mitose. No entanto, estes casos, no
ocorreu a formao de planos de clivagem e aparecimento de blastmeros (Filme 2material suplementar).
Tabela III. Durao do tempo mdio de cada clivagem (em minutos) para as
diferentes formas, com base na anlise dos cimogramas.
Clivagem

II

III

IV

VI

VII

VIII

IX

XI

99

140

178

213

248

283

319

357

395

420

480

Tempo(min)

Formas

PAA(n=2:21)
PA(n=1:6)

99

41

38

35

35

35

36

38

38

MBT

MBT

83

36

34

32

32

32

33

35

35

36

MBT

82

44

39

37

36

37

38

35

33

34

MBT

120

46

32

34

36

42

46

50

50

54

56

AA(n=1:4)

PAA(nofrtil)
1

Tempo mdio de ocorrncia das clivagem usando triploides como referncia.

2
Indicao de n representam posturas:embries analisados.

Nos embries triplides observou-se um atraso no tempo mdio do fim da

primeira clivagem (99 2.5 min) quando comparado com o tempo da primeira diviso
de ambas as formas diplides analisadas (PA e AA). Esta diferena, embora menos
evidente, manteve-se ao longo das primeiras X clivagens. Nos triplides, em todos os
embries analisados (n=21) nunca foi possvel identificar o fim da X clivagem, o que
sugere que a assincronia mittica ocorre logo aps a IX clivagem. Nos diploides
hbridos foi possvel identificar com preciso o fim da X clivagem em todos os

28

embries (n=6), enquanto nos AA foi possvel identificar a X clivagem em quatro de

um total de cinco embries, o que sugere que nestes casos a quebra de assincronia
ocorre apenas X clivagem. A figura 10 ajuda a entender a durao de cada clivagem
entre formas, demonstrando o atraso na 1clivagem dos triploides.
Tempo(minutos)
0

60

120

180

240

300

360

420

480

540
I
II

PAA

III
IV

Formas

V
PA

VI
VII
VIII
IX

AA

X
XI

Figura 10. Durao das diferentes clivagens para as diferentes formas. Note-se, por exemplo que s
4h (240min), os triploides estavam ainda a meio da V clivagem, enquanto os PA e AA estavam j na
VI. Curiosamente, os 4 embries AA analisados mostraram tempos de clivagens mais longos que os
PA, mais consistentes com os tempos observados nos PAA. Apesar disso, ao contrrio que que
aconteceu com os PAA, nos AA foi possvel identificar o fim da X clivagem (~410min) o que mostra
que os blastmeros se mantiveram sincronizados por mais tempo nesta forma.

A sincronia mittica foi analisada tambm por identificao das figuras

mitticas em embries fixados e recolhidos a intervalos de tempo fixos (ver materiais
e mtodos). Para melhor identificar a assincronia das cariocineses, em cada conjunto
de embries recolhidos em intervalos de tempo de 30min abrangendo o tempo
previsto para a MBT (5h, 5.5h, 6h e 6.5h) fizeram-se reconstrues 3D das imagens
de confocal recolhidas nas quais foi possvel identificar as diferentes figuras mitticas
e calcular ndices de assincronia para cada embrio (ver materiais e mtodos). Essas
contagens e ndices esto apresentados na Tabela IV

29

Tabela IV. Contagens mitticas e respectivos ndices de assincronia para as

diferentes formas (AA, PA e PAA) nas horas circundantes da MBT.
Forma

AA

PA

PAA

Horas
(p.f)
5,5
5,5
6,0
6,0
6,0
4,5
5,0
5,0
5,5
6,0
6,0
5,0
5,5
5,5
6,0

Blastmeros
vsiveis
189
176
95
158
95
58
345
295
195
405
322
20
77
24
230

Profase Metafase Anafase Telofase

189
176
35
41
34
0
338
277
195
262
206
0
51
15
62

0,0
0,0
36
39
27
0
1
8
0
39
60
0
14
3
39

0,0
0,0
14
4
4
0
0
0
0
5
2
20
4
2
37

0,0
0,0
10
74
30
58
6
10
0
99
54
0
8
4
92

ndicede
Assincronia
0,0
0,0
0,73
0,56
0,68
0,00
0,02
0,06
0,0
0,37
0,37
0,00
0,39
0,46
0,76

A identificao e contagem das figuras mitticas demonstrou que s 5 h (em

embries cultivados para recolha e fixao) aps a fertilizao no existe um nvel de
assincronia associado para ambas as ploidias (Figura 11). No entanto, a perda de
sincronia nos triploides (PAA) ocorre s 5.5 h ps-fertilizao (Figura 12), na mesma
altura nos diploides a sincronia ainda existe (Figura 13), ocorrendo em ambos os
diploides (PA e AA) apenas s 6 horas (Figura 14). O clculo do ndice de assincronia
(ver materiais e mtodos) demonstrou que a assincronia vai aumentando medida que
o tempo avana, pode-se observar este aumento no ndice de assincronia em PAA
(Figura 15).
Estes resultados sugerem que a quebra de sincronia das cariocineses nos
triplides ocorre mais cedo do que nos diplides, confirmando de igual modo a
anlise das filmagens.
Esta anlise mostrou que nos embries triplides a quebra de assincronia da
cariocinese acontece na IX diviso (s 5.5h) enquanto em diploides ocorre s 6h (X
clivagem).

30

Figura 11. Reconstrues 3D de embries fixados e corados pelo mtodo de Feulgen. Embora o
mtodo seja para marcao de DNA, o citoplasma tambm era visvel o que permite ver a forma dos
blastmeros. Em alguns casos so mostradas tambm as esferas coloridas que assinalam as diferentes
fases mitticas identificadas de acordo com a figura 5 nos materiais e mtodos. A) Embrio triploides
PAA fixado s 5h (p.f.); A) detalhe mostrando trs anafases; B) Embrio PA s 5h; B detalhe
mostrando profases. Nesta imagem esto representadas tambm as bolhas coloridas que identificam a
fase de cada ncleo analisado. (barras=300m).

Figura 12. Demonstrao da forma PAA s 5.5h (p.f), que ao contrrio das imagens
anteriores foi encontrada assincronia. (escala=125 m)

Figura 13. Demonstrao de sincronia nos embries diploide AA (A) e PA (B) s 5.5 h (p.f).
(escala=50m)

31

Figura 14. Demonstrao da reconstruo 3D para AA (A) e PA (B) s 6h (p.f), confirmando

a perda de sincronia.(escala A= 125 m e B=200 m)

ndicedeassincronia

0,8
0,7
0,6
0,5

PAA

0,4

PA

0,3
0,2

AA

0,1
0,0
4.5h

5h

5.5h

6h

Tempo(p.f)

Figura 15. ndice de assincronia mittica relativamente ao tempo ps-fertilizao nas

diferentes formas (PAA, PA, AA).

de salientar que aps a anlise das cariocineses estes embries (fixados e corados)
pareciam estar adiantados em relao aos embries filmados. Por exemplo, de acordo
com os filmes, s 5h os PAA deviam ter 64 blastmeros e estar a fazer a VII
clivagem, enquanto os PA deviam ter 128 blastmeros e estar a fazer a VIII
clivagem. A contagem das figuras mitticas mostrou consistentemente mais ncleos
nos diploides que os esperados, embora isto seja espectvel pois as cariocineses
antecedem as citocineses, o tamanho dos blastmeros visveis nas reconstrues 3D, e
a diferena no nmero de ncleos sugerem que estes embries estariam efectivamente
avanados. As possveis causas desta diferena so discutidas mais a baixo. De
qualquer das formas, estas observaes confirmaram a tendncia para os triploides
(PAA) mostrarem uma quebra de sincronia mais precoce.

32

3.1.3 Determinao de rcios ncleo-citoplasma (NCR)

Para melhor compreender os efeitos da ploidia no controlo dos ritmos das
clivagens tentmos estimar o NCR. Mais do que um valor absoluto, este um
conceito abstrato, pelo que optmos por fazer uma estimativa dividindo o nmero de
cromossomas presente em cada ploidia e uma medida do tamanho dos blastmeros.
No entanto, como no nos foi possvel medir de forma rigorosa os dimetros dos
blastmeros a partir das imagens dos filmes, ou sequer a partir das reconstrues 3D
de embries fixados (apresentavam deformaes significativas devido ao
processamento do tecido, assim como uma dimenso reduzida em relao aos
embries frescos), optou-se por estimar o NCR a partir da medio do dimetro da
blastoderme no momento da MBT. Apesar de a posio dos embries ser varivel, a
blastoderme tem um contorno circular pelo que as medies do dimetro eram
consistentes a partir de qualquer ngulo.

Figura 16. Relao entre o nmero de cromossomas e o volume do zigoto (VOLzig) e ITC (ndice
de tamanho celular de blastmeros em MBT). Apesar de haver uma relao aparentemente linear
entre a ploidia e o tamanho do zigoto ou blastmeros, os zigotos de embries AA apresentaram um
volume inesperadamente elevado (crculo tracejado). Este valor afectou significativamente as
estimativas de NCR apresentadas.

Tabela VI. Resultados das medies de dimetros dos zigotos e blastodermes e

clculos de NCRs abstratos.

PA
PAA
AA

Dimetro
zigoto(um)
DNA
50
911.1
75
1069.3
50
1056.9

VOLzig
(um3)
+08

3.96E
+08
6.40E
+08
6.18E

NCRzig

dimetro
nblastmeros

blastoderme
estimado
ITC
(um)
9
704.9
1024
0.74
126.2E
9
784.0
512
1.53
117.2E
768.1
1024
0.75

NCRMBT

72.6
49.0
66.7

33

Embora parea existir uma relao linear entre a ploidia e o tamanho do zigoto e
dos blastmeros em MBT (Figura 16), os embries AA apresentavam valores de
zigotos anormalmente grandes, facto para o qual no encontrmos um explicao e
pelo qual decidimos comparar apenas os NCRs de PAA e PA.
Para a primeira diviso estimamos um valor abstracto de NCRzig para o zigoto, e
para a MBT estimmos um NCRMBT, uma vez que j havia separao entre o
citoplasma dos blastmeros e do vitelo (de acordo com as frmulas descritas nos
matrias e mtodos). Curiosamente em ambos os casos os PAA parecem ter valores
de NCR abstratos menores que os PA, o que no nos permite concluir que uma MBT
precoce em triploides devida de um aumento no NCR.
De seguida fomos determinar os NCRs em clulas de tecidos adultos para
tentar confirmar um padro de NCR. Nas clulas de barbatana observadas ao
microscpio confocal, o tamanho nuclear maior nos triploides (Figura 17)
comparativamente com os ncleos diploides (AA, PA e PP), sendo esta uma diferena
estatisticamente significativa (p<0.05). A anlise dos tamanhos nucleares de
eritrcitos mostrou tambm um aumento do tamanho em triploides (p<0.05), e o
mesmo se verificou com os ncleos de fibroblastos em cultura embora neste caso
tivssemos apenas para comparao a forma triploide (PAA) e a forma diploide (PP)
(Figura 18).

Figura 17.. Demonstrao dos tamanhos nucleares (normalizados para PP) para as diferentes
ploidias no sangue e barbatana, sendo que PAA estatisticamente diferente (*) dos outros.

34

*
*

Figura 18. Demonstrao dos tamanhos nucleares (normalizado para PP) para as diferentes
ploidias nos fibroblastos, sendo PAA diferente de PP.

No entanto, tambm o citoplasma maior nos eritrcitos, assim como nas

clulas de barbatana (Figura 19). Infelizmente no nos foi possvel obter medidas
fiveis do tamanho do citoplasma de fibroblastos em cultura uma vez que as amostras
comparadas estavam com diferentes nveis de confluncia o que afecta a capacidade
das clulas expandirem o seu citoplasma.

Figura 19. Demonstrao dos tamanhos do citoplasma para as clulas da barbatana e sangue
nas diferentes ploidias.

Estes dados em conjunto sugerem que o tamanho celular normal quer em

blastmeros quer em clulas adultas influenciado pela ploidia. Embora exista um
aumento notrio no tamanho do ncleo, no claro que exista um aumento do
citoplasma equivalente.
No clculo do NCR estas diferenas observadas no so estatisticamente
diferentes entre PA e PAA. Contudo, nas clulas do sangue existem diferenas entre
AA e as restantes formas (p<0.05). No caso das clulas da barbatana essa diferena
ocorre em PP (Figura 20).

35

Figura 20. Valores do NCR (normalizado para PP) para as clulas da barbatana e do sangue,
havendo diferenas entre AA para o sangue e em PP para a barbatana.

3.2 Modificao de histonas - Anlise da Intensidade e heterogeneidade

das marcaes
3.2.1 Cultura de fibroblastos
Com recurso s culturas de fibroblastos efectuadas, apenas foi possvel
analisar para os genomas PAA e PP, devido ao facto das outras culturas no terem
crescido.
Analisando a intensidade nuclear dos anticorpos Hp1 e H3K9 para ambas as
formas, podemos verificar nas Figuras 21 e 22 que temos uma maior intensidade para
ambos os anticorpos no triplide (PAA) relativamente ao diploide (PP), no entanto
apenas na marcao de Hp1 se verificaram diferenas estatsticas significativas.
Intensidademdia(u.a)

1,2

1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
PAA

PP
Formas

Figura 21. Intensidade mdia de H3K9 nuclear para as diferentes formas, normalizado para a
intensidade mdia do diploide.

36

Intensidademdia

1,4
1,2

*
*

1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
PAA

PP
Formas

Figura 22. Intensidade mdia de HP1 nuclear para as diferentes formas, normalizado para a
intensidade mdia do diploide, havendo diferenas estatsticas entre eles..

Depois disto, realizou-se a anlise da heterogeneidade da marcao no ncleo para

tentar entender se existiam focos de intensidade para algum dos marcadores. Com
essa anlise verificou-se na anlise de H3K9 que a heterogeneidade maior no
diploide (Figura 23), enquanto que para a Hp1 existe maior heterogeneidade no
triploide (Figura 24). A anlise estatstica veio comprovar a existncia de diferenas
significativas para ambos os casos.

Heterogeneidademdia

1,2
1,0

*
*

0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
PAA

Formas

PP

Figura 23. Heterogeneidade mdia de H3K9 nuclear, normalizado para a heterogeneidade

mdia do diploide, mostrando diferenas significativas nos triploides (asterisco).

Heterogeneidademdia

2,5
2,0

1,5

*
1,0
0,5
0,0
PAA

Formas

PP

Figura 24. Heterogeneidade mdia de Hp1 nuclear, normalizada para os diploides, com
diferenas significativas nos triploides (asterisco).

37

Atravs da observao das imagens obtidas na cultura de fibroblastos,

verificou-se que na periferia dos ncleos no eram visveis focos de heterocromatina,
fentipo que por vezes est relacionado com o silenciamento. Nem a marcao de
DAPI nem a de marcadores heterocromticos para ambas as ploidias mostrou esse
efeito (Figura 25 e 26).
H3K9PAA

DAPIPAA

HP1PAA

DAPIPAA

Figura 25. Imagens de cultura de fibroblastos PAA com marcao para H3K9, HP1 e
respectiva marcao nuclear (DAPI). (escala= 5 m)
H3K9PAA

DAPIPP

HP1PP

DAPIPP

Figura 26. Imagens de cultura de fibroblastos PAA com marcao para H3K9, HP1 e
respectiva marcao nuclear (DAPI). (escala= 5 m)

3.2.2 Crebro
O estudo da verificao de diferenas da marcao de Hp1 no ncleo foi
tambm realizado em clulas do crebro. Sendo executada a mesma anlise que no
caso dos fibroblastos.
Neste caso, abordamos mais uma forma para os diplides (PA), para alm das
analisadas anteriormente. Aqui verificou-se que a intensidade nuclear de Hp1
diferente entre ploidias, essa intensidade mais elevada no caso dos triploides (Figura
27). Esta diferena estatisiticamente significativa, verificando-se essas diferenas

38

entre o triplide PAA e ambos os diplides (PA e PP). O mesmo se verificou em

relao heterogeneidade da marcao (Figura 28).
1,4

Intensidademdia

1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
PAA

PA

PP

Formas

Figura 27. Anlise da intensidade mdia da marcao nuclear de Hp1 nas diferentes ploidias,
normalizado para a intensidade mdia de PP), mostrando uma diferena significativa do
triploides (asterisco).

Heterogeneidademdia

2,5
2,0

1,5
1,0
0,5
0,0
PAA

PA
Formas

PP

Figura 28. Heterogeneidade mdia nuclear de HP1 para clulas de crebro nas diferentes
formas (normalizado para os PP), mostrando diferenas significativas no triplide (asterisco).

3.2.3 Sangue
O mesmo tipo de anlise foi efectuada em esfregaos de sangue, aps
observao da marcao de HP1. Desta forma, conseguimos abranger todas as formas
diplides (AA, PA e PP) do nosso estudo, enquanto que relativamente aos triploides a
mesma forma (PAA) foi utilizada. Esta anlise veio demonstrar que as diferenas j
anteriormente detectadas nos triploides (PAA) so outra vez significativas para este
tecido (Figura 29).

39

IntensidadeHp1

1,2

1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
AA

PA

PAA

PP

Formas

Figura 30. Intensidade mdia da marcao nuclear de Hp1 entre as diferentes formas,
normalizadas para a intensidade mdia em PP, mostrando diferenas significativas nos
triploides (asterisco).

Quanto anlise da heterogeneidade nuclear da marcao de Hp1 nas

diferentes formas, esta anlise mostrou diferenas estatisticamente significativas entre
o triplide e os diploides PA e PP, enquanto que relativamente a AA no existe
diferenas. Foi tambm verificada diferena entre diplides PA e PP (Figura 31).

HeterogeneidadeHp1

1,6

1,4

1,2

1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
AA

PA

PAA

PP

Formas

Figura 31. Heterogeneidade nuclear de HP1 nas diferentes formas, normalizada para a
heterogeneidade mdia de PP, mostrando diferenas significativas entre triploides e os
diploides PA e PP (asteriscos), mas no entre triploides e os diploides AA.

3.2.4 Embries pr e ps-MBT

Para a anlise da intensidade da protena HP1 em embries antes e depois da
MBT, utilizaram-se cinco embries para cada forma mencionada acima e realizou-se
a descorionizao para permitir a entrada do anticorpo o que resultou na destruio da
maioria dos embries. Tendo sido aproveitados para pr-MBT n=1 (PAA), n=2 (PA)
e para a anlise ps-MBT n=2 (AA), n=1(PAA), n=1(PA).
Atravs da quantificao da intensidade da marcao de HP1 que foi realizada
da mesma forma que as anlises anteriores, verificou-se que na observao pr-MBT
no existe marcao significativa desta protena para ambas as ploidias analisadas.
Enquanto que na anlise ps-MBT existe marcao em todas, com maior intensidade
nos triploides (Figura 32).

40

IntensidadeHp1

2,500

2,000
1,500
PrMBT

1,000

PsMBT

0,500
0,000
AA

PA

PAA

Formas

Figura 32. Representao das intensidades mdias da marcao de HP1 nuclear em embries
pr e ps-MBT (5h e 9h), normalizadas para os valores de PA, mostrando diferenas
significativas entre embries pr- e ps MBT, e aps MBT no triploide em relao aos
diploides.

Figura 33. Marcao de HP1 nuclear em embries de diferentes ploidias antes (5h) e depois
da MBT (9h). Verde = HP1, vermelho = DNA.

41

4. Discusso
Este trabalho procurou analisar se a poliploidia originava efeitos durante o
desenvolvimento inicial e nos mecanismos de epigentica do complexo Squalius
alburnoides.
Relativamente ao desenvolvimento foram realizadas observaes de vrios
embries para as diferentes ploidias e formas do complexo, verificou-se que existe
uma perda de assincronia mais cedo nos triploides do que nos diploides nos dois
mtodos utilizados para esse efeito. No entanto, na anlise realizada com base nos
vdeos com recurso a cimogramas verificou-se a perda de sincronia IX clivagem
nos triploides e X clivagem para diploides, ambas por volta das 6,5 h. O outro
mtodo realizado para verificar esta perda de sincronia demonstrou que nos triploides
ocorre s 5,5h, e no caso dos diploides s 6h ps fertilizao, embora no possamos
excluir a possibilidade destas diferenas serem devidas a diferentes temperaturas nos
dois mtodos de cultura usados. No entanto, em ambos os casos verificou-se que a
sincronia surge mais cedo nos triploides, tal como tinha sido previsto no trabalho de
Newport e Kirschner. As diferenas entre mtodos devem-se provavelemente ao facto
de durante a filmagem terem ocorrido oscilaes de temperatura na sala, e uma
diminuio da temperatura provocar atraso no desenvolvimento.
Esta ocorrncia poderia ter sido verificada com a anlise dos embries
marcados pelo mtodo de Feulgen, no entanto, aps as desidrataes no processo do
mesmo os blastmeros sofreram grandes alteraes e a sua anlise poderia cair em
erro. Para confirmar isto ter que se analisar formas mais precoces, uma vez que
anlise para j incidiu apenas sobre embries perto da MBT.
A criao de uma tabela com os tempos e estdios respectivos, um dado
importante para estudos futuros de S. alburnoides, assim como a verificao de que
possvel identificar os mesmos estdios tipo descritos por Kimmel et al., 1995.
Relativamente ao efeito do NCR durante o desenvolvimento, as anlises
realizadas relativamente aos dimetros obtidos para o zigoto no momento da MBT
embora mostrem diferenas no tamanho do PAA e PA, ela no altamente
significativa (p=0.03), o que sugere que os embries regulam o tamanho das suas
blastodermes, apesar do seu tamanho inicial maior (para o qual contribui
massivamente a reserva do vitelo). Salvaguardando que os triploides fizeram menos
uma clivagem e as blastodermes tenham tamanhos equivalentes, os blastmeros dos
triploides so quase o 2x maiores. Para confirmar estes valores seriam necessrias
medidas mais directas do volume dos blastmeros para que a determinao do NCR.
Dessa forma talvez fosse possvel determinar um NCR mais rigoroso e que apontasse
para uma confirmao do efeito do NCR no controlo da MBT.
Ficamos com dvidas sobre o significado do maior tamanho dos zigotos de
diploides AA. Para comprovar estas diferenas, mais cruzamentos e de diferentes
fmeas e machos deveriam de ser feitos, assim como uma anlise rigorosa do tamanho
tpico de ocitos nas diferentes formas. Este aspecto foi abordado por Ribeiro et al
(2003), embora e os dados apresentados no sejam comparveis com as nossas
observaes.

42

Foi ainda interessante observar que existe um ritmo basal de movimentos

citoplasmticos pr-programado no ocito, visto nas pulsaes de ocitos no
fertilizados, que continuam muito para l do tempo normal da MBT. De que forma
esse comportamento ritmado se sobrepe ao ritmo adquirido durante as clivagens
(presumivelmente regulado pelo NCR) no claro.
Os clculos que efectumos para estimativas de NCR abstractos mostraram ser
menores no zigoto triploide o que veio pr em causa o efeito do NCR na ocorrncia
da MBT. As observaes de clulas adultas apontam para poucas diferenas de NCR
entre formas, embora revelem claramente um aumento do tamanho nuclear em
triploides. A no existncia de diferenas nos NCRs de clulas somticas adultas
sugere uma expresso aditiva nos genes de RNA ribosomais, uma vez que estes
representam cerca de 90% do RNA total da clula e os ribossomas 30% da massa da
clula (Benjamin Lewin, Genes IX). A aditividade na expresso dos genes ribosomais
ainda suportada pela inexistncia de focus heterocromticos visveis na periferia dos
nuclolos (Figuras 25 e 26), caracterstica geralmente associada a um mecanismo de
dominncia nucleolar que se verifica muitas vezes em hbridos. Na dominncia
nucleolar um dos genomas parentais silenciado para os genes ribosomais, a ausncia
de evidncia para este fenmeno em S. alburnoides vem realar a espetacularidade
deste complexo, na medida em que, apesar da necessidade de regular negativamente
vrios mRNAs (Pala et al., 2008), no caso dos rRNAs parece no existir essa
urgncia, sendo mesmo pouco compreensvel a necessidade em aumentar a produo
da maquinaria de traduo, quando por sua vez os mRNAs esto reduzidos a uma
dosagem diploide. Assim, mais uma vez, este complexo reala a sua grande tolerncia
biolgica agora tambm ao nvel molecular/celular. No podemos no entanto excluir a
hiptese de apenas um dos genomas estar a expressar os genes de rRNA mas de uma
forma ampliada e assim compensar a ausncia de expresso do outro genoma.
Portanto, no podemos excluir por completo a suposio de ausncia de dominncia
nucleolar, sendo necessrio reforar esta investigao com outro tipo de experincias,
possivelmente testando a sobreposio de imagens com marcadores heterocromticos
e FISH para rDNA e/ou rRNA usando sondas especificas do genoma.
Neste trabalho tentou-se ainda identificar um dos possveis mecanismos do
silenciamento gnico verificado por Pala et al., 2008, para isso foram realizadas
diversas experincias com base na marcao de duas protenas frequentemente
utilizadas como marcadores heterocromticos: a HP1 e a H3K9me3. Durante esta
anlise deparamo-nos com vrios problemas associados, tais como as cultura de
clulas no terem proliferado e a marcao de ToPro3 (marcador nuclear) nem sempre
funcionar. Salvo estes problemas, os nossos resultados demonstram no geral a
existncia de maior marcao da protena HP1 nos triploides face aos diploides quer
nas clulas somticas adultas quer nas clulas do embrio. Nos embries verificmos
a inexistncia de marcao pr-MBT, o que esta de acordo com o descrito, na medida
que nesta fase o genoma do ocito est transcripcionalmente silenciado, sendo a
expresso exclusivamente materna (Lindeman&Pelegri, 2010). Assim, tal como
esperado, aps a MBT a marcao de HP1 surge indicando que o controlo da
expresso gnica tem incio durante o desenvolvimento inicial logo aps a MBT.
Contudo, algum cuidado tem de se ter na anlise destes resultados, na medida em que
a literatura se tem mostrado recentemente contraditria relativamente participao
da HP1 na regulao da expresso gnica, por vezes no associada represso mas h
activao da transcrio (Caillier et al., 2010)

43

Relativamente aos resultados para a marcao por H3K9, estes no foram to claros,
possivelmente por que esta marcao se mostra pouco especifica, apresentado
extenses para o citoplasma (Imagem H3K9- ver material suplementar)
A heterogeneidade da marcao heterocromtica nuclear mostrou-se
consistentemente maior nas formas triploides. Mais uma vez estes resultados
suportam a existncia de silenciamento nos triploides via mecanismos
heterocromticos, na medida em que expectvel a existncia de mais focus em
ncleos sujeito a silenciamento gnico. Por outro lado no h evidncias de grandes
marcaes heterocromticas na periferia desses ncleos, suportando as evidncias
dadas por Pala et al. 2008 de que no existe um silenciamento de um haploma inteiro,
pois nesse caso estes iria tendencialmente localizar-se na periferia (Francastel et al.,
2000).

44

5. Bibliografia
Alves MJ, Gromicho M, Collares-Pereira MJ, Crespo-Lpez E, Coelho MM (2004),
Simultaneous Production of Triploid Squalius alburnoides (Teleostei; Cyprinidae),
Journal of Experimental Zoology, 301A:552-558
Alves MJ, Collares-Pereira MJ, Dowling TE, Coelho MM (2002) The genetics of
maintenance of an all-male lineage in the Squalius alburnoides complex. J Fish Biol.
60, 649-662
Alves MJ, Coelho MM, Collares-Pereira MJ (2001) Evolution inaction through
hybridization and polyploidy in an Iberian freshwater: a genetic review. Genetica 111,
375-385
Alves MJ, Coelho MM, Prspero MI, Collares-Pereira MJ (1999). Production of
fertile unreduced sperm by hybrid males of Rutilus alburnoides complex (Teleostei,
Cyprinidae): an alternative route to genome tetraploidization in unisexuals. Genetics
151,277-283
Alves MJ, Coelho MM, Collares-Pereira MJ (1998) Diversity in the reproductive
modes of females of the Rutilus alburnoides complex (Teleostei, Cyprinidae): a way
to avoid the genetic constraintsof uniparentalism. Mol Biol Evol. 15, 1233-1242
Alves MJ, Coelho MM, Collares-Pereira MJ, Dowling TE (1997) Maternal ancestry
of the Rutilus alburnoides complex (Teleostei, Cyprinidae) as determined by analysis
of cytochrome b sequences. Evolution 51, 1584-1592
Anelli V, Santoriello C, Distel M, Reinhard KW, Ciccarelli F, Mione M (2009)
Global Repression of cancer gene expression in zebrafish model of melanoma is
linked to epigenetic regulation. Zebrafish. Volume 6. Number 4. 417.424
Bannister AJ, et al. (2001) Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3
by the HP1 chromodomain. Nature 410,120124
Benjamin Lewin. Genes IX. Jones and Bartlett Publishers. 867
Berger SL, Kouzarides T, Shiekhattar R, Shilatifard A (2009) An operational
definitions of epigenetics; Genes Dev., 23:781-783
Caillier M, Thnot S, Tribollet V, Birot AM, Samarut J, Mey A (2010) Role of the
epigenetic regulatorHP1 in the contril of embryonic stem cekk properties. Plos One.
Volume 5. 1-12.

45

Chen ZJ and Ni Z (2006) Mechanisms of Genomic Rearrangements and Gene

Expression Changes in Plant Polyploids, BioEssays, 28:240-252
Chen ZJ (2007) Genetic and epigenetic mechanisms for gene expression and
phenotypic variation in plant polyploids, Ann Rev. Plant Biol, 58:377-406
Carmona JA (1997) Evolucin y modelos de reproduccin en un organismo unisexual
de la Pennsula Ibrica: el complejo Tropidophoxinellus alburnoides, Universidad
Complutense.
Chvez CH, Turgeon J (2007) Asexual and sexual hybrids between Fundulu
diaphanus and F. heteroclitus in the Canadian Atlantic region. Molecular Ecology 16,
14671480.
Coelho MM, Bogutskaya NG, Rodrigues JA, Collares-Pereira MJ (1998) Leuciscus
torgalensis and L. aradensis, two new cyprinids for Portuguese fresh waters. Journal
of Fish Biology, 52, 937-950.
Comai L (2005) The Advantages and Disadvantages of Being Polyploid, Nature,
Volume 6, 10.1038/nrg1711
Collares-Pereira MJ, Coelho MM (2010) Reconfirming the hybrid origin and generic
status of the Iberian cyprinid complex Squalius alburnoides. Journal of Fish Biology
76, 707-715
Corry G, Tanasijevic B, Barry E, Winfried K, Rasmussen T (2009) Epigenetic
Regulatory Mecanisms During Preimplation Development, Interscience,10.1002
CrespoLpez ME, Duarte T, Dowling T, Coelho MM (2006) Modes of reproduction
of the hybridogenetic fish Squalius alburnoides in the Tejo and Guadiana rivers: An
approach with microsatellites. Zoology 109, 277286.
Cunha C, Doadrio I, Coelho MM (2008) Speciation towards tetraploidization after
intermediate processes of non-sexual reproduction. Philos Trans R Soc Lond B Biol
Sci. 363, 2921-2929
Edgar B, Kiehle C, Schubiger G (1986) Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic
ratio in early Drosophila development, Cell, 10.1016/0092-8674(86)90771-3
Eiben B, Bartels I, Porsch S, Borgmann S, Gatz G, Gellert G, Goebel R, Hammans
W, Hentemann M, Osmers R, Rauskolb R, Hansmann I (1990) Cytogenetic analysis
of 750 spontaneous abortions with the direct-preparation method oh chorionic villi

46

and its implications for studying genetic causes of pregnancy wastage. Am J Hum
Genet, 47(4):656-663
Festenstein R, Sharghi-Namini S, Fox M, Roderick K, Tolaini M, Norton T, Saveliev
A, Kioussis D, Singh P (1999) Heterochromatin Protein 1 Modifies Mammalian PEV
in a Dose- and Chromosomal-context-dependent Manner". Nature Genetics, 23 (4):
45761, 10.1038/70579
Gromicho M, Coelho MM, Alves MJ, Collares-Pereira MJ (2006) Cytogenetic
analysis of Anaecypris hispanica and its relationship with the paternal ancestor of the
diploid-polyploid Squalius alburnoides complex. Genome, 49:1621-1627
Halbeisen R, Galgano A, Scherrer T, Gerber A (2007) Pos-transcriptional gene
regulation: From Genome-wide studies to principles. Cell. Mol. Life Sci.
10.1007/s00018-007-7447-6
He H, Lehming N (2003) Global Effects of Histone modifications. Briefings in
Functional Genomics and Proteomics. Volume 2, No.3, 234-243
Incio A, Matos I, Machado MP, Coelho MM (2010) An easier method to identify the
individual genomic composition of allopolyploid complexes. Journal of Fish Bio
logy 76, 19952001.
Kraeussling M, Wagner T, Schartl M (2011) Higly asynchronous andasymmetric
cleavage divisions assompany early transcriptional activity in pre-blastula medaka
embryos. Plos One. doi:10.1371
Kimmel C, Ballard W, Kimmel S, Ullman B, Schilling T (1995) Stages of Embryonic
Development of Zebrafish. Developmental Dynamics. 203:253-310
Lewis WH (1980) Polyploidy Biological Relevance. New York: Plenum Press.
Lindeman E, Pelegri F (2010) Vertebrate Maternal-Effect Genes: Insights into
fertilization, Early cleavage divisons, and germ cell determinant localization from
studies in the zebra-fish. Mol. Reprod. Dev. 77:299-313
Mallet J (2007) Hybrid speciation. Nature. 446, 279283.
Masterson J (1994) Stomatal size in fossil plants: evidence for polyploidy in majority
of angiosperms. Science. 264, 42142444
Miller SA, Dykes DD, Polesky HF (1988) A simple salting out procedure or
extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 16, 1215.

47

Morgado-Santos M, Matos I, Vicente L, Collares-Pereira MJ (2010) Scaleprinting:

individual identification based on scale patterns. Journal of Fish Biology. 76, 12281232
Mosieniak G, Sikora E (2010) Polyploidy: The Link Between Senescence and Cancer.
Current Pharmaceutical Design. 16, 734-740
Newport J, Kirschner M (1982) A Major Developmental Transition in Early Xenopus
Embryos: I. Characterization and Timing of Cellular Changes at Midblastula Stage.
Cell. Vol.30, 675-686
Pala I, Coelho MM (2005) Contrasting views over a hybrid complex: Between
speciation and evolutionary "deadend". Gene 347, 283294.
Pala I, Coelho MM, Schartl M (2008) Dosage Compensation by Gene-Copy Silencing
in Triploid Hybrid Fish. Current Biology. 1344-1348
Prspero MI, Collares-Pereira MJ (2000) Nuclear DNA contente variation in the
diploid polyploid Leusciscus alburnoides complex (Teleostei: Cyprinidae) assessed
by flow citometry. Folia Zoologica 49, 53-58
Ramsey J, Schemske DW (2002) Neopolyploidy in flowering plants. Annu Rev Ecol S
yst. 33, 589639.
Ribeiro F, Cowx IG, Tiago P, et al. (2003) Growth and reproductive traits of
diploid and triploid forms of the Squalius alburnoides cyprinid complex in a tri
butary of the Guadiana River, Portugal. Archiv Fur Hydrobiologie 156. 471-484.
Rodrigues E, Collares-Pereira MJ (1996) NOR-polymorphism in the Iberian species
Chondrostoma lusitanicum (Pisces:Cyprinidae). Genetica 98: 59-63
Scribner KT, Page KS, Bartron ML (2001) Hybridization in freshwater fishes:
a review of case studies and cytonuclear methods of biological inference.
Reviews in Fish Biology and Fisheries. 10, 293323.
Sonnesen L, Nolting D, Engel U, Kjaer I (2009) Cervical Vertebrae, Cranial Base,
and Mandibular Retrognathia in Human Triploid Fetuses. American Journal of
Medical Genetics. Part A, Volume 149A, 177-187
Sousa-Santos C, Collares-Pereira MJ, Almada VC, (2006b) May a hybridogenetic
complex regenerate the nuclear Genome of both sexes of a missing ancestor? First
evidence on the occurrence of a nuclear non-hybrid Squalius alburnoides

48

(Cyprinidae) female based on DNA sequencing. Journal of Natural History. 40, 14431448
Sousa-Santos C, Collares-Pereira MJ, Almada V (2006) Reproductive sucess of
nuclear nonhybrid males of Squalius alburnoides complex (Teleostei, Cyprinidae): an
example of interplay between female choice and ecological pressures?. Acta Ethol.
9:31-36
Sousa-Santos C, Collares-Pereira MJ, Almada V (2007) Reading the history of a
hybrid fish complex from its molecular record. Molecular Phylogenetics and
Evolution 45. 981-996
Stewart S, Tsun ZY, Belmonte J (2009) A histone demethylase is necessary for
regenetration in zebrafish. PNAS, 106,no.47, 19889-19894
Storchova Z, Pellman D (2004) From Polyploidy to aneuploidy, genome instability
and cancer. Molecular Cell Biology. Vol.5: 45-54
Uchida JA, Freeman VC (1985) Triplody and chromosomes. Am. J. Obstet. Gynecol.
151, 65-69
Wang G, Mas A, Chow CM, Horsley D, Brown NR, Cowell IG, Singh PB,
Conservation of heterochromatin protein 1 function. Mol Cell Biol. 2000, 20:69706983
Van de Peer Y & Meyer A Chapter 6: Large-scale gene and ancient genome
duplications. In The Evolution of the Genome, ed. T. R. Gregory, 330-363 (San Diego,
Elsevier, 2005)

49