Manual Salmonella GSS 2008

Gnero Salmonella:
Caractersticas Epidemiolgicas e
Laboratoriais
Norma dos Santos Lzaro, Eliane Moura Falavina dos Reis, Christiane
Soares Pereira & Dalia dos Prazeres Rodrigues
Laboratrio de Referncia Nacional de Clera e outras Enteroinfeces

Bacterianas Laboratrio de Enterobactrias
LRNCEB/LABENT
IOC/VPSRA/FIOCRUZ
Outubro/2008
Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ

LRNCEB/LABENT
Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais
INDICE
Pgina
1. Taxonomia .......................................................................................
2.
2. Caractersticas Gerais .....................................................................
3. Habitat ............................................................................................
4. Caractersticas clnicas e patogenia ................................................
5. Ecologia ...........................................................................................
10
6. Epidemiologia .................................................................................
11
7. Diagnstico Laboratorial Coleta de Espcimes Clnicos .......... ...
12
7.1. Sangue............................................................................................
12
7.2. Fezes .............................................................................................
13
7.3. Transporte de espcimes clnicos .................................................
15
. Diagnstico Laboratorial de Salmonella spp. de Espcimes Fecais.......
16
Esquema de Isolamento - Fluxograma................................................
17
8.1. Pr-Enriquecimento .......................................................................
18
8.2. Enriquecimento Seletivo ................................................................
18
8.3. Meios Seletivos-Indicadores ..........................................................
20
7.4. Identificao Bioqumica Presuntiva (Meios de Triagem) ..............
25
8.5.Caracterizao Bioqumica Complementar .....................................
31
9. Aspectos Gerais sobre os Antgenos das Enterobactrias ..............
41
10. Controle de Qualidade de Meios de Cultura, Reagentes

e Equipamentos ................................................................................
47
11. Anexos .............................................................................................
50
12. Bibliografia .......................................................................................
54

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1. Taxonomia
A designao do gnero Salmonella foi adotada em 1900 por Lignires em
homenagem a Daniel Salmon, o qual isolou o microrganismo conhecido como
Salmonella enterica sorovar Choleraesuis de sunos. Sua nomenclatura teve como
orientao inicial informaes relacionadas s condies clnicas ou ao hospedeiro
do qual o microrganismo era isolado.
Entretanto, a diversidade inicial de sorovares que apresentavam etiologia no
especfica de um determinado hospedeiro, levou inicialmente a designao do
mesmo sorovar em hospedeiros distintos, em locais diferentes. A partir de 1920, um
grupo de microbiologistas, liderados por Fritz Kauffmann em Copenhagen e por
Philip Bruce White em Londres unificaram a taxonomia, tendo seu trabalho
reconhecido pelo subcomit de Salmonella da Sociedade Internacional de
Microbiologia em 1933, como esquema de Kauffmann-White. A partir de ento sua
nomenclatura sofreu algumas modificaes tendo por base a utilizao de mtodos
clssicos e mtodos moleculares, como AFLP, e seqenciamento 16S rRNA, MLEE,
FAFLP.
Na atualidade o gnero dividido em duas espcies e seis subespcies ou
subgneros, S.enterica (subespcies enterica, salamae, arizonae, diarizonae,
houtenae e indica) e S.bongori.
A forma de redao na nomenclatura atual como por ex. do sorovar
Typhimurium, deve ser reportada como Salmonella enterica subespcie enterica
sorovar Typhimurium. Contudo pode ser redigida de uma forma reduzida onde o
nome do sorovar iniciado com letra maiscula, porm nunca itlico, como por
exemplo, Salmonella sorovar Typhimurium ou Salmonella Typhimurium.
Salmonella o gnero de maior relevncia na famlia Enterobacteriaceae,
embora sua relao filogentica seja de certo modo conjuntural. Dependendo do
mtodo empregado, S.enterica mais relacionada com Citrobacter do que com
Escherichia coli (homologia de DNA) ou em sentido inverso quando empregado
mtodo de avaliao de grandes fragmentos (23S rRNA).

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Em geral, acredita-se que Salmonella e E.coli descendam de um ancestral

comum a 160-180 milhes de anos, durante o perodo tercirio, em paralelo com os
invertebrados. E.coli e Salmonella difsica se adaptaram aos mamferos, enquanto
sorovares monofsicos permaneceram adaptados aos repteis.
Em cada subespcie so reconhecidos diferentes nmeros de sorovares
tendo por base a caracterizao de seus antgenos somticos (O) e flagelares (H),
perfazendo atualmente >2.500 sorovares. Entre as espcies, a subespcie
S.enterica apresenta maior nmero de sorovares, sendo responsvel por 99% dos
isolamentos, usualmente de animais de sangue quente, cuja distribuio editada por
Popoff M.Y. & Le Minor L., 2001 encontra-se apresentada na Tabela 1.
Em 2002, foram includos 18 novos sorovares, sendo 12 pertencentes a
S.enterica subespcie enterica, 2 subespcie salamae, 2 diarizonae, 1 houtenae e 1
S. bongori.
Atualmente so reconhecidos cerca de 2510 sorovares includos em duas
espcies S.enterica e S. bongori, como discriminados abaixo:
Salmonella enterica subsp. enterica
1490 sorovares
Salmonella enterica subsp salamae -
500
Salmonella enterica subsp arizonae -
94
Salmonella enterica subsp diarizonae - 320

Salmonella enterica subsp houtenae
72
Salmonella entrica subsp. indica
12
Salmonella bongori
22
Em 2004 uma nova espcie foi proposta, tendo sido designada Salmonella
subterranea. Seu isolamento foi efetuado em sedimento subterrneo, de solo com
baixo pH na Oak Ridge, Tennessee. Esta amostra apresentou forte inter-relao
com S.bongori, atravs de seqenciamento 16S rRNA alm de algumas
caractersticas como indol positivo, H2S e lisina descarboxilase negativa, pigmento
amarelo e um flagelo lateral. A amostra tipo proposta ATCC BAA-86.

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Tabela 1. Nomenclatura atual
Espcies
S.enterica
Subespcies
enterica
salamae
arizonae
diarizonae
houtenae
indica
ATCC no.
43971
43972
13314
43973
43974
43976
S.bongori
43975
2. Caractersticas Gerais
Pertencente
famlia
Enterobacteriaceae,
sendo
que
morfologicamente
bastonetes Gram negativos, geralmente mveis, formam cido e, na maioria das

vezes, gs a partir da glicose, excetuando-se os sorovares S. Typhi, S. Pullorum e
S.Gallinarum (5% produzem gs). Tambm fermentam
arabinose, maltose,
manitol, manose, ramnose, sorbitol, trealose, xilose e dulcitol. A maioria das

salmonelas de interesse clnico no fermenta lactose, contudo, muitas cepas podem
adquirir esta caracterstica atravs de transferncia plasmidial. So oxidase negativo,
catalase positivo, indol, Voges-Proskauer (VP), vermelho de metila (VM), malonato
e uria negativos. Produzem gs sulfdrico a partir da reduo do enxofre por ao
da enzima cistena desulfidrase. Apresentam ainda como caractersticas metablicas
a capacidade de descarboxilar os aminocidos lisina e ornitina, reduzir nitratos a
nitritos e utilizar o citrato como fonte nica de carbono. No entanto, ocorrem
variaes em funo do sorovar e/ou subspcie. Por exemplo, S.Arizonae no
fermenta o dulcitol, mas freqentemente malonato positivo. S. Pullorum no
fermenta o dulcitol e S. Gallinarum no descarboxila ornitina e no produz gs a
partir da fermentao da glicose. Somando-se a estas caractersticas, S. Pullorum e
S. Gallinarum so imveis, enquanto as salmonelas paratficas so mveis.
As caractersticas bioqumicas que permitem diferenciar as distintas
subespcies dentro da espcie enterica e as espcies S. bongori e S. subterranea
so apresentadas na tabela 2.

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Tabela 2. Caractersticas diferenciais de espcies e subespcies de Salmonella spp.
Espcies
Dulcitol
ONPG(2h)
Malonato
Gelatinase
Sorbitol
Crescimento KCN
L(+)Tartarato(a)
Galacturonato
-glutamyl transferase
-glucuronidase
Mucato
Salicina
Lactose
Lise-fago O1
Habitat normal animais
Sangue
quente
+
+
+
+
+
+
- (75%)
-
+
+
+
+
+
+
+
- (70%)
+ (75%)
+
+
+
+
+
+
+
-
Indica
Caractersticas
houtenae
+
+
+
+
+
D
+
+
diarizonae
salamae
+
+
+
+(b)
D
+
+
arizonae
enterica
Subespcies
S.enterica
S.bongori
S.subterranea
d
d
+
+
d
+
d
+
+
+
+
+
+
+
+
+
D
+
+
+
+e
ND
ND
ND
ND
ND
ND
Sangue frio e meio ambiente
a: d-tartarato; b: S.Typhimurium (d), S.Dublin (-); +: 90% reaes positivas; - : 90% reaes negativas; d:
diferentes reaes(sorovares); e: crescimento sem produo de cido

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Tabela 3. Diferenciao bioqumica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e sorovares de S.enterica

subsp. enterica mais freqentes.
S. Typhi
S.Paratyphi A
S. enterica
subsp. enterica
+
Dulcitol
+/-
Arabinose
-/ +
+
-
+
+
Dehidrolao Arginina
+/-
H2S
+*
- / (+)
Glicose (gs)
cido:
Descarboxilao:
Lisina
Ornitina
Citrato de Simmons
+ : positivo; -: negativo; (+) 75% positivo aps 48 horas; *: fraco.
3. Habitat
O habitat natural das salmonelas pode ser dividido em 3 categorias com base
na especificidade do hospedeiro e padro clnico por eles determinado: altamente
adaptadas ao homem incluindo S. Typhi e S. Paratyphi A, B e C, agentes da febre
entrica (febres tifide e paratifoide); altamente adaptadas aos animais
representadas por S. Dublin (bovinos), S.Choleraesuis e S. Typhisuis
(sunos),
S.Pullorum e S.Gallinarum (aves), responsveis pelo paratifo dos animais.

Entretanto, em determinadas situaes (idade jovem, pacientes com doenas
crnicas, idosos, imunocomprometidos) os sorovares S.Dublin e S.Choleraesuis
podem determinar no homem, um quadro septicmico, i.., mais grave do que o
causado por S.Typhi.
A
terceira
categoria
inclui
maioria
dos
sorovares
que
atingem
indiferentemente o homem e animais, designadas salmonelas zoonticas, as quais

so responsveis por quadro de gastrenterite (enterocolite) ou doenas de
transmisso alimentar. Sua distribuio mundial, sendo os alimentos os principais

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veculos de sua transmisso. So responsveis por significantes ndices de
morbidade e mortalidade, tanto nos pases emergentes como desenvolvidos,
determinando pequenos e grandes surtos envolvendo, principalmente, o consumo
de alimentos de origem animal como ovos, aves, carnes e produtos lcteos.
4. Caractersticas clnicas e patogenia
A dose infectante varia de 105 a 108 clulas, porm em pacientes
imunocomprometidos tm sido observadas doses 103 para alguns sorovares,
envolvidos em surtos de doenas de transmisso alimentar (DTA). A manifestao
clnica inclui quadros entricos agudos ou crnicos, alm de localizao
extraintestinal, como infeces septicmicas, osteomielite, artrite, hepatite, etc.
Os microrganismos penetram por via oral invadindo a mucosa intestinal, com
disseminao para a submucosa, resultando em enterocolite aguda. Normalmente o
quadro diarrico moderado, sem a presena de sangue, entretanto, em alguns
quadros clnicos, pode ocorrer perda de pequeno volume de fezes associado a
tenesmo e sangue.
Seu transporte, atravs do sistema reticulo endotelial, aliado a capacidade de
multiplicao no interior dos macrfagos, possibilitam sua manuteno e
disseminao no organismo. Indivduos subnutridos ou com deficincias do sistema
imune podem apresentar infeces de extrema gravidade, como por exemplo,
incidncia de bacteremia em pacientes aidticos, dos quais 20 a 60% relatam
infeco gastrintestinal prvia.
Sua virulncia multifatorial, incluindo mobilidade, habilidade de penetrar e
replicar nas clulas epiteliais, resistncia ao do complemento, produo de
entero, cito e endotoxina, sendo desconhecido o exato papel de cada um, para a
manifestao da doena. Em alguns sorovares a virulncia mediada por um
plasmdio, em uma regio do operon de 8Kb que contem os genes spvR ABCD, cuja
origem ainda encontra-se desconhecida. A relao entre a presena deste plasmdio
de virulncia e sorovar j se encontra bem estabelecida em S.Dublin, S.Gallinarum e
S.Choleraesuis.
Em pacientes imunodeprimidos a salmonelose pode ser assintomtica ou
ainda determinar diarria auto-limitada em 95% dos casos. As infeces clnicas

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humanas determinadas por Salmonella spp. apresentam quatro sndromes clnicas
distintas: gastrenterite, febre entrica, septicemia com ou sem infeces localizadas
e determinar o estado de portador assintomtico. Entre a totalidade de sorovares
S.Enteritidis e S.Typhimurium so os sorovares de maior prevalncia em casos de
septicemia e infeces localizadas.
4.1. Infeces gastrentricas:

O quadro clinico humano pode variar com fezes diarricas de caractersticas
aquosas semelhante diarria colrica a consistentes com sangue oculto ou visvel
e muco. O quadro diarrico regride usualmente de 3 a 4 dias. Pode ocorrer febre
(39C) em cerca de 50% dos casos e normalmente de curta durao (dois dias),
clicas abdominais leves a intensas quando ocorre invaso dos linfonodos
(linfadenite mesentrica), podem mimetizar apendicite. Desenvolvimento de
sndrome de clon irritado (SCI), que se caracteriza por diarria branda persistente
seguida de quadro agudo de gastrenterite. Em pacientes portadores de SCI, a
persistncia como portador assintomtico em 31% aps cinco anos. Em pacientes
hospitalizados, portadores de cncer, o quadro reincide ocasionando quadro de
pneumonia
semelhante
quele
ocasionado
por
Pneumocystis.
Salmonella
permanece presente nas fezes aps cessarem os sintomas, com uma mdia de
excreo durante o perodo de cinco semanas. O estgio de portador persiste por
at nove semanas em 90% dos adultos, sendo em crianas <5 anos inferior a sete
semanas. A freqncia deste estagio entre manipuladores de alimentos usualmente
reduzida (0,5%). Entre estes profissionais normas de educao e higiene no
manuseio de alimentos representam os principais aspectos para minimizar o risco de
transmisso alimentar.
4.2. Bacteremia
Febre entrica usualmente determinada por S.Typhi, S.Paratyphi A e C e
S.Sendai entretanto pode ser determinada por outros sorovares. Sua freqncia
mais elevada entre pacientes do sexo masculino, acometendo de 1 a 4% dos
pacientes imunodeprimidos (especialmente doenas do sistema reticoendotelial,
linfoma, leucemia, cncer, lpus sistmico e outras doenas vasculares. O risco de

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desenvolvimento de bacteremia entre pacientes com HIV de 20-100 vezes maior
do que na populao normal. Entre estes somente 20% dos pacientes apresentam
quadro posterior diarrico.
Usualmente a bacteremia apresenta elevada prevalncia em adultos, os
quais tem como histrico o uso prvio de drogas imunosupressoras. Entre estes
pacientes, a complicao subseqente usualmente a pneumonia, sendo entre
idosos a responsvel por elevados ndices de letalidade.
4.3. Infeces do Sistema Nervoso Central

As infeces incluem meningites, ventriculite, abcessos, empiema subdural. A
presena de diarria e outros sintomas gastrentericos apontada em 50% dos
casos. Embora a bacteremia seja comum em pacientes com AIDS, complicaes do
sistema nervos central raramente so apontadas. A maior prevalncia destas
infeces apontada entre pacientes de longo perodo de hospitalizao, drenagem
cirrgica, terapia antimicrobiana prolongada, especialmente em pacientes com HIV.
Os sorovares de maior prevalncia em bacteremia e nas infeces do sistema

nervoso central so S. Typhimuriume S.Enteritidis.
4.4. Infeces em outros stios

Variam de bacteriuria
ao comprometimento de juntas (mais comuns), de
ossos a tecidos e endocardites (<1 a 0.1%), e raramente no bao, genital e

complicaes pulmonares. Podem determinar infeces no trato urinrio, de maior
prevalncia em mulheres, das quais 50% com quadro diarrico. Os principais fatores
de risco so imunossupresso, cistite, pielonefrite, abscesso renal e manuseio de
repteis, entretanto a maioria dos casos ocorre em pacientes sem fatores de risco
conhecidos.
Alem das meningites, Salmonella reconhecida por ocasionar leses
endovasculares e osteomielite acometendo 7 a 10% dos pacientes >50 anos.
Em pacientes que apresentam como fatores de risco a diabetes, Infeco por
HIV e aterosclerose a presena de Salmonella observada em placas

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arterosclerticas, tendo em vista a propriedade de se multiplicar nos fagcitos
encontradas nestas placas.
Entre as complicaes da gastrenterite podem ser citadas a rabdomiolise
(injria do msculo esqueltico, usualmente acompanhado de falha renal;
osteomielite que pode levar ao aparecimento de aneurisma abdominal artico, com
elevado ndice de mortalidade, linfadenite mesentrica, apendicite, peritonite,
colecistite, pericardite, pleutopneumonia, insuficincia renal, tm sido amplamente
apontadas como infeces extra-intestinais determinadas por Salmonella.
Artrite reativa, artrite inflamatria e a sndrome de Reiter (ocorrncia
simultnea de uretrite e/ou cervicite, conjuntivite e artrite) tem sido reportadas por
uma ampla variedade de enteropatgenos incluindo Salmonella spp. A incidncia de
artrite reativa e sndrome de Reiter em surtos variam de 6-29% e 3%
respectivamente. Estudos recentes apontam entre pacientes com o marcador
imunogentico HLA-B27 apresentam elevada probabilidade de desenvolver a
sndrome de Reiter. A antibioticoterapia no efetiva para o tratamento de artrite
reativa.
5. Ecologia
Salmonella spp. eliminada em grande nmero nas fezes contaminando o

solo e gua. A sobrevida no meio ambiente pode ser muito longa, em particular na
matria orgnica. Pode permanecer vivel no material fecal por longo perodo
(anos), particularmente em fezes secas, podendo resistir mais de 28 meses nas
fezes de aves, 30 meses no estrume bovino, 280 dias no solo cultivado e 120 dias
na pastagem, sendo ainda encontrada em efluentes de gua de esgoto, como
resultado de contaminao fecal.
Os produtos agrcolas no processados, como hortalias
e frutas e os
alimentos de origem animal, como as carnes cruas, o leite e os ovos, so veculos

freqentes de salmonelas. A contaminao de origem fecal geralmente a fonte
para os produtos agrcolas, pela exposio gua contaminada; para o leite e ovos,
atravs da exposio direta e para a carne, usualmente durante as operaes de
abate.
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A contaminao cruzada o fator principal no caso de alimentos elaborados
como cereais, chocolate, doces, produtos a base de soja, produtos a base de ovos
pasteurizados, leite em p, ingredientes de raes para animais (farinha de peixe, de
penas e de ossos) e condimentos. A contaminao durante a elaborao ou preparo
pode resultar do contato direto com alimentos antes de sua coco ou proveniente
do meio ambiente, como no caso de superfcies contaminadas em cozinhas ou
indstrias.
Comparando com outros bastonetes Gram negativos, as salmonelas so
relativamente resistentes a vrios fatores ambientais. A adaptabilidade fisiolgica de
Salmonella demonstrada por sua habilidade para proliferar em valores de pH entre
7.0 e 7.5 (extremos 3.8 9.5), temperatura de 35 - 43oC (extremos 5 a 46oC) e uma
atividade hdrica (0,94), ocorrendo variaes entre sorovares e/ou cepas. Nos
produtos secos como o chocolate, o cacau em p, as especiarias ou o leite em p e
em produtos congelados como os sorvetes, o normal a sobrevivncia por perodos
de tempo prolongados. A bactria sensvel ao calor, no sobrevivendo
temperatura superior a 700C, no entanto a termorresistncia pode incrementar-se

com menor coeficiente de atividade de gua.
A inativao ocorre rapidamente em temperatura de pasteurizao em
alimentos com atividade de gua 0,95 a qual quando inferior, aumenta a
termorresistncia. Esta associao entre tolerncia ao sal e cido resistncia so
interdependentes. Certos processos como salmoura (9,0%) e defumao tm efeito
limitado na sobrevivncia das salmonelas, podendo sobreviver por vrios meses na
salmoura com cerca de 20% de sal, em produtos de elevado teor protico ou de
gordura. Como exemplos, podem ser citados a carne seca defumada e o pescado,
onde apresentam capacidade de sobrevivncia de vrias semanas a meses. A
relativa
resistncia
que
estes
microrganismos
apresentam
dessecao,
congelamento, salmoura e defumao, explica porque sobrevivem em muitas

classes de alimentos. O efeito bactericida das condies cidas varia de acordo com
a natureza do cido utilizado no processo, onde os cidos actico e propinico so
mais inibitrios que os cidos ltico e ctrico.
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6. Epidemiologia
A salmonelose uma das zoonoses mais complexas em sua epidemiologia e

controle, cujos PA
dres diferem de uma regio para outra. Isto se deve a diferenas nos hbitos
alimentares, prticas de elaborao de alimentos, criao de animais e padres de
higiene e saneamento. O controle das salmoneloses representa um desafio para
a Sade Pblica, tendo em vista a emergncia de novos sorovares e a
reemergncia de outros em determinadas reas, tanto nos pases emergentes
quanto naqueles industrializados.
O fator epidemiolgico mais destacado nos animais o estado de portador,
onde a falta de sintomas e as dificuldades tcnicas para sua deteco antes ou
durante a inspeo dos produtos de origem animal, os convertem em fonte contnua
de contaminao do meio ambiente e, portanto, dos alimentos.
Qualquer alimento que contm Salmonella um risco potencial para o

consumidor, cuja veiculao facilitada, na atualidade, pela mudana nos hbitos
alimentares da populao. A necessidade cada vez mais intensa de produo/oferta
de alimentos tem como fatores de risco, falhas quanto ao manuseio, transporte
muitas vezes em condies inadequadas, aliados ausncia de critrios bsicos de
higiene e saneamento, os quais favorecem a disseminao.
Considerando que sua principal via de transmisso est na cadeia alimentar,
sua presena em animais, criados com objetivo comercial, aponta este
microrganismo
como
mais
incidente
relevante
agente
etiolgico
de
enteroinfeces. Isto resulta em milhes de dlares em perdas para a indstria,

particularmente de bovinos, sunos e aves, tanto para o mercado interno quanto para
exportao, onde em alguns pases, a rigidez na inspeo representa uma
necessidade constante de qualidade.
Neste contexto, observa-se o aumento da resistncia de Salmonella spp. aos
antimicrobianos, com o percentual se elevando de 17% na dcada de 70 para 31%
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no final dos anos 80 incluindo-se a resistncia as fluoroquinolonas. Tal fato vem
culminando neste sculo com o aparecimento, em diferentes paises, de cepas
produtoras de diferentes tipos de beta-lactamases.
A incidncia de resistncia bacteriana a antimicrobianos representa risco
sade humana e animal. Este tema de extrema importncia tem sido objeto de
ateno de instituies como a Organizao Mundial da Sade (OMS), Escritrio
Internacional de Epizootias (OIE) e Codex Alimentarius, que vm discutindo
solues globais para o problema. Tal fato tem por base sua distribuio mundial,
sendo detectadas na maioria das espcies animais utilizados para consumo
humano, alm de animais silvestres e domsticos.
7. Diagnstico Laboratorial - Espcimes clnicos

7.1.
Sangue
O hemocultivo reveste um interesse especial no caso de febre tifide e
paratifide, porm no constantemente positivo. Os percentuais de positividade,
na ausncia de tratamento antibitico, so de 90% durante a primeira semana de

evoluo, 75% na segunda, 40% na terceira e 10% na quarta semana.
Os hemocultivos so negativos nas sndromes de infeces transmitidas por
alimentos (infeces intestinais), no entanto, estes sorovares podem causar
septicemia em indivduos imunocomprometidos.
Principais cuidados para coleta:
A coleta deve ser efetuada antes da utilizao de antimicrobianos
Efetuar a desinfeco da superfcie dos frascos de cultivo (lcool 70GL);
Fazer a assepsia do stio de puno (lcool 70GL ou soluo iodada) em

movimentos concntricos do centro para a extremidade;
Volume para cultura:

Adultos: 20mL, coletados com seringa, divididos em duas alquotas para inoculao
em dois frascos de meio de cultura (inocular 10mL/100mL de meio enriquecido
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acrescido de anticoagulante SPS (Polianetolsulfonato sdico).
Crianas: (inocular 1mL/10mL de meio enriquecido acrescido de SPS).
Peso
Volume total
<1,5 kg
1 mL
< 4 kg
1 mL
4-13 kg
3 mL
13-25 kg
10 mL
>25 kg
20 mL
Processamento das amostras de sangue
Todas as culturas de sangue (hemocultura) devem ser incubadas a 35C e

quando o hemocultivo por efetivado por metodologia tradicional, avaliado por
7 dias. Paralelamente pode ser empregada a semeadura direta em meio
seletivo-indicador.
A partir do crescimento de colnias com morfologia tpica, dever ser

efetuado o isolamento e subseqente identificao bioqumica e antignica.
Caso ocorra o recebimento de sangue coagulado, deve ser efetuada a

dilacerao do cogulo, atravs de uma pipeta e em seqncia a semeadura
em meio de enriquecimento e paralelamente em seletivo-indicador.
7.2.
Fezes:
Aspectos relevantes para a coleta
As fezes devem ser coletadas durante a fase aguda, antes de se iniciar o

tratamento com antibiticos.
Swabs retais devem ser priorizados para pacientes com infeco ativa, do
mesmo modo que para crianas ou indivduos com dificuldade de obteno
de amostras.
14

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A pesquisa de Salmonella Typhi nas fezes indicada a partir da segunda

semana da doena, assim como na convalescena e na deteco de
portadores.
Fezes de emisso espontnea:
Estas amostras devem ser colhidas em recipientes de boca larga, limpos e/ou
esterilizados, sendo mantidos sem processamento laboratorial por um perodo
mximo de duas horas aps a coleta. Como amostra deve ser tomada de 0,5
a 2g de fezes e quando da presena de sangue ou muco, esta deve ser a
poro selecionada para a avaliao laboratorial.
Evitar a coleta de espcimes fecais a partir das roupas do paciente, da

superfcie de camas e/ou cho.
Espcimes retais:
Umedecer o swab em soluo fisiolgica ou gua destilada esterilizada;
Introduzir o swab na ampola retal do paciente ou comunicante, comprimindo-o

em movimentos rotatrios suaves, por toda a extenso da mesma;
Processar no perodo at duas horas e caso no seja possvel, introduzir o

swab no meio de Cary & Blair. Neste meio de transporte o espcime pode ser
conservado por at cinco dias em refrigerao.
Coleta de fezes em papel filtro.
Utilizar tiras de papel de filtro, tipo xarope ou mata-borro, com dimenses de

2,5cm de largura por 6,0cm de comprimento.
As fezes diarricas ou emocionadas em gua, devem ser espalhadas em 2/3

de uma das superfcies do papel, com auxlio de um fragmento de madeira
(palito individual) ou de qualquer outro material semelhante, disponvel no
momento.
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As tiras de papel de filtro devem ser acondicionadas em invlucros plsticos

aps dessecar naturalmente. Sob estas condies, Salmonella se mantm
vivel por um perodo aproximado de 30 dias.
7.3. Transporte de espcimes clnicos
Utilizar na medida do possvel containeres plsticos ou de isopor para

manuteno por perodo curto (duas a quatro horas) de transporte das
amostras;
Envolver os isolados ou espcimes clnicos com plstico ou papel e

coloc-los em outra embalagem no interior da caixa de transporte;
Manter as fichas contendo as informaes clnicas e/ou epidemiolgicas

parte de espcimes clnicos;
Para reutilizao dos containeres para transporte, efetuar a desinfeco

utilizando soluo de hipoclorito de sdio (100 ppm);
Exame direto de fezes: avaliao presuntiva
Presena de picitos e clulas mononucleares indicam processo inflamatrio.
A presena de polimorfonucleares indicativa de sndrome disenteriforme ou

colite determinada por patgenos invasivos.
Clulas mononucleares podem predominar em pacientes com febre tifide.
Metodologia: Utilizar soluo de azul de metileno de Loeffler, misturado em igual

quantidade com as fezes, colocada sobre lmina, coberta por lamnula e
examinar com microscpio tico (objetiva de 10X e 40X).
8.
Diagnstico Laboratorial de Salmonella spp em Espcimes Fecais
A procura de uma metodologia ideal para o isolamento de Salmonella, tem

sido uma constante entre os pesquisadores o que tem trazido melhorias na
especificidade, sensibilidade, simplicidade e rapidez na execuo dos exames
bacteriolgicos.
16

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Numerosos mtodos e tcnicas assegurando o isolamento de diferentes
sorovares de Salmonella procedentes de distintas fontes, tm sido descritos. As
frmulas incluem componentes que no s inibem o crescimento de certas espcies
bacterianas, como tambm revelam uma variedade de caractersticas bioqumicas,
que so importantes na identificao preliminar do microrganismo.
Particularmente, em relao aos alimentos, o isolamento de Salmonella
representa um problema para os bacteriologistas em funo do baixo nmero de
microrganismos presentes, associados a uma microbiota mista e numerosa,
considerando-se ainda a complexa composio dos alimentos. Neste caso, as
tcnicas de cultura convencionais envolvem as etapas subseqentes de prenriquecimento, enriquecimento seletivo e isolamento em meios seletivos indicadores.
Por outro lado, no caso de espcimes clnicos, durante a fase aguda da
doena,
se
um
espcime
apropriadamente
obtido,
procedimentos
de
enriquecimento no so requeridos pelo fato de que um grande nmero de clulas

est presente. Contudo na forma crnica, ou mesmo, na identificao de portadores,
caldos de enriquecimento seletivo e agar seletivo so necessrios.
17

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Esquema de Isolamento
Fezes (suspenso)
Swab fecal/retal
Semeadura Direta
Agar EMB
Agar MacConkey
Enriquecimento
Caldo Selenito Cistina
Caldo Tetrationato Kauffmann
Caldo Rappaport Vassiliadis*
18/24h-37C
*18/24h-43C
18/24h-37C
Isolamento
Agar Hektoen
Agar SS
Agar XLD
Agar Sulfito Bismuto
Agar Verde Brilhante
Isolamento 5 -10 colnias:

Meio de Triagem
Caracterizao bioqumica
Identificao antignica
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8.1. Pr-Enriquecimento
Na etapa de pr-enriquecimento, o espcime enriquecido em um meio no
seletivo para restaurar salmonelas injuriadas, a uma condio fisiolgica estvel. A
gua peptonada a 1,0% tamponada e o caldo lactosado so comumente usados,
mas outros meios tais como triptona de soja e caldo nutriente, podem ser
empregados. O caldo lactosado pode eventualmente ser inconveniente como prenriquecimento quando utilizado em amostras que contm alta populao de
microrganismos fermentadores da lactose, pois a subsequente reduo do pH do
meio pode limitar a multiplicao de salmonelas, em particular das clulas injuriadas,
no entanto a literatura aponta que Salmonella se multiplica a uma faixa ampla de pH
(pH 3.8 9.5).
8.2. Enriquecimento Seletivo
O enriquecimento seletivo determina um aumento contnuo de Salmonella

restringindo a proliferao de outras bactrias. Devido utilizao dos diferentes
agentes inibitrios adicionados aos meios, estes tambm diferem em sua
seletividade e aplicao especfica.
Diferentes tipos de inibidores tm sido propostos para enriquecimento seletivo
de salmonelas, sendo a bile, o tetrationato, o selenito e corantes como o verde
brilhante e o verde malaquita, os mais usados. Estes inibidores so incorporados
aos meios, isolados ou em combinao.
Vrios meios de enriquecimento so conhecidos, destacando-se o Caldo
Tetrationato, o Caldo Tetrationato-Verde Brilhante segundo MULLER-KAUFFMANN,
Caldo Selenito, Caldo Gram-Negativo, Caldo Cloreto de Magnsio-Verde Malaquita
segundo RAPPAPORT, o Caldo Rappaport-Vassiliadis, e variaes destes.
Caldo Tetrationato
A seletividade do Caldo Tetrationato depende de sua capacidade de
restringir a multiplicao de coliformes. Sorovares de Salmonella (exceto
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Choleraesuis, Typhisuis, Gallinarum e Pullorum) possuem a enzima tetrationatoredutase e, consequentemente, so capazes de multiplicar-se no meio. Porm, o
desenvolvimento excessivo de Proteus, que tambm produz essa enzima, pode
interferir na deteco de Salmonella. Neste caso, o Caldo Tetrationato - Verde
Brilhante segundo Muller-Kauffmann contendo verde brilhante e bile, inibe a
multiplicao de Proteus.
Caldo Selenito
Um outro meio de enriquecimento, o Caldo Selenito vem sendo recomendado
para o enriquecimento de Salmonella em espcimes fecais, o qual vem sendo
recomendado para o isolamento de S. Typhi e S. Paratyphi B, sendo tambm til
para a deteco de outros sorovares de Salmonella, mesmo quando os
microrganismos esto presentes em pequeno nmero. A adio de cistina melhora a
qualidade do meio de cultura.
Caldo Rappaport.
O Caldo Cloreto de Magnsio-Verde Malaquita (Caldo Rappaport) vem
demonstrando eficcia na deteco de Salmonella. A associao do cloreto de
magnsio com um corante bacteriosttico (verde malaquita) veio a se constituir no
meio de enriquecimento para a maioria dos sorovares de Salmonella, com exceo
de S. Typhi. Posteriormente, uma modificao desse meio, resultante da diminuio
da concentrao de verde malaquita e adotando-se a temperatura de 430C para
incubao, o qual foi denominado meio de Rappaport-Vassiliadis, vem evidenciando
maior eficincia quando da utilizao de pequenas quantidades de inculo, bem
como por inibir totalmente os microrganismos competitivos.
Caldo Gram Negativo (Caldo GN)

Este meio utilizado para o enriquecimento seletivo de bactrias Gram
negativas, particularmente Shigella e Salmonella, a partir de todo tipo de
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espcimes clnicos. Devido concentrao relativamente baixa de desoxicolato,
menos inibidor de Escherichia coli e outros coliformes, enquanto a maior
concentrao de manitol em relao a glicose, limita o crescimento de Proteus e
favorece o de Salmonella e Shigella, que so fermentadores do manitol.
Tabela 4. Caractersticas dos meios de enriquecimento seletivos
MEIOS
Caldo
Selenito
SUBSTNCIAS
INIBIDORAS
Selenito de sdio
BACTRIAS INIBIDAS
BACTRIAS
FAVORECIDAS
Coliformes
Salmonella sorovares
Typhisuis, Choleraesuis,
Gallinarum, Pullorum
Salmonella spp.
Caldo GN
Citrato
Desoxicolato
de sdio
Gram positivos,
Coliformes, Proteus
Maioria das
Enterobacteriaceae
Caldo
Rappaport
Cloreto de
magnsio
Verde malaquita
Gram positivos, coliformes

S. Typhi Shigella
Salmonella spp.
Caldo
Tetrationato
Sais biliares
iodo
Gram positivos, coliformes

Salmonella sorovares
Pullorum, Gallinarum,
Typhisuis, Choleraesuis,
Typhi, Paratyphi
Salmonella spp.
8.3. Meios Seletivos-Indicadores
Alm dos meios de enriquecimento, tem-se a considerar no esquema de

diagnstico das enterobactrias os chamados meios indicadores seletivos, de
natureza slida, que desempenham uma funo primordial para o isolamento de
diferentes membros desta famlia.
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Todos estes meios contm um sistema diagnstico para permitir diferenciao
de Salmonella com outras bactrias, em funo das diferenas em suas
propriedades inibitrias e no aspecto macroscpico das colnias (Tabela 4).
Estes so comumente baseados na incapacidade da maioria das salmonelas para

fermentar a lactose e, em alguns casos, outros substratos, tais como a sacarose e a
salicina, bem como na capacidade de produo de sulfeto de hidrognio.
Vrios meios, tais como o Agar Verde Brilhante, Agar Entrico Hektoen,
Agar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), Agar Salmonella-Shigella (Agar SS) e
Agar Sulfito de Bismuto, so amplamente usados nos mtodos padres para o
isolamento de Salmonella.
O Agar SS, XLD e Hektoen so relacionados mdia seletividade e
incidncia de numerosas reaes falso-positivas, enquanto o Agar Sulfito de
Bismuto e Verde Brilhante, apresentam alta seletividade. O Agar Sulfito de Bismuto
altamente recomendado para o isolamento de S. Typhi, entretanto no deve ser
utilizado se foi estocado por perodo superior a 2436 horas. Da mesma forma, tem
demonstrado inibir outros sorovares de Salmonella a menos que seja refrigerado a
4oC por no mnimo 24 horas antes de uso.
Meios de baixa seletividade tais como Agar Eosina Azul de Metileno e Agar
MacConkey podero ser utilizados para o isolamento de Salmonella quando
provenientes de material clnico, onde espera-se um maior nmero.
Mais recentemente, novos meios de cultura que incorporam substncias
cromognicas em sua frmula esto disponveis no mercado, os quais por serem
seletivos e indicadores, permitem a diferenciao de Salmonella de outras bactrias,
pelo desenvolvimento de cores caractersticas para cada gnero/grupo bacteriano.
Dentre os meios cromognicos, destacam-se o Agar Rambach, Cromocen SC,
CHROMagar Salmonella.
O Agar Rambach vem sendo utilizado para identificar Salmonella em
gneros alimentcios e amostras clnicas, permitindo a diferenciao com membros
do gnero Proteus e outras bactrias entricas. Alm de um composto cromognico
que indica a presena de -galactosidase, prpria dos coliformes, possibilita a
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identificao de Salmonella por formar cido a partir do propilenoglicol que, em
combinao com um indicador de pH, resulta em uma colorao vermelho carmin,
caracterstica de suas colnias.
A presena de fragmentos de -galactosidase, caracterstica dos coliformes
evidenciada pelo desenvolvimento de colnias azul-esverdeadas ou violetaazuladas. Outras enterobactrias ou bactrias Gram-negativas, como por exemplo,
Proteus, Pseudomonas, Shigella, S. Typhi e S. Paratyphi A apresentam colnias
incolores.
CROMOCEN SC um meio para a deteco, isolamento, diferenciao e/ou
contagem de Salmonella (exceto S. Typhi) e coliformes totais de outras bactrias
Gram-negativas. O meio se baseia na combinao de uma reao cromognica para
detectar a atividade -galactosidase e uma reao bioqumica de degradao de
fontes de carbono que produzem uma diminuio do pH, com a conseqente
alterao de cor do indicador includo na formulao. Salmonella (exceto S. Typhi)
apresenta colnias com centro vermelho e bordas mais claras; coliformes (exceto
Klebsiella e Citrobacter), colnias verde-azuladas e Klebsiella e Citrobacter, colnias
violeta. As colnias incolores ou com pigmentao prpria, correspondem a outras
bactrias Gram-negativas.
CHROMagar Salmonella um meio seletivo e diferencial para o isolamento e
identificao presuntiva de Salmonella spp. de outras bactrias coliformes e no
coliformes em amostras fecais e de alimento. Colnias de Salmonella incluindo S.
Typhi se caracterizam pela cor prpura, outras espcies bacterianas so inibidas,
incolores ou azuis.
COLOREX Salmonella um meio cromognico para isolamento e
diferenciao de Salmonella spp., incluindo S. Typhi, diretamente de espcimes
clnicos e de alimento. Apresenta em sua composio uma mistura cromognica
especial que permite diferenciar Salmonella de outras bactrias, com base na cor e
morfologia das colnias alm de inibir bactrias Gram-positivas. Colnias de
Salmonella se apresentam na cor prpura, E. coli e outros coliformes, azulesverdeadas enquanto os microrganismos incapazes de hidrolizar o composto
cromognico so incolores.
23

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A recuperao de mltiplos sorovares de Salmonella em um espcime requer
dois ou mais meios seletivos-indicadores, e a escolha de um deles, ou do esquema
a ser utilizado para o isolamento e identificao deste microrganismo, , em grande
parte, uma questo de preferncia pessoal. Portanto, na escolha do meio, deve-se
levar em considerao o espcime a ser analisado e os sorovares usualmente
detectados.
Salienta-se ainda que, a interao dos meios de enriquecimento e seletivos
com a temperatura e tempo de incubao, seria fundamental para melhor isolamento
desta bactria.
A prevalncia de Salmonella no ambiente natural e nos setores de alimentos
tem realado a necessidade de procedimentos analticos mais rpidos e
equivalentes em sensibilidade e especificidade, aos mtodos culturais comuns, os
quais esto baseados em testes bioqumicos miniaturizados, novos meios de
cultura, mtodos baseados em anticorpos e hibridizao de DNA .
Apesar de vrios destes mtodos serem considerados rpidos, a maioria dos
sistemas de deteco de Salmonella, ainda recorre aos mtodos culturais para
ressuscitar clulas injuriadas e ampliar a populao de Salmonella em caldo de
cultura. Desta forma, pr-enriquecimento, enriquecimento seletivo ou procedimentos
ps-enriquecimento, ou alguma combinao destes, deve ser usada em conjunto
com mtodos rpidos.
24
Enterobactrias
Bactrias
favorecidas
Aspecto
das
colnias
No
fermentadoras
transparentes
Fermentadoras
Prpura / verde
metlico
sais biliares
cristal violeta
eosina / azul de
metileno
Inibidores
No
fermentadoras
Incolores/
discretamente
amarelas
Fermentadoras
Vermelhas
Enterobactrias
fermentao da
lactose
Detectado
Indicadores
fermentao da
lactose
sacarose
lactose
azul de
bromotimol
fucsina cida
citrato frrico
lactose
proteose peptona
extrato de
levedura
AGAR
HEKTOEN
Salmonella
Shigella
sais biliares
Salmonella
Shigella
xilose, lactose
sacarose, produo
de H2S,
descarboxilao
da lisina
desoxicolato
de sdio
vermelho de fenol
citrato frrico
xilose, lactose
sacarose
extrato de levedura
AGAR XLD
Salmonella
verde brilhante
fermentao
lactose
sacarose
vermelho de
fenol
proteose
peptona
extrato de
levedura
lactose
sacarose
AGAR VERDE
BRILHANTE
Fermentadoras:
Fermentadoras Fermentadoras
Fermentadoras
Amarelas
Ncleo rosado,
Salmo
No fermentadoras;
periferia clara
No
Amarelo
fermentadoras
esverdeadas
No
Cor do meio
Descarboxilao da
fermentadoras
Verdes a
Lisina
incolores
azuladas
No
Produo de Produo de H2S vermelho-prpura ao fermentadoras
H2S
Ponto negro no
redor das colnias
Produo de H2S
centro
Ponto negro no
Vermelhas
centro
Ponto negro no centro
Salmonella
Shigella
sais biliares
citrato de sdio
fermentao
fermentao
lactose, sacarose,
lactose
salicina
produo deH2S
H2S
vermelho neutro
citrato frrico
lactose
proteose
peptona
peptona
proteose peptona
vermelho neutro
lactose
sacarose
proteose peptona
AGAR SS
MAC CONKEY
eosina,
azul de metileno
Carboidratos
Fontes
de aminocido
AGAR EMB
Tabela 5. Caractersticas dos Meios Seletivos - Indicadores
25
S.Typhi - Colnias
negras circundadas
por halo de brilho
metlico.
Outros sorovares:
Colnias negras
ou verdes
Salmonella
particularmente
S. Typhi
verde brilhante
sulfito de bismuto
produo de H2S
reduo do bismuto
sulfito de bismuto
sulfato de ferro
glicose
proteose peptona
extrato de levedura
AGAR SULFITO DE
BISMUTO

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8.4. Identificao Bioqumica Presuntiva (Meios de Triagem)
Uma vez selecionadas colnias sugestivas nos meios indicadores seletivos,

estas sero transferidas para meios de triagem, tais como Agar Ferro-Acar Triplo
(Agar TSI), Agar Ferro - Dois Aucares (Kligler KIA), Agar Lisina Ferro (LIA), Meio
de Costa & Vernin (CV), Meio IAL (modificao do meio de Rugai e Arajo), Agar
Motilidade-Indol-Lisina (MILi), Agar Motilidade-Indol-Ornitina (MIO) e Meio EPM,
isolados ou em associao, os quais proporcionam uma caracterizao bioqumica
presuntiva, indicando quais testes bioqumicos complementares so necessrios
para identificar os microrganismos.
A associao do LIA, EPM, MIO ou Mili, com qualquer um dos demais meios
de triagem indica a probabilidade de Salmonella que, aps complementao
bioqumica ser submetida caracterizao antignica.
Agar Ferro - Acar Triplo (Agar TSI)

Este meio utilizado para diferenciar bacilos Gram negativos com base na
fermentao de carboidratos (glicose - lactose - sacarose), produo de sulfeto de
hidrognio e gs. Propicia a verificao da fermentao da glicose pela bactria,
conferindo colorao amarela na base. Caso haja fermentao da lactose e/ou
sacarose a colocao da parte superior do tubo ser o amarelo. Quando estes dois
24
acares no so fermentados o pice permanece com a cor original (mbar). A

produo de H2S indicada pela cor negra na base do tubo e a produo de gs,
indicada pela formao de bolhas ou rachaduras no meio. Microrganismos como
Proteus, Edwardsiella, Citrobacter e Salmonella podem apresentar o mesmo
aspecto.
Agar Ferro - Dois Acares (Kligler Iron Agar - KIA)
Este meio apresenta as mesmas indicaes, leitura e interpretao do Agar
TSI, porm com diferena na sua formulao por no conter sacarose.
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Agar Lisina-Ferro (LIA)

um outro meio para identificao presuntiva de enterobactrias. A
descarboxilao da lisina evidenciada pela colorao prpura (alcalina) da base
que neutraliza o cido (amarelo) formado pela fermentao da glicose. A
desaminao da lisina vista no pice (vermelho) e a produo de H2S (negro) na
base do tubo.
Meio de Costa e Vernin (CV)

Este meio uma modificao do meio de Monteverde (Mem. Inst. Oswaldo
Cruz, 53:105,1955) e composto de uma camada semi-slida e outra slida,
permitindo avaliar as seguintes reaes: indol (tampo de algodo), fermentao da
lactose e sacarose, produo de gs, hidrlise da uria, produo de H2S o qual se
forma na interface entre semi-slido e slido e motilidade. Permite identificao dos
principais gneros de enterobactrias indicando a presena de bactrias no
fermentadoras.
O ataque lactose ou sacarose, ou ambas, com a produo de cido, torna o
meio vermelho. A presena de um anel negro na base da camada slida indica
produo de H2S; a turvao difusa ou no da parte semi-slida, revela a motilidade;
a colorao azul, distribuda por todo o meio, identifica as bactrias produtoras de
urease. Alm desses testes, o aparecimento de uma colorao rsea ou vermelha
na tira de papel de filtro ou no algodo, caracteriza as bactrias produtoras de indol.
Meio IAL (INSTITUTO ADOLFO LUTZ)

Elaborado para triagem de enterobactrias; consiste de 9 provas em apenas
um tubo de ensaio: indol (tampa), fermentao da sacarose e glicose, produo de
gs, fenilalanina desaminase, hidrlise da uria, produo de H2S, descarboxilao
da lisina e motilidade.
Este meio identifica os principais gneros de enterobactrias, indicando
tambm a presena de bactrias no fermentadoras e Vibrio.
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Meio MIO (Motilidade- Indol Ornitina)

Meio MILi (Motilidade Indol- Lisina)
Estes meios evidenciam a descarboxilao dos aminocidos ornitina ou lisina,
a motilidade e a produo de indol. A motilidade interpretada pela difuso do
microorganismo na zona da inoculao; a descarboxilao da ornitina ou lisina
evidenciada pela colorao prpura (alcalina) da base, que neutraliza o cido
(amarelo), formado pela fermentao da glicose. A produo de indol observada
pela formao de um anel vermelho aps acrescentar 2-4 gotas do reativo de
Kovacs superfcie do meio.
Meio EPM
O meio EPM uma modificao do meio de Rugai e Arajo, evidenciando a
produo de gs por fermentao da glicose, produo de H2S, hidrlise da uria e
desaminao do triptofano.
Tabela 6. Caractersticas diferenciais entre Kligler Iron Agar, Triple Sugar Iron
Agar e Lysine Iron Agar
Kligler Iron Agar
Triple Sugar Iron

Agar
Lysine Iron Agar
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Fontes de
aminocidos
(desaminao)
peptona,
extrato de carne
extrato de levedura
peptona,
extrato de carne
extrato de levedura
peptona
extrato de levedura
lisina
no
no
lisina
Fermentao de
carboidratos
lactose (1%),
glicose (0.1%)
lactose (1%),
sacarose (1%)
glicose (0.1%)
glicose (0.1%)
Indicador de pH
vermelho de fenol
cido = amarelo
alcalino = vermelho
vermelho de fenol
cido = amarelo
alcalino = vermelho
bromocresol
purpura:
acido = amarelo
alcalino = prpura
tiossulfato de sdio
tiossulfato de sdio
tiossulfato de sdio
sulfato ferroso
sulfato ferroso
citrato de ferro
amoniacal
aminocidos
(descarboxilao)
Fonte para
produo
de H2S
Indicador da
produo
de H2S
Tabela 7. Caractersticas diferenciais de TSI , KIA, MIO, MILi e LIA
Fontes de
aminocidos
(desaminao)
aminocidos
(descarboxilao)
Fermentao de
carboidratos
Indicador
de pH
Fonte para produo

de H2S
Indicador de
produo
de H2S
TSI e KIA
MIO/MILi
LIA
peptona,
extrato de carne
extrato de levedura
peptona
extrato de levedura
ornitina ou lisina
peptona
extrato de levedura
lisina
no
ornitina ou lisina
lisina
lac+sac+glic = TSI
lac+ glic = KIA
glicose (0,1%)
glicose (0.1%)
vermelho de fenol
cido = amarelo
alcalino = vermelho
bromocresol
purpura:
acido = amarelo
alcalino = prpura
bromocresol
purpura:
acido = amarelo
alcalino = prpura
tiossulfato de sdio
no
tiossulfato de sdio
sulfato ferroso
no
citrato de ferro
amoniacal
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Tabela 8. Reaes nos meios de triagem TSI e KIA*

LEITURA
INTERPRETAO
DIAGNSTICO
PRESUNTIVO
Escherichia,Klebsiella
Enterobacter
Providencia,Serratia
Reao cida (amarelo) e

gs na profundidade.
Reao cida na
superfcie.
Ausncia de H2 S.
fermentao da glicose
fermentao da lactose e/ou
sacarose, inclusive com produo
de gs
Reao cida e gs na
profundidade.
Superfcie alcalina
(vermelha).
Presena de H2S
Reao cida sem gs na
profundidade,
superfcie alcalina.
ausncia de H2S.
fermentao da glicose sem

ataque lactose e/ou sacarose
Salmonella,
Edwardsiella
Citrobacter,Proteus
glicose fermentada apenas

formando cido;
nenhuma ao sobre a lactose e
sacarose
Shigella, Salmonella
Proteus
Providencia,Serratia,
Yersinia
Meio inteiramente cido

com gs.
Presena de H2S.
Meio inteiramente cido,
sem gs.
Ausncia de H2S
fermentao da glicose com gs;

fermentao da glicose e/ou
sacarose
fermentao da glicose com
formao de cido; fermentao da
lactose e/ou sacarose
Citrobacter,Proteus
Escherichia coli,
Serratia
* Para a interpretao do Agar Kligler (KIA) no considerar a fermentao sobre a sacarose
Tabela 9. Reaes no Agar Lisina-Ferro (LIA)
Microrganismos
Base
pice
Prpura
Prpura
Salmonella
Amarelo
Prpura avermelhado
Proteus,Morganella
Amarelo
Prpura avermelhado
Providencia
Amarelo
Prpura
Citrobacter
Amarelo/ Prpura
Prpura
Escherichia
Amarelo
Prpura
Shigella
Prpura
Prpura
Klebsiella
Exceo: S.Paratyphi A = base amarela/ pice prpura
H2S
+
+/+
-
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Tabela 10. Reaes observadas no meio de Costa e Vernin (CV)
Leitura
Microrganismos
Meio inalterado, com certa alcalinidade no pice (esverdeado

ou azulado). Presena de H2S; ausncia de gs; mvel ou
imvel
Reaes idnticas s acima citadas, sem H2S
Meio inalterado no prazo de 24h, podendo se acidificar em
perodos mais longos (fermentao lenta); ausncia de H2S;
mvel ou imvel
Meio inteiramente azul, com produo ou no de H2S;
dificuldade na leitura da mobilidade.
Camada slida azul e amarelo-azulado na poro semi-slida
(ataque sacarose). Presena de H2S.
Meio totalmente vermelho, por vezes podendo apresentar
reas amareladas (reduo); grande produo de gs.
Ausncia de H2S. Mobilidade presente ou no. pice do meio
slido com discreta alcalinidade na Tribo Klebsielleae.
Meio com discreta acidez na profundidade, ligeira alcalinizao
na superfcie. Presena de H2S, Mvel
Meio inalterado com 24 h; pequena alcalinizao na superfcie,
acentuando-se aps 48 h. Forte tonalidade azul-esverdeada
na superfcie. Ausncia ou discreto crescimento no meio semislido.
Salmonella,
Edwardsiella
Citrobacter
Certos sorovares de
Salmonella H2S
Shigella
Providencia
Proteus
Proteus vulgaris
Escherichia
Enterobacter
Klebsiella
Serratia (meio sem gs)
Citrobacter
Pseudomonas
Tabela 11. Interpretao do meio EPM
Base
Superfcie
Produo de gs
Formao de bolhas ou rachaduras no meio
Produo de H2S
Presena de pigmento negro de qualquer

intensidade
Hidrlise da uria
Colorao azul-esverdeada (fraca) na base indica

prova positiva
Desaminao do
triptofano
Reao positiva: verde escuro ou acastanhado

Reao negativa: superfcie inalterada
31

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8.5. Caracterizao Bioqumica Complementar

Embora
seja
possvel
uma
identificao
preliminar
com
base
nas
caractersticas das colnias e reaes bioqumicas, nos diferentes meios indicadores

seletivos e de triagem, a identificao de membros da famlia Enterobacteriaceae
requer a utilizao de provas bioqumicas complementares, Como provas
preliminares destacam-se a deteco da produo de citocromo-oxidase e a
reduo do nitrato para a incluso nesta famlia. Alm destas, dispe-se de uma
variedade de provas diferenciais complementares, destacando-se entre outras,
aquelas amplamente utilizadas em laboratrios clnicos, as quais permitem avaliar
as caractersticas metablicas, contribuindo para a identificao posterior dos
gneros/espcies.
Estas caractersticas so: fermentao de carboidratos, produo de indol,
reao de vermelho de metila, produo de acetil-metil-carbinol, utilizao de citrato,
produo de urease, descarboxilao de aminocidos, produo de sulfeto de
hidrognio e motilidade.
Citocromo-Oxidase
Os citocromos so hemoprotenas que contm ferro e funcionam como a
ltima ligao da cadeia respiratria aerbica, transferindo eletrons (hidrognio) ao
oxignio com a formao de gua. O sistema citocromo encontrado nos
organismos aerbios ou microaerbios e anaerbios facultativos. Portanto, o teste
da oxidase importante na identificao de microrganismos que no possuem a
enzima ou so anaerbios obrigatrios. O teste muito til em estudos preliminares
para
diferenciao
shigelloides)
de
de
outras
Enterobacteriaceae
enterobactrias
(negativas,
como,
por
exceto
Plesiomonas
exemplo,
Aeromonas,
Pseudomonas e Vibrio (positivas).

A prova de citocromo-oxidase utiliza certos reativos corantes, como o
dicloridrato de p-fenilenodiamina ou oxalato de p-amino-dimetil-anilina, que atuam
como aceptores artificiais de eletrons, substituindo o oxignio. Estes so incolores
no estado reduzido, mas na presena de citocromo-oxidase e oxignio atmosfrico
se oxidam formando um produto de tonalidade azul ou rosa, respectivamente.
32

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Reduo de Nitratos
A capacidade de um microrganismo reduzir nitrato a nitrito uma
caracterstica importante utilizada na identificao e diferenciao de espcies de
muitos grupos de microrganismos. Todas as enterobactrias, exceto certos biotipos
de Panthoea agglomerans e Erwinia, reduzem nitratos. Os microrganismos que
reduzem nitratos tm a capacidade de retirar oxignio destes para formar nitritos e
outros produtos de reduo.
A presena de nitritos no meio teste evidenciada pela cor vermelha aps
adio de dois reagentes: soluo A (cido sulfanlico - 0,8g, cido actico 30 mL,
gua destilada 75 mL) e soluo B (alfa-naftilamina 0,5g, cido actico 30 mL,
gua destilada - 75mL).
Pesquisa da produo de indol

Indol um dos produtos metablicos de degradao do aminocido triptofano.
As bactrias que possuem a enzima triptofanase so capazes de
hidrolisar e desaminar o triptofano com produo de indol, cido pirvico e amnia.

A prova est baseada na formao de um complexo de cor vermelha quando o indol
reage com o grupo aldedo do p-dimetilaminobenzaldedo (reativos de Kovacs ou
Ehrlich). Deve-se usar um meio rico em triptofano.
Prova do Vermelho de Metila

Esta prova uma anlise quantitativa de produo de cidos fortes (ltico,
actico, frmico) a partir da glicose atravs da via da fermentao cida mista. Visto
que muitas espcies de enterobactrias podem produzir quantidades suficientes de
cidos fortes detectveis pelo indicador vermelho de metila durante as fases iniciais
da incubao, somente os organismos que podem manter este pH baixo aps
incubao prolongada (48 a 72 h) superando o sistema estabilizador de pH do meio,
que podem ser chamados de vermelho de metila positivos.
33

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Prova de Voges-Proskauer
O cido pirvico, composto principal formado pela degradao fermentativa
da glicose, metabolizado atravs de vrias vias, de acordo com os sistemas
enzimticos que possuem as diferentes bactrias. Uma destas vias leva produo
de acetona (acetil-metil-carbinol), um subproduto inativo. Os organismos tais como
membros do grupo Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia produzem acetona como
principal subproduto do metabolismo da glicose e formam quantidades menores de
cidos mistos. Na presena de oxignio atmosfrico e de hidrxido de potssio a
40%, a acetona convertida em diacetila e o alfa-naftol atua como catalizador para
revelar um complexo de cor vermelha.
Reaes no VM e VP
Glicose
cido pirvico
Acetilmetilcarbinol
(Acetona)
Fermentao cida mista

pH < 4,4
VM +
Butilenoglicol Diacetila
KOH + Ar
Alfa-naftol
Complexo vermelho = VP +
Utilizao do Citrato
O citrato de sdio um sal de cido ctrico, um composto orgnico simples
que constitui um dos metablitos do ciclo dos cidos tricarboxlicos (Ciclo de Krebs).
Algumas bactrias podem obter energia por via diferente da fermentao de
carboidratos, utilizando citrato como nica fonte de carbono. A avaliao desta
caracterstica importante na identificao de muitos membros da famlia
Enterobacteriaceae. Qualquer meio utilizado para detectar utilizao de citrato
34

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pelas bactrias deve ser isento de protenas e carboidratos como fontes de carbono.
O meio contm citrato de sdio, um nion, como nica fonte de carbono e
fosfato de amnia como nica fonte de nitrognio. As bactrias capazes de utilizar o
citrato tambm so capazes de extrair nitrognio do sal de amnio, levando
alcalinizao do meio a partir da converso do NH3 em hidrxido de amnia
(NH4OH). Como indicador utilizado o azul de bromotimol, que na presena de
reao positiva ocorre a viragem para um pH acima de 7,6, sendo evidenciado pela
tonalidade azul do meio.
Hidrlise da Uria
A urease uma enzima presente em muitas espcies de microrganismos que
podem hidrolisar a uria. A uria uma diamina do cido carbnico; todas as
aminas so facilmente hidrolisadas com liberao de amnia e dixido de carbono.
A amnia reage em soluo para formar carbonato de amnio resultando na
alcalinizao e aumento do pH do meio.
So utilizados dois meios para a deteco de urease, o Caldo Uria de
Stuart e o Agar Uria de Christensen. O caldo de Stuart fortemente tamponado
com sais de fosfato a um pH 6,8. O organismo em estudo deve produzir
quantidades relativamente grandes de amnia para superar o sistema e elevar
suficientemente o pH do meio para produzir uma viragem do indicador (acima de
8,0), sendo seletivo para espcies de Proteus. O Agar Uria de Christensen
possui um sistema tampo muito mais fraco, permitindo detectar produes
menores de amnia sendo, portanto apropriado para a anlise de bactrias que
apresentam formao escassa de urease ativa.
Produo de sulfeto de hidrognio

Capacidade de certas espcies de bactrias para liberar enxofre na forma de
H2S a partir de aminocidos ou de outros compostos. A produo de H2S pode ser
detectada em um sistema analtico se as seguintes condies estiverem presentes:
liberao de sulfeto a partir da cistena ou do tiossulfato por ao enzimtica
bacteriana; acoplamento do sulfeto com o on hidrognio para formar
35

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H2S; deteco do H2S pelos sais de metais pesados tais como ferro, bismuto ou
chumbo, na forma de sulfeto de metal pesado, um precipitado negro.
H2S + metal pesado = sulfeto = precipitado negro
Descarboxilases
As descarboxilases representam um grupo de enzimas substrato-especficas,
capazes de atuar sobre a poro carboxla dos aminocidos, formando aminas de
reao alcalina. Lisina, Arginina e Ornitina so os trs aminocidos habitualmente
avaliados na identificao das enterobactrias e produzem as seguintes aminas
especficas:
Lisina
cadaverina
Ornitina
putrescina
Arginina
citrulina
Na converso de arginina para citrulina intervm uma desidrolase ao invs de

uma descarboxilase, visto que na primeira etapa, o NH2 retirado da arginina. Em
seqncia, a citrulina transformada em ornitina que em seguida sofre
descarboxilao para formar putrescina.
Durante os perodos iniciais da incubao o meio torna-se amarelo devido
fermentao da pequena quantidade de glicose presente. Se o aminocido for
descarboxilado, formam-se aminas alcalinas e o meio volta cor prpura original.
Fenilalanina desaminase
A fenilalanina um aminocido que por desaminao forma um cetocido, o
cido fenilpirvico. Entre os membros da famlia Enterobacteriaceae, somente
espcies dos gneros Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima
desaminase, necessria para esta converso.
A prova da fenilalanina baseia-se na deteco de cido fenilpirvico no meio,
aps o crescimento do organismo teste. A prova positiva quando aparece uma cor
verde, visvel aps a adio de uma soluo de cloreto frrico a 10%.
Fenilalanina
desaminao__
cido fenil pirvico
Cloreto frrico 10%
36

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Fermentao de carboidratos
Fermentao um processo metablico de oxidao - reduo que tem lugar
em um ambiente anaerbico, no qual um substrato orgnico serve como aceptor de
hidrognio (eltron) em lugar do oxignio. Nos sistemas de provas bacteriolgicas
este processo detectado por observao da mudana de cor dos indicadores de
pH quando os produtos cidos so formados. A fermentao dos carboidratos
produz cido, ou cido e gs. A produo de gs (dixido de carbono e hidrognio)
se detecta pelo acmulo de gs em um tubo de vidro (tubo de Duhram) invertido no
meio.
37

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Tabela 12. Comportamento de Salmonella spp. nas diferentes provas

bioqumicas
Meios
TSI/KIA
LIA
Reaes
Reao cida e gs na profundidade. Superfcie alcalina (vermelha).
Presena de H2S
Reao cida sem gs na profundidade, superfcie alcalina. Discreta produo
ou ausncia de H2S.
Base e pice cor prpura, presena de H2S
(Exceo: S.Paratyphi A = base amarela/ pice prpura)
CV
Meio inalterado, com certa alcalinidade no pice (esverdeado ou azulado).

Presena de H2S na interfase slida/semi-slida; ausncia de gs;
mvel ou imvel
REAO NEGATIVA no h viragem do pH
URIA
Lisina
Descarboxilase
Positivo:Reao alcalina (cor prpura do meio) e amarelo no meio controle.

(exceo S. Paratyphi)
LDC
Ornitina
Descarboxilase
Positivo: Reao alcalina (cor prpura do meio) e amarelo no meio controle

(exceo S. Gallinarum ODC negativo)
ODC
Colorao vermelha do meio aps adio do reagente
Vermelho de
Metila (VM)
Meio sem alterao aps adio dos reagentes
VogesProskauer (VP)
Fenilalanina
desaminase
(FD)
Meio inalterado aps colocao do reagente

Positivo: Reao alcalina cor azul do meio
Utilizao do
Citrato
Meio SIM
Indol
H2S
Motilidade
Negativo anel amarelo aps colocao do reagente Kovacs

Presena de pigmento negro de qualquer intensidade ou somente na picada
(cepas imveis)
Crescimento ao longo da picada (imvel) ou turvao do meio (mvel)
Fermentao de aucares
Glicose
Lactose
Manitol
Sacarose
Positivo (reao cida) com/sem gs no tubo de Durhan

Negativo
Positivo
Negativo
38

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Tabela 13. Percentuais de positividade/negatividade nas provas bioqumicas

para Salmonella spp.
Reao
Positiva ou negativa
+
Percentual de isolamento
de Salmonella que
apresentam esta reao2
100
TSI glicose (gs)
91,93
TSI lactose
99,24
TSI sacarose
99,5
TSI H2S
91,6
LIA
98
SIM (H2S)
97
SIM (indol)
98,9
SIM (motilidade)
97
Hidrlise da uria
99
Lisina descarboxilase
94,65
Ornitina descarboxilase
97
Reao de Voges-Proskauer
100
Reao do Indol
98,9
Provas1
TSI glicose (cido)
1.
Ewing, W.H. & Ball, M.M. The biochemical reactions of members of the genus
Salmonella.NationalCommunicable Disease Center. Atlanta, Georgia,USA.1966.
2.
Estes percentuais indicam que nem todas as cepas apresentam as reaes marcadas como + ou
_.
3.
Salmonella Typhi anaerognica
4.
Salmonella enterica susp.arizonae d reaes + ou para lactose, porm sempre -galactosidase
positiva; Salmonella enterica susp.salamae d reao para lactose e para -galactosidase.
39

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Tabela 14. Caractersiticas bioqumicas diferenciais de Salmonella spp. ,
Edwardsiella
tarda
Proteus
mirabilis
Proteus
vulgarsis
Salmonella
spp.
Salmonella
Typhi
+/-
+/-
+
+/+/-/+
+/+
-
+
+/-/+
-/+
+
+
-
+
-/+
-/+
+
+
-
+
-
-/+
+
+/-
+
+
-
+
+
+
-
+
+
-
-/+
+/-
+
+
+
+
+
-
+/-
+
-/+
-/+
-/+
+/+/-/+
+/+
+
+/-
+/-/+
+
+/-
+
+
-
-/+
+
+
+
-/+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+/-
+/-
+/-
+/-
+/-
Cirobacter
diversus
Citrobacter
freundii
Glicose (gs)
Fermentao
Manitol
Lactose
Sacarose
Dulcitol
ONPG
Vermelho Metila
Voges
Proskauer
Indol
Citrato
Simmons
Acetato
Malonato
H2S
Mobilidade
Hidrlise da
uria
Fenilalanina
desaminase
Lisina
descarboxilase
Arginina
dehidrolase
Ornitina
descarboxilase
KCN
Citrobacter
amalonaticus
Proteus spp., Citrobacter spp. e Edwardsiella tarda.
+ : positivo; - : negativo
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Tabela 15. Diferenciao bioqumica entre S. enterica subsp. enterica,

Citrobacter sp. e Edwardsiella tarda
S. enterica
sub. enterica
Citrobacter
freundii
Citrobacter
diversus
Edwardsiell
a tarda
Descarboxilao:
Lisina
Ornitina
[-]
[+]
Indol
Citrato Simmons
H2S
+/
[+]
Urease
+/-
+/-
KCN
ONPG
+ : positivo; - : negativo; [+] : 76 a 89% positivo; [-] : 11 a 25% negativo.
Tabela 16. Diferenciao entre Citrobacter freundii e Salmonella arizonae e

S.diarizonae
LDC
Glicerol
Malonato
ODC
Gelatinase
Citrobacter freundii
Salmonella arizonae
+ (lenta)
Salmonella diarizonae
+ (lenta)
LDC: lisina descarboxilase; ODC: ornitina descarboxilase
Tabela 17. Diferenciao entre Salmonella Paratyphi C e Salmonella

Choleraesuis
Dulcitol
+
H2S
+
Mucato
-
S.Choleraesuis
S.Choleraesuis var. Kunzendorf
S. Paratyphi C (Vi ou Vi )
S. Paratyphi C essencialmente adaptada ao homem

S.Choleraesuis possui caracterstica ubiquitria
41

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9. Aspectos Gerais sobre os Antgenos das Enterobactrias
Antgenos comuns: Todas as espcies da famlia Enterobacteriaceae apresentam

um antgeno comum, tambm designado de antgeno de Kunin. Sua presena
usualmente no avaliada tendo em vista que no representa um critrio relevante
para a diferenciao entre gneros ou espcies.
Antgeno de parede ou antgeno O (Ohne): composio lipopolissacaridica

(hexosamina (3.5 a 4.5%), complexo fosfolipdico (20 a 30%), polissacardeos (60%).
termoestvel (1hora a 100oC), no sendo destrudo pelo lcool etlico a 50oGL. A
aglutinao das clulas bacterianas pelo antissoro especfico, apresenta como
caractersticas ser lenta, formar grnulos finos no dissociveis pela agitao, tendo
em vista que a reao ocorre pela interrelao entre a parede celular das clulas
bacterianas.
Este antgeno composto de trs partes:
Poro lipdica, a qual responsvel pela toxicidade e caractersticas

pirognicas;
Poro basal ou core;
Polissacardeo, caracterstico da especificidade somtica das formas lisas (S).

constitudo de cadeias repetitivas, cujo arranjo espacial confere natureza
definida. Esta, aliada ao tipo de ligao, determinam a especificidade dos
antgenos O .
Cepas em fase lisa (S-Smooth) apresentam colnias com superfcies

homogneas, brilhantes, bordos regulares indicativos de antgeno O completo. A
ocorrncia de mutao que afete sua poro basal, ou na sntese de sua cadeia
resulta na perda da especificidade do antgeno. So designadas rugosas R
(Rough) de superfcie e bordos irregulares. So autoaglutinveis em soluo salina,
facilmente fagocitveis e sensveis a ao do complemento e como conseqncia,
perdem sua capacidade patognica.
42

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Antgeno flagelar ou antgeno H (Hauch): Esto presentes nas enterobactrias

mveis, sua composio protica, designada flagelina. As diferenas antignicas
surgem devido a variaes na estrutura primria (contendo aminocidos) das
diferentes molculas de flagelina.
A estrutura flagelar possui como uma caracterstica importante de
termolabilidade podendo ser destrudos a 100oC, bem como aps ao lenta do
lcool 50oGL, sendo resistentes soluo de formol a 0,5%.
Anticorpos flagelares se fixam aos flagelos, cuja aglutinao apresenta como
caracterstica, a formao de grumos espessos que se dissociam rapidamente
atravs de agitao. Esta ocorre em tempo mais rpido do que aglutinao
somtica, devido ao nmero existente na clula se apresentar mais elevado, quando
comparado aglutinao somtica (entre as clulas bacterianas).
O arranjo espacial e caractersticas intrnsecas ao gnero possibilitam a
produo de dois tipos de flagelos distintos. Em uma populao bacteriana de uma
cepa de Salmonella spp, que produza dois tipos distintos de flagelo, a freqncia de
variao de clulas que apresentam um dos tipos ou fases na ordem de 104.
Antgeno de superfcie ou envoltrio Vi (Flix & Pitt): apresenta sua

localizao espacial externa, a qual impede a deteco do antgeno somtico.
Usualmente encontra-se presente em cepas de S.Typhi isoladas de pacientes,
podendo tambm ser detectados em S.Paratyphi C e S. Dublin. So termolbeis
podendo ser destrudos atravs do aquecimento da suspenso a 100oC por 10-15
minutos. Apresenta como relevncia, a possibilidade de uso como ferramenta
epidemiolgica atravs de um conjunto de preparados fgicos.
43

LRNCEB/LABENT

Caracterizao Antignica de Salmonella:
A
sorotipificao
complementar
na
constitui
identificao
uma
de
importante
ferramenta
epidemiolgica
Salmonella
permitindo
determinar
prevalncia/emergncia ou apontar tendncias de um sorovar em distintas zonas

geogrficas, bem como identificar surtos, conhecer as fontes de infeco e vias de
transmisso.
A identificao dos sorovares definida pelo esquema de Kauffmann & White,
(Poppof & LeMinor, 2001) e envolve a identificao dos antgenos somticos e
flagelares.
Esquema de Kauffmann-White
Baseado nos componentes antignicos somticos O e flagelares H foi
estabelecido o esquema denominado Kauffmann-White, este contm informaes
quanto as espcies, sub-espcies e apresenta listadas as frmulas antignicas de
todos os sorovares. Sua editorao efetuada pelo Centro Colaborador para
referncia e pesquisa em Salmonella da Organizao Mundial de Sade (Instituto
Pasteur-Paris), sendo revisado anualmente quanto caracterizao de novos
soravares e a editorao completa desta listagem efetivada a cada cinco anos.
Apresenta-se representado sob a forma de tabela, contendo o conjunto das
caractersticas antignicas, compreende na 1a coluna a estrutura somtica, cujos
sorovares que apresentam tais caractersticas so identificados por letras
maisculas. Ex. grupo A(O:2), grupo B(O:4); grupo C1(O:6,7), grupo C2 (O:6,8,20),
grupo D (O:9), grupo E1 (O:3,10), grupo E2 (O:3,15), grupo E4 (O:1,3,19),etc.
A 2a e 3a colunas apresentam suas estruturas flagelares, indicadas por letras
minsculas (fase 1) e a fase 2, representada por nmeros arbicos, alm de letras
minsculas..
Exemplos: S.Typhimurium: 1,4,[5],12: i : 1,2
S.Enteritidis:
1,9,12: g,m: -
S.Typhi:
1,9,12,[Vi]: d: -
S. Agona:
1,4,12:f,g,s:-
S. Paratyphi:
1, 2,12:a:-
S.Saintpaul:
1, 4, 5, 12:e,h:1,2
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Em relao aos antgenos O e H, alguns aspectos que devem ser

considerados:
Antgeno O:
Fatores que identificam o grupo antignico por exemplo, o fator O:4, o fator O:9.
Aqueles que tem pouco ou nenhum valor discriminatrio estando associados a

outros fatores, por exemplo O:12, associado com O:2, O:4 e O:9 como ocorre
com S. Paratyphi A (O:1,2,12), S.Typhimurium (O:1,4,5,12) e S. Enteritidis
(O:1,9,12).
Aqueles que surgem como conseqncia de uma modificao da estrutura dos

antgenos, por exemplo: O:5 resultante de uma reao de acetilao presente
nas unidades repetidas do polissacardeo responsvel pela especificidade
O:4,12; O:1 resulta da insero de uma cadeia de galactose no polissacardeo
como o caso do sorovar S. Typhimurium O:1,4,5,12.
Antgenos H
Alguns sorovares de Salmonella dispem de apenas uma fase flagelar,
i.e. monofsicas como S. Enteritidis (9,12:g,m:-), S.Typhi (9,12 [VI]:d:-), porm a
grande maioria dos sorogrupos apresentam duas fases flagelares ou seja so cepas
difsicas como por exemplo S.Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2) e S.Hadar (6,8:z10:e,n,x)
que expressam a fase 1 (antgenos i ou z10) e fase 2 (antgenos 1,2 e e,n,x
respectivamente), contudo tambm so reconhecidas cepas desprovidas de flagelos
(imveis).
Identificao antignica
Alguns
sorovares
apresentam
caractersticas
bioqumicas,
as
quais
associadas ao quadro clnico do paciente possibilitam orientar com maior facilidade

sua caracterizao, entretanto faz-se obrigatria em todos os casos a caracterizao
antignica empregando os antissoros especficos.
45

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Ex. Salmonella Typhi: ausncia de gs em glicose, produo reduzida de H2S, lisina

descarboxilase positiva, ornitina descarboxilase e uso do citrato de Simmons como
fonte nica de carbono, negativas.
Salmonella Paratyphi A: produo de gs em glicose, ornitina descarboxilase
positiva, produo de H2S, lisina descarboxilase e uso do citrato de Simmons como
fonte nica de carbono negativas.
Principais cuidados:
Nunca utilizar crescimento a partir de meios de cultura que contenham

carboidratos;
Semear preferentemente a cepa em tubo 13x100 contendo Agar Nutriente

inclinado, envasado com bizel longo (4 a 5 cm);
Preparar uma suspenso utilizando soluo salina (0.85% NaCl);
A suspenso dever apresentar turbidez correspondente ao tubo 3 da escala

de MacFarland. Usualmente o volume de soluo salina adicionada ao tubo
contendo Agar nutriente inclinado aproximadamente 1,5mL.
Realizar o teste somente a partir de cultivos recentes (mximo de 18-24h de

crescimento a 37C);
Para efetuar avaliao em amostras com antgeno de envoltrio, efetuar a

retirada, atravs do aquecimento da suspenso em banho-maria (100C por
15 minutos);
Observar se a suspenso apresenta-se homognea antes de realizar o teste,

certificando-se que esteja em sua forma lisa.
Execuo do teste de soroaglutinao rpida:
Semear a cepa isolada em agar nutriente inclinado;
Incubar a 37o C por 18-24 horas;
Preparar suspenso adicionando soluo salina (0,85%);
Homogeneizar a suspenso;
46

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Em uma lmina de vidro adicionar uma gota (10l) de antissoro polivalente e

uma gota da suspenso bacteriana, homogeneizando com o auxlio de uma
ala utilizada dentro dos procedimentos de rotina;
Impelir movimentos rotatrios e observar at o perodo de um minuto em

caixa de Huddleson a presena de aglutinao (grumos finos);
Em seqncia repetir o procedimento empregando antissoros somticos

especficos (grumos finos - somticos);
Para a caracterizao dos antgenos flagelares (grumos espessos)

necessrio que o laboratrio possua antissoros que permitam fazer a
diferenciao entre sorovares com estrutura comum. Ex. Hg,m; Hg,p; Hg,q;
Hg,m,s; Hf,g,s; Hg,z51; Hg,z62 , etc
Particularmente no diagnstico de Salmonella Typhi, empregar inicialmente o

antissoro Vi para caracterizao do antgeno de envoltrio. Caso a reao
seja positiva, aquecer a suspenso em banho-maria (15 minutos a 100oC)
reavaliando com antissoro Vi. Caso no seja observada aglutinao,
confirmar a estrutura somtica atravs do antissoro OD;
A identificao conclusiva de S.Typhi dever ser efetivada atravs da

caracterizao do antgeno flagelar Hd;
Variaes que afetam a Tipagem Antignica em Salmonella spp.:

Variao Capsular (V-W): fenotpica
Impede aglutinao somtica;
Utilizada em avaliao epidemiolgica (lisotipia em Salmonella Typhi);
Quando as cepas apresentarem aglutinao com antissoro Vi, a suspenso

bacteriana deve ser submetida ao aquecimento em banho-maria (100oC-15
minutos) e em seqncia reavaliadas para confirmar a eliminao desta
estrutura.
Variao da estrutura somtica (S-R): genotpica
Apresenta como caracterstica fundamental ser de natureza genotpica.
Determina alteraes quanto morfologia colonial.
47

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Usualmente apresenta ausncia de estabilidade em soluo salina.
Sua ocorrncia impede o diagnstico antignico tendo em vista que determina

reaes inespecficas ou cruzadas.
Variao flagelar (OH-O): fenotpica
Permitem a formao de grandes flocos que se dissolvem com agitao;
Importantes na caracterizao conclusiva dos sorovares de Salmonella spp;
Apresentam natureza fenotpica. Quando da perda de uma de suas fases,

podem ser, na maioria das vezes, recuperados utilizando o meio de Craigie
(agar semi-slido -0,5%):
Semear a cepa
Adicionar
antissoro de fase
conhecida
Repicar cepa e
caracterizar fase
desconhecida
Variaes mediadas por fagos:
Presena de fagos temperados: grupos A, B, D de Salmonella spp.
Converso lisognica: frao 12 (Salmonella spp.)
10. Controle de Qualidade de Meios de Cultura, Reagentes e Equipamentos.

1.
Principais aspectos quanto manuteno:
Somente devem ser recebidos meios de cultura, adquiridos atravs de

compra, cujo prazo de validade seja seis meses da data de recebimento;
Apertar todas as tampas dos frascos;
Observar prazo mximo de estocagem;
Registrar quantitativo em estoque, recepo e sada;
Nenhum meio de cultura pode ser utilizado aps a data de vencimento: a

revalidao somente pode ser efetuada pelo fabricante.
48

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2. Estocagem dos meios de cultura
Proteger da luz solar e calor;
Manter em rea com ventilao.
3. Preparo dos meios de cultura:
Seguir obrigatoriamente as instrues do fabricante;
Preparar a quantidade mnima, suficiente para o uso;
Observar o tempo de validade de meios preparados, estocados sob

condies adequadas.
Durao mxima de meios de cultura
Meio de cultura
4C
4C
Embalagem plstica
Agar sangue
Agar EMB
Agar MacConkey
15 dias
15 dias
15 dias
50 dias
60 dias
60 dias
Agar SS
Agar XLD
Agar Hektoen
Agar Verde Brilhante
6 dias
5 dias
5 dias
2 dias
10 dias
10 dias
10 dias
4 dias
Agar Sulfito Bismuto
24 horas
24 horas
Tubos com agar
Meio de Cultura
Bucha de algodo
Bucha de
4C
algodo - TA
N semanas
N semanas
Fechamento
hermtico-plstico4C - N meses
Agar LIA
1-2
1-2
3-6
Agar TSI
1-2
2-4
3-6
Agar KIA
3-4
2-4
2-4
Agar Mller Hinton
1-2
2-4
3-6
Agar Nutriente
3-4
1-2
2-4
Agar Uria
3-4
1-2
2-4
Agar Citrato
3-4
1-2
2-4
Agar Fenilalanina
3-4
1-2
2-4
49

LRNCEB/LABENT
Controle de Qualidade de Meios de Cultura
Controlar o pH de cada partida de meio;
Efetuar teste de esterilidade;
Realizar teste de desempenho: inocular uma ala do crescimento da cepa

padro e incubar nas condies de rotina at obter turvao correspondente
ao tubo 0.5 da escala de MacFarland.
Anotar e registrar resultados em cada lote, como o exemplo abaixo.
Meio de cultura:______________________________________
Cepas para controle: positivo:__________________________
negativo:__________________________
Data
Data - Lote
Controle Fabricao
Data
Vencimento
pH
Desempenho Esterilidade Responsvel

+/+/-
50

LRNCEB/LABENT
11. ANEXOS
Meios de Cultura e Reagentes

Os meios de cultura, reagentes e solues no discriminadas abaixo foram
preparados segundo as especificaes ditadas pelos fabricantes.
10.1. gua Peptonada 1% Tamponada (pH 7,2)

Peptona ........................................................................... 10,0 g
Cloreto de sdio ................. ............................................ 5,0 g
Fosfato de sdio bibsico ................................................ 3,5 g
Fosfato de potssio monobsico ....................................
1,5g
gua destilada ............................................................ 1000 ml.

Suspender e dissolver os componentes em gua destilada, esterilizar em autoclave
a 121C por 15minutos.
pH final: 7,2 0,2 a 2C
10.2. Meio de Costa & Vernin (CV)
A - Base Semi-Slido
Peptona............................................................................20,0 g
Cloreto de Sdio............................................................. 5g
Soluo de Azul de Timol ............................................. 3 mL
Indicador de Andrade .................................................... 10 mL
Agar ............................................................................... 5g
gua destilada ............................................................... 1000 mL
Adicionar todos os elementos gua e aquecer at dissolver completamente o Agar.

Ajustar o pH a 7,3 ou 7,4. Distribuir quantidades exatas do meio em bales e
esterilizar a 121C por 15 minutos.
51

LRNCEB/LABENT

B - Base Slida
Peptona (Bacto) .......................................................... 1g
Triptona ou tripticase ................................................... 5 g
Tiossulfato de Sdio .................................................... 0,2 g
Sulfato ferroso Amoniacal............................................ 0,2 g
Soluo de Azul de Timol ........................................... 3 mL
Indicador de Andrade ................................................... 10 mL
Agar .............................................................................. 20 g
gua destilada .............................................................. 1000 mL
Adicionar os componentes em gua destilada e aquecer em banho maria

fervente at completa dissoluo. Ajustar o pH a 7,3 ou 7,4. Distribuir quantidades
exatas do meio em bales e esterilizar a 121C por 15 minutos.
Preparo e distribuio final do meio

Fundir as bases e resfriar entre50 a 60C, aproxima damente. Adicionar a
cada um deles, na proporo de 5mL por cada 100 mL de meio, a soluo de uria e
acares. Distribuir inicialmente o agar semi-slido em volume de 2,5mL em tubos
esterilizados de 13mm de dimetro com altura varivel. Deixar solidificar
temperatura ambiente cerca de 30 minutos, e acrescentar em seguida, volume
idntico por tubo, da base slida. Inclinar os tubos de modo a deixar uma base de 2
a 3cm de altura, aproximadamente.
Soluo de Azul de Timol
Azul de Timol .............................................................. 1,6 g
NaOH 0,1N .................................................................. 34,4 mL
gua destilada .............................................................. 65,6 mL
Indicador de Andrade
Fucsina cida ............................................................... 0,5 g
Hidrxido de Sdio N ................................................. 16 mL
gua destilada ............................................................ 100 mL
Dissolver a fucsina em gua destilada e adicionar o hidrxido.
52

LRNCEB/LABENT

Soluo de Uria e Acares
Uria ........................................................................... 20 g
Lactose ....................................................................... 30 g
Sacarose ...................................................................... 30 g
gua destilada ............................................................. 100 mL
Dissolver a mistura por aquecimento brando em banho maria e esterilizar por

filtrao. Conservar em geladeira.
A semeadura executada com auxlio de agulha, introduzindo-a at o tero
superior da metade da camada semi-slida e sob a forma de estrias, na superfcie
da parte slida. Neste meio, poder ser pesquisada a produo de indol, fixando no
tampo, aps a inoculao, uma tira de papel de filtro, embebida no reativo para
pesquisa de indol ou ento impregnando o prprio algodo (hidrfilo) na sua base
interna, com esse reativo. Incubar a 37C durante 2 4 a 48 horas.
10.3. Meio para Fermentao de Carboidratos

Peptona ............................................................... 10 g
Extrato de Carne ................................................. 3 g
Cloreto de Sdio ................................................. 5 g
Indicador de Andrade ........................................... 10mL
gua destilada ...................................................... 1000mL
Ajustar pH a 7,1 7,2. Distribuir em volumes de3 a 5mL e esterilizara121C

por 15 minutos.
Os carboidratos glicose, lactose, sacarose e manitol so incorporados ao
meio, na concentrao final de 1,0%, os demais carboidratos so geralmente
utilizados a 0,5%.
A glicose, manitol, dulcitol, salicina, adonitol e inositol, podem ser includos ao
meio bsico e esterilizados a 121C por 15 minutos, pois resistem a este processo.
No entanto a lactose, sacarose, celobiose, arabinose, ramnose e xilose devem ser
esterilizados a parte, principalmente sob a forma de solues a 10 ou
53

LRNCEB/LABENT

20%, recorrendo-se para tanto, aos processos fsicos, como a filtrao ou o
aquecimento a 121C por 10 minutos, seguido de resf riamento brusco.
A presena de cido no meio, em decorrncia do metabolismo da bactria,
revelada pela viragem do indicador de Andrade para uma colorao avermelhada.
12. Bibliografia
Balfour, A.E., Lewis, R. &Ahmed, S. 1999. Convalescent excretion of Salmonella

Enteritidis in infants. J.Infect.34:133-138
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World Health Organization. 2003. Manual for the Laboratory Identification and
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LRNCEB/LABENT
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LRNCEB/LABENT
60
Interpretao dos testes de confirmao no ensaio de Salmonella pelo mtodo ISO 6579 (2007)

LRNCEB/LABENT
61

LRNCEB/LABENT
Esquema de anlise de Salmonella pelo Mtodo BAM/FDA (2006)
62

LRNCEB/LABENT
63

LRNCEB/LABENT
Identificao Bioqumica Presuntiva LIA x TSI

BAM/FDA (2006)
Reao no LIA
Reao no TSI
Aes
pice e base alcalinos com/sem

H2S (tpica)
pice alcalino, base cida,

com/sem H2S (tpica)
continuar
pice e base alcalinos com/sem

H2S (tpica)
pice e base cidos,

com/sem H2S (atpica)
continuar
Base cida, pice alcalino

pice alcalino, base cida,

com/sem H2S (tpica)
continuar
Base cida, pice alcalino

Base e pice cidos (atpica) descartar
64

LRNCEB/LABENT
Mtodo MLG/FSIS (2004)
65

LRNCEB/LABENT
66
descartar
Continuar
**
Base cida sem H 2S

pice alcalino
Base cida sem H 2S
pice alcalino
Base cida com/sem H 2S
pice alcalino
Base alcalina ou cida
sem H 2S, pice alcalino
Base e pice alcalinos
com H 2S
Base cida, pice

alcalino sem H 2 S
Base cida sem H 2S

pice alcalino
Base cida com H 2S,

pice alcalino
Base e pice cidos sem

H 2S
Base e pice cidos com

H 2S
S. Typhisuis eventualmente encontrada em sunos nos Estados Unidos

** S. enterica subsp. arizonae ou diarizonae
Sem alterao de cor no meio
continuar

sem H 2S
67
descartar
descartar
Continuar
*
Continuar
continuar
continuar
Base cida, pice

alcalino sem H 2 S

com H 2S
Base cida, pice

alcalino com H 2 S
Aes

com H 2S
Poli
H
Base cida/pice
alcalino com H 2 S
Poli
O
LIA
TSI
Mtodo MLG/FSIS (2004)

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Gnero Salmonella:

Laboratrio de Referncia Nacional de Clera e outras Enteroinfeces

Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ

Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

2. Caractersticas Gerais .....................................................................

4. Caractersticas clnicas e patogenia ................................................

7. Diagnstico Laboratorial Coleta de Espcimes Clnicos .......... ...

7.2. Fezes .............................................................................................

7.3. Transporte de espcimes clnicos .................................................

. Diagnstico Laboratorial de Salmonella spp. de Espcimes Fecais.......

Esquema de Isolamento - Fluxograma................................................

8.1. Pr-Enriquecimento .......................................................................

8.2. Enriquecimento Seletivo ................................................................

8.3. Meios Seletivos-Indicadores ..........................................................

7.4. Identificao Bioqumica Presuntiva (Meios de Triagem) ..............

8.5.Caracterizao Bioqumica Complementar .....................................

9. Aspectos Gerais sobre os Antgenos das Enterobactrias ..............

10. Controle de Qualidade de Meios de Cultura, Reagentes

11. Anexos .............................................................................................

12. Bibliografia .......................................................................................

Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ

Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ

Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

Em geral, acredita-se que Salmonella e E.coli descendam de um ancestral

Salmonella enterica subsp salamae -

Salmonella enterica subsp arizonae -

Salmonella enterica subsp diarizonae - 320

Salmonella entrica subsp. indica

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Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

bastonetes Gram negativos, geralmente mveis, formam cido e, na maioria das

manitol, manose, ramnose, sorbitol, trealose, xilose e dulcitol. A maioria das

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Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

Sangue frio e meio ambiente

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Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

Tabela 3. Diferenciao bioqumica entre S. Typhi, S. Paratyphi A e sorovares de S.enterica

+ : positivo; -: negativo; (+) 75% positivo aps 48 horas; *: fraco.

S.Pullorum e S.Gallinarum (aves), responsveis pelo paratifo dos animais.

indiferentemente o homem e animais, designadas salmonelas zoonticas, as quais

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Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

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Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

4.1. Infeces gastrentricas:

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Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

4.3. Infeces do Sistema Nervoso Central

Os sorovares de maior prevalncia em bacteremia e nas infeces do sistema

4.4. Infeces em outros stios

ao comprometimento de juntas (mais comuns), de

ossos a tecidos e endocardites (<1 a 0.1%), e raramente no bao, genital e

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Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

Salmonella spp. eliminada em grande nmero nas fezes contaminando o

alimentos de origem animal, como as carnes cruas, o leite e os ovos, so veculos

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Gnero Salmonella: Caractersticas Epidemiolgicas e Laboratoriais

temperatura superior a 700C, no entanto a termorresistncia pode incrementar-se

congelamento, salmoura e defumao, explica porque sobrevivem em muitas

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