Tesis Diterpenos

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
Departamento de Farmacologa
TESIS DOCTORAL
Estudio de la actividad neuroprotectora de diterpenos aislados del
gnero sideritis
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Elena M Gonzlez Burgos
Directoras
Mara Pilar Gmez-Serranillos Cuadrado
Mara Emilia Carretero Accame
Madrid, 2013
Elena M Gonzlez Burgos, 2012

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGA
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD
NEUROPROTECTORA DE DITERPENOS
AISLADOS DEL GNERO SIDERITIS
TESIS DOCTORAL
ELENA M GONZLEZ BURGOS

Madrid, 2012

DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGA
Dra. Da. M Pilar Gmez-Serranillos Cuadrado, Profesora Titular, y Dra.

Da.
Emilia
Carretero
Accame,
Profesora
Emrita
Complutense,
del
Departamento de Farmacologa de la Facultad de Farmacia de la Universidad

Complutense de Madrid.
CERTIFICAN:
Que la presente Tesis Doctoral presentada por Da. Elena M Gonzlez

Burgos, titulada "Estudio de la actividad neuroprotectora de diterpenos aislados del
gnero
Sideritis",
ha
sido
realizada
bajo
nuestra
inmediata
direccin
asesoramiento.
Concluido
el
trabajo
experimental
bibliogrfico,
autorizamos
su
presentacin para que sea juzgada por el Tribunal correspondiente.
Madrid, Junio 2012
M Pilar Gmez-Serranillos Cuadrado
M Emilia Carretero Accame
Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Farmacologa de la

Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid gracias a una beca
predoctoral de Formacin de Profesorado Universitario (FPU) del Ministerio de
Ciencia e Innovacin (AP200700678).
Durante el desarrollo de la Tesis Doctoral se han realizado dos estancias breves

financiadas por el Ministerio de Ciencia e Innovacin que se incluyen en el programa
formativo de la beca FPU. Una de ellas ha sido realizada en el Kings College de Londres
(Reino Unido) dentro del grupo de investigacin de Barrera Hematoenceflica y la otra en el
Centro de Neurociencia y Biologa Celular de Coimbra (Portugal) en el grupo de Mecanismos
Moleculares de la Enfermedad.
A mi familia
AGRADECIMIENTOS
A lo largo de estos aos he recibido el apoyo de muchas personas que de alguna

manera han hecho que este trabajo fuera posible. A todas ellas quiero mostrar mi ms sincero
agradecimiento.
En especial quiero expresar mi gratitud a mis directoras de Tesis, las Dras. M. Pilar
Gmez-Serranillos y M. Emilia Carretero Accame, por haberme brindado la oportunidad de
trabajar con ellas y por haberme ofrecido todo su apoyo, nimo y profesionalidad da a da
para culminar este trabajo de Tesis Doctoral.
A mis "compis" de Mdulo, en especial a Sara, Mara, Ana, Tarek I, Tarek II, Eva,
Pascuale... y al resto de mis amigos y compaeros Doctorandos y ya Doctores (Natalia,
Patricia, M Angeles, Adil, Irene, Pilar, Karim, Laura, Miguel, Ral...) por vuestra
desinteresada ayuda y sobre todo por los grandes momentos vividos, dentro y fuera del
Departamento, que han hecho posible que el difcil camino del Doctorando sea ms agradable
y divertido.
A todo el profesorado del Departamento de Farmacologa de la Facultad de Farmacia,
en especial al Grupo de Investigacin Farmacologa de Productos Naturales. A Jess,
Nieves, Azucena y Rosa por la alegra aportada entre experimento y experimento y la
escritura de este trabajo.
Thank you very much to Professor N. Joan Abbott for giving me the opportunity to
spend four wonderful months in your "Blood-Brain Barrier" Research Group at King's College
London. Thank you for your support and help along the time. Special thanks
to my lab mates Siti, Charlie, Ana, Diana, Mehmet, Christopher, Laura,
David, Larisa, Kunashi and Svetlana for making my brief stay so
comfortable and enjoyable.
Agradeo Dr Paula I. Moreira por me permitir realizar parte da
minha tese doutoral com o seu grupo de investigao " Mecanismos
Moleculares da Doena" no Centro de Neurocincia e Biologia
Celular da Universidade de Coimbra (Portugal). Agradeo
tambm aos meus companheiros Portugueses Ana Duarte,
Ana Plcido, Cristina, Emanuel, Renato, Snia, Susana,
Raquel, Daniela, ngelo e Paula a ajuda
sempre disponvel.
A mis amigos de siempre... Ana, Laura, Amaia, Sandra, Marina, Patxi, Isa, Ana, Juan,
Chema, Pablo, Irene, Abdul, Tamara, Fito, Elmo, Oku, Abel, Irene, Mada, Carlos, Soraya...
por haberme entendido siempre cuando mi tiempo lo ocupaban "mis celulitas" o las pginas de
esta Tesis.
El mayor agradecimiento va dirigido a mis padres, mi hermana, mis abuelas, Edu y
dems familia por su apoyo incondicional, confianza y cario demostrado en todo momento.
Sois la mejor familia!!!
Por ltimo, mi ms sincero agradecimiento a Jaime, por su ayuda, comprensin y
paciencia da a da. Gracias por estar ah en los buenos y malos momentos y por entender mis
viajes europeos para que este proyecto se haya hecho realidad. Esta Tesis tambin es tuya!!!
Gracias a todos
NDICE
ABREVIATURAS
RESUMEN / SUMMARY
11
JUSTIFICACIN Y OBJETIVOS
15
REVISIN BIBLIOGRFICA
21
1. Gnero Sideritis
23
1.1. Clasificacin botnica
23
1.2. Distribucin geogrfica
23
1.3. Descripcin botnica
24
1.4. Nombres comunes
25
1.5. Usos en medicina tradicional
26
1.6. Composicin qumica
27
1.6.1. Terpenos
1.6.1.1. Diterpenos
1.6.1.1.1. Diterpenos en Sideritis
2. Sistema Nervioso Central (SNC)
2.1. Interaccin entre astrocitos y neuronas
3. Estrs oxidativo
3.1. Especies reactivas de oxgeno (ROS)
28
28
30
35
35
37
37
3.1.1. Radical hidroxilo
38
3.1.2. Radical anin superxido
40
3.1.3. Perxido de hidrgeno
41
3.1.4. ROS y mitocondria
41
3.2. Sistemas antioxidantes
43
3.2.1. Enzimas antioxidantes
44
3.2.1.1. Enzima catalasa (CAT)
44
3.2.1.2. Enzima superxido dismutasa (SOD)
45
3.2.1.3. Enzima glutation peroxidasa (GPx)
46
3.2.1.4. Enzima glutation reductasa (GR)
49
3.2.1.5. Enzima hemooxigenasa-1 (HO-1)
50
3.2.2. Antioxidantes de bajo peso molecular. Sistema no enzimtico

3.2.2.1. Glutation
3.2.3. Nrf2 - ARE
4. Estrs oxidativo y enfermedades neurodegenerativas
51
51
53
54
4.1. El estrs oxidativo en la Enfermedad de Alzheimer (EA)
56
4.2. El estrs oxidativo en la Enfermedad de Parkinson (EP)
58
4.3. El estrs oxidativo en la Esclerosis lateral amiotrfica (ELA)
59
4.4. El estrs oxidativo en la Enfermedad de Huntington (EH)
60
5. La barrera hematoenceflica (BHE)
61
5.1. Antecedentes
61
5.2. Tipos de barreras en el SNC
62
5.3. La BHE
64
5.3.1. Propiedades de la BHE
64
5.3.2. Complejos de unin intercelulares: uniones estrechas y uniones adherentes
66
5.3.2.1. Uniones estrechas
66
5.3.2.2. Uniones adherentes
70
5.3.3. Rutas de transporte a travs de la BHE
71
5.3.3.1. Transporte pasivo
71
5.3.3.1.1. Paracelular
72
5.3.3.1.2. Transcelular
72
5.3.3.2. Transporte mediado por protenas
74
5.3.3.2.1. Transporte de entrada
74
5.3.3.2.2. Transporte de eflujo o de salida
75
5.3.3.3. Endocitosis
78
5.3.3.3.1. Endocitosis mediada por receptores
78
5.3.3.3.2. Endocitosis mediada por adsorcin
78
5.3.4. Estrategias para la administracin de frmacos en el cerebro
MATERIAL Y MTODOS
1. Materiales
79
81
83
1.1. Equipo instrumental
83
1.2. Productos qumicos y enzimticos
85
1.3. Material
85
1.3.1. Compuestos en estudio: Diterpenos
85
1.3.2. Lneas celulares
86
1.3.2.1. Lneas celulares utilizadas en los estudios de estrs oxidativo y disfuncin

mitocondrial
86
1.3.2.2. Lneas celulares utilizadas en estudios de paso a travs de BHE
86
2. Mtodos
2.1. Cultivos celulares
88
88
2.1.1. Mantenimiento de los cultivos
88
2.1.2. Subcultivos celulares
90
2.1.3. Congelacin celular o criopreservacin celular
90
2.1.4. Descongelacin celular
91
2.1.5. Recuento celular
91
2.2. Mtodos para el estudio de estrs oxidativo y disfuncin mitocondrial
92
2.2.1. Tratamiento de las clulas
92
2.2.2. Ensayos de citotoxicidad
92
2.2.2.1. Mtodo de reduccin de MTT
92
2.2.2.2. Evaluacin del dao celular por liberacin de LDH
94
2.2.2.3. Estudio de la morfologa celular
95
2.2.3. Evaluacin de la actividad antioxidante total
95
2.2.3.1. Medida de la generacin intracelular de radicales libres. Tcnica de

diclorofluorescena (DCFH-DA)
95
2.2.3.2. Ensayo ORAC (Capacidad de absorcin de radicales de oxgeno)
96
2.2.4. Determinacin de la concentracin de protenas
98
2.2.5. Determinacin de la peroxidacin lipdica
98
2.2.6. Determinacin de los niveles GSH y de GSSG
101
2.2.7. Preparacin de extractos celulares totales, citoplasmticos y nucleares
104
2.2.8. Determinacin de la actividad de enzimas antioxidantes
106
2.2.8.1. Actividad catalasa (CAT)
106
2.2.8.2. Actividad superxido dismutasa (SOD)
107
2.2.8.3. Actividad glutation reductasa (GR)
108
2.2.8.4. Actividad glutation peroxidasa (GPx)
110
2.2.8.5. Actividad hemooxigenasa-1 (HO-1)
111
2.2.9. Determinacin de la expresin de protenas mediante Western blot
112
2.2.10. Determinacin del potencial de membrana mitocondrial ( m)
115
2.2.11. Determinacin de los niveles de calcio citoslico
116
2.2.12. Determinacin de los niveles de calcio mitocondrial
117
2.2.13. Determinacin de los niveles de ATP
118
2.2.14. Determinacin de la actividad caspasa-3
121
2.3. Mtodos para el estudio de paso a travs de BHE
122
2.3.1. Estudios in silico

2.3.1.1. Estimacin de descriptores moleculares
122
122
2.3.1.2. Modelo computacional: software pCEL-x para anlisis de permeabilidad 123

2.3.2. Estudios in vitro
123
123
2.3.2.2. Estudios de cintica de captacin
124
2.3.2.3. Efecto del transportador de eflujo gp-P en la captacin
125
2.3.2.4. Estudios de permeabilidad
125
2.3.2.5. Anlisis de HPLC. Identificacin y cuantificacin de los diterpenos.
128
2.4. Anlisis estadstico
RESULTADOS
131
133
1. Estudio de la actividad neuroprotectora de diterpenos aislados de Sideritis spp. en un

modelo celular de estrs oxidativo inducido por H2O2
1.1. Resultados sobre la lnea celular PC12
135
135
1.1.1.Citotoxicidad celular
135
1.1.2. Efecto protector frente a la toxicidad inducida por H2O2
136
1.1.3. Efecto sobre la produccin de ROS
140
1.1.4. Efecto sobre la peroxidacin lipdica
142
1.1.5. Efecto sobre los niveles de GSH y GSSG
143
1.1.6. Capacidad "scavenger" de los diterpenos
145
1.1.7. Efecto sobre el sistema antioxidante enzimtico
147
1.1.8. Efecto sobre la va Nrf2
154
1.1.9. Efecto sobre los marcadores bioqumicos de la funcin mitocondrial
156
1.1.9.1. Efecto sobre el potencial de membrana mitocondrial
156
1.1.9.2. Efecto sobre los niveles de calcio
157
1.1.9.2.1. Niveles de calcio citoslico
157
1.1.9.2.2. Niveles de calcio mitocondrial
159
1.1.9.3. Efecto sobre los niveles de ATP
161
1.1.9.4. Efecto sobre la actividad caspasa-3
162
1.2. Resultados sobre la lnea celular U373-MG
163
1.2.1.Citotoxicidad celular
163
164
169
171
172
174
181
183
183
184
184
186
188
189
2. Barrera Hematoenceflica
190
2.1. Estudios in silico
190
2.2. Estudios in vitro
195
2.2.1. Estudios de viabilidad
195
2.2.2. Estudios de captacin
196
2.2.3. Efecto del transportador de eflujo, gp-P, sobre la captacin
199
2.2.4. Estudios de permeabilidad
200
DISCUSIN
203
CONCLUSIONES / CONCLUSIONS
223
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
229
ABREVIATURAS
Abreviaturas
AAPH 2,2-azobis (2-amidinopropano)

dihidrocloruro
DHEA dehidroepiandrosterona sulfato

DMEM Dulbeccos Modified Eagles Medium
Ac-DEVD-AMC [N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-AMP
(7-amino-4-metilcumarina)]
ADN cido desoxirribonucleico
DMSO dimetilsulfxido
DOXP/MEP 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato/ 2-Cmetil-D-eritritol-4-fosfato
ADNmt ADN mitocondrial

DTPA cido dietilentriaminopentaactico
AMC 7-amino-4-metilcumarina
DTT ditiotreitol
AMPc adenosn monofosfato cclico
EA Enfermedad de Alzheimer
ANT adenina nucletido translocasa
ANOVA anlisis de la varianza
ECACC Coleccin Europea de Cultivos

Celulares Animales
ARE elemento de respuesta antioxidante
ECL electroquimioluminiscencia
ARN cido ribonucleico
EDTA cido etilendiaminotetraactico
ATCC American Type Culture Collection
EGF factor de crecimiento epitelial
ATP adenosina trifosfato
EGTA cido bis (2-aminoetil) etilenoglicolN,N,N',N'-tetraactico
AUC rea bajo la curva

EH Enfermedad de Huntington
BCA cido bicinconnico
ELA esclerosis lateral amiotrfica
BCRP protenas de resistencia de cncer de
mama
EP Enfermedad de Parkinson
bFGF factor bsico de crecimiento de

fibroblastos
ERK quinasa regulada por seales

extracelulares
BHE barrera hematoenceflica
FAD flavn adenn dinucletido
BHE-LCR barrera hematolicuoral
FBS suero fetal bovino
BSA albmina de suero bovino
FCCP carbonilcianuro-p-trifluorometoxihidrazona
BSLCR barrera sangre-lquido cefalorraqudeo

FGF factor de crecimiento fibroblstico
BSO L-butionina-S,R-sulfoximina
FPP farnesilpirofosfato
CAT catalasa
G6PDH glucosa 6-fosfato-deshidrogenasa
CO monxido de carbono
GABA cido gamma-aminobutrico
COX-1 ciclooxigenasa-1
GDP guanosn difosfato
CSIC Consejo Superior de Investigaciones
Cientficas
GGPP 2E,6E,10E-geranilgeranilpirofosfato
DAMPP dimetilalil-pirofosfato
GLUT-1 transportador glucosa 1
DCF diclorofluorescena
GMP guanosina monofosfato
DCFH-DA 2,7-diclorofluorescena diacetato
gp-P glicoprotena-P
DE desviacin estndar
GPX glutation peroxidasa
Abreviaturas
GR glutation reductasa
MAO B monoamino oxidasa B
GSH glutation reducido
MDA malondialdehdo
GSSG glutation oxidado
-MEM -Minimum Essential Medium
GST glutation-S-transferasas
MPP+ metil-4-fenilpiridio
-GTP gamma-glutamil transpeptidasa
MRPs protenas relacionadas con la

multirresistencia a frmacos
GTP guanosin-5-trifosfato
H2O2 perxido de hidrgeno
MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)2,5-difeniltetrazol
HBSS Hank's Buffered Salt Solution
NADH nicotinamida adenina dinucletido
HEPES cido N-2-hidroxietilpiperacina-N'-2'etanesulfnico
NADPH nicotinamida adenina dinucletido

fosfato
4-HNE 4-hidroxinonenal
NEM N-etilmaleimida
HO-1 hemooxigenasa-1
NF-B factor nuclear kappa B
HOCl cido hipocloroso
NGF factor de crecimiento nervioso
HPLC cromatografa lquida de alta eficacia
NMDA N-Metil-D-Aspartato
HS suero de caballo
NO xido ntrico
HSP-32 protena de choque trmico 32
NOS-2 xido ntrico sintasa-2
Htt protena huntingtina
Nrf2 factor nuclear eritroide-2
IL-1 interleucina 1
O oxgeno atmico
IL-6 interleucina 6
iNOS xido ntrico sintasa inducible
O2 radical superxido
INSERM Instituto Nacional de la Salud y de la

Investigacin Mdica
O3 ozono
IPP pirofosfato de isopentenilo

IR ndice redox
JAK Janus quinasas
O2 oxgeno singlete
OATP polipptidos transportadores de aniones

orgnicos
OCTP polipptidos transportadores de
cationes orgnicos
OH radical hidroxilo
JAM molculas de adhesin de la unin

6-OHDA 6-hidroxidopamina
JNK protena quinasa del N-terminal de c-Jun
8-OHdG 8-hidroxi-2-deoxiguanosina
LCR lquido cefalorraqudeo
8OHG 8-hidroxiguanosina
LDH enzima lactato deshidrogenasa
MAGUKs protenas guanilato quinasa asociadas
a membrana
MAI molculas de adhesin intercelular
MAO A monoamino oxidasa A
ONOO peroxinitrito
OPT fluorforo o-ptaldehido
ORAC Capacidad de absorcin de radicales de
oxgeno
Abreviaturas
p38 MAPK protenas quinasas activadas por

mitgeno p38
SMILES Sistema Lineal Simplificado para

Entrada Molecular
PBS tampn fosfato salino
SNC sistema nervioso central
PECAM1 molculas de adhesin celular

endotelial plaquetaria-1
SNP sistema nervioso perifrico

SOD superxido dismutasa
PGE2 prostaglandina E2
TEER resistencia elctrica transendotelial
PI3K fosfatidilinositol 3-quinasa
TEMED N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina
PKC protena quinasa C
TGF factor de crecimiento trasformante
PMSF fluoruro de fenilmetanosulfonio
TMRM ster metlico de tetrametilrodamina
PTS sistemas de transporte para pptidos
pequeos
TNF- factor de necrosis tumoral alfa
PVDF polivinilpirrolidona
TPA 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol
RO radical alcoxilo
TPSA rea topolgica de la superficie polar
ROO radical peroxilo
UV ultravioleta
ROOH hidroperxidos orgnicos
VIH virus de la inmunodeficiencia humana
ROS especies reactivas de oxgeno
ZO zonula occludens
SDS dodecilsulfato sdico
OXPHOS sistema de fosforilacin oxidativa
RESUMEN / SUMMARY
Resumen/Summary
La excesiva produccin de especies reactivas de oxgeno (ROS) en el cerebro puede llevar

a una alteracin de la homeostasis xido-reduccin intracelular (denominada estrs oxidativo)
que trae consigo dao de las estructuras biolgicas y muerte celular. Consistentes evidencias
implican al estrs oxidativo en la fisiopatologa de varias enfermedades neurodegenerativas
incluidas la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de
Huntington y la Esclerosis Lateral Amiotrfica.
El objetivo de este trabajo es el de evaluar el potencial antioxidante de seis
diterpenos mayoritarios (andalusol, conchitriol, foliol, lagascatriol, linearol y sidol) aislados
de especies del gnero Sideritis en dos modelos celulares, PC12 (neuronal) y U373-MG
(astrocitoma), bajo condiciones de estrs oxidativo inducido por H2O2. El pretratamiento con
los diterpenos objeto de estudio (concentraciones 5 y 10 M, 24 h) protege a ambos tipos
celulares frente a los efectos dainos derivados del estrs oxidativo y causados por H2O2
(concentraciones de 0,1 mM para las clulas PC12 y de 1 mM para las clulas U373-MG, 30
min). Estos diterpenos aumentan la viabilidad celular, atenan los cambios morfolgicos,
inhiben la produccin de ROS y la peroxidacin lipdica, restablecen los cambios en los niveles
de GSH y GSSG y aumentan la actividad y la expresin proteica de las principales enzimas
antioxidantes. Adems, estos diterpenos protegen a la mitocondria de los cambios derivados
del estrs oxidativo; stos disminuyen las alteraciones en la homeostasis del calcio
(mitocondrial y citoslico), aumentan el potencial de membrana mitocondrial, atenan los
cambios en los niveles de ATP e inhiben la activacin de la caspasa-3. Los compuestos ms
activos son andalusol y linearol sobre la lnea celular PC12 y andalusol y lagascatriol sobre la
lnea celular U373-MG. Los resultados de este trabajo sugieren que el efecto protector de
estos diterpenos est mediado, al menos en parte, por la activacin de la expresin del factor
de transcripcin eritroide-2 nuclear (Nrf2).
Finalmente para completar el estudio se ha evaluado si estos diterpenos son capaces
de atravesar la barrera hematoenceflica (BHE) y ejercer as su accin protectora en el dao
oxidativo producido a nivel cerebral. Los ensayos in silico e in vitro realizados han permitido
demostrar que en estos compuestos la lipofilia es un factor determinante implicado en el paso
a travs de la BHE y que este paso se realiza por mecanismos de difusin pasiva va
transcelular. Este transporte no se ve influido por el transportador de salida glicoprotena-P.
13
14
Resumen/Summary
Excessive reactive oxygen species (ROS) production in the brain may disrupt
intracellular redox homeostasis (called oxidative stress) that can cause damage of biological
structures and lead to cell death. Evidence from other studies implicates oxidative stress in
the physiopathology of several neurodegenerative diseases including Alzheimer's disease,
Parkinson's disease, Huntington's disease and Amyotrophic Lateral Sclerosis.
The objective of this study is to evaluate the antioxidant potential of six major
diterpenes (andalusol, conchitriol, foliol, lagascatriol, linearol and sidol) isolated from
species of the genus Sideritis in two cellular models, PC12 (neuronal) and U373-MG
(astrocytoma) under oxidative stress conditions induced by H2O2. Pretreatments with
diterpenes (concentrations 5 and 10 M, 24 h) protect both cellular types from the harmful
effects of oxidative stress and caused by H2O2 (0.1 mM concentration for PC12 cells and 1 mM
concentration for U373-MG cells, 30 min). These diterpenes increase cell viability, attenuate
morphological changes, inhibit ROS production and lipid peroxidation, counteract GSH and
GSSG levels and increase activity and protein expression of the main antioxidant enzymes.
Moreover, these diterpenes protect mitochondria from oxidative stress-derived changes;
these decrease calcium homeostasis alterations (mitochondrial and cytosolic), increase
mitochondrial membrane potential, attenuate changes in ATP levels and inhibit caspase-3
activation. The most active compounds are andalusol and linearol on the PC12 cell line and
andalusol and lagascatriol on the U373-MG cell line. The results of this work suggest that the
protective effect of these diterpenes is mediated, at least in part, by inducing the expression
of the transcription factor nuclear erythroid-2 (Nrf2).
Finally, to complete the study it has been evaluated whether these diterpenes are
able to cross the blood-brain barrier (BBB) and thus to confer their protective action against
oxidative damage in brain. The in silico and in vitro studies conducted have demonstrated
that in these compounds lipophilicity is the determining factor involved in the passage of
these compounds across the BBB and that this pass is produced via transcellular passive
diffusion. This transport is not influenced by p-glycoprotein efflux pump.
JUSTIFICACIN Y OBJETIVOS
Justificacin y objetivos
Debido al aumento de la esperanza de vida y a la disminucin de la tasa de natalidad,

la proporcin de personas mayores de 60 aos est aumentando ms rpidamente que
cualquier otro rango de edad en casi todos los pases. Si bien el envejecimiento de la
poblacin puede considerarse un xito de las polticas de salud pblica y del desarrollo
socioeconmico, ello conlleva tambin el crecimiento progresivo de enfermedades asociadas
a la edad. As pues, si bien este fenmeno lo podemos considerar como una tendencia
positiva, habindose traducido el cambio demogrfico en un nmero y porcentaje creciente
de personas de ms de 60 aos (la poblacin mundial de 60 aos o ms es de 650 millones y se
calcula que en el 2050 alcanzar los 2000 millones), stos cambios deben ir acompaados de
retos sanitarios especiales para el s. XXI, entre ellos la prevencin y tratamiento de las
enfermedades crnicas asociadas a la edad (World Health Organization, 2009).
Algunas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la
enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrfica se
asocian al envejecimiento. La edad es el factor de riesgo ms importante en estas patologas,
existiendo un crecimiento exponencial de los casos diagnosticados entre los 65 y los 85 aos.
El aumento de la longevidad de la poblacin se manifiesta en un incremento progresivo de la
incidencia en muchas de estas patologas del Sistema Nervioso Central (SNC) que al presente
ritmo demogrfico, se estima que puede llegar a triplicarse en los prximos 20 aos e incluso
algunas de estas enfermedades pueden convertirse, para algunos autores, en "epidemia del
siglo XXI" (Zecca et al., 2004; Hung et al., 2010).
Actualmente, de los frmacos existentes para las diferentes categoras teraputicas,
slo el 5% se destinan a la farmacologa del SNC, y de ellos la mayora estn indicados para el
tratamiento de la depresin, la esquizofrenia y el insomnio (Taylor and Triggle, 2007;
Connolly Martin, 2012). Si comparamos con otras reas teraputicas, la probabilidad de
descubrimiento y desarrollo de frmacos con accin sobre el SNC es muy baja (7% respecto a
la media de un 15% para el resto de reas teraputicas). Adems el tiempo requerido para
que el uso de un frmaco neuroactivo sea autorizado es muy alto (12-16 aos para frmacos
dirigidos al tratamiento de enfermedades del SNC frente a 10-12 aos para frmacos
utilizados en patologas de cualquier otro rgano o sistema). En los estudios de fases de
frmacos, el ratio de xito para que un frmaco destinado al tratamiento de desrdenes del
SNC pueda pasar la primera, segunda y tercera fase es de 1, 2 y 15%, respectivamente,
mientras que para frmacos dirigidos al tratamiento del cncer y de patologas
cardiovasculares es de un 5, 10 y 30-40%, respectivamente (Philips and Mackintosh, 2007).
17
18
Las dificultades que se encuentran durante todo este proceso vienen explicadas en
gran medida por el desconocimiento de las causas del desarrollo de muchas de estas
enfermedades neurodegenerativas, derivado en gran medida por la complejidad del cerebro,
as como por la existencia de la barrera hematoenceflica (BHE), impermeable a un
importante nmero de compuestos activos, que dificulta an ms la teraputica (GilgunSherki et al., 2001; Abbott, 2010). A da de hoy, el aumento de la poblacin envejecida
sumado a la inexistencia de tratamientos etiolgicos para estas enfermedades degenerativas
del SNC (las acciones teraputicas para estas enfermedades son principalmente de tipo
sintomtico y paliativo), hacen que stas supongan para la comunidad cientfica uno de los
mayores "retos teraputicos" del S. XXI.
Numerosos trabajos de investigacin publicados en estos ltimos aos apuntan al
estrs oxidativo (alteracin del balance redox) como una causa y/o una consecuencia comn
en la patognesis de las enfermedades neurodegenerativas anteriormente citadas (Halliwell,
2006; Ehrnhoefer et al., 2011; Katsuno et al., 2012). Esta evidencia se manifiesta en la
presencia de ciertos marcadores de estrs oxidativo como la relacin GSH/GSSG, productos
de peroxidacin lipdica (niveles elevados de malondialdehdo y 4-hidroxinonenal), oxidacin
de protenas (carbonilos y 3-nitrotirosina) y oxidacin de ADN (8-OHdG), entre otros, que han
sido detectados en modelos in vitro e in vivo de enfermedades neurodegenerativas as como
en cerebros post mortem de pacientes que han sufrido alguna de las patologas degenerativas
del SNC mencionadas previamente (Valko et al., 2005; Avery, 2011).
El uso de antioxidantes exgenos se presenta como una de las estrategias teraputicas
ms prometedoras para disminuir o neutralizar el dao oxidativo ocasionado por las especies
reactivas de oxgeno (ROS) (Floyd, 1999). Los mecanismos de accin descritos que definen la
capacidad antioxidante de un compuesto son diversos: a) interaccin directa con especies
reactivas o actividad "scavenger" de radicales libres, va "transferencia de un solo electrn"
(SET) o va "transferencia de un tomo de hidrgeno" (HAT), b) quelacin de metales de
transicin (hierro, cobre) que pueden iniciar reacciones de oxidacin, c) induccin o
activacin de las enzimas antioxidantes (catalasa, superxido dismutasa, glutation
peroxidasa, glutation reductasa, hemooxigenasa-1, entre otras), lo que se traduce en un
mayor equilibrio redox celular y d) inhibicin de la actividad, expresin o sntesis de enzimas
prooxidantes como NADPH-oxidasa, mieloperoxidasa, xido ntrico sintasa y xantina-oxidasa,
implicadas en la generacin de especies reactivas (Ndhlala et al., 2010). En este contexto, los
productos naturales constituyen una fuente inagotable de principios activos con potencial
antioxidante. De hecho, recientes investigaciones han demostrado la capacidad
antioxidante de diversos compuestos de origen natural, siendo entre ellos relevantes el grupo
de los diterpenos (Gonzlez-Burgos and Gmez-Serranillos, en prensa).
Como se ha sealado anteriormente, la BHE, por sus caractersticas fsicas,
metablicas y de transporte, constituye una de las grandes limitaciones en la teraputica de
las enfermedades neurodegenerativas, y explica en gran medida el elevado fracaso en la
investigacin de frmacos activos a nivel del SNC. Segn datos recientes, un 98% de las
molculas pequeas y casi el 100% de las molculas grandes que se descubren con actividad
sobre el SNC no pueden atravesar la BHE (Gabathuler, 2010). A da de hoy, diversas
investigaciones van encaminadas a la bsqueda de tcnicas de tipo invasivo y no invasivo que
logren la difusin de frmacos neuroactivos a travs de la BHE. Sin embargo, todas estas
tcnicas presentan todava grandes dificultades. As, por ejemplo, las tcnicas invasivas
presentan el riesgo de infecciones y de cambios neuropatolgicos, mientras que las tcnicas
no invasivas como las modificaciones qumicas o el empleo de nanopartculas, pueden llevar,
en el caso de las primeras, a una prdida de la actividad de la molcula en el SNC o a una
modificacin de su farmacocintica y perfil de distribucin y, en el caso de las segundas, a
que sean eliminadas rpidamente de la circulacin sangunea tras su administracin
intravenosa o bien, puedan sufrir una degradacin biolgica (Gabathuler, 2009). As pues,
teniendo en cuenta que los avances producidos en este campo no han resuelto de forma
satisfactoria el paso de barrera, uno de los pilares fundamentales en la investigacin en
neurofarmacologa bsica, encaminada a la bsqueda y desarrollo de frmacos activos a nivel
del SNC, sigue siendo el encontrar molculas con capacidad de atravesar la BHE, sin
necesidad de recurrir a tcnicas tanto invasivas como no invasivas (Gabathuler, 2009).
En este contexto, la bsqueda, aislamiento e identificacin de compuestos
antioxidantes con actividad neuroprotectora procedentes de especies vegetales y su estudio
en diferentes modelos de estrs oxidativo, se enmarca dentro de una de las principales lneas
de investigacin del grupo de trabajo "Farmacologa de productos naturales" del
Departamento de Farmacologa de la Facultad de Farmacia (Naval et al., 2007; Martin et al.,
2011). Los estudios farmacolgicos y fitoqumicos de diterpenos aislados de diversas especies
del gnero Sideritis, uno de los principales y mayoritarios grupos de compuestos identificados
en dichas especies medicinales, utilizadas tradicionalmente en el rea mediterrnea, ha
constituido durante aos un objetivo destacado de nuestras investigaciones (GmezSerranillos et al., 1997; Gmez-Serranillos et al., 1998; Gonzlez-Burgos et al., 2011).
En lnea con estos trabajos nos planteamos los siguientes objetivos en esta Tesis
Doctoral:
19
20
1. Evaluar la actividad neuroprotectora de los diterpenos andalusol, conchitriol,

lagascatriol, foliol, linearol y sidol aislados de Sideritis spp., sobre clulas PC12 (modelo
neuronal) y clulas U373-MG (modelo de astrocitoma) bajo condiciones de estrs
oxidativo.
1.1. Establecer el efecto del H2O2 como inductor de estrs oxidativo sobre los
principales marcadores celulares.
1.2. Estudiar el efecto de los diterpenos aislados en el dao celular inducido por H2O2
en los siguientes parmetros:
Efectos sobre la integridad de la membrana plasmtica y la funcin de la
mitocondria (marcadores de viabilidad celular) y sobre la morfologa de las
clulas.
Efectos sobre los marcadores de dao oxidativo [niveles intracelulares de
especies reactivas de oxgeno (ROS), productos de la peroxidacin lipdica y
relacin GSH/GSSG] y de defensa antioxidante (tanto de naturaleza enzimtica
como no enzimtica).
Efectos sobre los biomarcadores de disfuncin mitocondrial por estrs
oxidativo (homeostasis de calcio, potencial de membrana mitocondrial, niveles
de ATP).
1.3. Establecer el posible mecanismo de accin.
2. Realizar estudios de paso de BHE. Evaluar mediante estudios "in silico" e "in vitro"
la capacidad de los diterpenos objeto de estudio para atravesar la BHE, determinando los
sistemas de transporte implicados.
Con este trabajo se pretende aportar nuevos compuestos con propiedades
potencialmente antioxidantes que ejerzan un efecto citoprotector en modelos de estrs
oxidativo y sobre las principales clulas del SNC. Adems, se pretende conocer los
mecanismos de transporte implicados en el paso de los diterpenos a travs de la BHE,
profundizndose as en el conocimiento de la farmacocintica de estos compuestos a nivel de
esta barrera. Todo ello con la finalidad de ampliar los conocimientos aplicables a estrategias
preventivas en deterioros neurodegenerativos.
REVISIN BIBLIOGRFICA
Revisin bibliogrfica
1. GNERO SIDERITIS
1.1. Clasificacin botnica
Reino
Subreino
Divisin
Clase
Subclase
Orden
Familia
Subfamilia
Gnero
Sideritis
Secciones perennes
- Seccin Sideritis
- Seccin Empedoclea
Plantae
Tracheobionta
Magnoliophyta
Magnoliopsida
Asteridae
Lamiales
Lamiaceae
Lamioideae
Sideritis
Subgneros
Marrubiastrum
Secciones perennes
- Seccin Empedocleopsis
- Seccin Marrubiastrum
- Seccin Creticae
Secciones anuales
- Seccin Hesiodia
- Seccin Burgsdorfia
1.2. Distribucin geogrfica

El gnero Sideritis L. comprende aproximadamente 150 especies distribuidas por la
vertiente mediterrnea europea, africana y parte de la asitica, extendindose desde las islas
Canarias y Madeira hasta el Cucaso (Loolu et al., 2006; Kpeli et al., 2007) (Fig.1.).
Espaa y Turqua poseen el mayor nmero de especies diferentes. En Espaa, la mayora de
las especies de Sideritis crecen en el Sudeste de la Pennsula Ibrica y en las Islas Canarias,
mientras que en Turqua predominan en las regiones del Mrmara y del Egeo (Gven et al.,
2005; Aslan et al., 2006).
Fig.1. Distribucin geogrfica del gnero Sideritis.
23
24
Existe una distribucin geogrfica caracterstica dependiendo de los dos subgneros

(subgnero Marrubiastrum y subgnero Sideritis) en los que se divide el gnero Sideritis. El
subgnero Marrubiastrum comprende unas 24 especies que son endmicas de la regin
Macaronsica. Por otro lado, el subgnero Sideritis incluye las especies continentales,
aproximadamente unas 125 (Barber et al., 2002). Las especies del subgnero Sideritis,
agrupadas en dos secciones, perenne (seccin Sideritis y seccin Empedoclea) y anual
(seccin Hesiodia y seccin Burgsdorfia), presentan tambin una redistribucin particular. La
seccin Sideritis se localiza en la regin Mediterrnea Occidental, especialmente en la
Pennsula Ibrica y en el Norte de frica (Marruecos y Argelia), mientras que la seccin
Empedoclea se extiende por el Mediterrneo Oriental (Grecia y Turqua) y Oriente Medio
(Siria, Israel, Irak, Lbano y Palestina). En cuanto a las secciones anuales, la seccin Hesiodia,
que comprende nicamente la especie S. montana L., se extiende por la Europa Mediterrnea
y los Balcanes, mientras que la seccin Burgsdorfia, a la que pertenecen las especies S.
romana L. con sus dos variedades, var. romana y var. lazae y la especie S. cossoniana Ball, se
localiza en la regin Mediterrnea (Gonzlez-Burgos et al, 2011).
1.3. Descripcin botnica

El gnero Sideritis est constituido por plantas herbceas o pequeos arbustos
anuales o perennes. Pueden ser plantas inodoras, aromticas o incluso malolientes, que
crecen en tierras calizas, preferentemente en espacios abiertos y soleados de montes y
colinas, adaptadas a condiciones de sequa. Presentan hojas enteras o dentadas, glabras o
cubiertas de pelos tectores, glandulares o eglandulares. Sus flores son generalmente amarillas
y en ocasiones pueden ser blancas o rojas. La corola es bilabiada con 4 estambres didnamos.
El cliz tubuloso-campanulado, se caracteriza por la presencia de un anillo continuo de pelos
en su garganta (carpostegio), de suma importancia en la botnica sistemtica de estas plantas
(Davis, 1982; Davis et al., 1988) (Fig.2.).
Es un gnero complejo desde el punto de vista taxonmico debido principalmente a la
gran tendencia a hibridar entre las diferentes especies, as como a la multitud de ecotipos
resultantes de la adaptacin a las variadas condiciones ecolgicas (Toms-Barbern et al.,
1990).
Otro aspecto botnico a destacar es el amplio nmero de especies endmicas que
presenta este gnero. En la Pennsula Ibrica e Islas Baleares, de las 49 especies que viven en
esta regin, 36 son endmicas. En las Islas Canarias es uno de los gneros con mayor grado de
endemicidad y diversidad; est representado por 19 especies endmicas entre las cuales se
encuentran S. canariensis L. (comnmente conocida como sidertide), S. candicans Aiton
(chagorro o chachorra), S. dasygnaphala (Webb et Berth) Clos (salvia blanca o salvia de
cumbre) y S. gomeraea De No ex Bolle (tajora) (Darias et al., 1990; Hernndez-Prez and
Rabanal Gallego, 2002). En Turqua, de las 45 especies de Sideritis presentes en el pas, 34
son endmicas (Topu and Gren, 2002) y en Marruecos, 16 de las aproximadamente 25
(Ghoumari et al., 2005).
B)
A)
Fig.2. Imgenes de Sideritis spp. A) Sideritis hirsuta L. B) Icono con los caracteres botnicos ms
caractersticos de Sideritis spp. (Jacob Sturm. Deutschlands Flora in Abbildungen).
1.4. Nombres comunes

Algunas especies de este gnero son conocidas popularmente en Espaa como rabo
de gato, zaharea, "sajarea", "hierba del herido", "zaharea lanuda de flor amarilla",
"espinadella", etc (Ros et al., 1986). En Turqua y en Grecia, donde se utilizan
tradicionalmente en forma de infusin, reciben comnmente el nombre de Mountain Tea
(t de montaa) aludiendo a su localizacin geogrfica en pendientes elevadas rocosas.
Tambin se conoce a este t como "t de los pastores", en honor a los pastores de las
montaas de Madonia quienes guardaban hojas de Sideritis en sus bolsillos para usarlas en
caso de necesitarlas (Lentini, 2000; Gven et al., 2005).
25
26
1.5. Usos en medicina tradicional

El trmino Sideritis viene ya recogido en la obra escrita por Dioscrides (siglo I) "De
Materia Mdica". Deriva del griego "sideros", hierro, aludiendo al uso que se ha dado a estas
plantas en la Antigedad para curar heridas producidas por armas frreas (Font Quer, 1999).
Las especies de Sideritis se han usado tradicionalmente para preparar infusiones,
como agentes saborizantes as como con fines teraputicos (Gonzlez-Burgos et al., 2009).
Sobre el uso teraputico tradicional, las infusiones y decocciones de Sideritis spp.,
administradas va oral o tpica, se usan por sus propiedades antiinflamatorias, antioxidantes,
antiulcerosas, digestivas, antimicrobianas, vulnerarias, analgsicas y carminativas (GonzlezBurgos et al., 2011).
La
infusin de
Sideritis
se emplea
frecuentemente para
tratar
trastornos
gastrointestinales tales como dolor de estmago, indigestin y flatulencia, as como para

aliviar los sntomas del resfriado comn, incluida la fiebre y el dolor de garganta, y tambin
como tnico y diurtico. Estas infusiones, preparadas a partir de las partes areas de Sideritis
spp., se suelen servir con miel y limn y se caracterizan por presentar un agradable aroma y
un sabor especial (Gonzlez-Burgos et al., 2011). La decoccin de las hojas se emplea en
procesos inflamatorios y los extractos acuosos de los tallos se utilizan tpicamente para
desinfectar y curar heridas y quemaduras (Torres Montes, 2004).
La mayora de los usos medicinales de Sideritis spp. se limitan a la medicina
tradicional; as cabe destacar su cada vez mayor presencia como remedios herbales en los
mercados. No obstante se puede hablar de un aumento en el nmero de fitofrmacos que
contienen la especie Sideritis tragoriganum Lag., en forma de infusin, extracto fluido o
tintura, para tratar problemas gastrointestinales (gastritis, lcera, intestino irritable, etc) y
problemas respiratorios (faringitis, laringitis, bronquitis, gripe, resfriados, etc) as como
presentaciones para uso tpico (conjuntivitis, heridas, contusiones, quemaduras, eczemas,
etc) que se aplican en forma de locin, compresas o baos oculares (Gonzlez-Burgos et al.,
2009). Adems de los usos citados por sus propiedades beneficiosas, las especies de Sideritis
tambin se emplean a menudo como plantas ornamentales en jardines rocosos (Obn de
Castro and Rivera-Nez, 1994).
Numerosos estudios farmacolgicos realizados "in vitro" e "in vivo" han permitido
validar el uso tradicional de diversas especies de Sideritis como antimicrobiano,

antiinflamatorio, antioxidante y digestivo. En muchos casos se ha podido determinar los
principios activos responsables de dicha actividad, en su mayora flavonoides y diterpenos,
habindose establecido en muchos casos su mecanismo de accin (Villar et al., 1986a; Villar
et al., 1986b; Barbern et al., 1987; Alcaraz and Tordera, 1988; Daz et al., 1988; Zarzuelo,
1993; Gabrieli et al., 2005; zkan et al., 2005; Basile et al., 2006). Adems, se han evaluado
actividades diferentes a las de su empleo tradicional, obtenindose resultados positivos como
anti-VIH, citotxico o repelente de insectos (Bondi et al., 2000; Bruno et al., 2002; Loizzo et
al., 2007; Gonzlez-Burgos et al., 2009).
1.6. Composicin qumica

El gnero Sideritis es rico en aceite esencial, terpenos y flavonoides, siendo stos
los principales compuestos responsables de las diferentes actividades farmacolgicas
evaluadas. Tambin se ha descrito la presencia de otros componentes como glucsidos
feniletanoides, cumarinas, esteroles e iridoides (Gven et al., 2005; Tsaknis and Lalas,
2005).
Debido a la facilidad de hibridacin entre especies, anteriormente mencionada, la
determinacin de la composicin qumica de cada una de ellas puede ser un factor clave en
su clasificacin botnica. Entre sus diferentes constituyentes, los terpenos y los flavonoides
se consideran marcadores quimiotaxonmicos dentro de este gnero (Toms-Lorente et al.,
1988; Toms-Barbern et al., 1990; Gil et al., 1993; Dewick, 2007). As por ejemplo, durante
aos S. almeriensis Pau y S. pusilla ssp. almeriensis (Pau) Malagarriga, se han considerado
como sinnimos. Sin embargo, el anlisis de la composicin qumica de las mismas revel
claras diferencias tanto cualitativas como cuantitativas en el contenido de flavonoides: la
primera contiene sideritoflavona y xantomicrol, mientras que la segunda es rica en
isoscutelarein-7-glucsido y desmetilnobiletina, lo que condujo a su definicin como especie
independiente (Palomino et al., 1996).
Dado que el tema de la presente Tesis Doctoral atae a la evaluacin de la actividad
neuroprotectora de diterpenos aislados de Sideritis spp., nos centraremos para la revisin
bibliogrfica principalmente en este grupo de compuestos.
27
28
1.6.1. Terpenos
En las diferentes especies de Sideritis se han identificado terpenos de tipo
monoterpeno como 1,8-cineol, limoneno, timol y carvacrol; sesquiterpenos entre los que cabe
destacar bisabolol y cariofileno (todos ellos componentes del aceite esencial) (Aligiannis et
al., 2001) y triterpenos como - y -amirina (Fraga et al., 1995). Sin embargo el grupo ms
importante y mayoritario de terpenos identificados en Sideritis lo constituyen los diterpenos.
1.6.1.1. Diterpenos
Los diterpenos son metabolitos secundarios constituidos por 4 unidades isoprnicas en
unin cabeza-cola (C20). Se distribuyen ampliamente en el reino vegetal, en especial, en las
familias Lamiaceae y Euphorbiaceae (Rohmer, 1999; Wanke et al., 2001).
Estudios previos que utilizan istopos como marcadores sugieren que la biosntesis de
los diterpenos en las plantas tiene lugar en los plsmidos va DOXP/MEP (1-deoxi-D-xilulosa-5fosfato/2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato), tambin llamada va gliceraldehdo fosfato/piruvato,
a travs del grupo GGPP (2E, 6E, 10E-geranilgeranilpirofosfato) (Wanke et al., 2001,
Eisenreich et al., 2004). En la Fig.3. se muestra un esquema de la biosntesis de los
diterpenos.
Las diferentes reacciones que se producen durante la sntesis de estos compuestos
conducen a la formacin de los ms de 5000 tipos que se conocen. Se clasifican de acuerdo al
nmero de ciclos y al modo de ciclacin de su esqueleto en los siguientes grupos: acclicos
(ej.: fitanos), bicclicos (ej.: labdanos, clerodanos), tricclicos (ej.: abietanos, pimaranos,
rosanos,
casanos),
tetracclicos
(ej.:
kauranos,
beyeranos,
atisanos,
giberelanos,
traquilobanos) y diterpenos macrocclicos (ej.: taxanos, cembranos, tiglianos, ingenanos,

dafnanos) (Garca et al., 2007). En la familia Lamiaceae, los grupos ms comunes de
diterpenos son los labdanos, neoclerodanos, pimaranos, abietanos y kauranos (Harley et al.,
2004).
Diferentes estudios farmacolgicos han demostrado que los diterpenos tienen un
amplio rango de actividades biolgicas tales como antiinflamatorias, anticancergenas,
antioxidantes, antimicrobianas y antifngicas (Calixto et al., 2003; Wagner and Elmadfa,
2003).
En los ltimos aos existe un creciente inters en el estudio de estos compuestos

como agentes neuroprotectores. El equipo de investigacin dirigido por el Dr. Ohizumi ha
identificado recientemente varios compuestos diterpnicos con estructuras de tipo kaurano,
labdano, clerodano y mirsinol, aislados de especies vegetales como Fritillaria ebeiensis G.D.
Yu and G.Q.Ji, Ajuga ciliata Bunge y Euphorbia prolifera Buch-Ham, con actividad
neuroprotectora frente a la muerte neuronal producida por MPP+ (metil-4-fenilpiridio) en
clulas SH-SY5Y dopaminrgicas (modelo de neuroblastoma) (Guo et al., 2011; Xu et al.,
2011a; Xu et al., 2011b; Xu et al., 2011c).
CO2
COO
NADPH
OH
O
H
O-P-O
DXP sintasa
O-P-O
O-P-O
cido pirvico
NADP
HO
OH
OH
1-desoxi-Dxilulosa 5-fosfato
reductoisomerasa
(DXR)
O
OH
OH
2-C-metil-D-eritrosa
4-fosfato
(MEP)
CTP
1-Desoxi-D-xilulosa-5-fosfato
(DOXP)
D-gliceraldehido-3-fosfato
PPi
NH2
ATP
ADP
P
O
CMP
O
O
OH
OH
OH
OH
P
O
O
H
OH
OH
O
H
2-C-metil-D-eritritol
2,4-ciclodifosfato (ME-2,4cPP)
?
?
OPP
IPP
OPP
3x
Diterpenos
HO
OPP
(E)-4-hidroxi-3-metilbut-2-enil difosfato
(HMBPP)
OPP
DMAPP
GGPP (geranilgeranilpirofosfato)
Fig.3. Biosntesis de diterpenos. Tiene lugar en los plsmidos va DOXP/MEP (1-deoxi-D-xilulosa-5fosfato/2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato). La sntesis se inicia con la condensacin de piruvato y de Dgliceraldehdo-3-fosfato (intermediarios de la va glicoltica) generndose el intermedio 1-deoxi-D-xilulosa-5fosfato. La transposicin y reduccin de este primer intermediario conduce a la formacin de 2-C-metil-Deritritol-4-fosfato. Sucesivas reacciones llevan finalmente a la sntesis de pirofosfato de isopentenilo (IPP) y
dimetilalil-pirofosfato (DMAPP). La adicin secuencial de IPP sobre el farnesilpirofosfato (FPP) origina
geranilgeranilpirofosfato (GGPP) que es el precursor de los diterpenos en C 20 (Modificado de Kuzuyama and
Seto, 2003).
29
30
Tambin se ha demostrado recientemente la actividad neuroprotectora de diterpenos

tipo labdano aislados del cuerpo fructfero del hongo parsito Antrodia camphorata Wu,
Ryvarden et Chang. Varios de estos compuestos mostraron efecto protector sobre cultivos
primarios de neuronas corticales frente a la muerte apopttica inducida por el fragmento 2535 del pptido amiloide- (A25-35) (Cheng-Chi et al., 2006). Tambin ha sido mostrada
proteccin frente a este pptido por un nuevo diterpeno aislado de la labiada Isodon
japonicus
Hara,
el
19-hidroxi-1,6-diacetoxi-6,7-seco-ent-kaur-16-en-15-ona-7,20-olido
(conocido como CBNU06) en clulas PC12. Este diterpeno ejerce su accin inhibiendo la
translocacin al ncleo del NF-, as como ejerciendo un efecto antiapopttico, aumentando
y disminuyendo los niveles de la protena anti-apopttica Bcl-2 y de la protena proapopttica Bax, respectivamente (Kim et al., 2009).
Adems de la actividad neuroprotectora de diterpenos aislados de especies del reino
vegetal, estudios muy interesantes han demostrado la potente actividad neuroprotectora de
un diterpeno tipo atisano con un grupo sulfuro en su estructura, llamado cido serofndico
(cido 15-hidroxi-17-meilsulfinilatisano-19-oico), aislado de la fraccin lipdica del suero fetal
de ternera. Este compuesto ha mostrado ejercer un significante efecto protector frente a la
toxicidad inducida por glutamato, paraquat y H2O2, en neuronas corticales primarias de rata,
sugirindose la actividad captadora de radicales libres, particularmente frente a radicales
hidroxilo, como uno de los posibles mecanismos de accin de este compuesto (Kume et al.,
2002; Osakada et al., 2004).
1.6.1.1.1. Diterpenos en Sideritis
Ms de 160 diterpenos, incluidos en al menos 9 grupos de estructuras diferentes, han
sido identificados y aislados de las partes areas de distintas especies del gnero Sideritis
(Piozzi et al., 2006). Los compuestos sideridiol y siderol fueron los primeros diterpenos
aislados y su estructura se elucid durante la segunda mitad del siglo XX (Venturella and
Bellino, 1965; Piozzi et al., 1968).
Se ha determinado que las especies que crecen en el Mediterrneo Occidental y en la
regin Macaronsica presentan un contenido en diterpenos con una gran variedad estructural
(con esqueletos de kaurano, labdano, atisano, beyerano, traquilobano y rosano), mientras que
en las especies del Mediterrneo Oriental predominan fundamentalmente diterpenos tipo
kaurano (Piozzi et al., 2006; ahin et al., 2006). Los diterpenos derivados del kaurano, entre
los que se incluyen foliol, linearol, sidol, sideridiol e isolinearol, son los que se encuentran
ms comnmente en Sideritis spp. Los diterpenos de tipo labdano como andalusol y ribenol,
de tipo beyerano como conchitriol y tobarrol, de tipo rosano como lagascatriol y de tipo
atisano como serradiol, son tambin muy frecuentes en Sideritis (Gonzlez-Burgos et al.,
2011).
En este trabajo de Tesis Doctoral se ha abordado el estudio farmacolgico de seis
diterpenos aislados de diferentes especies de Sideritis: andalusol, conchitriol, foliol,
lagascatriol, linearol y sidol. En la Fig.4. se muestran las estructuras qumicas de los mismos.
OH
CH2OH
OH
CH2OH
HO
OH
OH
HOH2C
OH
Andalusol (C20H34O3)
ent-13(16),14-labdadiene- 6, 8, 18-triol
HO
OH
OH
Foliol (C20H32O3)
ent-3,7,18 -trihidroxikaur-16-ene
Lagascatriol (C20H34O3)
ent-11,15,16-trihidroxi-ros-5-eno
Conchitriol (C20H32O3)
ent-15-beyerene- 7, 12, 17-triol
HO
OH
AcO
OAc
Linearol (C22H34O4)
ent-18 -acetoxi -37-dihidroxikaur-16-ene
OH
OH
Sidol (C22H34O4)
ent-3 -acetoxi -718-dihidroxikaur-16-ene
Fig.4. Estructura qumica de los diterpenos objeto de estudio.
Andalusol
El diterpeno de tipo labdano, andalusol, se aisl y caracteriz por primera vez en
1977 (Lpez et al., 1977); al menos 9 especies de Sideritis lo contienen (ver Tabla 1).
Diversos estudios realizados con macrfagos y con animales de experimentacin han
confirmado la potente actividad antiinflamatoria de andalusol. Su administracin oral (60
mg/kg) reduce un 44,8% el edema inducido por carragenina 5 horas despus de su inyeccin
(Navarro et al., 1997). Tambin reduce el edema producido por aplicacin tpica de 13acetato de 12-O-tetradecanoilforbol (TPA) en oreja de ratn, reduccin que se asocia con una
31
32
disminucin de la infiltracin de neutrfilos. Adems, andalusol inhibe la expresin de xido

ntrico sintasa-2 (NOS-2) en macrfagos por inactivacin del factor NF- (de las Heras et al.,
1999).
Conchitriol
Se aisl por primera vez a partir de S. angustifolia Lag. Es un diterpeno con esqueleto
de tipo beyerano (von Carstenn-Lichterfelde et al., 1974). Este compuesto se ha identificado
en al menos 7 especies de Sideritis (Tabla 1). No se han encontrado publicaciones de estudios
farmacolgicos realizados con conchitriol.
Lagascatriol
Fue en 1972, cuando Martn Panizo y colaboradores identificaron y aislaron por
primera vez el diterpeno lagascatriol a partir de la especie S. angustifolia Lag. (Martn Panizo
et al., 1972). En un principio se sugiri que lagascatriol presentaba una estructura entisopimarano. Sin embargo, los mismos autores, al revisar dos aos ms tarde la estructura,
demostraron que el grupo 10 haba migrado a la posicin C-9, dando lugar a la estructura
atpica de un esqueleto tipo rosano (Martn Panizo et al., 1974). Lagascatriol ha sido
identificado en al menos 10 especies diferentes de Sideritis (Tabla 1).
Estudios in vitro realizados en macrfagos peritoneales estimulados con el ionforo de
calcio A23187 han demostrado que lagascatriol inhibe la enzima ciclooxigenasa-1 (COX-1), lo
que lleva a una disminucin en la produccin de prostaglandina E2 (PGE2) (de las Heras et al.,
2001).
Foliol, linearol y sidol
En 1972, se identificaron en S. leucantha Cav., especie endmica del sureste de
Espaa, los diterpenos foliol, linearol y sidol (Garca de Quesada et al., 1972). Estos tres
compuestos, con esqueleto tipo kaurano, son los diterpenos ms abundantes entre las
especies del gnero Sideritis. Foliol se ha identificado en al menos 28 especies, linearol en al
menos 32 y sidol en al menos 25 (Tabla 1).
Estos compuestos disminuyen la liberacin de xido ntrico (NO) en macrfagos al
inhibir la expresin del enzima NOS-2 por bloqueo de la activacin del factor NF-B (Castrillo
et al., 2001).
SIDERITIS spp.
TERPENOS
Linearol Sidol
Referencias
Andalusol
Conchitriol
Foliol
Lagascatriol
S. almeriensis Pau
Garca-Granados et al., 1983;

Gmez-Serranillos et al., 1997
S. akmanii Ayta, Ekici et Dnmez
Bondi et al., 2000
Martn Panizo et al., 1972; Martn Panizo

et al., 1974; von Carstenn-Lichterfelde et
al., 1974
+
-
+
+
+
+
+
+
S. biflora Porta et Rigo
S. bourgeana Boiss et Reut
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
S. foetens Clem ex Lag.
Garca-lvarez and Rodrguez, 1980;

Garca-Granados et al., 1994
S. funkiana Willk
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
S. angustifolia Lag.
S. arborescens Salzm.
S. arborescens var arborescens Salzm.
S. arborescens Salzm ex Bentham ssp. paulii
(Pau) P W Ball ex Heywood
S. argyrea Davis
S. athoa Papanikolau et Kokkini
S. brevidens Davis
S. cillensis
S. crispata Willd
S. chamaedryfolia Cav.
S. flavovirens Rouy
S. granatensis (Pau) F.Q ssp. nijarensis O. Soc.

S. gulendamii Duman et Karavelioullar
S. hirsuta L.
S. hirsuta L. ssp. nivalis
S. huber-morathii Greuter et Burdet
S. ilicifolia Willd
Tabla 1. Especies de Sideritis en las que se han identificado los diterpenos objeto de estudio.
Lpez et al., 1977

Topu et al., 2001
Topu et al., 1999
Garca-lvarez and Rodrguez, 1976;
Bondi et al., 2000
Carrascal et al., 1978
Rodrguez et al., 1975
Escamilla and Rodrguez, 1980

Bondi et al., 2000
Lpez-Gmez et al., 1979
Cabrera et al., 1983
Baser et al., 1996
SIDERITIS spp.
TERPENOS
Linearol Sidol
Referencias
Andalusol
Conchitriol
Foliol
Lagascatriol
+
+
+
S. leucantha Cav.
S. leucantha Cav. var. flavovirens Rouy
de Quesada et al., 1972 ;

de Quesada et al., 1973
S. leucantha Cav. var. incana F.Q
S. leucantha Cav ssp. incana var.meridionalis F.Q
+
-
+
-
+
-
S. linarifolia Lam.
+
+
S. luteola F.Q
S. niveotomentosa Hub.-Mor
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
S. incana L. ssp. incana

S. incana L. ssp. virgata Desf.
S. lagascana Willk
S. leucantha var. meridionalis F.Q

S. leucantha var. serratifolia Willk
S. ochroleuca No
S. pusilla (Lange) Pau
S. pusilla ssp. almeriensis Pau et F.Q
S. pusilla ssp. pusilla var. granatensis Pau
S. reverchonii Willk
S. rubriflora Hub.-Mor
S. serrata Lag.
S. sipylea Boiss
S. stricta Boiss et Heldr
S. tragoriganum Lag.
S. varoi Soc.
S. varoi Soc. ssp. oriensis
S. zafrae O.Socorro
Tabla 1. Especies de Sideritis en las que se han identificado los diterpenos objeto de estudio.
Rodrguez, 1978
Garca-Granados et al., 1983 ;

de Quesada et al., 1972 ;
Rodrguez et al., 1975;
Bondi et al., 2000
Lpez et al., 1976
Mrquez et al., 1975
Bondi et al., 2000
Topu et al., 2002
Kilic, 2006
Carrascal et al., 1978
Algarra et al., 1983
2. SISTEMA NERVIOSO CENTRAL

El sistema nervioso central (SNC) est integrado por dos tipos celulares bsicos, las
neuronas, que constituyen la unidad morfolgica y funcional, y las clulas de la gla, que
superan en 5 a 10 veces en nmero a las neuronas (Cherniak, 1990; Temple, 1990). stas
ltimas a su vez se dividen en dos grandes grupos: clase microgla, que se asemeja
funcionalmente a los macrfagos, y clase macrogla, consistente en oligodendrocitos y
astrocitos; los oligodendrocitos son responsables de la mielinizacin en el SNC y pueden ser
considerados como equivalentes de las clulas de Schwann en el sistema nervioso perifrico
(SNP), mientras que los astrocitos, que son las clulas gliales ms grandes y abundantes
(representan el 40% del total de las clulas del SNC) (Rutka et al., 1997), desempean
diversas y relevantes tareas, que describiremos a continuacin, y que aseguran el buen
funcionamiento del SNC, particularmente de las neuronas (Barres, 2003; Araque and
Navarrete, 2010).
2.1. Interaccin entre astrocitos y neuronas

Los astrocitos ofrecen apoyo estructural, metablico y trfico a las neuronas, adems
de participar activamente en diferentes procesos como la transmisin sinptica, el
mantenimiento de la homeostasis inica y el desarrollo, actividad, plasticidad, diferenciacin
y maduracin neuronal, entre otras funciones.
Soporte estructural. Los astrocitos, repartidos alrededor de los cuerpos de las
neuronas, participan a nivel estructural, sirviendo de soporte fsico y confiriendo consistencia
a las neuronas (Landis and Reese, 1981).
Soporte trfico. Distribuidos por todo el SNC, los astrocitos contactan directamente
con los vasos sanguneos y con los somas, dendritas y axones de las neuronas, aportando los
nutrientes necesarios como la glucosa a la unidad bsica del SNC (Temburni and Jacob, 2001;
Theodosis et al., 2008).
Soporte metablico. Los astrocitos estn directamente implicados en los procesos de
sntesis y catabolismo de los aminocidos. A diferencia de las neuronas, expresan a nivel
mitocondrial la enzima piruvato carboxilasa que cataliza la formacin de oxalacetato a partir
de piruvato (Shank et al., 1985; Maragakis and Rothstein, 2006). Adems, en el citosol de los
astrocitos se encuentra de manera tambin prcticamente exclusiva la enzima glutamina
35
36
sintetasa que cataliza la sntesis de glutamina a partir de glutamato y amonio, previniendo as

de la excitotoxicidad dependiente de glutamato e interviniendo en la detoxificacin del
amoniaco (Papageorgiou et al., 2011).
Mantenimiento de la homeostasis inica. Los astrocitos mantienen el pH y el
equilibrio inico extracelular, esencial para el buen funcionamiento del cerebro. Durante la
actividad nerviosa, las neuronas liberan potasio al medio extracelular. Mediante mecanismos
de difusin pasiva (cotransportador Cl-/K+ y Na+/K+), transporte activo (bomba Na+/K+-ATPasa)
y redistribucin espacial, los astrocitos mantienen los niveles de K+ extracelular, evitndose
los efectos negativos de concentraciones elevadas de este ion como despolarizaciones en las
neuronas y bloqueos eventuales de los potenciales de accin (Newman, 1993; Walz, 2000; Gee
and Keller, 2005).
Adems, los astrocitos regulan, a travs de diferentes transportadores expresados en
sus membranas, los cambios de pH que se producen como consecuencia de la actividad
metablica, en la que se genera H+, y como consecuencia de la actividad nerviosa, en la que
la liberacin de neurotransmisores viene acompaada de una alcalinizacin del medio
(Boyarsky et al., 1993; Chesler, 2003).
Sntesis de factores de crecimiento y citoquinas. Los astrocitos segregan diferentes
factores de crecimiento (FGF, TGF, EGF) que juegan un papel esencial en el proceso de
formacin, proliferacin, migracin, diferenciacin neuronal y formacin de las vas de
conexin (Gomes et al., 2001; Nakagawa and Schwartz, 2004). Adems, durante el proceso
inflamatorio, los astrocitos liberan citoquinas como IL-1, IL-6 y TNF-, que inducen y regulan
la respuesta inmune (Lau and Yu, 2001; Liberto et al., 2004).
Sinapsis tripartita. El concepto de "sinapsis tripartita" surge como consecuencia de las
numerosas evidencias que implican directamente a los astrocitos en los procesos sinpticos.
Segn esta teora, los neurotransmisores liberados desde la terminal presinptica de las
neuronas, no slo activan a las neuronas postsinpticas, sino tambin a los astrocitos. La
activacin de stos conduce a la liberacin de gliotransmisores como glutamato y ATP, que
estimulan directamente a las neuronas. Adems, los neurotransmisores liberados por las
neuronas presinpticas movilizan los reservorios de calcio intracelular de los astrocitos, lo que
desencadena excitabilidad celular astrocitaria (Haydon, 2001; Newman, 2003; Evanko et al.,
2004; Fields and Burnstock, 2006).
Metabolismo del glutation. Los astrocitos aportan a las neuronas los precursores,
cisteinilglicina y glutamina, necesarios para la sntesis del antioxidante glutation. El
glutation, sintetizado y liberado en los astrocitos, es hidrolizado por accin de la enzima glutamiltranspeptidasa, localizada en la membrana plasmtica de los mismos, rindiendo como
producto el dipptido cisteinilglicina (CysGly). Adems, los astrocitos liberan glutamina al
medio extracelular, que ser captada por las neuronas para generar glutamato (Dringen et
al., 1999; Dringen, 2000).
Dado que en las enfermedades neurodegenerativas se produce la muerte progresiva
de las neuronas y que los astrocitos estn estrechamente vinculados con las neuronas, al
proporcionar apoyo estructural, metablico, trfico y funcional, resulta esencial evaluar en
estos dos modelos celulares el efecto protector frente al proceso de estrs oxidativo que
contribuye a la aparicin y progresin de las enfermedades neurodegenerativas.
3. ESTRS OXIDATIVO
3.1. Especies reactivas de oxgeno (ROS)
El concepto de especies reactivas de oxgeno (ROS) comprende toda una serie de
molculas qumicas derivadas del oxgeno molecular cuya reactividad es mucho mayor que la
de este elemento qumico en su estado basal. Entre estas especies se incluyen iones de
oxgeno como oxgeno atmico (O), ozono (O3) y oxgeno singlete (1O2); radicales libres como
radical superxido (O2), radical hidroxilo (OH), radical alcoxilo (RO ) y radical peroxilo
(ROO); y perxidos como perxido de hidrgeno (H2O2) y peroxinitrito (ONOO) (Apel and
Hirt, 2004; DAutreaux and Toledano, 2007).
Atendiendo a la reactividad de las ROS, es especialmente destacable la que presentan
los radicales libres. stos son especies qumicas que se forman por la prdida o ganancia de
electrones o bien como consecuencia de la ruptura homoltica de un enlace covalente de una
molcula, por accin del calor, de radiaciones o por iniciadores de radicales como perxidos y
azo compuestos, lo que les lleva a poseer un electrn desapareado en su estructura,
hacindoles alta e inespecficamente reactivos (Halliwell and Gutteridge, 1989).
Para determinar la magnitud de la reactividad de los radicales libres, podemos tomar
como referencia su vida media. Los radicales libres tienen una vida media muy corta, desde
37
38
nanosegundos para el radical hidroxilo (10 -9 seg) hasta 1-10 segundos para el radical xido
ntrico. A pesar de su corta vida media, su reactividad es tal, que en tan poco tiempo son
capaces de alcanzar diferentes compartimentos celulares y ejercer su accin nociva
(Priyadarshini et al., 2002).
Las ROS se producen constantemente como producto del metabolismo de la clula.
Durante la respiracin celular se genera ATP a partir de oxgeno adems de grandes
cantidades de ROS (95-98%), siendo sta la principal fuente generadora de ROS en el
organismo (Pierrefiche and Laborit, 1995). Otras fuentes endgenas de ROS incluyen algunas
reacciones catalizadas por el citocromo P450 (Beckman and Ames, 1998); la oxidacin
peroxisomal de los cidos grasos, proceso en el que se forma H 2O2 como producto (Ames et
al., 1993); la autooxidacin espontnea de diferentes molculas como las flavinas,
catecolaminas, hemoglobina o hidroquinonas, que da lugar a la produccin de radicales
superxido (Leibovitz and Siegel, 1980); tambin se liberan importantes cantidades de ROS
durante el proceso de la fagocitosis de los macrfagos, neutrfilos y eosinfilos atrados por
mediadores de la inflamacin (Beckman and Ames, 1998) y por ltimo, durante el propio
metabolismo enzimtico de compuestos como dopamina, en el que por la accin de las
monoamino oxidasas se genera H2O2 (Beal, 2003).
Adems de las fuentes endgenas citadas anteriormente, se sabe que el humo del
tabaco, la contaminacin urbana, la radiacin solar, algunos frmacos as como las sales de
hierro y cobre, entre otras varias fuentes exgenas, pueden contribuir a la produccin de ROS
(Franco et al., 2008).
A bajas o moderadas concentraciones, las ROS participan en diferentes procesos
fisiolgicos tales como el crecimiento celular, el control de la homeostasis o los mecanismos
de defensa del organismo (Drgue, 2002; Valko et al., 2007).
Sin embargo, a altas concentraciones, las ROS oxidan molculas biolgicas como
protenas, lpidos y ADN, pudindose alcanzar una situacin de desequilibrio del balance
redox conocida como estrs oxidativo, y que abordaremos ms adelante (Kohen and Nyska,
2002).
3.1.1. Radical hidroxilo

El radical hidroxilo (OH) es el radical ms daino de todos los que se conocen. Este
radical ataca al ADN causando la rotura de sus hebras as como modificaciones por oxidacin
de las bases pricas y pirimidnicas, siendo el 8-hidroxi-2-deoxiguanosina (8-OHdG) el
producto oxidativo ms abundante formado (Evans et al., 2004). Asimismo, el radical
hidroxilo inicia la lipoperoxidacin, proceso que implica la conversin oxidativa de cidos
grasos insaturados en hidroperxidos lipdicos, los cules bien pueden acumularse en las
membranas alterando su funcionalidad, o bien pueden degradarse a productos citotxicos
como los aldehdos malondialdehdo (MDA) o 4-hidroxinonenal (4-HNE) (Tejero et al., 2007).
Las protenas, y en particular los residuos de cistena y metionina, tambin son susceptibles
de oxidacin por el radical hidroxilo (Leeuwenburgh et al., 1998).
Aunque las acciones del radical hidroxilo resultan principalmente en un dao
oxidativo de las biomolculas, tambin se ha descrito alguna actividad fisiolgica en la que
participa este radical, como es en la activacin de la enzima guanilato ciclasa que cataliza la
conversin de guanosin-5-trifosfato (GTP) en guanosin- 3,5'-monofosfato (Mittal and Murad,
1977).
En cuanto a las fuentes endgenas del radical hidroxilo, ste puede formarse a partir
de H2O2 y de radical superxido (O2), en presencia de metales de transicin como cobre y
hierro, por medio de las reacciones conocidas como Fenton y Haber-Weiss (1) (Kehrer, 2000).
O2 + Fe3+
(1)
H2O2 + Fe2+
O2 + Fe2+
OH + OH + Fe3+
O2 + H2O2 OH + OH + O2
Los radicales hidroxilo (OH) tambin pueden originarse en la desintegracin del

peroxinitrito, producto de la reaccin entre el radical superxido y el xido ntrico (2) (Huie
and Padmaja, 1993), as como en la reaccin entre el cido hipocloroso (HOCl) y el anin
superxido (O2) (3) (Candeias et al., 1994) y en la descomposicin, por fisin homoltica del
enlace covalente de una molcula de agua a causa de una excesiva exposicin a radiaciones
ionizantes (4) (Von Sonntag, 1987).
(2)
(3)
(4)
O2 + NO
ONOO + H+
O2 + HOCl
ONOOH OH
OH + O2 + Cl
UV
H2O+ + H2O H3O+ + OH
39
40
3.1.2. Radical anin superxido

El radical anin superxido (O2) se origina principalmente en la cadena de transporte
de electrones mitocondrial, en los complejos I y III, por reduccin incompleta del oxgeno
molecular que se produce durante el proceso de la respiracin celular (5) (Cadenas and
Davies, 2000). Estudios realizados en partculas submitocondriales sugieren que alrededor del
1-3% del oxgeno que se consume en la respiracin mitocondrial no se reduce a agua, sino que
da lugar a la formacin de O2 (Muller et al., 2004).
(5)
O2 + e
O2
Adems de en la mitocondria, el O2 se forma por accin de la flavoprotena NADPHcitocromo P450 del retculo endoplsmico (Archakov et al., 1979), por accin de la enzima
xantina oxidasa del citosol (Murata et al., 1994) y en los procesos de autooxidacin de
compuestos como dopamina, 6-hidroxidopamina, epinefrina y norepinefrina, entre otros
(Halliwell, 2006a).
En cuanto a la reactividad, el O2 es menos reactivo que el radical hidroxilo, en parte
debido a su incapacidad de atravesar las membranas celulares al estar cargado
negativamente, por lo que quedar confinado en aquellos compartimentos donde se produce
(Nordberg and Arnr, 2001); adems su reactividad es especfica. Particularmente, se ha
observado que el O2 inactiva enzimas con centros hierro-azufre como aconitasa o 6fosfogluconato deshidratasa, por reduccin del ion hierro y su consiguiente liberacin. Este
hierro liberado, va reaccin de Fenton, puede originar el radical hidroxilo, expandindose as
el dao ocasionado por las ROS (Liochev and Fridovich, 1994).
Adems de los efectos negativos anteriormente comentados, el radical O2 est
implicado a bajas concentraciones en diferentes procesos fisiolgicos; as, participa en la
regulacin de la produccin de eritropoyetina (Drge, 2002), en el proceso de la explosin
respiratoria que se produce durante la actividad fagoctica como mecanismo de defensa
celular (Johnston et al., 1975) y en la activacin de diferentes receptores como los de
tirosina quinasas (PTKs) pertenecientes a la familia de las Src quinasas y de Janus quinasas
(JAK) en fibroblastos, linfocitos T y B, macrfagos y clulas mieloides (Abe and Berk, 1999).
3.1.3. Perxido de hidrgeno

El H2O2 se forma durante el metabolismo aerbico celular por reduccin bivalente del
oxgeno (6), as como por la accin enzimtica de la enzima superxido dismutasa en el
proceso de transformacin del anin superxido (7).
(6)
(7)
O2 + 2e + 2H+
H2O2
SOD
O2 + O2 + 2H+
H2O2 + O2
Tambin se forma en reacciones catalizadas por oxidasas como la monoaminooxidasa,

la L-aminocido oxidasa y la glicolato-oxidasa, as como en el proceso de oxidacin de cidos
grasos que acontece en los peroxisomas (Halliwell et al., 2000).
El H2O2 per se, al igual que ocurra con el anin superxido, presenta una reactividad
selectiva y menor que la del radical hidroxilo. Por ejemplo, el H2O2 inactiva de manera
especfica enzimas como fructosa bifosfatasa y sedoheptulosa bifosfatasa (Halliwell, 2006a).
Sin embargo, la toxicidad del H2O2 no se relaciona con su efecto directo (a no ser que
se encuentre a concentraciones no fisiolgicas), sino por ser precursor de radicales libres. El
H2O2 es capaz de atravesar las membranas celulares y alcanzar as los diferentes
compartimentos, en donde a travs de diferentes reacciones citadas anteriormente, origina el
potente radical hidroxilo (Halliwell, 1992).
Adems de su accin nociva para las biomolculas, y al igual que las ROS vistas
anteriormente, el H2O2, a bajas concentraciones, interviene en diferentes procesos
biolgicos, destacando su papel como molcula sealizadora en procesos como la divisin,
diferenciacin y migracin celular (Stone and Yang, 2006; Veal and Day, 2011) y su
participacin en la sntesis y activacin de diferentes mediadores de la inflamacin
(Holmquist et al., 2007).
3.1.4. ROS y mitocondria

La mitocondria, principal productor de ROS, presenta unas caractersticas que la
hacen especialmente susceptible al dao oxidativo. El ADN mitocondrial (ADNmt), comparado
con el ADN nuclear, es mucho ms sensible al ataque por ROS ya que no est protegido por
41
42
histonas, posee mecanismos de reparacin muy poco efectivos y adems se encuentra

localizado en la matriz mitocondrial, donde se producen ROS durante el proceso de la
respiracin mitocondrial (Mandavilli et al., 2000; Sawyer et al., 2001).
La funcin principal de las mitocondrias es la de producir energa en forma de ATP
mediante el sistema OXPHOS (proceso de fosforilacin oxidativa), de vital importancia en
algunos tipos celulares incluidas las neuronas. stas requieren ATP para el correcto
funcionamiento de las bombas, canales inicos, y receptores, as como para los procesos de
liberacin de vesculas y reciclaje de neurotransmisores, entre otros (Nicholls and Budd,
2000).
El ADNmt codifica para 13 de las aproximadamente 85 protenas que conforman la
cadena respiratoria, necesarias para el transporte de electrones y la sntesis de ATP.
Particularmente, el ADNmt codifica para siete protenas que son componentes del complejo I
(NADH-ubiquinona oxidorreductasa o NADH deshidrogenasa); una protena componente del
complejo III (complejo citocromo bc1); tres protenas componente del complejo IV (citocromo
C oxidasa) y dos del complejo V (ATP sintetasa), siendo el resto de las protenas as como
todo el complejo II (succinato-ubiquinona reductasa o succinato deshidrogenasa) codificados
por el ADN nuclear (Alexeyev et al., 2004; Benard et al., 2006; Chevallet et al., 2006;
Barrientos et al., 2009).
El dao oxidativo del ADN mitocondrial, por una exposicin prolongada de ROS o una
sobreproduccin de los mismas, conduce a un fallo en la transcripcin y sntesis de las 13
protenas para las que codifica y que estn implicadas en la cadena de transporte de
electrones, con la consiguiente alteracin de la funcionalidad de la mitocondria, que implica
una prdida del potencial de membrana mitocondrial, una prdida de los niveles de ATP
celular y una alteracin de la homeostasis del ion calcio (Lee and Wei, 2007; Shokolenko et
al., 2009).
Adems del ADN, es especialmente destacable el dao producido por las ROS a las
protenas y, particularmente, la inactivacin de la aconitasa mitocondrial por accin del O2.
Esta especie reactiva puede ocasionar daos en los centros Fe-S causando la liberacin del ion
ferroso que puede catalizar reacciones generadoras de ROS como la reaccin de Fenton,
exacerbndose as el dao oxidativo y culminando con la muerte celular. Adems, la
inactivacin de esta enzima lleva a una alteracin del ciclo de Krebs, ya que su funcin es la
de catalizar la isomerizacin reversible de citrato e isocitrato en este proceso (Liang and
Patel, 2004; Cantu et al., 2009). Asimismo, se puede ver comprometida la integridad del ADN
mitocondrial ya que la aconitasa est asociada al mismo, formando un complejo llamado
nucleoide, pudiendo influir la inactivacin de esta enzima en la expresin de genes
mitocondriales (Chen et al., 2005).
Por ltimo, se debe incidir tambin sobre el efecto de las ROS en los lpidos, y
principalmente sobre la cardiolipina. Este fosfolpido insaturado, principal componente de la
membrana interna mitocondrial, sirve de apoyo estructural y funcional para protenas de los
complejos III, IV y V as como de transportadores como la adenina nucletido translocasa
(ANT) (Fernndez-Checa et al., 2010). Este lpido, localizado prximo al lugar donde se
reduce la ubiquinona, mantiene la estabilidad del centro cataltico del complejo citocromo
bc1 y participa en el proceso de translocacin de protones a travs de la membrana interna
(Chicco and Sparagna, 2007); tambin, mantiene al citocromo C oxidasa asociado a la cara
externa de la membrana mitocondrial (Marsh and Powell, 1988; Petrosillo et al., 2010) y
mantiene la estructura cuaternaria de la ATP sintetasa, estructura necesaria para el buen
funcionamiento de la enzima (Schlame et al., 2000; Pfeiffer et al., 2003). La peroxidacin de
la cardiolipina por accin de las ROS conduce a una alteracin de la funcin de la
mitocondria, llevando a una prdida del potencial de membrana mitocondrial, a una
alteracin de la homeostasis de calcio y causando la muerte celular por apoptosis al liberarse
el citocromo c de la membrana mitocondrial; el citocromo c activa la caspasa 9 en el citosol,
que a su vez activa la caspasa efectora 3, desencadenndose as el proceso de la apoptosis
(Nakagawa, 2004; Garrido et al., 2006).
Estos cambios estructurales y funcionales en la mitocondria, consecuencia de un
exceso de ROS, llevan a una disfuncin mitocondrial que a su vez ocasiona una mayor
generacin de ROS, y por tanto, un aumento del dao mitocondrial, crendose un crculo
vicioso que finalizar con la muerte celular. Dada la importancia de este orgnulo en la
funcin celular y su especial susceptibilidad a las ROS, se hace necesario su estudio en
modelos de estrs oxidativo.
3.2. Sistemas antioxidantes

En 1989, Halliwell and Gutteridge definieron el concepto de antioxidante como toda
"aquella sustancia que encontrndose a concentraciones ms bajas respecto a la de un
sustrato oxidable (biomolculas), retarda o previene la oxidacin de dicho sustrato" (Halliwell
and Gutteridge, 1989).
43
44
Los mecanismos de accin descritos para las sustancias antioxidantes son diversos;
entre ellos se incluyen la capacidad captadora de ROS (ejemplo, los polifenoles de la dieta o
el glutation) (Saint-Cricq de Gaulejac et al., 1999; Jiao and Wang, 2000), la capacidad para
unirse a los iones metlicos que catalizan muchas de las reacciones que generan ROS (caso de
los flavonoides quercetina o catequina) (Malesev and Kuntic, 2007), la capacidad para inhibir
la formacin de ROS as como para eliminar el oxgeno (las vitaminas C y E) (Liu and Schubert,
2009) y la capacidad para activar la expresin y actividad de las enzimas antioxidantes
(ejemplo, el polifenol resveratrol que se encuentra en el vino) (Li et al., 2006).
Los sistemas biolgicos han desarrollado diferentes mecanismos de defensa
endgenos, de tipo enzimtico y no enzimtico, para proteger a las clulas del dao causado
por las ROS.
Las enzimas implicadas en la proteccin oxidativa se diferencian en enzimas primarias
de accin directa como superxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutation peroxidasa
(GPx), las cules eliminan directamente las ROS a travs de diferentes reacciones que se
explicarn a continuacin; las enzimas primarias de accin indirecta como la enzima de fase II
hemooxigenasa-1 (HO-1) y enzimas secundarias como glutation reductasa (GR) o glucosa-6fosfato deshidrogenasa (G6PDH) que generan, respectivamente, glutation reducido (GSH) y
nicotinamida adenina dinucletido fosfato (NADPH), cofactores necesarios para el buen
funcionamiento de las enzimas primarias (Pamplona and Costantini, 2011).
Adems del sistema antioxidante enzimtico, el organismo cuenta con toda una serie
de molculas de bajo peso molecular con capacidad antioxidante que constituyen el sistema
no enzimtico como son manitol, selenio, bilirrubina, cido rico, melatonina, NADPH,
vitamina E, ascorbato y glutation, entre otros. El glutation es el ms importante de todos los
antioxidantes no enzimticos y sobre l se incidir ms adelante en detalle (Pamplona and
Costantini, 2011).
3.2.1. Enzimas antioxidantes

3.2.1.1. Enzima catalasa (CAT)
La CAT es una enzima tetramrica con 4 subunidades idnticas de 60 kDa que
contienen un grupo prosttico hemo (Mats, 2000).
Esta enzima se localiza en los peroxisomas (80%) y en el citosol (20%), en donde

convierte eficientemente el H2O2 en agua y oxgeno molecular (8) a travs de un mecanismo
que consta de dos etapas e implica al ion hierro. Es tal la eficiencia de esta enzima, que una
molcula de la misma es capaz de convertir seis millones de molculas de H2O2 en agua y
oxgeno cada minuto (Eriksson et al., 1992; Valko et al., 2006), y no puede ser saturada a
ninguna concentracin de H2O2 (Lledias et al., 1998).
(8)
CAT
2 H2O2 O2 + 2 H2O
Aunque la concentracin de CAT en el cerebro es baja en comparacin con otros

rganos (Evans, 1993), y la actividad detoxificadora de H2O2 se atribuye en este rgano
principalmente a GPx, diversos estudios han evidenciado la importancia de esta enzima en la
proteccin frente al dao oxidativo (Szymonik-Lesiuk et al., 2003). As se ha comprobado en
un modelo de isquemia/reperfusin que la disminucin de la actividad de CAT viene
acompaada de un aumento de la susceptibilidad al estrs oxidativo, principalmente en las
regiones del hipocampo y estriado (Homi et al., 2002). En otro trabajo, realizado en
oligodendrocitos, en un modelo de dao cerebral por isquemia se mostr que la actividad
tanto de CAT como de GPx es crucial para proteger a este tipo celular de la muerte inducida
por H2O2 (Baud et al., 2004).
3.2.1.2. Enzima superxido dismutasa (SOD)

La enzima SOD, descubierta en 1969 por los investigadores McCord y Fridovich
(McCord and Fridovich, 1969), cataliza la dismutacin del anin superxido (O 2) en oxgeno
molecular (O2) y en H2O2 (9), siendo esta reaccin hasta cuatro veces ms rpida que la
dismutacin no enzimtica de este radical (Fridovich, 1975; Halliwell, 1991).
(9)
SOD
O2 + O2 + 2H+
O2 + H2O2
45
46
En los mamferos, se distinguen tres formas diferentes de enzimas SOD de acuerdo a

los metales que contienen, al nmero de subunidades, los cofactores y/o a su localizacin
celular: CuZnSOD (SOD1), MnSOD (SOD2) y EC-SOD (SOD3) (Perry et al., 2010).
La enzima CuZnSOD (SOD1), de localizacin citoslica, es un homodmero de 32 kDa,
con un tomo de cobre y otro de zinc en cada una de sus subunidades. El tomo de cobre
parece ser responsable de la actividad cataltica mientras que el tomo de zinc cumple una
funcin estabilizadora de la estructura (Bergendi et al., 1999). Estudios previos en modelos
de estrs oxidativo a nivel cerebral han demostrado que tanto la prevencin de la
inactivacin de la enzima CuZnSOD (Murakami et al., 1996; Hakue et al., 2003; Stvolinskii et
al., 2003) como la regulacin al alza de esta enzima evitan el dao producido por las ROS
(Filipovi and Radoji, 2005; Mauriz et al., 2007).
La enzima MnSOD (SOD2) se localiza a nivel de la mitocondria y est constituida por
cuatro subunidades idnticas (homotetrmero) con un tomo de manganeso en cada una de
ellas (96 kDa). La acumulacin del anin superxido a nivel de la mitocondria, consecuencia
de la inactivacin o prdida de la actividad de la enzima MnSOD causada por una situacin de
estrs oxidativo, conduce a un dao oxidativo y a una disfuncin mitocondrial que concluye
en muerte celular (Keller et al., 1998; Lee and Wei, 2007), quedando demostrado que esta
enzima es esencial para la supervivencia de la vida aerobia.
La enzima EC-SOD (SOD3), de localizacin extracelular, es una glicoprotena
tetramrica (132 kDa) que contiene iones de cobre y de zinc en su estructura. Esta isoforma
se encuentra unida a la heparina de la matriz extracelular, a travs de la regin carboxilo
terminal de cada una de sus subunidades (Adachi et al., 1992). En el cerebro, la cantidad de
la isoforma EC-SOD es mucho menor que la de cualquiera de las otras dos isoformas, MnSOD y
CuZnSOD (Marklund, 1984a; Stralin et al., 1995). Sin embargo, diversos estudios con modelos
de animales transgnicos y knockout han demostrado que la presencia y actividad de esta
enzima es necesaria para la proteccin del dao oxidativo (Oury et al., 1993, Oury et al.,
1999; Maier and Chan, 2002). Uno de sus principales efectos protectores es el hecho de que al
catalizar la dismutacin del anin superxido, evita que este radical reaccione con el xido
ntrico, que se genera en grandes cantidades en las regiones de la matriz, y por tanto evita la
formacin de los peroxinitritos que tienen un efecto muy citotxico (Oury et al., 1999).
3.2.1.3. Enzima glutation peroxidasa (GPx)

La GPx, descubierta por primera vez en eritrocitos en la segunda mitad del siglo XX
(Mills, 1957), cataliza la reduccin de diferentes hidroperxidos (H2O2, hidroperxidos

orgnicos e hidroperxidos lipdicos) utilizando glutation (GSH) como sustrato (10) (Arthur,
2000).
GPx
ROOH + 2GSH ROH + GSSG + H2O

(10)
GPx
H2O2 + 2GSH 2H2O + GSSG
Se distinguen dos isoformas de GPx: GPx dependiente de selenio y GPx independiente

de selenio.
La enzima GPx dependiente de selenio es una enzima tetramrica (80 kDa) con 4
tomos de selenio en su centro activo unidos covalentemente en forma de selenocistena.
Esta enzima, de localizacin principalmente en el citosol y en menor cantidad en la
mitocondria, cataliza la reduccin tanto de H2O2 como de hidroperxidos orgnicos (ROOH)
(Sunde and Hoekstra, 1980; Tosatto et al., 2008).
El mecanismo de accin de GPx dependiente de selenio, esquematizado en la parte
inferior (11), implica primero la oxidacin del grupo selenolato (Se ) dando lugar a la
formacin del cido selnico (SeOH). A continuacin, la unin de una molcula de GSH forma
el aducto selenenilsulfido (Se-SG), el cual se transforma en selenolato, que ya es activo, tras
una segunda adicin de GSH y la consecuente liberacin de GSSG (Brigelius-Floh, 1989;
Nordberg and Arner, 2001).
GSSG + H+
Ez-Se-
ROOH + H+
ROH
[Ez-Se-SH-GSH]
Ez-Se
(11)
GSH
[Ez-Se-SG-GSH]
GSH
[Ez-SeOH-GSH]
Ez-SeSG
H2O
47
48
En mamferos se han identificado al menos 4 isoformas diferentes de GP x dependiente

de selenio: GPx1, GPx2, GPx3 y GPx4 (Dreher et al., 1997). La isoforma GPx1 o glutation
peroxidasa celular se expresa en el citosol de la mayora de los tejidos (Himeno and Imura,
2000). La isoforma GPx2 o glutation peroxidasa gastrointestinal debe su nombre a que se
expresa fundamentalmente en el epitelio del tracto gastrointestinal, donde previene la
absorcin de hidroperxidos (Florian et al., 2001; Esworthy et al., 2005). La isoforma GPx3 o
glutation peroxidasa extracelular es secretada al plasma para proteger frente a los
hidroperxidos que circulan en este fluido coloidal (Schwaab et al., 1998; Ottaviano et al.,
2009). Finalmente, la isoforma GPx4 o fosfolpido hidroperxido GPx, que est asociada a la
membrana, ejerce un efecto protector frente a los hidroperxidos lipdicos que se generan en
este elemento estructural (Liang et al., 2007).
La enzima GPx independiente de selenio es una enzima dimrica (19-25 kDa), con un
sitio de unin para GSH y otro de unin para los sustratos electroflicos, que se expresa a
nivel del citosol, mitocondria y membranas celulares. A este grupo pertenecen miembros de
la familia de las glutation-S-transferasas (GST), los cules disminuyen su actividad
transferasa, aumentando as su actividad peroxidasa. Esta enzima es activa slo frente a
hidroperxidos orgnicos (ROOH) (Hayes and Mclellan, 1999; Arthur, 2000).
Tanto la enzima CAT como la GPx son esenciales en la detoxificacin del H2O2 en el
cerebro. Sin embargo, dado que CAT se distribuye de una manera ms localizada que GPx
(concretamente presentan una localizacin peroxisomal y citoslica, respectivamente) y dado
que la actividad de GPx es siete veces mayor que la de CAT, la enzima GPx juega un papel
protector en el cerebro ms importante en respuesta a un aumento de los niveles de H2O2
(Marklund et al., 1982).
Numerosos modelos experimentales in vitro e in vivo de cerebro han demostrado que
alteraciones en la enzima GPx resultan en una mayor predisposicin al dao oxidativo. As, por
ejemplo, se ha visto en varios estudios con ratones knockout a los que se les ha eliminado el
gen que codifica para la enzima GP x1 que su susceptibilidad a la muerte celular en clulas del
cerebro es mayor que la de los animales control, siendo este hecho atribuido al dao
oxidativo inducido, entre otros compuestos, por H2O2 (de Haan et al., 1998; Flentjar et al.,
2002). En otro trabajo sobre el envejecimiento realizado en ratones, se ha observado que
como consecuencia de la edad se produce una significativa disminucin de la enzima GP x que
conduce a una disfuncin cerebral asociada al estrs oxidativo (Kishido et al., 2007).
3.2.1.4. Enzima glutation reductasa (GR)

La enzima GR es una enzima homodimrica (120 kDa), constituida por dos
subunidades que se unen por medio de un puente disulfuro. Contiene un sitio de unin al
NADPH y un sitio cataltico formado por flavn adenn dinucletido (FAD) y un grupo disulfuro
(Schulz et al., 1978; Rescigno and Perham, 1994).
Esta flavoprotena, con localizacin citoplasmtica y mitocondrial, cataliza la
conversin de glutation oxidado (GSSG) en glutation reducido (GSH), utilizando NADPH como
cofactor (Mannervik, 1999). Esta reaccin cataltica consta de dos pasos: un primer paso que
implica la reduccin del sitio cataltico por NADPH y un segundo paso, en la que el grupo
ditiol resultante reacciona con GSSG generndose dos molculas de GSH (12) (Tandoan and
Ulusu, 2006).
(12)
GR
NADPH + H+ + GSSG NADP+ + 2GSH
Esta enzima secundaria es clave en el sistema de defensa antioxidante celular, no

slo porque el GSH formado es necesario para que GPx pueda llevar a cabo su funcin
detoxificadora, sino porque existe una estrecha relacin con los otros dos sistemas
antioxidantes enzimticos, el de CAT y el de SOD (Harris, 1992; Masella et al., 2005). La
relacin entre los diferentes sistemas antioxidantes de enzimas primarias con la enzima GR se
muestra esquemticamente en la parte inferior (13). Adems el GSH generado es importante
para el mantenimiento de los valores del cociente GSH/GSSG, que en condiciones fisiolgicas
se encuentran en una relacin molar de alrededor de 10:1 (Pajares et al., 1992).
SOD
2O2
(13)
CAT
H2O2
GPX
H2O2 H2O
2GSH
NADP+
GR
GSSG
NADPH
La GR es por tanto un componente integral en el sistema antioxidante del organismo y

prueba de ello, son los diferentes estudios que han evaluado las consecuencias que
alteraciones en esta enzima producen sobre el sistema redox. Como ejemplo, en varios
trabajos de investigacin se ha observado que la inhibicin especfica de esta enzima por la
49
50
carmustina hace que los cerebros de las ratas sean mucho ms sensibles a los efectos txicos
del oxgeno (Puglia and Powell, 1984; Powell and Puglia, 1987).
3.2.1.5. Enzima hemooxigenasa-1 (HO-1)

La HO-1 o protena de choque trmico 32 (HSP-32), descubierta en los aos 1960
(Wise and Drabkin, 1964), cataliza la degradacin del grupo hemo, rindiendo monxido de
carbono (CO), hierro (Fe2+) y biliverdina. Esta biliverdina ser transformada en una reaccin
posterior en bilirrubina por accin de biliverdina reductasa (14) (Maines and Gibbs, 2005;
Gozzelino et al., 2010).
Ferritina
(14)
HO-1
Hemo CO + Fe
2+
+ Biliverdina
Biliverdina reductasa
Bilirrubina
La expresin de esta enzima se induce no slo en respuesta al grupo hemo, sino

tambin en respuesta a una gran variedad de estmulos que conducen a situaciones de estrs
como luz UV, metales pesados, H2O2 y situaciones de hipoxia, entre otros (Abraham and
Kappas, 2007).
Esta enzima, frente a situaciones de estrs oxidativo, ejerce un papel citoprotector
atribuido en gran medida a sus propiedades antioxidantes ya que la capacidad de degradar el
grupo hemo evita los efectos prooxidantes del mismo (Jeney et al., 2002). El hierro que se
libera en esta reaccin podra catalizar reacciones que producen ROS como la reaccin de
Fenton; sin embargo, diversos estudios han demostrado que la enzima HO-1 participa en la
movilizacin del hierro celular al promover la actividad de una Fe-ATPasa (Ferris et al., 1999;
Baraano et al., 2000) e inducir la expresin de la ferritina, protena que almacena hierro en
el organismo (Grosser et al., 2004; Erdmann et al., 2006), evitndose as los efectos
citotxicos del hierro libre. Adems, la biliverdina y la bilirrubina, otros dos productos del
metabolismo del grupo hemo, presentan actividad captadora de ROS, siendo activos frente a
radicales peroxilo, peroxinitrito, hidroxilo y superxido (Baraano and Snyder, 2001; Stocker,
2004; Mancuso et al., 2006).
Estudios en neuronas granulares de cerebelo aisladas de ratones transgnicos HO-1 Tg

han demostrado que la sobreexpresin de la enzima HO-1 protege a estas clulas frente a la
toxicidad mediada por glutamato y H2O2 (Chen et al., 2000). Asimismo, clulas de
neuroblastoma transfectadas con HO-1 cDNA son ms resistentes al dao oxidativo inducido
por H2O2 y el pptido -amiloide, comparado con las clulas control (Le et al., 1999; Takeda
et al., 2000). El efecto neuroprotector de HO-1, particularmente frente a H2O2 y 4-HNE,
tambin ha sido demostrado en clulas HT22 transfectadas con siRNA que suprime la
expresin de esta enzima (Kaizaki et al., 2006). Estos estudios hacen patente la importancia
de la induccin de la expresin de HO-1 en la proteccin frente al estrs oxidativo.
3.2.2. Antioxidantes de bajo peso molecular. Sistema no enzimtico

3.2.2.1. Glutation
El glutation, descubierto en un extracto de levadura Saccharomyces cerevisiae en
1888 por Rey-Pailhade (Meister, 1988), es el principal antioxidante no enzimtico del
organismo.
Estructuralmente, el glutation es un tripptido formado por los aminocidos cistena,
glicina y cido glutmico (L--glutamil-L-cisteinilglicina) (Nicolet, 1930).
Existen dos formas de glutation: la forma reducida (GSH) y la forma oxidada (GSSG),
prevaleciendo significativamente en condiciones fisiolgicas la forma reducida, que es la
forma activa. Las diferentes actividades biolgicas en las que participa este compuesto se
deben al grupo tiol (-SH) de la cistena, que acta como donador de protones. La oxidacin
reversible de este grupo conduce a la formacin de GSSG (Townsend et al., 2003; Owen and
Butterfield, 2010).
Este antioxidante de bajo peso molecular est presente en todos los rganos,
especialmente en el hgado. En cuanto a su ubicacin en los distintos compartimentos
celulares, el glutation es especialmente abundante en el citosol (1-11 mM), en el ncleo (3-15
mM) y en la mitocondria (5-11 mM) (Valko et al., 2007).
La sntesis de glutation tiene lugar en el citosol e implica la participacin de las
enzimas -glutamilcistena sintetasa y glutation sintetasa, as como el consumo de dos
molculas de ATP. La reaccin que cataliza la primera enzima, -glutamilcistena sintetasa,
es la etapa limitante de la reaccin y en ella se produce la unin entre glutamato y cistena a
51
52
travs del grupo -carboxilo del glutamato para formar el dipptido -glutamilcistena. En la
segunda etapa de la sntesis, catalizada por la enzima glutation sintetasa, el dipptido
formado reacciona con glicina, generndose una molcula de GSH (Forman and Dickinson,
2003; Lu, 2009).
El glutation sintetizado en el citosol es transportado al resto de los compartimentos
celulares por diferentes mecanismos. As, se ha comprobado que el glutation atraviesa la
membrana nuclear por difusin pasiva. Este glutation nuclear tiene un papel esencial en el
mantenimiento del estado redox de los grupos sulfhidrilos de las protenas que participan en
la expresin y reparacin del ADN (Smith et al., 1996). Por otro lado, el glutation pasa al
interior de la mitocondria utilizando los sistemas antiporte electroneutros, dicarboxilato y 2oxoglutarato (Lash, 2006; Mari et al., 2009).
Las funciones que ejerce el glutation en el organismo son numerosas: captadora de
especies reactivas derivadas tanto de oxgeno como de nitrgeno (OH , O2, NO, ONOO)
(Aoyama et al., 2008); cofactor esencial de diferentes enzimas incluidas GPx o glutation
transferasa (Cooper and Kristal, 1997); fuente celular principal de almacenamiento de
cistena, evitndose as por ejemplo los efectos neurotxicos de este aminocido libre
(Janaky et al., 2000); accin como neuromodulador/neurotransmisor, ya que parte de las
acciones mediadas por los receptores N-Metil-D-Aspartato (NMDA) se deben a la unin de GSH
a este receptor a travs de los residuos gamma-glutamil (Giustarini et al., 2004);
participacin en el transporte de aminocidos as como en la detoxificacin de compuestos
xenobiticos (Will, 1999; Dringen, 2000).
Teniendo en cuenta la multitud e importancia de cada una de las funciones que
ejerce el glutation, es innegable que este elemento es vital para el buen funcionamiento del
organismo. Estudios experimentales han demostrado que la deficiencia de este tripptido a
nivel cerebral, consecuencia de la inhibicin enzimtica de la enzima -glutamilcistena
sintetasa por L-butionina-S,R-sulfoximina (BSO) lleva a un significativo dao mitocondrial
(Jain et al., 1991). Adems, estos cerebros deficientes en glutation son ms susceptibles al
dao ocasionado por la liberacin de ROS provocado por compuestos como 6-hidroxidopamina
(6-OHDA) (Garca et al., 2000) o bien bajo una situacin de isquemia (Mizui et al., 1992). Pero
quizs la consecuencia ms importante por una deficiencia en glutation sea su implicacin en
la patognesis de la enfermedad de Parkinson. Diversos estudios han evidenciado una
disminucin significativa de los niveles de GSH en la pars compacta de la sustancia negra de
enfermos que padecen esta enfermedad neurodegenerativa, disminucin que no viene
acompaada de un aumento de GSSG (Davie, 2008).
3.2.3. Nrf2 - ARE

La expresin de las enzimas antioxidantes est regulada por el factor de transcripcin
eritroide-2 nuclear (Nrf2), a travs de su unin a la secuencia especfica del ADN llamada
elemento de respuesta antioxidante (ARE) (Fig.5.) (Lee and Johnson, 2004).
El factor de transcripcin Nrf2, codificado por el gen NFE2L2, contiene en su regin Cterminal una caracterstica cremallera de leucinas (bZip), homloga a la protena "Capn
Collar" (CNC) de Drosophila, que es la responsable de la unin al ADN. Adems, posee una
regin acdica requerida para la activacin transcripcional (McMahon et al., 2003; Li et al.,
2005).
En un estado de equilibrio redox, Nrf2 se encuentra en el citosol unido a travs de sus
residuos ETGE (bisagra) y DLG (cierre) a dos molculas de la protena Keap1 (Tong et al.,
2006; Tong et al., 2007). Esta protena Keap1 dirige la degradacin de este factor de
transcripcin va de ubiquitinacin y degradacin por el proteosoma 26S, siendo la vida media
de Nrf2 muy corta (entre 10 y 40 minutos) (Lo et al., 2006; Zhang, 2006).
ROS
xenobiticos
compuestos quimioprotectores
S
Keap 1
SH
Keap 1
Keap 1
SH
Keap 1
Nrf2
SH
SH
Proteccin
frente al estrs
oxidativo
Aumento de la capacidad
antioxidante
Nrf2
CITOPLASMA
Nrf2
Maf
ARE
NCLEO
Enzimas antioxidantes
(p.e. CAT, SOD, GPx, HO-1)
Expresin de genes
Fig.5. Esquema de activacin de Nrf2. En un estado de equilibrio redox, Nrf2 se encuentra unido a dos
molculas de Keap1 en el citosol. Bajo condiciones oxidantes como la presencia de ROS o agentes xenobiticos
electroflicos o bien bajo la presencia de determinados compuestos citoprotectores, Nrf2 se disocia de Keap1
va oxidacin de los grupos tiol y se transloca al ncleo. En el ncleo, Nrf2 dimeriza con protenas de la familia
Maf y se une al sitio promotor especfico de ARE induciendo la expresin de enzimas antioxidantes,
ejercindose as un efecto protector frente al estrs oxidativo.
53
54
Sin embargo, la modificacin directa de grupos tiol de los residuos cistenas 151, 273
y 288 de Keap1 por accin de compuestos como los isotiocianatos, o bien, modificaciones por
fosforilacin de los grupos serina y treonina de Nrf2 por activacin de quinasas, en respuesta
al estrs oxidativo [como fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), protena quinasa C (PKC), quinasa
regulada por seales extracelulares (ERK), protena quinasa del retculo endoplsmico,
protena quinasa del N-terminal de c-Jun (JNK), protenas quinasas activadas por mitgeno
p38 (p38 MAPK), entre otras] llevan a la disociacin de Nrf2 de Keap1. Es entonces, cuando
Nrf2 se transloca al ncleo, dimeriza con protenas de la familia Maf y se une al sitio
promotor especfico de ARE (5-TGACnnnGCA-3), induciendo, entre otras, la expresin de
enzimas antioxidantes y de enzimas que participan en la sntesis de glutation (Kang et al.,
2005; Pi et al., 2007; Taguchi et al., 2011).
El papel protector que juega Nrf2 ha sido demostrado en diversos estudios in vitro e
in vivo. As, se ha observado en estudios comparativos de cultivos primarios de neuronas
corticales y de astrocitos, deficientes o no para Nrf2, que la susceptibilidad a los efectos
citotxicos inducidos por ionomicina, 2,5-di-terc-butil-1,4-hidroquinona, factor activador de
plaquetas o H2O2, era mayor para las clulas que no presentaban este factor de transcripcin.
Los perfiles de expresin gnica revelaron que los niveles de protenas antioxidantes, enzimas
de detoxificacin y protenas que regulan la homeostasis del calcio, eran mucho menores en
las clulas deficientes para Nrf2 (Lee et al., 2003a; Lee et al., 2003b). Otros estudios con
modelos de clulas de cerebro y modelos animales genticamente modificados, deficientes
ambos en Nrf2, han demostrado que este factor es un factor determinante crtico en la
susceptibilidad a los efectos provocados por inhibidores de los complejos I y II mitocondriales
como rotenona, malonato y cido 3-nitropropinico (Lee et al., 2003b; Calkins et al., 2005).
4. ESTRS OXIDATIVO Y ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

El trmino de estrs oxidativo define una situacin patolgica resultado de la
produccin de cantidades excesivas de especies reactivas de oxgeno (ROS) que no pueden ser
compensadas por el sistema antioxidante del organismo (enzimtico y no enzimtico). Esta
produccin excesiva de ROS provoca peroxidacin lipdica, oxidacin proteica y mutagnesis a
nivel del ADN, lo que puede conducir a un dao celular irreversible o a la muerte celular,
fundamentalmente por apoptosis (Valko et al., 2005; Avery, 2011).
En las ltimas dcadas, la llamada hiptesis del estrs oxidativo ha cobrado fuerza
como una de las causas o consecuencias de la patogenia de muchas enfermedades
neurodegenerativas incluidas la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la

esclerosis lateral amiotrfica y la enfermedad de Huntington (Barnham et al., 2004).
En comparacin con otros rganos, el cerebro presenta unas caractersticas propias de
su metabolismo, que lo hacen especialmente susceptible al dao oxidativo. Esta
vulnerabilidad se atribuye a varios factores, entre ellos:
(a) Elevado consumo de oxgeno por el cerebro. El cerebro representa slo el 2% del
peso corporal total, pero la alta cantidad de ATP demandada por las neuronas para el
mantenimiento del potencial de membrana y, la liberacin y almacenamiento de los
neurotransmisores, hacen que el cerebro requiera un elevado y constante aporte de oxgeno,
que supone una quinta parte del oxgeno corporal total (Floyd, 1999; Valko et al., 2007).
(b) Composicin en cidos grasos insaturados. El 80% de los lpidos que constituyen
el cerebro son cidos grasos insaturados, principalmente de tipo 20:4 (cido araquidnico) y
22:6 (cido docosahexaenoico). La presencia de dobles enlaces en estos cidos grasos
insaturados facilita la sustraccin del hidrgeno del grupo metileno por parte de los radicales
libres, generndose radicales peroxilipdicos. La autopropagacin del proceso de oxidacin de
cidos grasos (lipoperoxidacin) conduce a la formacin de productos secundarios como 4hidroxi-2,3-nonenal (HNE), acrolena, malondialdehido (MDA) y F2-isoprostanos (Halliwell,
1991; Halliwell, 2006b).
(c) Molculas autooxidables. Algunos neurotransmisores como dopamina, L-DOPA (su
precursor), serotonina o norepinefrina pueden generar por procesos de autooxidacin
diferentes especies reactivas como O2, H2O2 y quinonas/semiquinonas (Graham et al., 1978;
Stokes et al., 1999).
(d) El contenido de hierro en el cerebro es elevado, especialmente en determinadas
reas incluidas la sustancia negra, el ncleo caudado, el putamen y el globus pallidus. El
promedio de hierro no-hemo en el cerebro es de alrededor de 60 mg, alcanzndose el mximo
nivel a los 30 aos de edad (Halliwell, 2006b). Este hierro libre puede catalizar muchas de las
reacciones que generan ROS como la reaccin de Fenton, los procesos de autooxidacin de los
neurotransmisores y la peroxidacin lipdica (Zaleska and Floyd, 1985; Halliwell, 2001).
(e) Las defensas antioxidantes del cerebro son bajas, especialmente de CAT. En
mamferos, las reas del cerebro que contienen los mayores niveles de CAT son el hipotlamo
y la sustancia negra (Brannan et al., 1981).
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56
(f) Metabolismo de la dopamina. Las isoenzimas monoaminooxidasa A (MAO-A) y

monoaminooxidasa B (MAO-B) catalizan la oxidacin de dopamina, generndose H2O2 como
producto (Gal et al., 2005).
(g) Presencia de aminocidos excitotxicos (ej.: glutamato). En condiciones
fisiolgicas, la concentracin de glutamato en el cerebro es menor de 1 M. Sin embargo,
como consecuencia de alteraciones en el metabolismo energtico cerebral, se puede producir
la liberacin de cantidades masivas de este neurotransmisor que, al activar su receptor,
conduce a un aumento del calcio intracelular hasta niveles patolgicos. Adems, las ROS
disminuyen la propia captacin de glutamato por clulas gliales e inhiben a la enzima
glutamina sintetasa que cataliza la condensacin entre glutamato y amoniaco para dar
glutamina (Aksenov et al., 1997).
(h) Produccin de ROS por clulas del SNC. Las clulas de la microgla, consideradas
como los macrfagos del SNC por su capacidad para eliminar las sustancias de desecho y
estructuras daadas, cuando se encuentran activadas, liberan ROS como O 2 y H2O2 as como
toda una serie de citoquinas. Estas ltimas pueden, por un lado, inducir a la microgla para
que libere ms ROS, o bien inducir la expresin de la enzima xido ntrico sintasa inducible
(iNOS), que produce especies reactivas derivadas de nitrgeno (ej.: xido ntrico) (Boje and
Arora, 1992; Colton et al., 1996; Duncan and Heales, 2005).
(i) Presencia del citocromo P450. En las reacciones que cataliza el complejo
citocromo P450 se generan ROS. Varias isoformas de dicho citocromo como CYP2E1 y CYP2D6,
han sido identificadas en diferentes regiones del cerebro (Miksys et al., 2002; Miksys and
Tyndale, 2004; Shahabi et al., 2008).
4.1. El estrs oxidativo en la Enfermedad de Alzheimer (EA)

La enfermedad de Alzheimer, descrita por primera vez en 1907 por el mdico alemn
Alois Alzheimer (Alzheimer, 1907), es la enfermedad neurodegenerativa ms comn. Esta
patologa asociada a la edad afecta en la actualidad a aproximadamente 33,9 millones de
personas en el mundo, de las cuales alrededor de un 10% del total son personas mayores de 65
aos, y alrededor de un 50% son mayores de 80 aos (Barnes and Yaffe, 2011). Como
consecuencia del creciente envejecimiento de la poblacin se estima que el nmero de
personas que padecern el mal de Alzheimer en el ao 2050 se cuadriplicar (1 de cada 85
personas en el mundo padecern Alzheimer), asumindose estas cifras siempre que no se
produzcan cambios en el patrn de mortalidad ni que aparezcan estrategias efectivas para la

prevencin y tratamiento de esta patologa (Brookmeyer et al., 2007).
La fisiopatologa de la enfermedad de Alzheimer incluye la aparicin de placas seniles
y ovillos neurofibrilares y la prdida de neuronas colinrgicas, con la consiguiente deficiencia
del neurotransmisor acetilcolina. Estos cambios en el cerebro conducen a la prdida de
memoria a corto y largo plazo, a la prdida de la capacidad espacial y temporal, a la
aparicin de cambios de personalidad y a la aparicin de alteraciones del lenguaje (McKhann
et al., 1984; Liu et al., 2007a).
El pptido -amiloide en su forma insoluble (A 1-42), principal componente de las
placas seniles, est directamente implicado en la neurodegeneracin asociada a la
enfermedad de Alzheimer. Uno de los mecanismos que explica la neurotoxicidad de este
pptido involucra al estrs oxidativo, y ms concretamente a su capacidad productora de
ROS, particularmente de H2O2, mediada por iones de metales de transicin. El centro y la
periferia de las placas seniles de enfermos de Alzheimer contienen altas cantidades de iones
de metales de transicin como cobre (400 M), zinc (1 mM) y hierro (1 mM) (Lovell et al.,
1998), los cules se unen al pptido -amiloide a travs de sus tres residuos de histidinas en
las posiciones 6, 13 y 14; mediante tcnicas espectrofotomtricas se ha demostrado que el
complejo pptido -amiloide-iones de transicin produce H2O2 a partir de O2 a travs de la
reduccin del estado de oxidacin de estos metales (Huang et al., 1999a; Huang et al.,
1999b). El H2O2 generado reacciona con el metal en su estado reducido formndose el radical
hidroxilo (OH) va Fenton (Barnham et al., 2004).
Entre las diferentes evidencias que demuestran la implicacin del estrs oxidativo en
la contribucin de la patologa del Alzheimer cabe citarse los niveles elevados de productos
de la peroxidacin lipdica como HNE, MDA y acrolena (Hajimohammadreza and Brammer,
1990; Subbarao et al., 1990; Zarkovic, 2003; Williams et al., 2006); niveles elevados de 8hidroxi-2-deoxiguanosina (8OHdG) y 8-hidroxiguanosina (8OHG), marcadores de la oxidacin
del ADN y ARN, respectivamente (Nunomura et al., 1999; Nunomura et al., 2001); protenas
carboniladas y nitrotirosinas, indicativo de la oxidacin de protenas (Smith et al., 1997;
Hensley et al., 1998) y disminucin de la actividad del complejo IV de la mitocondria (de
Moura et al., 2010).
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4.2. El estrs oxidativo en la Enfermedad de Parkinson (EP)

La enfermedad de Parkinson debe su nombre al mdico ingls James Parkinson que la
describi
por
primera
vez
en
1817.
Esta
enfermedad
es
el
segundo
desorden
neurodegenerativo ms frecuente del mundo y afecta principalmente a personas mayores de

60 aos. Se estima a nivel mundial que ms de 4,5 millones de personas en el mundo sufren
de esta enfermedad, y esta cifra se estima que se doblar en 25 aos (Elbaz and Moisan,
2008; Muangpaisan et al., 2011).
La fisiopatologa de la enfermedad de Parkinson se caracteriza por la prdida
progresiva y gradual de las neuronas dopaminrgicas localizadas en la pars compacta de la
sustancia negra (lo que lleva a una deplecin de dopamina en el estriado), as como por la
aparicin de inclusiones citoplasmticas, constituidas principalmente por -sinuclena
(cuerpos de Lewy), en las neuronas dopaminrgicas que permanecen vivas (Jenner, 2003).
Clnicamente los sntomas ms notorios y caractersticos de la enfermedad son motores como
rigidez, temblor en reposo, bradicinesia e inestabilidad postural. Adems, se han descrito
diferentes sntomas no motores incluidos depresin, alteraciones cognitivas, trastornos del
sueo y alteraciones olfatorias (Ziemssen and Reichmann, 2007).
La implicacin del estrs oxidativo en la neurodegeneracin progresiva de la sustancia
negra que ocurre en la enfermedad de Parkinson, ha sido demostrada en numerosos estudios
post-mortem y en estudios con modelos experimentales. Se ha constatado que los niveles de
especies reactivas en la pars compacta de la sustancia negra son mucho ms elevados en
enfermos de Parkinson que en personas que no presentan dicha patologa. Estas especies
reactivas proceden fundamentalmente del propio metabolismo de la dopamina (Jenner, 2003;
Zhou et al., 2008).
La
desaminacin
oxidativa
de
la
dopamina,
catalizada
por
las
enzimas
monoaminooxidasas A y B (MAO A y MAO B), conduce a la formacin de H2O2 (Ahmad et al.,

1990). Este H2O2 libera radical hidroxilo va Fenton, reaccin que se ve favorecida por los
elevados niveles de Fe2+ en la sustancia negra (la relacin de los niveles de Fe2+:Fe3+ es 2:1 en
enfermos de Parkinson y 1:2 en personas que no padecen tal patologa) (Gtz et al., 2004).
La dopamina, tambin puede autooxidarse formndose quinonas y semiquinonas con
la consiguiente produccin de anin superxido, H2O2 y radicales hidroxilo (Asanuma et al.,
2003).
Desde el punto de vista bioqumico, los cambios ms significativos observados en la

sustancia negra que evidencian una situacin de estrs oxidativo y disfuncin mitocondrial en
enfermos de Parkinson, son niveles elevados de HNE, niveles elevados de 8-hidroxiguanina y
8-hidroxi-2-deoxiguanosina (Alam et al., 1997; Zhang et al., 1999), disminucin de la
actividad del complejo I mitocondrial, que viene acompaada por una disminucin de los
niveles de ATP, alteracin de la homeostasis de calcio y prdida del potencial de membrana
(Schulz and Beal, 1994) y niveles reducidos de GSH que son significativos desde los primeros
estadios de la enfermedad (reducciones entre un 30-40%) y que no vienen acompaados de un
aumento de la forma oxidada de glutation (Sofic et al., 1992; Sian et al., 1994). Esta
disminucin de los niveles de GSH no se debe a un fallo en el proceso de sntesis, ya que se ha
observado
que
en
los
enfermos
de
Parkinson,
la
actividad
de
la
enzima
glutamiltranspeptidasa est significativamente aumentada. La liberacin de excesivas

cantidades del dipptido cisteinilglicina (CysGly) por accin de esta enzima, y la consiguiente
actuacin de las dipeptidasas, genera cistena que, en vez de ser utilizada en la sntesis de
GSH, puede reaccionar con quinonas de dopamina, formndose 5-S-cisteinildopamina. Este
compuesto puede, a su vez convertirse, en derivados de dihidrobenzotiazina, que son
inhibidores irreversibles del complejo I mitocondrial (Schultz et al., 2000).
4.3. El estrs oxidativo en la Esclerosis lateral amiotrfica (ELA)

La esclerosis lateral amiotrfica (ELA) es una enfermedad, de tipo espordico o
familiar, que afecta a las neuronas motoras de la corteza cerebral, tronco cerebral y mdula
espinal, causando una debilidad muscular y una atrofia progresiva, generalmente con
desenlace fatal (Rao and Balachandran, 2002; Kamat et al., 2008).
Desde el punto de vista fisiopatolgico, esta enfermedad se caracteriza por la
presencia de inclusiones celulares parecidas a los cuerpos de Lewy, por el engrosamiento de
los axones motores y por la degeneracin walleriana (Cleveland et al., 1996).
En la forma familiar de ELA (5-10% de todos los casos diagnosticados), se ha observado
que, entre un 20 y un 30% de los enfermos de este tipo, presentan mutaciones en el locus
21q22.1 del gen que codifica la enzima SOD1 (CuZnSOD). Ms de 120 mutaciones diferentes
han sido identificadas en enfermos de ELA, siguiendo la mayora de ellas un patrn de
herencia autosmica dominante (Deng et al., 1995; Orrell, 2000; Andersen, 2006; Gros-Louis
et al., 2006). Existen mutaciones que producen una prdida hasta del 40% en la actividad de
SOD1 (Robberecht et al., 1994), otras que originan agregados de SOD1 que causan la muerte
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de las neuronas motoras (Shibata et al., 1998; Rowland and Shneider, 2001) y otras que
conducen a enzimas SOD1 con propiedades aberrantes que producen peroxinitritos y otros
radicales libres a travs de reacciones similares a la reaccin de Fenton (Beckman, 1993; Beal
et al., 1997; Rowland and Shneider, 2001; Cozzolino et al., 2008).
Muchas de estas mutaciones implican directamente al estrs oxidativo como uno de
los mecanismos de la patogenia de algunas de las formas familiares de ELA. Por un lado, la
prdida de la actividad de SOD1 observada en algunos enfermos, supone un aumento de los
radicales libres, ya que la enzima SOD1 elimina directamente los radicales superxido a
travs de una reaccin de dismutacin. Por otro lado, tambin se produce en las enzimas
SOD1 con propiedades aberrantes un aumento de radicales libres, tal como se ha comentado
en el prrafo anterior.
Los marcadores de estrs oxidativo identificados en algunas formas de ELA son:
niveles elevados de 8-OHdG (Bogdanov et al., 2000), de 4-HNE y MDA (Simpson et al., 2004;
Baillet et al., 2010) y oxidacin de protenas (Siciliano et al., 2007).
4.4. El estrs oxidativo en la Enfermedad de Huntington (EH)

George Huntington public en 1872 un artculo titulado "On Chorea" en la revista "The
Medical and Surgical Reports" que revolucion el conocimiento de esta enfermedad. En este
artculo, George Huntington describi con gran precisin y enorme valor clnico y diagnstico,
los aspectos ms relevantes de esta enfermedad como son su naturaleza hereditaria y su
caracterstica sintomatologa. En honor a este valioso documento clnico para la medicina se
denomin a esta enfermedad como "Corea de Huntington" o "Enfermedad de Huntington"
(Huntington, 1872).
La enfermedad de Huntington es una enfermedad neurodegenerativa de tipo
autosmico dominante, que afecta fundamentalmente al crtex y al estriado, y que es
causada por una expansin del trinuclotido CAG en el exn 1 del gen que codifica para una
secuencia de poliglutamina en el extremo N-terminal de la protena huntingtina (Htt)
(MacDonald et al., 1993; DiFiglia et al., 1997). Las caractersticas clnicas de esta enfermedad
son: alteraciones psiquitricas, movimientos coreiformes (movimientos involuntarios e
incontrolados) y demencia gradual (Bonilla, 2000; Siemers, 2001).
Diversas evidencias in vitro e in vivo, demuestran que la agregacin de la protena
huntingtina mutante, conduce a la produccin de ROS, siendo ste uno de los mecanismos
postulados para explicar la neurodegeneracin producida en esta enfermedad (Hands et al.,
2011). En este mecanismo de produccin de ROS se implica directamente a los iones de cobre
y de hierro, acumulados a niveles altos (Dexter et al., 1991), los cules interaccionan con los
extremos N-terminal de la protena huntingtina mutante que tiene actividad redox (Firdaus et
al., 2006; Fox et al., 2007).
Tanto en cerebros de pacientes con EH como en modelos de animales utilizados para
el estudio de esta enfermedad, se ha detectado la presencia de diferentes biomarcadores
indicativos de estrs oxidativo, destacando niveles elevados de productos de la peroxidacin
lipdica como MDA y F2-isoprostanos, de la oxidacin de protenas como 3-nitrotirosina y de la
oxidacin del ADN como 8-OHdG, as como una deficiencia en molculas antioxidantes como
cido ascrbico y -tocoferol. Adems, se ha detectado una disminucin de la actividad de los
complejos mitocondriales II/III as como niveles elevados de lactato (indicativo de disfuncin
mitocondrial) (Browne et al., 1997; Browne et al., 1999; Montine et al., 1999; Polidori et al.,
1999; de Moura et al., 2010; Tnez et al., 2011).
La importante contribucin del estrs oxidativo en la patogenia de muchas
enfermedades, incluidas las enfermedades neurodegenerativas comentadas anteriormente, ha
dado lugar en los ltimos aos a un importante esfuerzo cientfico orientado a conocer los
mecanismos moleculares implicados en este proceso, as como a la bsqueda de tratamientos
que prevengan o mejoren el dao oxidativo. A da de hoy, la teraputica ms prometedora es
el uso de compuestos exgenos, naturales o sintticos, que presenten actividad antioxidante.
5. LA BARRERA HEMATOENCEFLICA
5.1. Antecedentes
La existencia de una barrera vascular entre la circulacin sistmica y el SNC se conoce
desde principios del siglo XX, cuando el bacterilogo alemn Paul Ehrlich, mostr que, al
inyectarse colorantes derivados de la anilina en la sangre de ratones, se tea todo el
organismo a excepcin del encfalo. Paul Ehrlich supuso que el encfalo posea una menor
afinidad por el colorante que el resto de los tejidos y que por ello no se tea (Ehrlich, 1904).
Sin embargo, diez aos ms tarde, su discpulo Edwan Goldman observ que al
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inyectar el colorante azul tripano directamente en el lquido cefalorraqudeo (LCR) de

conejos y perros, el encfalo se tea inmediatamente, pero no el resto de los tejidos del
organismo. Estos experimentos demostraron claramente la existencia de una barrera que
separa la sangre del lquido intercelular cerebral (Goldmann, 1913).
En 1900, Lewandowsky, en sus estudios de permeabilidad del ferrocianuro de potasio
en el cerebro, utiliz por primera vez el trmino de bluthirnschranke (barrera
hematoenceflica) (Lewandowsky, 1900).
No obstante, la evidencia anatmica de esta barrera no se confirm hasta la
introduccin del microscopio de barrido electrnico en el campo de las investigaciones
mdicas, en los aos 1960.
5.2. Tipos de barreras en el SNC

El transporte de compuestos entre la sangre y el SNC est limitado y regulado por tres
tipos de barreras hemticas que se diferencian en la localizacin, tipo celular y funcin:
barrera
hematoenceflica
(BHE),
barrera
sangre-lquido
cefalorraqudeo
(BSLCR)
hematolicuoral (BHE-LCR) y barrera sangre-aracnoides o subaracnoidea (Abbott, 2005)

(Fig.6.).
Estas barreras fsicas y metablicas protegen al SNC frente a xenobiticos as como
frente a aquellas sustancias endgenas que pudieran resultar potencialmente txicas para el
organismo. Asimismo, la presencia de estas barreras va a determinar y limitar la distribucin
de molculas con actividad a nivel del SNC (Abbott, 2005; Bernacki et al., 2008).
La BHE y la BHE-LCR conforman las dos barreras fisiolgicas ms importantes en el
control de entrada y salida de compuestos endgenos y exgenos, siendo la primera la ms
limitante de las dos. Esto se debe a su gran superficie de intercambio, de entre 12-18 m2 para
un adulto humano, es decir, supone un rea unas 5000 veces mayor que la correspondiente a
la BHE-LCR (Pardridge, 1995; Pardridge, 2002; Graff and Pollack, 2004). Por otra parte, la
BHE subaracnoidea no influye de manera significativa debido a su naturaleza avascular y a su
pequea rea superficial (Kandel, 2000).
BARRERA SANGRE-LQUIDO
CEFALORRAQUDEO (BSLCR)
BARRERA
SANGRE-ARACNOIDES
BARRERA
HEMATOENCEFLICA (BHE)
Clulas
epiteliales
Astrocitos
Neuronas
Capilares
coroidales
SANGRE
Dura
Aracnoides
Uniones
estrechas
Piamadre
Pericitos
Membrana
basal
LCR
SANGRE
LCR
Macrfagos
Fenestraciones
Capilares
vascular
Microglia
Macrfagos
Clulas dendrticas
Uniones
estrechas
Clulas
endoteliales
Fig.6. Barreras en el SNC. Se distinguen tres tipos diferentes en cuanto a su localizacin, tipo celular y
funcin: barrera sangre-lquido cefalorraqudeo (BSLCR) o hematolicuoral (BHE-LCR), barrera sangrearacnoides o subaracnoidea y barrera hematoenceflica (BHE). La primera localizada, entre el plexo coroideo
y el LCR, est formada por clulas epiteliales que presentan fenestraciones y hendiduras intercelulares, pero
que establecen uniones estrechas a nivel apical para restringir el paso paracelular. La segunda, localizada
entre la pared de los grandes vasos durales y subaracnoideos y el LCR del espacio subaracnoideo, est formada
por clulas planas aracnoides. La BHE, la cual separa el sistema vascular del espacio extracelular del
parnquima cerebral, est formada por clulas endoteliales, que carecen de fenestraciones y de vesculas
pinocticas y que establecen fuertes uniones estrechas intercelulares a nivel apical.
La BHE, presente en todos los vertebrados a excepcin de los tiburones y las lampreas
(Lane, 1991), separa el sistema vascular del espacio extracelular del parnquima cerebral.
Est constituida por clulas endoteliales de los microvasos cerebrales, rodeadas por
prolongaciones de los astrocitos y por una membrana basal continua a la que se adosan los
pericitos (Engelhardt and Sorokin, 2009). Los compuestos que atraviesan esta barrera han de
pasar a travs de las membranas luminal y aluminal, separadas ambas por un citoplasma
endotelial de tan slo 300 nm de grosor (Brightmann and Reese, 1969).
Las clulas endoteliales de la BHE presentan una serie de caractersticas especiales
(presencia de uniones estrechas, ausencia de fenestraciones y baja actividad pinoctica) que
determinan su limitada permeabilidad al paso de determinadas molculas en ambos sentidos
(Grant et al., 1998).
Adems, estas clulas endoteliales expresan diferentes transportadores que aseguran
el paso de compuestos como oxgeno y glucosa al interior y, excluyen y eliminan aquellos que
pudieran alterar la homeostasis cerebral y, por tanto, su buen funcionamiento (Abbott et al.,
2010).
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64
La BHE-LCR, la cual separa el sistema vascular del LCR, est formada por clulas
epiteliales del plexo coroideo (Engelhardt and Sorokin, 2009). Estas clulas, a diferencia de
las clulas endoteliales de la BHE, presentan fenestraciones y hendiduras intercelulares. Sin
embargo, la difusin paracelular de compuestos hidrosolubles se ve dificultada por la
presencia de uniones estrechas establecidas entre las clulas epiteliales a nivel apical
(Redzic, 2011). Adems, aparte de esta funcin de barrera, estas clulas epiteliales presentan
una funcin secretora y producen el fluido cerebroespinal (Brown et al., 2004; Engelhart and
Sorokin, 2009).
En algunas zonas del cerebro se han identificado regiones carentes de una BHE bien
definida, siendo en este caso la BHE-LCR la principal barrera protectora frente al libre
trnsito de compuestos. Entre estas regiones se incluyen los plexos coroideos, el rgano
vasculoso de la lmina terminal, el rgano subfornical, el rgano subcomisural, la eminencia
media, la glndula pineal, la neurohipfisis y el rea postrema, recibiendo en su conjunto el
nombre de rganos circunventriculares (Broadwell, 1992; Broadwell and Sofroniew, 1993).
La BHE subaracnoidea se localiza entre la pared de los grandes vasos durales y
subaracnoideos y el LCR del espacio subaracnoideo. Se encuentra constituida por clulas
planas aracnoides, las cules se adhieren a la pared de los vasos de la duramadre (Abbott et
al., 2006).
5.3. La BHE
En la literatura cientfica se utiliza muchas veces el concepto de BHE para referirse al
conjunto de barreras que restringe el paso de compuestos bidireccionalmente entre la sangre
y el SNC. Sin embargo de manera ms correcta, el trmino de BHE se ha de restringir a la
estructura histolgica constituida por las clulas endoteliales de la vasculatura cerebral,
asociadas ntimamente a pericitos, a astrocitos y a una membrana basal (Bernacki et al.,
2008).
5.3.1. Propiedades de la BHE

La BHE funciona como una barrera fsica, metablica y de transporte (Abbott et al.,
2006). Como resultado de la combinacin de estas tres funciones, la BHE asla al SNC del resto
del organismo, protegindolo de los cambios bruscos de osmolaridad y de aquellos agentes
que pudieran resultar potencialmente neurotxicos (Dash and Elmquist, 2003).
Las clulas endoteliales que forman la BHE parecen ser responsables de estas
propiedades. Estas clulas presentan una serie de peculiaridades morfolgicas y bioqumicas
que las hacen diferentes del resto de las clulas endoteliales del organismo (Fig.7.).
CAPILAR CEREBRAL
Astrocitos
CAPILAR GENERAL
Clulas
endoteliales
Membrana
basal
Pericitos
Vesculas
pinocticas
Clulas
endoteliales
Capilar
Uniones
estrechas
Capilar
Mitocondrias
Microglia
Neuronas
Fenestraciones
Fig.7. Esquema comparativo de la estructura de un capilar cerebral y de un capilar general en seccin

transversal. Las clulas endoteliales de los capilares cerebrales, a diferencia de las clulas endoteliales de un
capilar general, estn conectadas mediante uniones estrechas, adolecen de fenestraciones y de vesculas
pinocticas y presentan un gran nmero de mitocondrias.
Funcin barrera fsica

Las clulas endoteliales de la BHE estn conectadas a nivel apical mediante uniones
estrechas que sellan los espacios intracelulares, restringiendo el transporte paracelular
bidireccional de compuestos, y confiriendo una alta resistencia transendotelial (1500-2000 x

cm2) (Huber et al., 2001). sta es mucho mayor que la medida en otros tejidos (<100 x cm2)
(Fricker, 2008).
Adems, las clulas endoteliales de la BHE presentan una baja actividad pinoctica y
adolecen de fenestraciones, lo que limita an ms el paso de compuestos a travs de las
mismas (Grant et al., 1998). Consecuencia de estas caractersticas especiales, el endotelio
capilar cerebral es unas 50 a 100 veces ms estrecho que los microvasos perifricos (Abbott,
2002).
Asimismo, las clulas endoteliales cerebrales presentan un elevado nmero de
65
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mitocondrias, sugirindose una alta actividad metablica. La energa producida durante el

metabolismo es utilizada para el transporte activo de nutrientes y otros compuestos en ambas
direcciones (de Boer and Gaillard, 2006), as como en diferentes reacciones catalizadas por
enzimas (Persidsky et al., 2006).
Funcin barrera metablica
La funcin como barrera metablica se suma a la funcin de barrera fsica de la BHE,
ya que las clulas endoteliales cuentan con toda una serie de sistemas enzimticos que
metabolizan compuestos con accin en el SNC, reduciendo as sus niveles en el cerebro. En
los microvasos cerebrales se han detectado niveles elevados de las enzimas gamma-glutamil
transpeptidasa (-GTP), fosfatasa alcalina, monoaminooxidasas tipo A y B y L-aminocidos
descarboxilasas (Mensch et al., 2009). stas y otras enzimas metabolizan molculas que
transitan a travs de la BHE entre ellos distintos frmacos como codena o L-Dopa, o
neurotoxinas como paraquat, reduciendo as su paso al cerebro (Minn et al, 1991; Abbott and
Romero, 1996).
Funcin barrera transporte
Por ltimo, como barrera de transporte, las clulas endoteliales expresan diferentes
sistemas de transporte eflujo o de salida que dificultan an ms el paso de xenobiticos.
Entre estos transportadores, la glicoprotena-P (gp-P) es el ms estudiado de todos (Golden
and Pollack, 2003). En el apartado 5.3.3.2.2. se explica en detalle los diferentes
transportadores de salida.
5.3.2. Complejos de unin intercelulares: uniones estrechas y uniones

adherentes
Los principales complejos de unin intercelulares que se establecen entre las clulas
endoteliales de los capilares cerebrales son las uniones estrechas y las uniones adherentes
(Fig.8.).
5.3.2.1. Uniones estrechas

Las uniones estrechas de las clulas endoteliales son el complejo de unin ms apical
en la membrana plasmtica. Estn compuestas por un complejo de protenas transmembrana
[claudinas, ocludinas y molculas de adhesin intercelular (MAI)] y de protenas

citoplasmticas accesorias [zonula occludens (ZO-1, ZO-2 y ZO-3), cingulina, AF-6 y 7H6]
unidas al citoesqueleto por los filamentos de actina (Engelhart and Sorokin, 2009).
Membrana apical
Zonula occludens
ZO3
Uniones
estrechas
Claudinas
3, 5, 12
ZO2 ZO1
Cingulina
ZO3
Ocludinas
JAM-1
ZO2 ZO1
ZO1
Filamentos de actina
Uniones
adherentes
PECAM-1
Cateninas
VE-Cadherinas
Membrana basal
Fig.8. Estructura de los principales complejos de unin intercelulares (uniones estrechas y uniones
adherentes) establecidos entre las clulas endoteliales de los capilares cerebrales. Las uniones estrechas
estn compuestas por un complejo de protenas transmembrana (claudinas, ocludinas y molculas de adhesin
intercelular) y de protenas citoplasmticas (zonula occludens, cingulina, AF-6 y 7H6) unidas al citoesqueleto
por los filamentos de actina. Las uniones adherentes, situadas debajo de las uniones estrechas, tienen como
unidad bsica al complejo cadherina-caterina.
Protenas transmembranales
Las protenas transmembrana, ocludina, claudina y molculas de adhesin
intercelular (MAI), son responsables de las uniones estrechas.
La ocludina (65 kDa) fue la primera protena transmembrana localizada en las uniones
estrechas de las clulas endoteliales descrita (Furuse et al., 1993). Diversos estudios en
ratones knockout del gen que codifica para la ocludina han demostrado, que dicha protena,
no es fundamental para el buen desarrollo morfolgico de las uniones estrechas (Saitou et al.,
67
68
2000); no obstante, diversas condiciones patolgicas que implican a la BHE se asocian con una
disminucin de la expresin de la ocludina (Bolton et al., 1998; Persidsky et al., 2006).
La ocludina presenta cuatro dominios transmembrana, con dos bucles extracelulares y
con dos dominios citoplasmticos que se corresponden con los extremos amino y carboxilo
terminal (Correale and Villa, 2009).
El dominio carboxilo terminal es el que interacciona con el citoesqueleto de actina a
travs de las protenas ZO-1 y ZO-2 (Fanning et al., 1998). Por otro lado, la fosforilacin del
dominio citoplasmtico de la ocludina, rico en residuos de serina y treonina, est asociado a
una alta resistencia elctrica y a un descenso de la permeabilidad celular (Hirase et al.,
1997). Particularmente, el dominio carboxilo terminal junto con los dos bucles extracelulares
parecen regular la permeabilidad paracelular (Balda and Matter, 2000), mientras que el
dominio amino terminal regula la migracin transepitelial de los neutrfilos (Bamforth et al.,
1999).
Las claudinas son fosfoprotenas de pequeo tamao (entre 20 y 22 kDa) que constan
de cuatro dominios transmembrana. Sus dos porciones extracelulares contienen aminocidos
cargados y su cola citoplasmtica juega un importante papel en la transduccin de seales
(Ballabh et al., 2004). Estas protenas forman dmeros y se adhieren homotpicamente a otras
molculas de claudina de clulas endoteliales adyacentes, formando las uniones estrechas
(Huber et al., 2001). La presencia de estas protenas, a diferencia de la ocludina, parece ser
esencial para el desarrollo y formacin de las uniones estrechas (Persidsky et al., 2006).
Adems, de entre los diferentes componentes de los complejos de unin, se cree que las
claudinas son los principales determinantes de la restriccin en la permeabilidad de la BHE
(Tsukita et al., 2001).
En ratones y humanos se han identificado al menos 24 miembros de la superfamilia de
las claudinas, entre ellas, las claudinas 1, 2, 3, 5, 11, 12 y 18 estn presentes en el cerebro
(Mahajan et al., 2008; Neuhaus et al., 2008; Romanitan et al., 2009) y particularmente la 3, 5
y 12 se localizan en los endotelios cerebrales junto con la ocludina (Neuhaus et al., 2008).
Las molculas de adhesin intercelular (MAI) (40 kDa), pertenecen a la superfamilia
de las inmunoglobulinas. Slo las molculas de adhesin de la unin JAM-1 y JAM-2 han sido
identificadas en los endotelios cerebrales de ratn (Aurrand-Lions et al., 2001), realizndose
a da de hoy diversas investigaciones centradas en la identificacin de estos componentes en
el cerebro del ser humano (Ballabh et al., 2004).
Estas protenas estn constituidas por un nico dominio transmembrana con un

fragmento extracelular que media interacciones de tipo homoflico y heteroflico en la regin
de las uniones estrechas (Vorbrodt and Dobrogowska, 2003; Stamatovic et al., 2008).
En asociacin con las molculas de adhesin celular endotelial plaquetaria-1
(PECAM1), estas protenas estn involucradas en el proceso de migracin leucocitaria (MartinPadura et al., 1998).
Protenas citoplasmticas accesorias
Las protenas citoplasmticas, como las protenas zonula occludens (ZO1, ZO2 y
ZO3), la cingulina y las protenas AF-6 y 7H6, son necesarias para la estructura de las
uniones estrechas.
Las protenas zonula occludens (ZO1, ZO2 y ZO3) pertenecen a la familia de
protenas conocidas como protenas guanilato quinasa asociadas a membrana (MAGUKs). Estn
compuestas por tres dominios PDZ (PDZ1, PDZ2 y PDZ3), un dominio SH3 y un dominio
guanilquinasa (Erickson et al., 2007).
La isoforma ZO-1 (220 kDa) se expresa fundamentalmente en las clulas endoteliales y
epiteliales de los capilares cerebrales, aunque tambin se han localizado en otras clulas
como los fibroblastos, las clulas de Schwann y los astrocitos (Mitic and Anderson, 1998). Choi
y Kim (2008) observaron que alteraciones en los niveles y en la estructura de ZO-1 conducen a
un incremento de la permeabilidad capilar.
La isoforma ZO-2 (160 kDa) forma parte de la estructura de las uniones estrechas de
clulas endoteliales y epiteliales. Tambin se ha identificado esta isoforma en las uniones
adherentes de fibroblastos y de clulas musculares cardacas (Itoh et al., 1999a). Adems
presenta una alta homologa con ZO-1 en su secuencia aminoacdica (51%), existiendo
diferencias importantes en la misma en la regin carboxilo terminal (Collins and Rizzolo,
1998).
La isoforma ZO-3 (130 kDa), la cual se identific por coprecipitacin con ZO-1,
tambin presenta homologa de secuencia con las isoformas ZO-1 y ZO-2 (Balda et al., 1993).
Estas protenas conectan mltiples componentes intracelulares y superficies de las
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clulas en las uniones estrechas. El dominio SH3 se une a protenas sealizadoras y a

elementos del citoesqueleto, el dominio guanilquinasa cataliza la transformacin de GMP a
GDP usando ATP y, el dominio PDZ, se une a grupos carboxilo terminal de diferentes protenas
transmembrana (Wolburg and Lippoldt, 2002). Particularmente, el dominio PDZ1 de las
protenas zonula occludens interacciona con la claudina (Itoh et al., 1999a) y el dominio
guanilquinasa de ZO1 se une a la ocludina (Mitic et al., 2000). Estas protenas zonula
occludens forman complejos entre ellas de tipo ZO-1/ZO-2 y ZO-2/ZO-3 (Wittchen et al.,
1999).
La cingulina (140-160 kDa), fosfoprotena que sirve de nexo de unin entre el
citoesqueleto de actina y las protenas ZO, MAI, miosina y AF-6, se localiza en el lado
citoplasmtico de las uniones estrechas (Sandoval and Witt, 2008). Mientras que miosina y
ZO3 conectan con cingulina a travs de su dominio C-terminal, las protenas MAI y AF-6 lo
hacen a travs de su dominio N-terminal (Cordenonsi et al., 1999).
La fosfoprotena 7H6 (155 kDa) parece contribuir a la impermeabilizacin de las
uniones estrechas al paso de compuestos, ya que se ha visto que cuando los niveles celulares
de ATP disminuyen, la protena 7H6 se desliga de las uniones estrechas y se produce un
aumento de la permeabilidad paracelular (Bernacki et al., 2008).
Finalmente, la protena AF6 interacciona de manera directa con ZO-1 a travs de su
dominio N-terminal, regulando de esta manera las interacciones clula-clula establecidas en
las uniones estrechas (Yamamoto et al., 1997).
5.3.2.2. Uniones adherentes

Las uniones adherentes, formadas debajo de las uniones estrechas y que tienen como
unidad bsica al complejo cadherina-catenina, parecen ser necesarias para la formacin de
las uniones estrechas (Schulze and Firth, 1993).
Las cadherinas son molculas de adhesin celular calcio-dependiente, que median
uniones de tipo homoflico y heteroflico. Existen distintos tipos (cadherinas-E, -N,-P,-R,-VE y
-T); concretamente, la cadherina tipo 2 (VE-cadherina) ha sido identificada en los endotelios
vasculares (Breier et al. 1996).
Las cateninas tienen como funcin conectar las cadherinas al citoesqueleto de actina.
De los cuatro tipos de cateninas descritos (-, -, - y -), las cateninas -, - y - han sido
detectadas en los capilares cerebrales (Vorbrodt et al., 2008). Adems, Itoh y colaboradores
(1997, 1999b) demostraron que las cateninas - pueden tambin interaccionar con las
protenas ZO-1 y ZO-2 de las uniones estrechas.
5.3.3. Rutas de transporte a travs de la BHE

La BHE se caracteriza por presentar una permeabilidad muy restringida al paso de
compuestos entre la sangre y el SNC. Se estima que aproximadamente un 98% de las
molculas de pequeo tamao, as como prcticamente el 100% de las grandes molculas
(protenas recombinantes, anticuerpos monoclonales y pptidos), que son activos frente a los
diferentes trastornos del SNC, no atraviesan la BHE (Gabathuler, 2010).
El agua, molculas gaseosas como O2 y CO2, as como algunas molculas liposolubles
con pesos moleculares muy pequeos (menores de 400-600 Da), son capaces de atravesar la
BHE por mecanismos de difusin pasiva. El resto de molculas que son capaces de atravesarla,
como es el caso de algunas molculas orgnicas, lo hacen a travs de sistemas de transporte
especficos como GLUT-1 o el sistema carrier L (Ueno et al., 2010).
Se conocen varios sistemas de transporte implicados en el paso de compuestos a
travs de la BHE. Entre estos sistemas se incluyen el transporte pasivo (paracelular y
transcelular), el transporte mediado por protenas (transportadores
de entrada y
transportadores de eflujo o de salida) y la transcitosis (transporte mediado por receptores y

transporte mediado por adsorcin) (Fig.9.) (Chen et al., 2004).
5.3.3.1. Transporte pasivo

El proceso de difusin pasiva en el cerebro puede ser de dos tipos: paracelular (entre
las clulas) o transcelular (a travs de las clulas). El primer tipo es poco frecuente debido a
la presencia de las uniones estrechas entre las clulas endoteliales; sin embargo, el
transporte transcelular es el ms frecuentemente utilizado por compuestos con actividad a
nivel del SNC. Ambos tipos de transporte son de tipo no saturable y no competitivo (Soni et
al., 2010).
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Difusin
pasiva
paracelular
Migracin celular Carriers

mononuclear
de solutos
Compuestos
hidrosolubles
Glucosa
Aminocidos
Bases pricas
Colina
Endocitosis
mediada por
adsorcin
Endocitosis
mediada por
receptores
Protamina
Polilisina
Histona
Avidina
Insulina
Transferrina
Leptina
Transportadores
de eflujo
Alcaloides de la
Vinca
Ciclosporina A
Ranitidina
Difusin
pasiva
transcelular
Compuestos
liposolubles
Sangre
Clulas
endoteliales
+
+
++
+ +
+
+
Cerebro
Fig.9. Rutas de transporte a travs de la BHE. Atendiendo a la naturaleza qumica de los compuestos que se
transportan, existen diferentes mecanismos de paso a travs de las clulas endoteliales: los compuestos
hidrosolubles como la sacarosa lo hacen por medio de mecanismos de difusin pasiva paracelular; los
leucocitos, mediante un proceso de diapdesis o bien modificando las uniones estrechas; los carriers de
solutos, uni y bidireccionales, transportan compuestos esenciales para el buen funcionamiento y homeostasis
del cerebro como son glucosa, aminocidos, colina o bases pricas. Mediante endocitosis mediada por
adsorcin se transportan compuestos con carga positiva, y mientras que la endocitosis mediada por receptores
transporta compuestos como insulina, transferrina o leptina; adems, los transportadores de eflujo o de salida
pueden interrumpir el paso de compuestos liposolubles por difusin pasiva transcelular, mecanismo utilizado
por compuestos liposolubles que cumplen adems otra serie de caractersticas fsico-qumicas descritas en la
introduccin.
5.3.3.1.1. Paracelular
Las molculas hidroflicas pequeas como sacarosa, manitol o fluorescena, pueden
difundir entre las clulas endoteliales a travs de sus uniones estrechas (Pardridge, 2005;
Neuhaus et al., 2006).
5.3.3.1.2. Transcelular
Las molculas gaseosas, como O2 y CO2, y las molculas liposolubles como alcohol o
nicotina, pueden difundir libremente a travs de las membranas luminal (apical) y aluminal
(basal) de las clulas endoteliales (Banks, 2009; Abbott et al., 2010).
Diversos estudios han demostrado que el paso de molculas desde la sangre al cerebro
a travs de las clulas por mecanismos de difusin pasiva depende de diferentes propiedades
fsico-qumicas de las propias molculas entre las que se incluyen la lipofilia, el peso
molecular, el rea total de superficie polar, el estado de la carga, la flexibilidad y el
potencial de la molcula para adherirse a los iones de hidrgeno (Mensch et al., 2009). Estos
parmetros fsico-qumicos son inter-dependientes, por lo que a la hora de evaluar si un
compuesto puede o no pasar la BHE se han de considerar todos ellos en su conjunto y no de
manera individualizada. Adems, hay que tener muy en cuenta que dichas propiedades van a
condicionar, pero no determinar, su paso a travs de la BHE. Experimentalmente se ha
comprobado que muchas molculas con caractersticas fsico-qumicas idneas para el
transporte por difusin pasiva son incapaces de atravesar la BHE (Bodor and Buchwald, 2003).
El tamao de las molculas lipoflicas est inversamente relacionado con su paso por
difusin pasiva a travs de la BHE; stas molculas deben tener un peso molecular inferior a
500 Da. Sin embargo, son varias las excepciones encontradas a esta premisa, ya que se ha
comprobado que diferentes pptidos y protenas con pesos moleculares de ms de 600 Da,
como los anlogos de encefalina, pueden atravesar la BHE transcelularmente (Banks, 2009).
La lipofilia de las molculas, expresada mediante el coeficiente de particin log
octanol/agua (log Po/w), condiciona el proceso de transporte por mecanismos de difusin
pasiva (Rapoport and Levitan, 1974). En general, a mayor lipofilia, mayor facilidad de paso a
travs de la BHE. Sin embargo, una elevada lipofilia puede tener tambin un efecto negativo
en este proceso, ya que un compuesto muy liposoluble puede quedar retenido en la BHE
(Youdim et al., 2003) o bien puede ser diana de diversos transportadores eflujo como la
glicoprotena-p, limitndose en ambos casos su permeabilidad a travs de la BHE (van Asperen
et al., 1997).
El llamado coeficiente de distribucin (log D) a pH 7,4, el cual incluye la suma de las
concentraciones tanto de las especies neutras como de las especies ionizadas de un
compuesto, es junto con el log P otro coeficiente muy utilizado (Clark, 2003). Este
coeficiente da informacin muy valiosa acerca de las formas posibles de transporte de un
compuesto a travs de la BHE. As, si log D indica que un compuesto puede presentarse en
forma ionizada, ste no podr atravesar la BHE por mecanismos de difusin pasiva
transcelular, requiriendo de otros como la endocitosis mediada por adsorcin (Herv et al.,
2008).
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Otros factores que restringen la entrada de compuestos en el SNC son la elevada

flexibilidad conformacional otorgada por los enlaces rotables (Abbott et al., 2010), un rea
topolgica de la superficie polar (TPSA) alta (ms de 80 ), definida como la suma de las
contribuciones superficiales de los tomos polares de una molcula, especialmente oxgenos,
nitrgenos e hidrgenos unidos a dichos tomos (Clark, 2011), y un elevado potencial de la
molcula para adherirse a los iones de hidrgeno (a menor nmero de grupos de unin de
hidrgeno, mayor ser la captacin de las molculas por las clulas endoteliales). As, se ha
observado que cuando una molcula tiende a formar ms de 8-10 enlaces de hidrgeno, se
incrementa la energa libre para transferir una molcula desde una fase acuosa hasta la
membrana lipdica celular (Gleeson, 2008). En este sentido se ha comprobado que las aminas
y amidas forman tres enlaces de hidrgeno y si la amida es terminal formar cuatro enlaces;
los grupos hidroxilo forman dos, los grupos teres y grupos carbonilo forman uno y los steres
establecen medio enlace de hidrgeno (Pardridge, 1998).
5.3.3.2. Transporte mediado por protenas

5.3.3.2.1. Transporte de entrada
Las clulas endoteliales del cerebro que conforman la BHE expresan protenas
transportadoras especficas en sus membranas que facilitan el paso de compuestos como
nutrientes (aminocidos, hexosas, bases pricas...) al cerebro.
Se han identificado al menos diez sistemas diferentes de carriers o portadores: de
transporte de hexosas para glucosa y manosa; de transporte de aminocidos neutros como
fenilalanina y leucina; de transporte de aminocidos cidos como glutamato y aspartato; de
transporte de aminocidos bsicos como arginina y lisina; de transporte para -aminocidos
como -alanina y taurina; de transporte de cidos monocarboxlicos como lactato y de cidos
grasos de cadena corta como acetato y propionato; sistema de transporte de colina para
colina y tiamina; de transporte de aminas para mepiramina; de transporte de nuclesidos
para bases pricas tales como adenina y guanina, pero no para bases pirimidnicas y por
ltimo, de transporte para pptidos pequeos como vasopresina (Tsuji and Tamai, 1999).
Estos sistemas de transporte son especficos de sustrato, saturables y pueden requerir
energa y/o el cotransporte con otra sustancia. Pueden localizarse en la membrana luminal de
las clulas endoteliales, en la membrana abluminal o en ambas (Bernacki et al., 2008;
Roberts et al., 2008; Abbott et al., 2010).
Para que se produzca el transporte de un compuesto a travs de la BHE desde la

sangre al cerebro es necesario que el sistema de transporte se exprese en ambas membranas
(luminal y abluminal) de las clulas endoteliales y que sea bidireccional. Este es el caso del
sistema portador de hexosas que transporta los sustratos endgenos D-glucosa y manosa a
ambos lados de la membrana. Este transportador, que es independiente de sodio, se expresa
en mayor medida en la membrana abluminal para evitar la acumulacin de glucosa en el
cerebro (Bradbury, 1993). Otro ejemplo es el transportador de aminocidos neutros (L1) que,
al igual que el transportador de hexosas, se localiza en ambas membranas, transportando en
ambas direcciones de modo facilitativo e independientemente de sodio, los aminocidos
fenilalanina, leucina, isoleucina, valina, triptfano, tirosina, treonina y metionina (Bernacki
et al., 2008; Abbott et al., 2010).
Puede darse tambin el caso de que un portador o carrier se exprese slo en una de
las membranas de manera que transporte un sustrato al interior de las clulas endoteliales y
sea otro transportador el que, alternativamente, lo saque al exterior celular. Un ejemplo de
este tipo es el sistema de transporte de nuclesidos para bases pricas tales como adenina y
guanina. Los transportadores ENT1 y ENT2 que se localizan en la membrana luminal,
transportan los nuclesidos desde la sangre al endotelio. Estos nuclesidos pasan al interior
cerebral desde el endotelio por medio de los transportadores dependientes de sodio CNT1,
CNT2 y CNT3 (Abbott et al., 2010).
Por ltimo, tambin puede ocurrir que el transportador slo se exprese en una de las
membranas y que no exista un transportador alternativo, quedando entonces el sustrato
retenido en el interior celular. Este es el caso del sistema n, que se expresa exclusivamente
en la membrana luminal endotelial y que transporta los aminocidos asparagina, glutamina e
histidina desde la sangre al interior del endotelio (Ennis et al., 1998; Abbott et al., 2010).
5.3.3.2.2. Transporte de eflujo o de salida
En las clulas endoteliales, adems de transportadores de entrada existen
transportadores de salida, los cules juegan un importante papel fisiolgico para evitar la
neurotoxicidad de ciertos compuestos endgenos y de xenobiticos. Sin embargo, estos
transportadores de salida tambin pueden restringir la entrada de frmacos, dificultndose
as el tratamiento de muchas patologas del SNC. Entre estos transportadores de salida se
distinguen los transportadores de la familia ABC y los portadores o carriers.
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Transportadores de la familia ABC

Los transportadores ABC son los transportadores ms importantes de salida en la BHE
y los que tienen el papel ms relevante en la restriccin de compuestos con actividad
teraputica al interior cerebral. Dentro de esta gran familia de ms de 48 miembros, en las
clulas endoteliales cerebrales destacan los transportadores de la gp-P, el cul es el
transportador de salida por excelencia, las protenas relacionadas con la multirresistencia a
frmacos (MRPs) y la protena de resistencia de cncer de mama (BCRP)(Abbott et al.,
2010).
La glicoprotena-p (gp-P), producto del gen MDR1 en humanos, es una protena de 170
kDa perteneciente a la superfamilia de transportadores ABC; en concreto es un transportador
ABCB1. Esta protena, localizada en la membrana apical de diferentes tejidos incluidos la
mucosa intestinal, el endotelio de los capilares cerebrales, los tbulos del rin y los
canalculos biliares, es el transportador de eflujo mejor caracterizado (Garrigues et al.,
2002).
En el organismo, este transportador dependiente de ATP juega un papel protector
frente a xenobiticos hidrofbicos. Su funcin consiste en eliminar determinadas sustancias
que se encuentran, sobre o dentro de la membrana plasmtica, antes de que penetren en la
clula o bien expulsar del citoplasma celular aquellas sustancias que hayan logrado penetrar
(Schinkel et al., 1997). Cientos de compuestos con una gran diversidad de tamao, estructura
y funcin han sido identificados como sustratos de la gp-P (Sun et al., 2003). En general,
muchos de estos sustratos comparten en comn que son molculas con pesos moleculares de
ms de 400 g/mol, hidrofbicas, anfipticas, con un anillo aromtico y normalmente
presentan carga positiva a pH fisiolgico (Sharon, 1997). Sin embargo, son muchas las
excepciones observadas, ya que compuestos neutros como digoxina, compuestos con carga
negativa como atorvastatina, molculas hidroflicas como metotrexato as como molculas
con pesos moleculares de menos de 400 Da como ranitidina, han sido identificados como
sustratos de la gp-P (Sun et al., 2003).
Adems de esta funcin detoxificadora, la gp-P se ha implicado en los mecanismos de
multirresistencia a frmacos, entre los que se incluyen algunos quimioterpicos como
antraciclinas, paclitaxel o alcaloides de la Vinca (Kim, 2002), algunos antibiticos
(tetraciclinas, rifampicina) (van Bambeke et al., 2000), inhibidores de la proteasa del VIH
(indinavir, ritonavir) (Sun et al., 2003) e inmunosupresores (ciclosporina A y FK506) (Saeki et
al., 1993). Como consecuencia de la expresin incrementada de esta protena, estos frmacos
no pueden atravesar la BHE y alcanzar su diana para ejercer su correspondiente accin
teraputica.
De las protenas de multirresistencia a frmacos (MRPs), el transportador MRP1 o
ABCC1 es el ms representativo de todos. Este transportador se expresa a unos niveles muy
altos en las membranas basolaterales de las clulas endoteliales de cerebro (Gazzin et al.,
2008). Los metabolitos endgenos como los conjugados de glutation, los glucurnidos de
bilirrubina o las sales biliares dianinicas son sustratos para el transportador MRP1
(Jedlitschky et al., 1996; Jedlitschky et al., 1997). Adems, MRP1 tambin transporta
antraciclinas, alcaloides de la Vinca y etopsido (Aszalos, 2008).
Diversos estudios han demostrado tambin la presencia de los MRPs tipo 2, 4 y 5 en
clulas endoteliales de cerebro (Begley, 2004; Colabufo et al., 2009).
La protenas de resistencia de cncer de mama (BCRP) se encuentra altamente
expresada en la membrana luminal de las clulas endoteliales de cerdo, ratn y humano. Se
cree que BCRP facilita tambin la eliminacin de xenobiticos (Schinkel and Jonker, 2003).
Sistemas carriers o portadores
Los sistemas carriers o portadores, adems de ser fundamentales para el transporte

de entrada de compuestos endgenos y de nutrientes al cerebro, tambin tienen un
importante papel en el transporte de salida de compuestos.
As, los sistemas de transporte para pptidos pequeos PTS-1 y PTS-2, localizados
en la membrana abluminal, median respectivamente el transporte de salida de pptidos
opioides y de arginina-vasopresina desde el cerebro (Banks, 2006).
Dentro de ellos, los transportadores de salida Oatp2, Oatp3 y Oatp14, pertenecientes
a la familia de polipptidos transportadores de aniones orgnicos (OATP) independientes de
sodio, han sido identificados en los capilares de las clulas endoteliales (Bernacki et al.,
2008). El transportador Oatp2, localizado en la membrana luminal y abluminal de los
capilares, media el transporte de salida de un gran nmero de compuestos muy diversos
estructuralmente, entre los que se incluyen, hetersidos cardiotnicos como digoxina,
pptidos aninicos como BQ-123 y aniones orgnicos anfipticos como esteroides, y
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particularmente de importancia la dehidroepiandrosterona sulfato (DHEA), que acta sobre

receptores GABA A y receptores sigma, incrementando la excitabilidad y plasticidad neuronal
(Noe et al., 1997; Reichel et al., 1999; Asaba et al., 2000; Gao et al., 2000). El transportador
Oatp3, de localizacin exacta todava indeterminada, expulsa al exterior conjugados de
esteroides y hormonas tiroideas (Cattori et al., 2001; Ohtsuki et al., 2004). Y el transportador
Oatp14, altamente expresado en el cerebro, transporta de manera efectiva las hormonas
tiroideas, tiroxina (T4) y triyodotironina (T3) (Pizzagalli et al., 2002; Sugiyama et al., 2003).
Tambin, los polipptidos transportadores de cationes orgnicos (OCTP) como
OCT2 y OCT3, ambos expresado en cerebro, pueden actuar como portadores de salida (Tamai
et al., 1997).
5.3.3.3. Endocitosis
5.3.3.3.1. Endocitosis mediada por receptores
Durante este proceso, cuando el ligando se une a su receptor en el lado apical de la
clula endotelial, la membrana se invagina y se recubre de clatrina. Se forma una vescula
endoctica que contiene el complejo ligando-receptor, el cul es transportado a lo largo del
citoplasma hasta la membrana basolateral de la clula endotelial. El receptor se expone
entonces hacia el intersticio y se libera el ligando. Este tipo de transporte es saturable y
dependiente de la energa y de la temperatura (Rodemer and Haucke, 2008). Molculas como
insulina, transferrina, leptina o TNF, son capaces de cruzar la BHE por endocitosis mediada
por receptores (Pardridge, 2007).
5.3.3.3.2. Endocitosis mediada por adsorcin
A pH fisiolgico, los sialoglicoconjugados y los proteoglicanos tipo heparn sulfato
localizados en la superficie luminal de las clulas endoteliales del cerebro presentan carga
negativa (Vorbrodt, 1989).
Diversos estudios han demostrado que determinadas protenas catinicas como
protamina, polilisina, albmina glucosilada, histona o avidina son capaces de atravesar la BHE
por interaccin electroesttica entre su carga positiva y la carga negativa de la superficie de
la membrana plasmtica del cerebro (Scherrmann, 2002).
Este tipo de transporte mediado por adsorcin, es dependiente de energa, saturable

y no especfico de sustrato (De Boer and Gaillard, 2007).
5.3.4. Estrategias para la administracin de frmacos en el cerebro

Una de las principales dificultades en el desarrollo de frmacos dirigidos al
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas es la imposibilidad de muchos de ellos de
alcanzar su diana teraputica por la existencia de la BHE.
Los mtodos desarrollados para lograr la difusin de frmacos a travs de la BHE son
muchos y muy diversos. Estos mtodos se pueden clasificar en dos amplios grupos: tcnicas
invasivas y tcnicas no invasivas.
Tcnicas invasivas
Entre las tcnicas invasivas se incluyen la infusin intracerebroventricular, los

implantes intracraneales de compuestos neuroactivos (Bobo et al., 1994; Kroll et al., 1996) y
la interrupcin temporal de las uniones estrechas mediante mtodos como el shock osmtico
(uso de una solucin hipertnica de manitol), los ultrasonidos y los mtodos qumicos (uso de
anlogos de bradiquinina) (Joshi et al., 2007). Estas tcnicas presentan el riesgo de
infecciones as como de cambios neuropatolgicos. Adems son relativamente costosas,
requieren de hospitalizacin y no son muy bien aceptadas por los pacientes (Gabathuler,
2009).
Tcnicas no invasivas
Entre las tcnicas no invasivas se pueden diferenciar las modificaciones qumicas, la

administracin intranasal, las nanopartculas y las tecnologas genticas.
La modificacin qumica, como su propio nombre indica, consiste en cambiar
qumicamente la estructura de un compuesto con el fin de mejorar sus propiedades fsicoqumicas para que pueda atravesar la BHE. Estas modificaciones fundamentalmente se
orientan a aumentar la lipofilia o a minimizar el potencial de unin a hidrgeno (Chen et al.,
2004). La reduccin del nmero de grupos polares mediante la adicin de grupos metilos
favorece la penetracin al cerebro de barbituratos o pptidos opioides (Hansen et al., 1992).
Sin embargo, este tipo de modificaciones puede conducir a una prdida de la actividad en el
79
80
SNC o a una modificacin de su farmacocintica y perfil de distribucin (Gabathuler, 2009).

La administracin intranasal consiste en la administracin de frmacos a travs de las
neuronas sensitivas olfativas. Los resultados obtenidos de la administracin intranasal de
frmacos grandes como la insulina han sido exitosos en diferentes modelos animales. Es por
ello, por lo que a da de hoy existe un gran inters en el uso de esta va de administracin
como una posible alternativa de entrega de frmacos activos en el SNC, en especial, la de
aquellos frmacos dirigidos al tratamiento de enfermedades como Alzheimer o Parkinson
(Illum, 2000).
Las tecnologas genticas se basan en la entrega al interior cerebral de una molcula
conjugada con un vector (pptidos, protenas modificadas o anticuerpos monoclonales),
utilizando transportes ya existentes de otras sustancias endgenas como la endocitosis
mediada por receptor (Temsamani et al., 2001).
Por ltimo, las nanopartculas, de naturaleza polimrica o lipdica, permiten la
incorporacin al interior del SNC de frmacos que no pueden atravesar la BHE al encubrir sus
propiedades fsico-qumicas. Entre las dificultades que en ocasiones se encuentran en este
tipo de mtodo cabe citar que las nanopartculas pueden ser eliminadas rpidamente de la
circulacin sangunea tras la administracin intravenosa o bien pueden sufrir una degradacin
biolgica (Gabathuler, 2009).
Estas
tcnicas
no
invasivas
parecen
prometedoras.
Sin
embargo,
muchas
investigaciones son todava necesarias para mejorar cada una de estas tcnicas, con el fin de
reducir los inconvenientes que se derivan de su uso, en especial aquellos relacionados con la
biodisponibilidad, prdida de actividad de la molcula en el SNC y efectos secundarios.
MATERIAL Y MTODOS
Material y mtodos
1. MATERIALES
1.1. Equipo instrumental
Durante el desarrollo de este trabajo de Tesis Doctoral se han utilizado los siguientes
equipos:
Agitadores
- Agitador asimtrico orbital-balanceo 3D,

Boeco (Hamburgo, Alemania)
- Agitador magntico con calefaccin Modelo

ARE, VELP Scientifica (Usmate, Italia)
- Agitador
orbital
GFL
3005
(Burgwedel,
Alemania)
Autoclave
- Raypa, Modelo STERICLAV-S, (Barcelona,

Espaa)
Balanzas
- Balanza de precisin Mettler Toledo, Modelo

AJ100, con una sensibilidad de 0,0001 g
- Balanza Balingen-Frommern, Modelo KERN EMB

500-1, con una sensibilidad de 0,1 g
Bao termostatizado
- Bao de agua termostatizado con agitacin

Modelo Unitronic 320 OR, Selecta Precisterm
(Barcelona, Espaa)
Cabinas de flujo laminar
- Cabina de flujo laminar vertical Modelo BV-100,

Telstar Industrial, S.L. (Barcelona, Espaa)
- Cabina de flujo laminar vertical Thermo

Scientific (Barcelona, Espaa)
- Cabina de flujo laminar vertical Thermo

electron corporation, HERA safe (Heraeus,
Alemania)
- Cabina de flujo laminar vertical Gelaire BSB 4 A

(Meckenheim, Alemania)
Cmara digital
- MOTIC Moticam 2500
Centrfugas
- Centrfuga Sorvall RT 6000, Du Pont Instruments

(Giralt, Connecticut, EEUU)
- Centrfuga Sorvall RC-5B, Du Pont Instruments

(Barcelona, Espaa)
83
84
Material y mtodos
Congelador
- Congelador de -80C, Modelo 902, Thermo

Electron Corporation (Madrid, Espaa)
Cromatgrafo lquido de alta
- 1200 Series, Agilent Technologies Inc. (EEUU)
resolucin (HPLC)
Espectrofotmetro
- Espectrofotmetro UV-vis UVIKON 930, Kontron

Instruments (Miln, Italia)
- Espectrofotmetro
SPECTRAmax
384
Plus,
Molecular Devices (Sunnyvale, EEUU)

Fluormetros
- Lector
de
microplacas
FLx800,
BioTek,
Instruments, Inc (Winooski, Vermont, EEUU)
- Lector de microplacas FLUOstar Optima, BMG

Labtech (Offenburg, Alemania)
- Lector de microplacas SPECTRAmax gemini EM,

Molecular Devices (Sunnyvale, EEUU)
Homogeneizador
- Homogeneizador Ultra Turrax T45, marca IkaWerk, Modelo Janke & Kunkel, IKA Biotechnik
(Heidelberg, Alemania)
Incubador
- Incubador de CO2, Modelo Heracell 150, Thermo

Electron Corporation (Barcelona, Espaa)
- Incubador de CO2, Modelo Shell 3500 Series,

Sheldon Manufacturing (Oregon, EEUU)
Lector de placas
- Lector de placas ELISA Digiscan Microplate

Reader V3.0 ASYS Hitech (Eugendorf, Austria)
Mquina de hielo
- Mquina de hielo triturado Scotsman AF-80

(Miln, Italia)
Microscopio ptico
- Microscopio ptico invertido, Nikon TMS (Tokio,

Japn)
- Microscopio ptico invertido, Primo Vert, Carl

Zeiss
MicroImaging
GmbH
(Gttingen,
Alemania)
- Microscopio ptico de contraste de fases Nikon

Optiphot (Tokio, Japn)
pH-metro
- pH Meter Basic 20, Crison Instruments, S.A.

(Barcelona, Espaa)
Sonicador
- Ultrasonic
Processor
Modelo
UP50H
Hielscher GmbH (Teltow, Alemania)

Tanque de nitrgeno lquido
- Taylor-Wharton 35 VHC (Husum, Alemania)
Dr.
Material y mtodos
1.2. Productos qumicos y enzimticos

Los productos qumicos y enzimticos fueron suministrados por los siguientes
proveedores: Sigma-Aldrich Qumica, Panreac Qumica S.A., Invitrogen, Merck, Santa Cruz
Biotechnology, Fluka, GibcoBRL, Boehringer.
1.3. Material
1.3.1. Compuestos en estudio: Diterpenos
Los diterpenos objeto de estudio de la presente Tesis Doctoral (andalusol, conchitriol,
foliol, lagascatriol, linearol y sidol) fueron elucidados estructuralmente por el Dr. Benjamn
Rodrguez del Departamento de Productos Naturales del Instituto de Qumica Orgnica del
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC), formando parte este trabajo de
proyectos previos de colaboracin.
El diterpeno de tipo labdano andalusol se aisl de la especie Sideritis arborescens
Salzm. (Lpez et al., 1977). Tanto el diterpeno de tipo beyerano, conchitriol, como el de tipo
rosano, lagascatriol, se aislaron de Sideritis angustifolia Lag. (von Carstenn-Liechterfelde et
al., 1974; Martn Panizo et al., 1972; Martn Panizo et al., 1973). Los diterpenos derivados del
kaurano, foliol, linearol y sidol se obtuvieron de Sideritis linearifolia Lam. (Garca de
Quesada et al., 1972).
Preparacin de las muestras
Para los estudios de estrs oxidativo y disfuncin mitocondrial, los diterpenos se
disuelven en dimetilsulfxido (DMSO) (Panreac Qumica S.A.) y se realizan diluciones sucesivas
en tampn fosfato salino (PBS) (Invitrogen).
Para los ensayos de cintica de captacin y de paso a travs de barrera
hematoenceflica (permeabilidad), los diterpenos se disuelven en dimetilsulfxido (DMSO)
(Panreac Qumica S.A.), realizndose a continuacin diluciones sucesivas en el vehculo de
transporte [25 mM de HEPES (cido N-2-Hidroxietilpiperacina-N'-2'-Etanesulfnico) (SigmaAldrich) en HBSS (sin rojo fenol) (Hank's Buffered Salt Solution) (Sigma-Aldrich) y 0,1% de
albmina de suero bovino (BSA) (Sigma-Aldrich)].
En ambos casos, la concentracin final de DMSO en las clulas fue menor de 0,1%.
85
86
Material y mtodos
1.3.2. Lneas celulares (Fig.10.)

1.3.2.1. Lneas celulares utilizadas en los estudios de estrs oxidativo y disfuncin
mitocondrial
Lnea celular PC12 (Neuronas)

La lnea celular PC12 se adquiri de la coleccin de cepas American Type Culture
Collection (ATCC).
Esta lnea celular, utilizada comnmente en el estudio del desarrollo y funcin
neuronal, procede de un feocromocitoma de rata (Rattus norvegicus), un tipo de tumor
derivado de las glndulas suprarrenales.
Las clulas PC12 presentan un comportamiento muy diferente en funcin del
protocolo de cultivo utilizado. Si se cultivan en un medio que contiene suero, adoptan una
morfologa esfrica y presentan una baja capacidad de adherencia, tendiendo a crecer
formando agrupaciones. Este comportamiento es el presentado por las clulas en nuestro
estudio. Sin embargo, si se utiliza el factor de crecimiento nervioso (NGF) en lugar del suero,
las clulas se diferencian, desarrollando neuronas ramificadas, volvindose elctricamente
excitables y pueden llegar a adquirir propiedades fenotpicas de las neuronas simpticas. Por
ello, son comnmente utilizadas para reemplazar clulas neuronales en estudios de
investigacin de las enfermedades neurodegenerativas y de los efectos de frmacos en estos
desrdenes (Greene and Tischler, 1976; Amit et al., 2008).
Lnea celular U373-MG (Astrocitos)
La lnea celular U373-MG se adquiri desde Sigma-Aldrich procedente de la Coleccin
Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC).
Esta lnea celular deriva de un astrocitoma-glioblastoma cerebral humano de grado III.
Los astrocitos presentan morfologa epitelial, aspecto estrellado y se adhieren con facilidad a
la superficie del material de cultivo, presentando un crecimiento en monocapa.
1.3.2.2. Lneas celulares utilizadas en los estudios de paso a travs de BHE

Lnea celular RBE4
Material y mtodos
La lnea celular RBE4 es el tipo celular mejor caracterizado entre las diferentes
clulas endoteliales de cerebro inmortalizadas disponibles. Deriva de clulas del endotelio de
la microcirculacin de cerebro de rata inmortalizadas por transfeccin con el plsmido pE1Aneo. Este plsmido contiene el gen de la regin E1A del adenovirus 2 y el gen de la resistencia
a la neomicina como marcador selectivo (Roux et al., 1989; Roux et al., 1994).
Las clulas RBE4 fueron amablemente cedidas por el Dr. Pierre Olivier Couraud del
Instituto Cochin del Instituto Nacional de la Salud y de la Investigacin Mdica (INSERM) de
Pars (Francia).
Lnea celular ECV304
La lnea celular ECV304 corresponde a clulas endoteliales de cordn umbilical
humano. Esta lnea celular se obtuvo de la Coleccin Europea de Cultivos Celulares Animales
(ECACC).
Lnea celular C6
Esta lnea procede de clulas de glioma de rata. Se adquiri de la Coleccin Europea
de Cultivos Celulares Animales (ECACC). En este trabajo, se emplearon sistemas de cocultivos
entre las lneas celulares ECV304 y C6.
LNEA CELULAR
U373-MG
PC12
RBE4
ECV304
C6
Origen
Humano
Rata
Rata
Humano
Rata
Tejido
Cerebro
Glndula
suprarrenal
Cerebro
Cordn
umbilical
Cerebro
Morfologa
Epitelial
Esfrica,
poligonal
Endotelial
Endotelial
Neural
Crecimiento
Adherente
Suspensin
Adherente
Adherente
Adherente
Tendencia a
agruparse,
pobre
adherencia
Fig.10. Caractersticas de las lneas celulares utilizadas en la presente Tesis Doctoral.
87
88
Material y mtodos
2. MTODOS
2.1. Cultivos celulares
2.1.1. Mantenimiento de los cultivos
Lnea celular PC12
Se cultiva en frascos de cultivo de 75 cm2 (Sarstedt), colocados en vertical para su
crecimiento en suspensin. El medio de cultivo utilizado es Dulbeccos Modified Eagles
Medium (DMEM) (Gibco, Invitrogen Corporation) suplementado con 0,5% de gentamicina
(Gibco, Invitrogen Corporation) y 0,2% de piruvato (Sigma-Aldrich) para mantener el pH
adecuado. Para favorecer la proliferacin celular se utiliza adems suero fetal bovino (FBS) al
5% y suero de caballo (HS) al 10% y para el mantenimiento del cultivo se utiliza suero de
caballo (HS) al 1% (Gibco, Invitrogen Corporation).
Las clulas se mantienen a 37C en atmsfera de aire al 95% y de CO2 al 5%. El medio
de cultivo se cambia cada 2-3 das y se realizan pases de 1:2 a 1:3 al alcanzarse el 80% de
confluencia.
Para los ensayos experimentales, las placas de Petri y las placas de 24, 48 y 96
pocillos se revisten durante 2 horas con polilisina L (10 mg/mL) (Sigma) para favorecer la
adherencia de las clulas PC12.
Lnea celular U373-MG
Esta lnea se siembra en frascos de cultivo de 75 cm2 (Sarstedt), siendo el medio de
cultivo empleado Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) (Gibco, Invitrogen Corporation)
suplementado con 0,5% de gentamicina (Gibco, Invitrogen Corporation) y suero fetal bovino
(FBS) (Gibco, Invitrogen Corporation) al 10% para favorecer la proliferacin celular o al 1%
para mantener el cultivo.
Las clulas se mantienen en condiciones de temperatura y atmsfera hmeda de
37C, 95% de aire y 5% de CO2. El medio de cultivo se cambia unas 2-3 veces/semana y se
realizan pases de 1:3 a 1:6 al alcanzarse el 80% de confluencia.
Material y mtodos
Lnea celular RBE4

Las clulas RBE4 crecen en frascos de cultivo de 25 cm2 (Sarstedt) tapizados durante
al menos 3 horas con 3 mL de una solucin de colgeno obtenida a partir del tendn de cola
de rata (ver procedimiento de obtencin de colgeno descrito abajo). Las clulas se
mantienen en una atmsfera de 95% de aire y 5% de CO 2, saturada de humedad a 37C. El
medio de cultivo empleado es Hams F-10/-Minimum Essential Medium (-MEM) (1:1) (Gibco,
Invitrogen Corporation), suplementado con Glutamax (Sigma-Aldrich), 10% de suero fetal de
ternero (Gibco, Invitrogen Corporation), geneticina (300 g/mL) (Sigma-Aldrich) y factor
bsico de crecimiento de fibroblastos (bFGF, 1 ng/mL) (Boehringer). El medio de cultivo se
cambia cada 2 das y se realizan pases celulares cada 5-6 das al alcanzarse el 80% de
confluencia celular.
Mtodo de extraccin/obtencin de colgeno (a partir del tendn de la cola de rata)
El colgeno se obtiene a partir de los tendones de las colas de ratas Wistar
procedentes de animales de experimentacin sacrificados, siguiendo el procedimiento
descrito por Strom and Michalopoulos (1982). Las colas de rata se conservan a -20C,
pudindose mantener durante un perodo mximo de ao y medio para la obtencin del
colgeno. Dos horas antes de iniciar la extraccin del mismo se descongelan a temperatura
ambiente. A continuacin, se realiza una incisin longitudinal no muy profunda a lo largo de
toda la cola para eliminar la piel que la recubre. Seguidamente se secciona cada tres o cuatro
espacios intervertebrales desde el extremo hacia la base para extraer las fibras de colgeno
de los tendones. stas se desecan a temperatura ambiente durante 3 horas y se pesan para
determinar la cantidad de fibras de colgeno de la que se dispone. A continuacin, se
exponen a la luz UV durante 48 horas. Pasado este tiempo, se aade 1 g de las fibras de
colgeno disecadas a 300 mL de una solucin de cido actico 0,1% (1 mL de cido actico
glacial a 1000 mL de agua destilada) y se mantiene la solucin en agitacin a baja velocidad
durante 72 horas. Por ltimo, los restos de fibras se eliminan por filtracin a travs de una
triple gasa estril. Una dilucin 1:10 de la solucin de colgeno stock se prepara para el
tapizado de los frascos y placas de cultivo para el ptimo crecimiento de la lnea celular
RBE4.
Modelo de cocultivo celular ECV304/C6
Estas clulas crecen en frascos de cultivo de 75 cm2 (Sarstedt), en medio M199
89
90
Material y mtodos
(Sigma) suplementado con Glutamax (Sigma-Aldrich), 10% de suero fetal de ternero (Gibco,
Invitrogen Corporation) y penicilina/estreptomicina (100 U/mL; 100 g/mL) (Gibco,
Invitrogen Corporation). Las clulas se mantienen en atmsfera hmeda de 5% CO2/95% aire a
37C.
El medio se cambia cada 2-3 das, y se realizan pases cuando se alcanza confluencia
celular (80%).
2.1.2. Subcultivos celulares

Cuando las clulas alcanzan el 80% de confluencia, se realizan subcultivos celulares
pases con el fin de mantenerlas en condiciones de replicacin normal. Para ello, se elimina
el medio de cultivo y se lavan las clulas con PBS sin calcio ni magnesio. Se tripsinizan las
clulas con una solucin de tripsina-EDTA durante 3 minutos a 37C. Transcurrido este
tiempo, se inactiva la tripsina aadiendo 10 mL de medio correspondiente a cada lnea
celular. En el caso de las lneas celulares PC12, ECV304 y C6 se procede a realizar el cultivo.
Las lneas celulares U373-MG y RBE4, requieren de un paso ms en el procedimiento. As estas
clulas se centrifugan a 800 rpm durante 5 minutos, se elimina el sobrenadante y se aaden
10 mL del correspondiente medio. Finalmente se procede a cultivar las clulas tras el
recuento celular.
2.1.3. Congelacin celular o criopreservacin celular

Las clulas en suspensin se congelan en una solucin de suero fetal bovino (FBS) con
glicerol al 10% como agente crioprotector. El glicerol es capaz de penetrar en el interior
celular, evitando as la formacin de cristales de hielo que puedan destruir la integridad de
las membranas y orgnulos celulares.
Las clulas se mantienen 24 horas en un congelador de -20C. A continuacin, se
transfieren a un congelador de -80C en donde se mantienen un tiempo mnimo de una
semana y un mximo de dos meses. Para perodos ms prolongados de tiempo, las clulas se
almacenan sumergidas en nitrgeno lquido (-196C).
La velocidad de congelacin de las clulas debe ser gradual para minimizar el dao
celular. Si es muy rpida, la clula no es capaz de deshidratarse, favorecindose la formacin
de hielo intracelular. Por el contrario, si la velocidad de enfriamiento, es lenta, conlleva a
una deshidratacin extrema de la clula pudindose llegar al colapso celular (Mazur, 1984).
Material y mtodos
2.1.4. Descongelacin celular

A diferencia del proceso de congelacin, la descongelacin celular debe ser rpida
para evitar la formacin de cristales de hielo durante la rehidratacin. Una vez descongeladas
las clulas (unos 60 segundos en un bao a 37C), se resuspenden en el medio de cultivo,
especfico para cada lnea celular, con el fin de evitar la toxicidad del agente crioprotector.
Las clulas se centrifugan a 800 rpm durante 5 minutos y se elimina el sobrenadante para
eliminar los restos de glicerol. Finalmente, el pellet celular se resuspende en el medio de
cultivo y las clulas se siembran en frascos de cultivo. A las 24 horas, se cambia el medio para
retirar las clulas muertas y los restos de glicerol que pueden afectar al crecimiento celular.
Transcurridos 10 das desde la descongelacin, y tras su mantenimiento cambiando el medio
cada 2-3 das, las clulas ya pueden ser utilizadas.
2.1.5. Recuento celular

El nmero de clulas viables in vitro de una suspensin celular se determina mediante
la tcnica de exclusin con azul tripn en cmara de Neubauer.
El colorante azul tripn tie de manera selectiva las clulas muertas, mientras que las
vivas, al presentar intactas las membranas citoplasmticas, impiden el paso del colorante al
interior celular.
La cmara de Neubauer se carga con una suspensin celular a una dilucin 1:10 con el
azul tripn. Se cuenta el nmero de clulas vivas presentes en los cinco cuadrantes de la
cmara y se obtiene el valor medio. El nmero de clulas por mililitro de suspensin permite
calcular el nmero de clulas total.
N clulas
contadas
N clulas totales =
4
Volumen final de
Factor de
X 10 X dilucin X la suspensin
N cuadros
contados
Factor de
conversin de la
cmara
91
92
Material y mtodos
2.2. Mtodos para el estudio de estrs oxidativo y disfuncin

mitocondrial
2.2.1. Tratamiento de las clulas
Las clulas U373-MG y PC12 se tratan con los diterpenos objeto de estudio (diferentes
concentraciones segn el propio desarrollo de la Tesis) durante 24 h, y posteriormente con
H2O2 (1 mM para las clulas U373-MG y 0,1 mM para las clulas PC12) durante 30 minutos.
Las concentraciones y tiempo de incubacin utilizadas para H2O2 corresponden a
aquellas condiciones experimentales que causan aproximadamente el 50% de mortalidad (IC 50)
en las respectivas lneas celulares (Naval, 2006; Martn, 2009).
2.2.2. Ensayos de citotoxicidad

2.2.2.1. Mtodo de reduccin de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5difeniltetrazol (MTT)
Fundamento
La determinacin de la viabilidad celular mediante el ensayo de reduccin de MTT se
realiza siguiendo el mtodo original de Mossmann (1983) con algunas modificaciones.
Se trata de un mtodo colorimtrico cuantitativo que mide la actividad metablica de
las clulas en fase de proliferacin activa. Este mtodo se basa en la apertura del anillo de la
sal de tetrazolio, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT), en el
interior de las mitocondrias de las clulas vivas, por accin de la enzima succinato
deshidrogenasa. El producto resultante, formazn, forma unos cristales morados insolubles en
agua pero que se solubilizan con disolventes orgnicos, como dimetilsulfxido (DMSO). La
cantidad de formazn formado se determina espectrofotomtricamente y es directamente
proporcional al nmero de clulas metablicamente activas, siendo un indicador de la
integridad y actividad de las mitocondrias (Mosmann, 1983; Liu et al., 1997; Takahashi et al.,
2002).
Material y mtodos
Reactivos
Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) (Sigma-Aldrich)
Dimetilsulfxido (DMSO) (Panreac Qumica S.A.)
Solucin de fosfato salino (PBS) (Invitrogen)
Procedimiento
1.- Efecto de los diterpenos sobre la integridad y actividad funcional de las mitocondrias de
las clulas
Las lneas celulares U373-MG (5 x 104 clulas/pocillo) y PC12 (2 x 10 4 clulas/pocillo)
se siembran en placas de 96 pocillos y se incuban a 37C y 5% de CO2 durante 24 horas.
Transcurrido este tiempo, las clulas se tratan con diferentes concentraciones de los
diterpenos en estudio (rango de concentraciones de 1-100 M) durante 24 horas. A
continuacin, se adicionan 100 L/pocillo de una mezcla de una disolucin de MTT (2 mg/mL
en PBS) y medio DMEM al 10%. Las clulas se mantienen en incubacin a 37C durante 1 hora.
Los cristales de formazn formados se disuelven por adicin de 100 L de DMSO/pocillo con
agitacin vigorosa de la placa para asegurarse una completa solubilizacin. La medicin se
realiza espectrofotomtricamente a una longitud de onda de 550 nm.
Los resultados se expresan como % de reduccin de MTT, considerndose como 100%
la media de las absorbancias de los pocillos con clulas no sometidas a ningn tratamiento
(control).
2.- Efecto de los diterpenos sobre la integridad y actividad funcional de las mitocondrias de
las clulas en un modelo de estrs oxidativo inducido por H2O2
El procedimiento seguido es el mismo que el desarrollado en el apartado anterior, con
la diferencia de que las clulas se someten a estrs oxidativo producido por H2O2. A las 24
horas del pretratamiento con diferentes concentraciones de los diterpenos en estudio (1; 2,5;
5 y 10 M), las clulas se exponen a H2O2 durante 30 minutos. Veinticuatro horas despus, se
realiza el ensayo de MTT en las mismas condiciones experimentales del apartado anterior.
93
94
Material y mtodos
2.2.2.2. Evaluacin del dao celular por liberacin de lactato deshidrogenasa (LDH)
Fundamento
La enzima lactato deshidrogenasa (LDH) presenta localizacin citoplasmtica, de
manera que la cuantificacin de la enzima liberada en el medio de cultivo celular, es un
indicativo de la viabilidad relativa y de la integridad de la membrana plasmtica.
La actividad de LDH se determina espectrofotomtricamente siguiendo el mtodo de
Koh and Choi (1987). LDH cataliza la reduccin de piruvato a lactato usando NADH como
cofactor. La disminucin de la absorbancia debido a la oxidacin de NADH a NAD+ es
proporcional a la actividad de LDH. La tasa de disminucin de la absorbancia como
consecuencia de la conversin de NADH a NAD+, medida durante 1 minuto a 340 nm, ser
directamente proporcional a la actividad de LDH.
Reactivos
Nicotinamida adenina dinucleotido (NADH) (Sigma-Aldrich)
Piruvato sdico (Sigma-Aldrich)
Tampn fosfato (NaH2PO4, Na2HPO4) (Panreac Qumica S.A.)
Tritn X-100 (Sigma-Aldrich)
Procedimiento
1.- Efecto de los diterpenos sobre la integridad de la membrana plasmtica de las clulas
Las clulas U373-MG y PC12, sembradas en placas de 24 pocillos y una vez alcanzado
entre 80-90% de confluencia, se tratan con los diterpenos en estudio (rango de
concentraciones de 1-100 M) durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se recogen los
sobrenadantes, los cules contienen la LDH liberada al medio de cultivo por las clulas
muertas, y se centrifugan a 3000 rpm durante 5 minutos y a 4C para eliminar los restos
celulares. Los sobrenadantes, una vez centrifugados se utilizan para la determinacin de la
enzima LDH liberada. Se toman 100 L de los sobrenadantes de cada muestra y se aaden 100
L de una mezcla reactiva de 0,18 mM de piruvato sdico y 0,60 mM de NADH en tampn
fosfato (50 mM NaH2PO4 + Na2HPO4, pH 7,4). La tasa de disminucin de la absorbancia, como
consecuencia de la conversin de NADH a NAD+, medida durante 1 minuto a 340 nm, ser
directamente proporcional a la actividad de la LDH.
Material y mtodos
Los resultados se expresan como % de liberacin de LDH, siendo el mximo liberado

de la enzima el correspondiente al producido por el Tritn X-100, agente que causa
mortalidad por lisis celular.
2.- Efecto de los diterpenos sobre la integridad de la membrana plasmtica de las clulas en
un modelo de estrs oxidativo inducido por H2O2
Las clulas U373-MG y PC12 se tratan durante 24 horas con diferentes concentraciones
de los diterpenos en estudio (1; 2,5; 5 y 10 M), previo a la exposicin durante 30 minutos con
H2O2, especie mayoritaria de oxgeno e inductora de estrs oxidativo. Veinticuatro horas
despus, se lleva a cabo la evaluacin del dao celular por liberacin de LDH, en las mismas
condiciones experimentales desarrolladas en el apartado anterior.
2.2.2.3. Estudio de la morfologa celular

El estudio de la morfologa celular se lleva a cabo utilizando un microscopio de
contraste de fases (objetivo 40x). Se toman imgenes con una cmara digital.
2.2.3. Evaluacin de la actividad antioxidante total

2.2.3.1. Medida de la generacin intracelular de radicales libres. Tcnica de
diclorofluorescena (DCFH-DA)
Fundamento
2,7-diclorofluorescena diacetato (DCFH-DA) es un compuesto no fluorescente que
atraviesa las membranas celulares. En el interior de las clulas, DCFH-DA por accin
enzimtica de esterasas intracelulares es deacetilada a DCFH, compuesto intermediario que
en presencia de especies reactivas de oxgeno es oxidado al compuesto fluorescente
diclorofluorescena (DCF). La intensidad de la fluorescencia ser directamente proporcional a
la cantidad de especies reactivas de oxgeno generadas (LeBel et al., 1992; Wang and Joseph,
1999; Afri et al., 2004).
Reactivos
2,7-diclorofluorescena diacetato (DCFH-DA) (Sigma-Aldrich)
95
96
Material y mtodos
Glucosa (Panreac Qumica S.A.)
Procedimiento
Se siembran 5 x 104 clulas/pocillo para la lnea celular U373-MG y 4 x 104
clulas/pocillo para la lnea celular PC12 en placas de 96 pocillos. Veinticuatro horas
despus, las clulas se tratan con los diterpenos (5 y 10 M) durante 24 h, previo a la adicin
de H2O2 (1 mM para la lnea celular U373-MG y 0,1 mM para la lnea celular PC12) durante 30
minutos. Tras los tratamientos, se aaden 200 L/pocillo de una mezcla de una solucin de
0,01 mM DCFH-DA con PBS glucosado (180 mg glucosa/100 mL PBS estril) y se mantiene la
placa en incubacin durante 30 minutos a 37C. Despus de este tiempo, las clulas se lavan
con 200 L/pocillo de PBS glucosado y se procede a la lectura utilizando un Fluormetro
Lector de microplacas FLx800, BioTek, Instruments, Inc., en las condiciones de lectura de
excitacin 480 nm y de emisin 510 nm. Las medidas se toman cada 10 minutos en la primera
hora de medida (7 medidas) y cada 30 minutos en la siguiente hora (2 medidas).
2.2.3.2. Ensayo de capacidad de absorcin de radicales de oxgeno (ORAC)

Fundamento
La capacidad antioxidante de los diterpenos se determina mediante el ensayo ORAC
siguiendo el mtodo descrito por Dvalos et al. (2004) con algunas modificaciones. Este
mtodo se basa en la prdida de fluorescencia que experimenta el compuesto fluorescena,
en presencia de radicales peroxilo generados por la descomposicin trmica del
azocompuesto AAPH. Aquellos compuestos con actividad antioxidante, capaces de neutralizar
los radicales peroxilo, impedirn que stos reaccionen con la fluorescena y por tanto se
evitar una cada brusca en la intensidad de la fluorescencia.
Reactivos
2,2-azobis (2-amidinopropano) dihidrocloruro (AAPH) (Sigma-Aldrich)
Fluorescena (Sigma-Aldrich)
Metanol (Panreac Qumica S.A.)
Tampn PBS (K2HPO4, NaH2PO4) (Panreac Qumica S.A.)
Trolox (cido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxlico) (Sigma-Aldrich)
Material y mtodos
Procedimiento
Los diterpenos se disuelven inicialmente en metanol (1 mg/mL) y se preparan hasta
doce diluciones diferentes en PBS (0,075 M, pH 7,4). Se utiliza Trolox (anlogo sinttico
hidrosoluble de la vitamina E) como compuesto antioxidante de referencia para la
preparacin de una recta de calibrado (rango de 1 a 8 M). Las soluciones de diterpenos,
Trolox y fluorescena (120 L, 70 nM en la concentracin final) se aaden a una placa de 96
pocillos de poliestireno negro y se preincuban durante 10 minutos a 37C. Pasado este
tiempo, se adiciona el radical iniciador, AAPH (60 L ,12 mM concentracin final). La
fluorescencia se mide cada 90 segundos durante 2 horas y media a una longitud de onda de
excitacin de 485 nm y a una longitud de onda de emisin de 520 nm en el lector de
fluorescencia FLUOstar Optima. Todas las muestras de los diterpenos y del Trolox se ensayan
por duplicado en cada placa. Los resultados corresponden al menos a tres ensayos
independientes de cada una de las muestras.
Para el anlisis de los resultados, las curvas de fluorescencia versus tiempo para cada
una de las muestras se normalizan por la curva del blanco (sin antioxidantes). A continuacin,
se determina el rea bajo la curva (AUC) de descenso de la fluorescencia mediante la
siguiente frmula, en donde f0 es la fluorescencia en el minuto cero y fi es la fluorescencia en
el tiempo i:
i = 104
AUC = 1 + fi/f0
i=1
Posteriormente, se calcula el rea bajo la curva neta (AUC) para cada muestra:
AUC neta = AUC antioxidante AUC blanco
De esta forma se calculan las ecuaciones de las rectas de regresin correspondientes

al rea neta y la concentracin de cada antioxidante. El valor de la pendiente de recta
obtenido para el Trolox y para cada muestra se utiliza para determinar el valor ORAC. Los
resultados se expresan como equivalentes de Trolox (moles de Trolox/mg de muestra
analizada).
97
98
Material y mtodos
2.2.4. Determinacin de la concentracin de protenas

Fundamento
La concentracin de protenas totales se determina mediante el mtodo del cido
bicinconnico (BCA) (Smith et al., 1985), basado en el mtodo previamente desarrollado por
Lowry et al. (1951). El cido bicinconnico, en su forma de sal sdica, es capaz de formar un
complejo prpura intenso con los iones cuprosos (Cu1+) producidos en la reaccin entre las
protenas y los iones cpricos (Cu2+) en medio alcalino (reaccin de Biuret). La intensidad de
color, medida espectrofotometricamente, ser directamente proporcional a la concentracin
de protenas.
OHProtena + Cu2+
Cu1+ + BCA
Cu1+
complejo prpura BCA- Cu1+
Reactivos
lbumina srica bovina (BSA) (Sigma-Aldrich)
Solucin de cido bicinconnico (Sigma-Aldrich)
Solucin de sulfato de cobre (II) (Sigma-Aldrich)
Procedimiento
En placas de 96 pocillos, se adicionan 3 L de los sobrenadantes de los extractos
celulares de cada muestra. Asimismo, y partiendo de una solucin stock de BSA de 1 mg/mL,
se prepara una recta patrn con concentraciones conocidas de dicha protena. Cada pocillo se
completa hasta un volumen total de 25 L con agua destilada. Por ltimo, se aaden 200
L/pocillo de una mezcla reactiva de cido bicinconnico al 98% (v/v) y de sulfato de cobre
(II) al 2% (v/v). El volumen final en cada pocillo es de 225 L. La placa se incuba durante 30
minutos a 37C. La lectura espectrofotomtrica se realiza a una longitud de onda de 550 nm
en un lector de placas Digiscan 340. La concentracin de protenas se determina por
interpolacin de los valores de absorbancia obtenidos para cada una de las muestras en la
recta patrn de BSA. Los resultados se expresan como mg de protena/mL de muestra.
Material y mtodos
2.2.5. Determinacin de la peroxidacin lipdica

Fundamento
Para la cuantificacin de la peroxidacin lipdica se miden los niveles de MDA
presentes en cada muestra mediante cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC), siguiendo
un protocolo modificado de Grotto et al. (2007).
Reactivos
Malondialdehido (MDA) (Merck)
Metanol HPLC (Panreac Qumica S.A.)
Acetonitrilo HPLC (Panreac Qumica S.A.)

Preparacin de las soluciones estndar
Se prepara una solucin madre de MDA en agua (3 mM). A partir de la misma, se
preparan diferentes diluciones en agua dentro del rango de concentraciones de 0,28 a 6,6 M.
Preparacin de las muestras celulares
Se toman 200 L del sobrenadante de los extractos celulares totales de cada muestra,
preparados tal y como se indica en el apartado 2.2.7. del material y mtodos, y se aaden
200 L de acetonitrilo con pureza para HPLC con el objeto de precipitar las protenas. Las
muestras se agitan en el vrtex y se centrifugan durante 10 minutos a 3000 rpm a 4C. A
continuacin, los sobrenadantes se filtran a travs de filtros con un tamao de poro de 0,22
m, como paso previo a su anlisis por HPLC.
Instrumentacin y condiciones cromatogrficas
Se ha utilizado un equipo de cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) Agilent
Technologies, modelo 1200 Series, equipado con inyector automtico, bomba con sistema de
desgasificacin, detector de diodos y software para el procesado de datos cromatogrficos
(Agilent ChemStation). La columna analtica es de fase reversa Mediterranean Sea C 18 (5 m
99
100
Material y mtodos
de dimetro de partcula, 15 x 0,46 cm de dimetro interno) (Teknokroma, Barcelona,

Espaa)
Las condiciones cromatogrficas establecidas han sido las siguientes:
Fase mvil: agua Milli-Q/metanol (50:50 v/v)
Elucin isocrtica
Longitud de onda de deteccin: 254 nm
Flujo: 0,6 mL/min
Volumen inyectado: 10 L
Temperatura ambiente
Tiempo de anlisis: 8 minutos

El metanol usado ha sido de grado HPLC (Panreac Qumica S.A.) y el agua, ultrapura
(sistema Milli-Q plus). Previo a su uso, cada una de estas soluciones se filtran a vaco,
utilizando para ello filtros de membrana de tamao de poro de 45 m.
En la Fig.11. se ilustra un cromatograma representativo de MDA patrn. El tiempo de
retencin de MDA se ha situado a 1,6 min.
400
mAU
1.58
300
200
100
0
0
min
Fig.11. Cromatograma representativo de MDA.
Se ha realizado una curva de calibracin con diferentes concentraciones de MDA

(0,28; 0,56; 1,7; 3,4 y 6,6 M) para determinar la concentracin de este producto secundario
de la peroxidacin lipdica en cada una de las muestras (ver apartado de resultados 1.1.4. y
1.2.4.).
Material y mtodos
Los valores del coeficiente de correlacin lineal (r) y del coeficiente de determinacin
(r2) han demostrado una buena respuesta linealidad dentro del rango de concentraciones
ensayadas de MDA (Fig.12.).
MDA
18000
16000
14000
rea
12000
10000
8000
y 2248,6 x 870,75
r 0,9923
r 2 0,9848
6000
4000
2000
0
0
Concentracin ( M)
Fig.12. Recta de calibrado para MDA. La ecuacin de la recta de calibrado se ha utilizado para la
cuantificacin de la concentracin de MDA en las muestras celulares de PC12 y U373-MG tratadas con los
diterpenos en estudio y H2O2.
2.2.6. Determinacin de los niveles de glutation reducido (GSH) y de glutation

oxidado (GSSG)
Fundamento
El glutation, tripptido compuesto por los aminocidos cistena, cido glutmico y
glicina (L--glutamil-L-cisteinil-glicina), es el principal antioxidante no enzimtico del
organismo. Segn su estado de oxidacin, puede encontrarse como glutation reducido (GSH),
que es la forma activa, o como glutation oxidado (GSSG). La forma reducida, a travs de su
grupo sulfhidrilo del residuo de la cistena, ejerce un papel protector frente a ROS.
Los niveles de GSH y de GSSG se determinan de acuerdo al mtodo descrito por Hissin
and Hilf (1976), mtodo modificado del protocolo original de Cohn and Lyle (1966). Dicho
mtodo se basa en la capacidad del fluorforo o-ftaldehido (OPT) para reaccionar como un
agente heterobifuncional con aminas primarias en presencia de grupos tiol, sulfitos o
101
102
Material y mtodos
cianidinas, generando un isoindol fluorescente que se mide a una longitud de onda de

excitacin de 350 nm y de emisin de 420 nm.
GSH reacciona de manera especfica con OPT a pH 8,0 mientras que GSSG lo hace a un
pH de 12. Se ha observado que a pH mayores de 8,0, GSH se oxida a GSSG. Para prevenir
dicha conversin en la determinacin de los niveles de GSSG se aade a cada muestra Netilmaleimida (NEM) que reacciona con GSH formando un complejo estable. De esta manera
se obtienen valores reales de GSSG, y no del resultado de la oxidacin de GSH a GSSG que se
produce a pH por encima de 8,0 (Hissin and Hilf, 1976; Senft et al., 2000).
Reactivos
cido perclrico (HClO4) (Panreac Qumica S.A.)
cido etilendiaminotetraactico (EDTA) (Panreac Qumica S.A.)
Glutation oxidado (GSSG) (Sigma-Aldrich)
Glutation reducido (GSH) (Sigma-Aldrich)
Hidrxido sdico (NaOH) (Panreac Qumica S.A.)
N-etilmaleimida (NEM) (Sigma-Aldrich)
o-ftalaldehdo (OPT) (Sigma-Aldrich)
Tampn fosfato (NaH2PO4 + Na2HPO4) (Panreac Qumica S.A.)
Procedimiento
Las clulas U373-MG (4 x 106 clulas/placa petri) y PC12 (2 x 10 6 clulas/placa petri),
una vez tratadas (diterpenos, 5 y 10 M, 24 h; H2O2, 1 mM para U373-MG y 0,1 mM para PC12,
30 min) se recogen por raspado o scrapping. Seguidamente, los extractos celulares se
centrifugan a 800 rpm durante 5 minutos y se elimina el sobrenadante. Los pellets celulares
se lavan entonces con PBS y se centrifugan durante otros 5 minutos a 800 rpm. Los
sobrenadantes son eliminados, y los extractos celulares totales se resuspenden en 300 L de
una solucin de tampn fosfato (0,1 M NaH2PO4 + Na2HPO4, 0,005 M EDTA, pH 8.0). Cada una
de las muestras, mantenidas en hielo, se sonican durante 10 segundos para romper las
membranas celulares y as extraer el contenido celular. A continuacin, las muestras se
centrifugan a 2500 rpm durante 10 minutos (4C). Una alcuota de 3 L del sobrenadante se
reserva para la determinacin de la concentracin de protenas mediante el mtodo del cido
Material y mtodos
bicinconnico segn se detalla en el punto 2.2.4. del material y mtodos. Las protenas, que
permanecen en el sobrenadante, se precipitan con 1% de cido perclrico (HClO 4) (v/v)
durante 5 minutos, siendo entonces las muestras centrifugadas a 14000 rpm durante 10
minutos a 4C. Los sobrenadantes se utilizan para la determinacin de los niveles de glutation
reducido (GSH) y de glutation oxidado (GSSG) en cada una de las muestras.
Determinacin de glutation reducido (GSH)
Para medir los niveles de GSH, en cada pocillo de una placa de 96, se adicionan 50 L
del sobrenadante de cada muestra, 150 L de una solucin de tampn fosfato (0,1 M NaH 2PO4
+ Na2HPO4, 0,005 M EDTA, pH 8.0) y 20 L de una solucin de OPT (concentracin 1 mg/mL en
metanol) y se mantiene la placa en incubacin durante 15 minutos a temperatura ambiente.
La fluorescencia se mide a una longitud de onda de excitacin de 350 nm y a una longitud de
onda de emisin de 420 nm en un Fluormetro Lector de Placas (FLx800, BioTek, instruments).
Determinacin de glutation oxidado (GSSG)
Para medir los niveles de GSSG, se adicionan 50 L del sobrenadante de cada muestra
y 3 L de NEM 7,5 M en cada pocillo de una placa de 96. La mezcla se mantiene en incubacin
durante 5 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. A continuacin, se adicionan 150 L
de tampn NaOH (0,1N, pH 12) y 20 L de una solucin de OPT (concentracin 1 mg/mL en
metanol). La placa se mantiene entonces en incubacin durante 15 minutos a temperatura
ambiente. La fluorescencia se mide a una longitud de onda de excitacin de 350 nm y a una
longitud de onda de emisin de 420 nm en un Fluormetro Lector de Placas (FLx800, BioTek,
instruments).
Clculos
Los niveles de GSH y GSSG en cada una de las muestras se determinan por
interpolacin de sus correspondientes valores de fluorescencia en rectas patrn realizadas a
partir de concentraciones conocidas de glutation reducido y oxidado. La cantidad de GSH y
GSSG, expresada en nmoles, se normaliza por la cantidad de protena en cada muestra
(nmoles de GSH GSSG/mg de protena en la muestra).
Los resultados se expresan mediante el ndice redox (IR). En una situacin de estrs
oxidativo, la concentracin de glutation oxidado se encuentra aumentada con la consiguiente
103
104
Material y mtodos
alteracin del estado redox de glutation, disminuyendo el cociente GSH/GSSG (Sies, 1986).
IR = GSH/GSSG
2.2.7. Preparacin de extractos celulares totales, citoplasmticos y nucleares

Los extractos celulares totales se utilizan para la determinacin de la actividad y de
la expresin de las enzimas antioxidantes (CAT, SOD, GR, GPx y HO-1), para la determinacin
de los niveles de MDA, para la determinacin de la actividad de caspasa-3 as como para la
cuantificacin de protenas.
Los extractos celulares citoslicos y nucleares se utilizan para la determinacin de la
expresin del factor Nrf2.
Reactivos
Fluoruro de fenilmetanosulfonio (PMSF) (Sigma-Aldrich)
Leupeptina (Sigma-Aldrich)
Cloruro de sodio (NaCl) (Panreac Qumica S.A.)
Pepstatina (Sigma-Aldrich)
Tris (Sigma-Aldrich)
cido de etileno glicol tetraactico (EGTA) (Sigma-Aldrich)
cido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil-(1)] etanosulfnico (HEPES) (Sigma-Aldrich)
Glicerol (Sigma-Aldrich)
Ditiotreitol (DTT) (Panreac Qumica S.A.)
Fluoruro de sodio (NaF) (Sigma-Aldrich)
Vanadato de sodio (NaVO4) (Sigma-Aldrich)
Molibdato de sodio (Na2MoO4) (Sigma-Aldrich)
Material y mtodos
Procedimiento
1.- Obtencin de extractos celulares
Las clulas U373-MG y PC12 se siembran en placas petri a una densidad de 4 x 10 6
clulas/placa y 2 x 106 clulas/placa, respectivamente. Tras los correspondientes
tratamientos con los diterpenos (5 y 10 M, 24 h) y con H2O2 (1 mM para U373-MG y 0,1 mM
para PC12, 30 minutos), las clulas se recogen mediante raspado o scrapping para la
obtencin de los extractos celulares. A continuacin, se centrifugan a 800 rpm durante 5
minutos y se elimina el sobrenadante. Las clulas se lavan entonces con una solucin de
tampn fosfato salino (PBS) y se centrifugan nuevamente a 800 rpm durante otros 5 minutos.
Finalmente, se elimina el sobrenadante y los extractos celulares se conservan a -20C hasta su
utilizacin.
2.- Preparacin de los extractos celulares totales, citoslicos y nucleares
2.1) Preparacin de los extractos celulares totales para determinar la actividad y expresin
de las enzimas antioxidantes (CAT, SOD, GR, GPx y HO-1), los niveles de MDA, actividad
caspasa-3 y concentracin de protenas
Los pellets celulares se resuspenden en 300 L de una solucin formada por tampn
de lisis a pH 7,4 (Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, y 0,1% Tritn X-100) y antiproteasas
[20 L/mL de leupeptina (1 mg/mL), 35 L/mL de PMSF (0,5 mg/mL) y 10 L/mL de
pepstatina (1 mg/mL)]. Las muestras se mantienen en hielo durante 20 minutos, y a
continuacin se centrifugan a 2500 rpm durante 10 minutos a 4C. Los sobrenadantes
obtenidos tras el lisado del extracto celular total se utilizan en los diferentes ensayos
enumerados anteriormente.
2.2) Preparacin de los extractos citoplasmticos y nucleares para la determinacin de la
expresin del factor Nrf2
Para la preparacin de los extractos citoslicos, los pellets celulares se resuspenden
en una solucin que contiene 10 mM HEPES (pH 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM KCl, 1
mM DTT, 5 mM NaF, 1 mM NaVO4, 10 mM Na2MoO4, 0,5 mM PMSF, 10 g/mL leupeptina y 1
g/mL pepstatina durante 15 minutos en hielo. A continuacin, las clulas se lisan con
Nonidet P-40 al 10% y se centrifugan a 13000 rpm durante 30 segundos a 4C. Se recogen los
105
106
Material y mtodos
sobrenadantes correspondientes a los extractos citoslicos. Los pellets celulares residuales se

utilizan para la obtencin de los extractos nucleares. Estos pellets se resuspenden en una
solucin consistente en 20 mM Hepes (pH 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,4 mM NaCl, 20%
glicerol, 1 mM DTT, 5 mM NaF, 1 mM NaVO4, 10 mM Na2MoO4, 0,5 mM PMSF, 10 g/mL
leupeptina y 1 g/mL pepstatina. Finalmente, las muestras se agitan durante 30 minutos en
cmara fra y se centrifugan a 15000 rpm durante 5 minutos a 4C para la obtencin de los
sobrenadantes, correspondientes a los extractos nucleares.
2.2.8. Determinacin de la actividad de enzimas antioxidantes

2.2.8.1. Actividad catalasa (CAT)
Fundamento
CAT es una hemo-enzima tetramrica formada por 4 subunidades idnticas de 60 kDa
cada una. Es una de las enzimas ms eficientes conocidas, tanto que no puede ser saturada a
ninguna concentracin de H2O2 (Mats, 2000). CAT puede actuar catalticamente,
descomponiendo H2O2 en agua y oxgeno cuando las concentraciones de H 2O2 son altas o bien
puede oxidar molculas donadoras de oxgeno como metanol, etanol, fenol o cido frmico si
la concentracin de H2O2 es baja (actividad peroxidasa).
CAT
2 H2O2
2 H2O + O2
CAT
ROOH + AH2
H2O + ROH + A
Reactivos
Perxido de hidrgeno (H2O2) (Sigma-Aldrich)
Procedimiento
La actividad de CAT (actividad cataltica) se determina por espectrofotometra
Material y mtodos
siguiendo el mtodo desarrollado por Aebi (1984). A 670 L de una solucin de H2O2 15 mM en
tampn fosfato (50 mM NaH2PO4 + Na2HPO4, pH 7,4), se aaden 30 L de los extractos
celulares totales de cada una de las muestras. La descomposicin de H2O2 se determina
directamente por monitorizacin de la disminucin de la absorbancia de H2O2 a 240 nm,
durante 1 minuto y a una temperatura de 25 C. Como blanco se utiliza la solucin de tampn
fosfato (50 mM NaH2PO4 + Na2HPO4, pH 7,4, volumen de 700 L). El espectofotmetro
utilizado ha sido UVIKON 930.
Actividad CAT:
Actividad CAT (UI/mg protena) = [(abs/min) x 0,7 x F]/(43,6 x 10-3 x Vm x C)
0,7 = volumen final de la muestra
F = factor de dilucin
43,6 x 10-3 mL x nmol-1 x cm-1 = coeficiente de extincin molar del H2O2
Vm = volumen de la muestra
C = concentracin de protena (mg/mL)
2.2.8.2. Actividad superxido dismutasa (SOD)

Fundamento
SOD es una metaloenzima que cataliza la conversin del radical superxido (O 2.-) en
H2O2 y oxgeno molecular. En humanos se han identificado tres tipos diferentes de SOD
localizadas a nivel mitocondrial (Mn-SOD), citoslico (Cu/Zn-SOD) y extracelular (EC-SOD).
SOD
2
O2.-
+2H
H2O2 + O2
Para la determinacin de la actividad de SOD se ha seguido el mtodo descrito por

Marklund and Marklund (1974). Este mtodo se basa en la capacidad de la enzima para inhibir
en medio alcalino la autooxidacin de pirogalol, compuesto que rinde pirogalina (de color
amarillo) y anin superxido.
107
108
Material y mtodos
Reactivos
cido clorhdrico (HCl) (Panreac Qumica S.A.)
cido dietilentriaminopentaactico (DTPA) (Sigma-Aldrich)
Pirogalol (Sigma-Aldrich)
Procedimiento
En la cubeta de reaccin que contiene una solucin de 0,15 mM de pirogalol en HCl 10
mM y tampn Tris-DTPA, pH 8,2 se aaden 25 L de cada muestra (volumen final de 800 L).
La cintica de aparicin del producto de la autooxidacin de pirogalol se determina
espectrofotomtricamente (espectrofotmetro, UVIKON 930) a una longitud de onda de 420
nm durante 1 minuto a 25C. Como blanco se utiliza tampn Tris-DTPA, pH 8,2 (800 L).
Actividad SOD:
Actividad SOD (UI/mg protena) = (% inhibicin/50) x (0,8/Vm) x F/C
0,8 mL = volumen total/final de la muestra
2.2.8.3. Actividad glutation reductasa (GR)

Fundamento
GR es una flavoprotena de localizacin citoslica cuya funcin principal es mantener
los niveles intracelulares de GSH. La actividad de esta enzima se evala de acuerdo al mtodo
de Barja de Quiroga et al. (1990). GR cataliza la reduccin de GSSG, utilizando NADPH como
cofactor, dando lugar a dos molculas de GSH. Se determina espectrofotomtricamente la
tasa de disminucin de la absorbancia ( = 340 nm) ocasionada por la oxidacin de NADPH a
NADP+, la cul ser directamente proporcional a la actividad de la enzima GR.
Material y mtodos
GR
GSSG + H2O
NADPH
2 GSH
NADP+
Reactivos
Glutation oxidado (GSSG) (Sigma-Aldrich)
Nicotinamida adenina dinucletido fosfato (NADPH) (Sigma-Aldrich)
Procedimiento
Para llevar a cabo el estudio de la actividad SOD, se aaden 50 L de cada muestra a
580 L de una solucin de tampn fosfato (50 mM NaH2PO4 + Na2HPO4, 6,3 mM EDTA, pH 7,4).
La reaccin se inicia por adicin a la mezcla anterior de 35 L de GSSG 80 mM y 35 L de
NADPH 6 mM. El blanco est constituido por tampn fosfato, GSSG y NADPH. La absorbancia
se mide a 340 nm durante 4 minutos con un tiempo de retraso de 60 segundos en un
espectrofotmetro UVIKON 930. Los resultados se normalizan por la cantidad de protenas en
cada muestra.
Actividad GR:
Actividad GR (nmoles NADPH/min x mg protena) = [(abs/min) x 0,7 x F]/(6,22 x 10-3 x Vm x C)
C= concentracin de protena (mg/mL)
109
110
Material y mtodos
2.2.8.4. Actividad glutation peroxidasa (GPx)

Fundamento
Existen dos formas GPx: dependiente de selenio y no dependiente de selenio. La
primera cataliza la reduccin de hidroxiperxidos orgnicos e inorgnicos, mientras que la
segunda slo presenta actividad frente a hidroperxidos orgnicos.
La
actividad
de
la
enzima
GPx
dependiente
de
selenio
se
determina
espectrofotomtricamente, usando H2O2 como sustrato, segn el mtodo de Paglia y

Valentine (1967). Asimismo se ha medido la actividad de GPx total, usando hidroxiperxido de
cumeno como sustrato, siguiendo el protocolo desarrollado por Lauwrence y Burk (1976). La
actividad tanto de GPx dependiente de selenio como de GPx total es proporcional a la tasa de
disminucin de la absorbancia medida de NADPH que se oxida a NADP+ a 340 nm.
GPx
2 GSH
ROOH
GSSG + H2O
ROH
Reactivos
Azida sdica (Sigma-Aldrich)
Glutation reducido (GSH) (Sigma-Aldrich)
Glutation reductasa (Sigma-Aldrich)
Hidroxiperxido de cumeno (Fluka)
Perxido de hidrgeno (H2O2) (Sigma-Aldrich)
Procedimiento
La actividad de GPx se mide tras una incubacin de 4 minutos, a temperatura
ambiente y en oscuridad, de 30 L del sobrenadante de cada muestra con 600 L de una
Material y mtodos
solucin reactiva compuesta por azida sdica, EDTA, GSH, NADPH y glutation reductasa en
tampn fosfato (50 mM NaH2PO4 + Na2HPO4, pH 7,4). Para la determinacin de GPx
dependiente de selenio y para la determinacin de GPx total, se adicionan 70 L de H2O2 y 70
L de hidroxiperxido de cumeno, respectivamente. La absorbancia se mide a 340 nm durante
3 minutos en un espectrofotmetro UVIKON 930. Los resultados se normalizan por la cantidad
de protenas en cada muestra.
Actividad GPx:
Actividad GPx (nmoles NADPH/min x mg protena) = [(abs/min) x 0,7 x F]/(6,22 x 10-3 x Vm x C)
2.2.8.5. Actividad hemooxigenasa-1 (HO-1)

Fundamento
La enzima HO-1 cataliza la degradacin oxidativa del grupo hemo, generando
bilirrubina, monxido de carbono (CO) y hierro (Fe2+). Esta enzima se induce en situaciones de
estrs oxidativo, actuando como molcula citoprotectora. La degradacin del grupo hemo en
su forma libre pro-oxidante reduce la formacin del radical hidroxilo y por tanto previene
frente al dao oxidativo. Adems, la biliverdina y la bilirrubina que se generan
posteriormente a partir de la primera por accin de biliverdina reductasa, actan como
secuestradores de ROS.
HO-1
Grupo hemo
ROOH
Biliverdina + Fe2+ + CO + 3 H2O
ROH
111
112
Material y mtodos
La actividad de HO-1 se mide espectrofotomtricamente de acuerdo al protocolo de

Motterlini et al. (1996) sobre el que hemos realizado algunas modificaciones.
Reactivos
Glucosa-6-fosfato (Sigma-Aldrich)
Glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa (Sigma-Aldrich)
Glutation reductasa (Sigma-Aldrich)
Hemina (Sigma-Aldrich)
Procedimiento
El pellet celular obtenido a partir de cada una de las muestras se resuspende en 500
L de un tampn fosfato (100 mM) MgCl2 (2 mM) pH 7,4. Las muestras se someten a 3 ciclos de
congelacin-descongelacin (-80C; 37C), se sonican en hielo durante 15 segundos y se
centrifugan a 5000 rpm durante 10 minutos a 4C. Al sobrenadante de cada muestra (400 L)
se le aade 200 L de una mezcla reactiva consistente en: 8 mM NADPH, 2 mM glucosa-6fosfato, 0,2 U glucosa-6-fosfato-1-deshidrogenasa y 2 mg de protena citoslica de hgado de
rata y 10 M de hemina en tampn fosfato potasio. La reaccin se mantiene durante 1 hora a
37C en oscuridad. La reaccin se detiene poniendo las muestras en hielo. La bilirrubina
extrada se determina por diferencia entre la absorcin a 464 nm y 530 nm, determinada
utilizando un espectrofotmetro UVIKON 930. La actividad de HO-1 se expresa como
picomoles de bilirrubina formados por miligramo de protena por hora.
2.2.9. Determinacin de la expresin de protenas mediante Western blot

Fundamento
La deteccin de protenas especficas en una muestra se determina mediante la
tcnica analtica Western-Blot. Esta tcnica, descrita por primera vez por Towbin et al. en
1979, se basa en la transferencia de protenas desde un gel hasta una membrana, para su
posterior deteccin mediante quimioluminiscencia en la superficie de la misma empleando
anticuerpos especficos.
-2
Material y mtodos
Reactivos
Tampn de carga 5x (Tampn Laemmli-SDS): 60 mM Tris-HCl (pH 6,8) (Sigma-Aldrich),

25% glicerol (Sigma-Aldrich), 2% dodecil sulfato sdico (SDS) (Sigma-Aldrich), 14,4 mM
mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) y 0,1% azul de bromofenol (Sigma-Aldrich).
Tampn de lisis: 25 mM Tris (Sigma-Aldrich), 150 mM NaCl (Panreac Qumica S.A.),

nicotinamida adenina dinucletido fosfato
(EDTA) (Sigma-Aldrich) y Tritn X-100
(Sigma-Aldrich).
Preparacin de los geles
Gel separador: Solucin A (30% acrilamida y 0,8% bisacrilamida de Sigma-Aldrich),

Solucin B [2 M Tris-HCl (pH 8) y 10% SDS de Sigma-Aldrich], 10% persulfato amnico
(Sigma-Aldrich) y N,N,N',N'-tetrametil-etileno-diamina (TEMED) (Sigma-Aldrich).
Gel concentrador: Solucin A (30% acrilamida y 0,8% bisacrilamida de Sigma-Aldrich),

Solucin C [1 M Tris-HCl (pH 6,8) y 10% SDS de Sigma-Aldrich], 10% persulfato amnico
(Sigma-Aldrich) y TEMED (Sigma-Aldrich).
Electroforesis
Tampn de electroforesis: 25 mM Tris (Sigma-Aldrich), 192 mM glicina (Sigma-Aldrich)

y 0,1% SDS (Sigma-Aldrich) (pH 8,3).
Transferencia
Tampn de transferencia: 15,6 mM Tris (Sigma-Aldrich), 120 mM glicina (SigmaAldrich) y 20% metanol (Panreac Qumica S.A.) (pH 8,1-8,4).
Inmunodeteccin
Anticuerpos primarios utilizados en los ensayos de Western-Blot:
113
114
Material y mtodos
Anticuerpo
Peso molecular
Fuente
Dilucin
Casa comercial
Referencia
anti-CAT
~ 60 kDa
Ratn
1:1000
Sigma-Aldrich
C-0979
anti-SOD
~ 22 kDa
Conejo
1:1000
Stressgen
SOD-105
anti-GR
~ 58 kDa
Conejo
1:2000
Abcam
ab16801
anti-GPx
~ 22 kDa
Conejo
1:2000
Abcam
ab16798
anti-HO1
~ 32 kDa
Conejo
1:1000
Santa Cruz Biotechnology
sc-10789
anti-Nrf2
~ 57 kDa
Conejo
1:500
Santa Cruz Biotechnology
sc-722
anti-actina
~ 42 kDa
Ratn
1:5000
Sigma-Aldrich
A-5441
Anticuerpos secundarios utilizados en los ensayos de Western-Blot:

Los anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo (sc-2004, Santa Cruz Biotechnology) y
anti-IgG de ratn (A9044, Sigma-Aldrich), conjugados con peroxidasa de rbano, se han

utilizado a la dilucin de 1:1000.
Procedimiento
Se preparan 20 g de protena en 25 L de tampn de lisis y 5 L de tampn de carga
5x. Las muestras se hierven durante 4 minutos a 100C para desnaturalizar las protenas.
Electroforesis
Durante la electroforesis, las protenas se separan en funcin de su peso molecular.
Para ello, se preparan geles de poliacrilamida al 10-15%. La electroforesis se realiza a voltaje
constante (100 V).
Transferencia
Concluida la electroforesis, las protenas se transfirieren desde el gel de
poliacrilamida a una membrana de polivinilpirrolidona (PVDF) en tampn de transferencia
mediante una corriente continua de 350 mA durante 60 minutos en fro.
Material y mtodos
Inmunodeteccin
Tras la transferencia, la membrana se bloquea con una solucin de leche en polvo al
10% en PBS durante al menos 1 hora para evitar la unin inespecfica de los anticuerpos que
se van a emplear en la deteccin de la protena de inters.
Finalizado el tiempo de bloqueo, las membranas de PVDF se incuban con los
anticuerpos primarios durante toda la noche en fro: anti-CAT, anti-GPx, anti-GR, anti-SOD,
anti-HO1 y anti-Nrf2. Tras dicha incubacin, las membranas se lavan con PBS-Tween durante
30 minutos, renovando la solucin de lavado cada 5 minutos y se incuban durante 2 horas con
el correspondiente anticuerpo secundario anti-conejo o anti-ratn. Pasadas estas dos horas,
las membranas se vuelven a lavar con PBS-Tween.
La deteccin de las bandas de protenas se realiza por quimioluminiscencia utilizando
el kit de deteccin ECL-Advance. La cuantificacin de las bandas se realiza por anlisis
densitomtrico utilizando el programa GenTools de Syngene. Como normalizador de carga se
utiliza actina.
2.2.10. Determinacin del potencial de membrana mitocondrial (m)

Fundamento
El mantenimiento del potencial de membrana mitocondrial (m) es fundamental para
mantener la funcin fisiolgica de la cadena respiratoria para generar ATP. Los cambios en el
m se detectan empleando el ster metlico de tetrametilrodamina (TMRM), fluorocromo
lipoflico catinico selectivo de las mitocondrias, que se acumula en el interior de aquellos de
estos orgnelos metablicamente activos con potencial de membrana mitocondrial negativo.
La adicin del antibitico oligomicina, inhibidor de la subunidad F0 de la ATPasa, lleva a la
hiperpolarizacin de la mitocondria (lo que se traduce en un incremento de la fluorescencia
TMRM). La adicin del carbonilcianuro-p-trifluorometoxi-hidrazona (FCCP), desacoplador de la
fosforilacin oxidativa, provoca la despolarizacin de las mitocondrias (disminucin de la
fluorescencia) (Correia et al., 2012).
Reactivos
ster metlico de tetrametilrodamina (TMRM) (Invitrogen)
Oligomicina (Sigma-Aldrich)
115
116
Material y mtodos
Carbonilcianuro-p-trifluorometoxi-hidrazona (FCCP) (Sigma-Aldrich)
Medio de Krebs (NaCl, KCl, MgCl2, glucosa, HEPES, CaCl2)
Procedimiento
Las clulas U373-MG y PC12 se siembran en placas de 48 pocillos (0,42 x 10 6
clulas/pocillo). Despus de los correspondientes tratamientos (diterpenos, 5 y 10 M, 24 h;
H2O2, 1 mM para U373-MG y 0,1 mM para PC12, 30 min), se adiciona TMRM (150 nM) en medio
de Krebs y se mide la fluorescencia a una excitacin de 549 nm y a una emisin de 573 nm
durante 45 minutos a 37C usando un fluormetro Spectramax Gemini EM (Molecular Devices).
Tras estos 45 minutos, se aade oligomicina (0,25 g/mL) y FCCP (6 M) y se mide la
fluorescencia en las mismas condiciones descritas anteriormente durante 15 minutos. La m
se calcula determinando la diferencia entre la fluorescencia final (correspondiente a la
fluorescencia obtenida tras la adicin de la oligomicina y el FCCP) y la fluorescencia inicial.
Los resultados se expresan en %, considerndose como 100% al valor del m de las clulas
control.
2.2.11. Determinacin de los niveles de calcio citoslico

Fundamento
En condiciones fisiolgicas las clulas tienen niveles de calcio citoslico bajos. El
aumento de la concentracin de calcio citoslico est ligado a la mitocondria, e influye
directamente sobre la respiracin mitocondrial y puede provocar disfuncin mitocondrial. El
nivel de calcio citoslico se cuantifica utilizando la sonda fluorescente Indo-1/AM (forma
ster). Este fluorocromo, por accin de las esterasas intracelulares, se transforma en un
compuesto capaz de unirse al calcio presente en el citosol, acompandose la formacin de
este complejo de un desplazamiento en su espectro de emisin. La adicin del ionforo
ionomicina incrementa los niveles de calcio libre citoplasmtico, obtenindose la seal de
fluorescencia mxima. La adicin de MnCl2 permite estimar la autofluorescencia (seal de
fluorescencia mnima) (Resende et al., 2008).
Reactivos
Indo-1/AM (Invitrogen)
Ionomicina (Sigma-Aldrich)
MnCl2 (Sigma-Aldrich)
Material y mtodos
Procedimiento
Las clulas U373-MG y PC12 se siembran a una densidad de 0,42 x 106 clulas/pocillo
en placas de 48. Tras los correspondientes tratamientos (diterpenos, 5 y 10 M, 24 h; H2O2, 1
mM para U373-MG y 0,1 mM para PC12, 30 min), las clulas se incuban con la sonda
fluorescente Indo-1/AM (3 M) en medio de Krebs durante 45 minutos a 37C en oscuridad. A
este perodo de incubacin le sigue otro en medio de Krebs sin la sonda fluorescente durante
15 minutos a la misma temperatura y en oscuridad. La fluorescencia se mide durante 4
minutos a una excitacin de 350 nm y a una emisin de 410 nm a 37C en un fluormetro
Spectramax Gemini EM (Molecular Devices). Despus de este tiempo de medida, se adiciona
ionomicina (3 M) y se mide la fluorescencia durante 8 minutos en las mismas condiciones
descritas anteriormente. Por ltimo, se adiciona MnCl2 (3 mM), y se mide la fluorescencia
durante 4 minutos (mismas condiciones). La [Ca2+]i se calcula siguiendo la frmula expuesta
abajo, en donde Kd = constante de disociacin del complejo Indo-1-Calcio (250 nM); F= seal
de fluorescencia relativa de la muestra; Fmin= AF + 1/12(Fmax-AF); Fmax = seal de fluorescencia
mxima tras la adicin de ionomicina; AF= seal de autofluorescencia obtenida despus de la
adicin de MnCl2.
[Ca2+]i = Kd x (F-Fmin)/(Fmax-F)
2.2.12. Determinacin de los niveles de calcio mitocondrial

Fundamento
El aumento de los niveles de calcio mitocondrial puede llevar a un desacoplamiento
de la funcin de la fosforilacin oxidativa, y la consecuente disfuncin mitocondrial. La
concentracin de calcio mitocondrial se determina midiendo la fluorescencia de Rhod-2. La
forma ster de Rhod-2, fluorforo lipoflico catinico, se distribuye preferentemente por la
matriz mitocondrial (cargas negativas en el interior). Una vez all, la forma ster de Rhod-2 es
hidrolizada, quedando el producto resultante acumulado de manera efectiva en el interior de
las mitocondrias y permitiendo su medida por fluorescencia (Takahashi et al., 1999). La
adicin del ionforo de calcio A23187 incrementa los niveles de calcio citoslico libre, al
liberar el calcio del retculo endoplsmico (Deniaud et al., 2008).
117
118
Material y mtodos
Reactivos
Acetoximetil ster de rodamina (Rhod-2/AM) (Invitrogen)
Pluoronic F127 (Invitrogen)
Ionforo de calcio A23187 (Sigma-Aldrich)
Procedimiento
Las clulas U373-MG y PC12 se siembran a una densidad de 7,5 x 104 clulas/pocillo
en placas de 24. Despus de los tratamientos (diterpenos, 5 y 10 M, 24 h; H2O2, 1 mM para
U373-MG y 0,1 mM para PC12, 30 min), las clulas se lavan con medio de Krebs con calcio y
sin sonda fluorescente (2 veces), y a continuacin se incuban durante 40 minutos a 37C en
oscuridad con medio de Krebs con calcio y con la sonda fluorescente. Despus de la
incubacin, las clulas se lavan 2 veces con medio de Krebs sin calcio y sin sonda fluorescente
y se dejan incubar durante 30 minutos a la misma temperatura para permitir la hidrlisis
completa del ster. La fluorescencia se mide a 37C durante 5 minutos a una excitacin de 552
nm y a una emisin de 581 nm a 37C en un fluormetro Spectramax Gemini EM (Molecular
Devices). A continuacin, se adiciona el ionforo A23187 (5 M) y se mide la fluorescencia
durante 15 minutos en las mismas condiciones descritas anteriormente. Los resultados se
expresan como capacidad de captacin de calcio por la mitocondria (ratio entre la
fluorescencia mxima despus de la adicin del ionforo A23187 y la fluorescencia basal).
2.2.13. Determinacin de los niveles de ATP

Fundamento
El valor de los niveles del nucletido trifosfato (ATP) es un parmetro que refleja el
estado de la funcin mitocondrial. Su determinacin se ha llevado a cabo mediante HPLC
siguiendo el protocolo descrito por Stocchi et al. (1985).
Reactivos
cido perclrico (HClO4) (Merck)
cido etilendiaminotetraactico-sodio (EDTA-Na+) (Sigma-Aldrich)
Material y mtodos
Hidrxido de sodio (NaOH) (Sigma-Aldrich)
Hidrxido de potasio (KOH) (Sigma-Aldrich)
Adenosn trifosfato (ATP) (Sigma-Aldrich)
Metanol (Merck)
Bifosfato potsico (KH2PO4) (Sigma-Aldrich)

Se preparan diferentes diluciones
de ATP en agua dentro del rango de
concentraciones de 0,25 a 5 M a partir de una solucin madre (3 mM).

Las clulas U373-MG y PC12 se siembran en placas de 24 pocillos (7,5 x 10 4
clulas/pocillo) y se tratan con los diterpenos en estudio (5 y 10 M, 24 h) y con H2O2 (1 mM
para U373-MG y 0,1 mM para PC12, 30 min). Despus de las correspondientes incubaciones
con los diterpenos y con H2O2, las clulas se lavan con PBS 1x fro. A continuacin, se aade
de nuevo PBS 1x fro y se raspan las clulas para recoger los sobrenadantes. A los extractos
celulares se les adiciona entonces una mezcla de HClO4 0,6 M y EDTA-Na+ 25 mM, y se
centrifugan a 14000 rpm durante 2 minutos a 4C. Los sobrenadantes se recogen, y los pellet
celulares se reservan para la posterior determinacin de la concentracin de protenas. A los
sobrenadantes recogidos se les adiciona una mezcla de KOH 3 M y Tris 1,5 M para neutralizar
las muestras (pH ~ 7) y se centrifugan a 14000 rpm durante 2 minutos (4C). Los
sobrenadantes se recogen y se conservan a -80C para la posterior determinacin de los
niveles de ATP por HPLC.
Los pellets celulares conservados para la determinacin de la concentracin de
protenas, se disuelven en NaOH 1 M. La concentracin de protenas se realiza tal y como se
explica en el apartado 2.2.4.
Se ha utilizado un cromatgrafo con sistema cuaternario, equipado con inyector
119
120
Material y mtodos
automtico, con sistema de desgasificacin y software para el procesado de datos

cromatogrficos (Agilent ChemStation). La columna analtica ha sido de fase reversa
Mediterranean Sea C18 (5 m de dimetro de partcula, 15 x 0,46 cm de dimetro interno)
(Teknokroma, Barcelona, Espaa).
Las condiciones cromatogrficas establecidas han sido las siguientes:
Fase mvil: Tampn 100 mM KH2PO4 (pH 6,5)/1% metanol
Elucin isocrtica
Longitud de onda de deteccin 254 nm
Flujo: 1 mL/min
Volumen de inyeccin 10 L

Todos los disolventes utilizados han sido de grado HPLC (Panreac) y el agua, ultrapura
(sistema Milli-Q plus). Todas las muestras se filtran a vaco, utilizando filtros de membrana de
45 m de tamao de poro, previo a su inyeccin en el cromatgrafo.
En la Fig.13. se muestra un cromatograma representativo para el ATP patrn. El
tiempo de retencin se situ a 2,1 min.
600
2.11
mAU
500
400
300
200
100
0
0
Fig.13. Cromatograma representativo del ATP.
min
Material y mtodos
Se ha realizado una curva de calibracin con diferentes concentraciones de ATP (0,25;

1; 2,5 y 5 M) que se muestra en la Fig.14. para la cuantificacin de la concentracin de ATP
en las muestras celulares (ver apartado de resultados 1.1.9.3. y 1.2.8.3.).
Los valores del coeficiente de correlacin lineal (r) y del coeficiente de determinacin
2
(r ) demuestran una buena linealidad dentro del rango de concentraciones ensayadas.
ATP
8000
rea
6000
4000
y 1313,92 x 443,04
r 0,999
r 2 0,998
2000
0
0
Concentracin ( M)
Fig.14. Recta de calibrado para ATP. La ecuacin de la recta de calibrado obtenida para la posterior
cuantificacin de la concentracin de ATP en las muestras celulares de PC12 y U373-MG tratadas con los
diterpenos y H2O2.
2.2.14. Determinacin de la actividad caspasa-3

Fundamento
La caspasa-3, perteneciente a la familia de las cistein-proteasas, es un mediador de
gran relevancia en los procesos de apoptosis. La determinacin de su actividad enzimtica se
basa en la deteccin fluorimtrica del compuesto AMC (7-amino-4-metilcumarina), generado
en la hidrlisis del sustrato sinttico especfico de caspasa-3 (Ac-DEVD-AMC) [N-acetil-AspGlu-Val-Asp-AMP (7-amino-4-metilcumarina)] (Hpfner et al., 2004).
Reactivos
Ac-DEVD-AMC
Biochemicals)
[N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-AMP
(7-amino-4-metilcumarina)]
(Alexis
121
122
Material y mtodos
Procedimiento
La actividad de caspasa-3 se mide en los extractos celulares totales, preparados tal y
como se explica en el apartado 2.2.7. Para ello, se incuban 20 g de protenas totales de cada
muestra con el sustrato Ac-DEVD-AMC (20 M) durante 1 hora a 37C. La fluorescencia de
AMC, producto de la hidrlisis de Ac-DEVD-AMC, se mide a una longitud de onda de excitacin
de 360 nm y a una longitud de onda de emisin de 460 nm en un Fluormetro Lector de
microplacas FLx800. Los resultados de la actividad de caspasa-3 (escisin de Ac-DEVD-AMC) se
expresan como % del control, considerndose como 100% al valor de la actividad de caspasa-3
de las clulas control.
2.3. Mtodos para el estudio de paso a travs de BHE

2.3.1. Estudios in silico
2.3.1.1. Estimacin de descriptores moleculares
Los descriptores moleculares de los diterpenos objeto de estudio de la presente Tesis
Doctoral as como determinadas de sus propiedades fsico-qumicas se han estimado mediante
el uso de diferentes modelos computacionales, con el fin de predecir su paso a travs de BHE.
A. log P, log D y peso molecular
La lipofilia de los diterpenos en estudio, representada como el logaritmo del

coeficiente de reparto n-octanol/agua (log P), cuando se consideran slo las formas neutras, y
como el coeficiente de distribucin (log D) a pH 7,4, cuando se consideran todas las formas
inicas de la especie, se han estimado utilizando el modelo computacional ALOGPS 2.1. El
programa
ALOGPS
2.1
del
Laboratorio
Virtual
de
Qumica
Computacional
(http://www.vcclab.org) (Tetko et al., 2005) permite predecir la lipofilia de las molculas en

base a sus caractersticas electrnicas y topolgicas. Este software se desarroll a partir de 64
redes neuronales, 12908 molculas cuyos valores experimentales de log P estn recogidos en
la base de datos PHYSPROP y 75 parmetros de entrada que comprenden aspectos del tomo
e ndices de estado electropolgico (Tetko et al., 2001; Tetko and Tanchuk, 2002). Todos los
compuestos se han convertido a sus representaciones SMILES (Sistema Lineal Simplificado para
Entrada Molecular) para la determinacin del log P.
Material y mtodos
El peso molecular de cada uno de los diterpenos se determina tambin utilizando el

software ALOGPS 2.1.
B. rea topolgica de la superficie polar (TPSA)
La estimacin del rea topolgica de la superficie polar (TPSA), definida como la
suma de las contribuciones superficiales de los tomos polares de una molcula,
especialmente oxgenos y nitrgenos, as como los hidrgenos unidos a dichos tomos, se
realiza utilizando la herramienta informtica Daylight Chemical (http://www.daylight.com),
basada en el procedimiento descrito por Erlt et al. (2000). Para la determinacin del TPSA,
los diterpenos se convierten a sus representaciones SMILES (Sistema Lineal Simplificado para
Entrada Molecular).
C. Volumen molecular, nmero de grupos aceptores y donadores de enlaces de
hidrgeno, y nmero de enlaces rotables
El volumen molecular, el nmero de grupos aceptores y donadores de enlaces de
hidrgeno, y el nmero de enlaces rotables de cada uno de los diterpenos se han determinado
utilizando el software Molinspiration (http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties).
2.3.1.2. Modelo computacional: software pCEL-x para el anlisis de permeabilidad

El posible mecanismo de transporte de los diterpenos a travs de la BHE se ha
estimado utilizando el programa computacional pCEL-X (pION Inc.). ste se basa en datos
estructurales 2D y en varios de los denominados descriptores de Abraham (Abraham, 2004)
(fuerza de los enlaces de hidrgeno, interaccin soluto-disolvente, potencial, fuerzas de
dispersin y volumen molar) calculados mediante el programa ADME Boxes de Pharma
Algorithms.
2.3.2. Estudios in vitro

Fundamento
El fundamento de esta tcnica se desarrolla en el apartado 2.2.2.1.
123
124
Material y mtodos
Reactivos
Los reactivos utilizados en esta tcnica se desarrollan en el apartado 2.2.2.1.
Procedimiento
Las lneas celulares RBE4 (2-3 x 104 clulas/pocillo) y ECV304 (2 x 10 4 clulas/pocillo)
se siembran en placas de 96 pocillos y se tratan durante 24 horas con los diterpenos objeto de
estudio a la concentracin de 25 M para evaluar el posible efecto citotxico de los mismos a
la mxima concentracin y tiempo ensayados para los estudios de paso a travs de BHE. El
resto del procedimiento es igual al desarrollado en el apartado 2.2.2.1.
2.3.2.2. Estudios de cintica de captacin
Fundamento
Los estudios de cintica de captacin de los compuestos en estudio tienen por objeto
evaluar si stos son capaces de penetrar en las clulas endoteliales de los capilares
cerebrales.
Reactivos
Procedimiento
Los ensayos de captacin de los diterpenos por clulas del endotelio cerebral se han
llevado a cabo utilizando la lnea celular de endotelio de cerebro de rata (RBE4). Estas clulas
se siembran en placas de 96 pocillos (2-3 x 104 clulas/pocillo) y se incuban a distintos
tiempos (0,5; 6; 18 y 24 h) con 200 L de los diterpenos a las concentraciones finales de 5, 10
y 25 M. Despus de la incubacin, el medio se elimina y las clulas se lavan tres veces con
PBS fro (pH 7,4). A continuacin, las clulas se incuban durante una hora a 37C con una
solucin de Tritn X-100 al 1% (200 L) para provocar la lisis celular. Finalmente, un volumen
de 100 L del extracto de lisado celular se utiliza para determinar la concentracin de
protenas (vase apartado 2.2.4) mientras que los otros 100 L se emplean para la
Material y mtodos
cuantificacin de la concentracin de los diterpenos mediante HPLC (vase punto 2.3.2.5).

Los resultados se expresan como ng/mg de protena.
2.3.2.3. Efecto del transportador de eflujo gp-P en la captacin

Fundamento
Los transportadores de eflujo como gp-P cumplen una funcin de extrusin: sacan
molculas xenobiticas del interior de las clulas. La influencia del principal transportador de
eflujo, gp-P, en la captacin de los diterpenos por parte de las clulas endoteliales RBE4 se
evala utilizando el inhibidor tariquidar. ste es un inhibidor potente, especfico y no
competitivo de la gp-P, que acta inhibiendo su actividad ATPasa.
Reactivos
Tariquidar (EvaluatePharma)
Procedimiento
Las clulas RBE4, sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad de 2-3 x 104
clulas/pocillo, se tratan con los diterpenos en estudio a la concentracin final de 25 M, en
presencia y ausencia del inhibidor (1,16 M), durante 6 horas. Transcurrido el tiempo de
tratamiento, se procede de la misma manera que en los estudios de captacin: eliminacin de
medio, lavado de las clulas con PBS fro e incubacin durante una hora a 37C con una
solucin de Tritn X-100 al 1% para inducir la lisis celular. El extracto obtenido se utiliza para
la determinacin de la concentracin de protenas (vase apartado 2.2.4) as como para la
cuantificacin de la concentracin de los diterpenos mediante HPLC (vase punto 2.3.2.5).
Los resultados se expresan como ng/mg de protena.
2.3.2.4. Estudios de permeabilidad

Fundamento
Previos estudios de permeabilidad han utilizado como modelo in vitro de BHE el
125
126
Material y mtodos
sistema celular de cocultivo compuesto por las lneas celulares ECV304 y C6. Las clulas
endoteliales ECV304 establecen uniones fuertes y estrechas, lo que se refleja en los valores
de la resistencia elctrica transendotelial (TEER), siendo esta caracterstica fundamental para
que un modelo celular pueda utilizarse en estudios de permeabilidad.
Reactivos
Fluorescena de sodio (Sigma-Aldrich)
Hidrocortisona (Sigma-Aldrich)
4-(3-Butoxi-4-metoxibencil)-2-imidazolidinona (RO-20-1724) (Sigma-Aldrich)
Adenosn monofosfato cclico (cAMP) (Sigma-Aldrich)
Procedimiento
En los estudios de permeabilidad se han usado membranas Transwell de
policarbonato de 12 mm de dimetro (1,12 cm2 de rea) con un tamao de poro de 0,4 m (1
x 108 poros/cm2) (Corning Costar).
Las clulas C6 se siembran a una densidad de 4 x 105 clulas/pocillo en placas de 12
pocillos (volumen 1500 L/pocillo), mientras que las clulas ECV304 se cultivan a una
densidad de 2 x 105 clulas en cada inserto (volumen 500 L/inserto).
Para evaluar la integridad del modelo celular, se utiliza como referencia el transporte
de la fluorescena de sodio del compartimento apical a basal as como la resistencia elctrica
transendotelial (TEER).
El transporte de la fluorescena de sodio (peso molecular = 376 Da), marcador
fluorescente paracelular, se determina tras 1 hora de incubacin a 37C. La fluorescencia se
mide a una longitud de onda de excitacin de 485 nm y de emisin de 520 nm. A
continuacin, se determina la concentracin de la fluorescena de sodio a partir de una recta
patrn elaborada con diferentes concentraciones de dicho compuesto (0; 1; 10; 20 y 30 nM).
Determinada la concentracin de fluorescena de sodio, se calcula su permeabilidad aparente
utilizando la frmula expuesta ms adelante.
En cuanto a la resistencia elctrica transendotelial (TEER), reflejo del grado de
permeabilidad que ofrecen las uniones estrechas establecidas entre las clulas de la
Material y mtodos
monocapa, se mide cada da con un voltmetro epitelial EVOM (World Precision Instruments
Inc.) conectado a un electrodo planar. Los valores TEER se calculan restando la resistencia de
los filtros (blanco) a la resistencia de las clulas. Los valores de resistencia de la monocapa
obtenidos se multiplican por la superficie del inserto (1,12 cm 2), de manera que los resultados
se expresan como x cm2. Para los estudios de permeabilidad se utilizan aquellas monocapas
celulares cuyo valor de TEER sea 100 x cm2.
TEER = (TEER clulas - TEER sin clulas) x A (Ohm x cm2)
Al cabo de unos 6-8 das, las monocapas celulares alcanzan valores de TEER 100 x
2
cm . El da previo a la determinacin del transporte de los diterpenos a travs de la BHE, se

aade hidrocortisona 1% al medio (preparada a partir de una solucin stock de 550 M) para
incrementar los valores de TEER. Adems, se aade RO-20-1724 y cAMP (Rubin et al., 1991),
ya que cAMP incrementa las uniones estrechas y RO evita que la enzima pueda degradar
cAMP. De este modo se consigue aumentar los valores de TEER.
El experimento de transporte se inicia con la adicin de los diterpenos a una
concentracin final de 25 M en un volumen de 0,5 mL en el compartimento apical (para el
transporte apical a basal) y en un volumen de 1,5 mL en el compartimento basal (para el
transporte basal a apical). Las placas se incuban a 37C en agitacin durante 6 h. Una vez
finalizado el transporte, se toman alcuotas de los lados apical y basal, para su posterior
anlisis y cuantificacin por HPLC (vase punto 2.3.2.5).
Para determinar la permeabilidad aparente (Papp, cm/s) a travs de la BHE, se utilizan
las siguientes ecuaciones:
Papp = VD/(A x MD) (MR/t)

Papp = VD/(A x MD - Mclulas) (MR/t)
3
VD = volumen donador (cm )

2
A = superficie del filtro (cm )

MD = cantidad del compuesto en el lado donador (mol)
Mclulas = cantidad de compuesto que queda retenido en la membrana (mol). [Mclulas = MD0 (MDt + MR)].
MR/t = cantidad del compuesto (mol) transferido al compartimento recibidor a lo largo del tiempo de medida.
127
128
Material y mtodos
2.3.2.5. Anlisis de HPLC. Identificacin y cuantificacin de los diterpenos.

Fundamento
El anlisis de las muestras de los ensayos de captacin y de permeabilidad se realiza
por Cromatografa Lquida de Alta Eficacia (HPLC) con deteccin UV siguiendo el protocolo
descrito por Gmez-Serranillos et al. (2004).
Reactivos
Dimetilsulfxido (DMSO) (Panreac Qumica S.A.)
Metanol HPLC (Panreac Qumica S.A.)
cido N-2-hidroxietilpiperacina-N'-2'-etanesulfnico (HEPES) (Sigma-Aldrich)
Hank's Buffered Salt Solution (sin rojo fenol) (HBSS) (Sigma-Aldrich)

Los diterpenos se disuelven en DMSO, y se preparan diferentes disoluciones de los
mismos en el vehculo de transporte consistente en 25 mM de HEPES en HBSS (sin rojo fenol).
Las diferentes disoluciones de los diterpenos (2,5; 5; 10 y 25 M) se emplean para elaborar
una recta patrn de cada uno de ellos.
Las muestras se tratan con acetonitrilo para precipitar las protenas y se centrifugan
durante 10 minutos a 3000 rpm y a 4C. Previo a la inyeccin de las muestras, los
sobrenadantes se filtran a travs de un filtro de 0,22 m de tamao de poro.
El equipo empleado ha sido un cromatgrafo lquido de alta resolucin 1200 Series de
Agilent Technologies con inyector automtico y acoplado a un programa de procesado de
datos Agilent ChemStation. La columna analtica ha sido de fase reversa Mediterranean Sea
C18 (5 m, 15 x 0,46 cm) (Teknokroma, Barcelona, Espaa).
Material y mtodos
Las condiciones cromatogrficas utilizadas han sido:
Fase mvil: mezcla de metanol/agua (20:80)
Elucin isocrtica
Longitud de onda de deteccin: 220 nm
Flujo: 1 mL/min
Volumen de inyeccin: 10 L

Todos los disolventes usados han sido de grado HPLC (Panreac) y el agua, ultrapura
(sistema Milli-Q plus). Estas soluciones se filtran a vaco mediante filtros de membrana de 45
m de tamao de poro.
En La Fig.15. se muestra un cromatograma representativo de cada uno de los
diterpenos estndar obtenidos mediante el mtodo analtico anteriormente descrito. En cada
una de las muestras celulares evaluadas, se identifican los diterpenos, por comparacin con
los tiempos de retencin de cada uno de los estndares puros. Estos tiempos de retencin han
sido los siguientes: andalusol (2,1 min), conchitriol (1,9 min), foliol (2,0 min), lagascatriol
(2,2min), linearol (1,8 min), sidol (2,9 min).
Andalusol
400
mAU
Conchitriol
400
mAU
2.16
300
300
200
200
100
100
Lagascatriol
500
mAU
400
1.99
2.20
300
200
100
0
6 min
Foliol
400
mAU
min
Linearol
500
mAU
400
2.08
300
6 min
Sidol
500
mAU
400
1.80
300
300
200
200
100
100
2.99
200
100
0
0
6 min
0
0
6 min
Fig.15. Cromatograma representativo de cada uno de los diterpenos estndar.
6 min
129
Material y mtodos
130
Como paso previo a la cuantificacin de los diterpenos en este estudio, se elaboraron

curvas de calibracin con cada uno de los diterpenos, empleando el rango de concentraciones
de 2,5 a 25 M. Estas rectas se realizan representando las reas bajo la curva de cada
compuesto estndar frente a cada una de las concentraciones ensayadas (2,5; 5; 10 y 25 M).
Para cada concentracin el anlisis se realiza por triplicado. La media de las reas bajo la
curva de los tres ensayos se utiliza para la obtencin de las rectas de calibrado representadas
en la Fig.16.
Se determina el coeficiente de correlacin (r) y el coeficiente de determinacin (r2)
en cada una de las rectas de calibrado, observndose en todos los casos una buena relacin
entre la respuesta obtenida (expresada en rea bajo la curva) y las concentraciones
inyectadas de los diterpenos.
La concentracin de los diterpenos de cada muestra celular (de los ensayos de
captacin y de los ensayos de permeabilidad) se determina por interpolacin de las reas
obtenidas en las rectas de calibrado representadas en la Fig.16. (ver apartado de resultados
2.2.2., 2.2.3. y 2.2.4.).
ANDALUSOL
5000
CONCHITRIOL
7000
6000
4000
5000
rea
rea
3000
2000
y 172,81x 114,35
r 0,9998
r 2 0,9997
1000
4000
3000
y 271,18x 278,64
r 0,9971
r 2 0,9943
2000
1000
0
0
10
15
20
25
30
Concentracin ( M)
FOLIOL
6000
10
15
20
25
30
Concentracin ( M)
LAGASCATRIOL
10000
5000
8000
6000
rea
rea
4000
3000
y 208,3x 262,53
r 0,9991
r 2 0,9984
2000
1000
4000
y 317,6x 166,44
r 0,9978
r 2 0,9957
2000
10
15
20
Concentracin ( M)
25
30
10
15
20
Concentracin ( M)
Fig.16. Rectas de calibrado para los diterpenos. Contina en la pgina siguiente.
25
30
Material y mtodos
LINEAROL
6000
SIDOL
5000
5000
4000
4000
rea
rea
3000
3000
2000
y 206,53x 254,68
r 0,9992
r 2 0,9986
2000
1000
y 135,14x 473,30
r 0,9922
r 2 0,9846
1000
0
0
10
15
20
25
30
Concentracin ( M)
10
15
20
25
30
Concentracin ( M)
Fig.16. Rectas de calibrado para los diterpenos. Continuacin. Las ecuaciones de las rectas de calibrado se
utilizan para la cuantificacin de la concentracin de diterpenos en los ensayos de captacin y de
permeabilidad de BHE.
2.4. Anlisis estadstico

Los datos se han procesado con el programa de anlisis estadstico Statgraphics plus
5.1. Los resultados se expresan como media desviacin estndar (DE) de al menos tres
experimentos independientes. La comparacin de los resultados se lleva a cabo empleando el
anlisis de la varianza (ANOVA) seguido del test de Bonferroni, estableciendo el nivel de
significacin estadstica cuando p < 0,05.
131
RESULTADOS
Resultados
1. ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD NEUROPROTECTORA DE

DITERPENOS AISLADOS DE SIDERITIS spp. EN UN MODELO
CELULAR DE ESTRS OXIDATIVO INDUCIDO POR H2O2
1.1. Resultados sobre la lnea celular PC12
1.1.1. Citotoxicidad celular
Previo al estudio de la actividad neuroprotectora de los diterpenos en un modelo
celular de estrs oxidativo, se ha determinado el rango de concentraciones no citotxicas de
60
40
40
20
20
20
40
60
80 100
Andalusol (M)
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
20
40
60
80 100
Foliol (M)
100
80
80
60
60
40
40
20
20
20
40
60
80 100
Conchitriol (M)
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
20
40
60
80 100
Linearol (M)
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
20
40
60
80 100
Lagascatriol (M
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
20
40
60
80 100
Liberacin de LDH (% respecto al mximo)
120
100
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
120
Reduccin de MTT (% respecto al control)
60
120
80
100
80
100
120
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
120
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
cada uno de ellos.
Sidol (M)
Fig.16. Citotoxicidad celular. La citotoxicidad de los diterpenos sobre la lnea celular PC12 se ha
determinado midiendo la capacidad de reduccin celular de MTT como indicador de la actividad mitocondrial
y midiendo la actividad enzimtica de la enzima LDH liberada al medio de cultivo como indicador de la lisis de
la membrana. Las clulas PC12 se tratan con diferentes concentraciones de los diterpenos (rango de
concentraciones de 1100 M) durante 24 h. La reduccin celular de MTT se expresa como % respecto al
control, definindose como 100% la viabilidad de las clulas sin tratar, mientras que la liberacin de LDH se
expresa como % respecto al mximo, definindose como 100% la liberacin de la enzima al medio provocada
por Tritn X-100. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos
independientes.
135
136
Resultados
Para este fin, las clulas PC12 se tratan con diferentes concentraciones de los
diterpenos (1; 2,5; 5; 10; 25; 50 y 100 M) durante 24 h, y se evala la citotoxicidad in vitro
por medio de los ensayos de MTT y de LDH. El ensayo de MTT mide la actividad mitocondrial
mientras que el ensayo de LDH evala la integridad de la membrana.
Los resultados, representados en la Fig.16., muestran que concentraciones de los
compuestos en estudio por encima de 10 M causan una prdida de la actividad mitocondrial
y de la integridad de la membrana de manera concentracin-dependiente. Esta prdida es
marcada para todos los compuestos, a excepcin de andalusol. Por otro lado, las
concentraciones ms bajas ensayadas (1; 2,5; 5 y 10 M) no presentan efectos citotxicos
(valores de reduccin de MTT por encima del 90% y valores de liberacin de LDH por debajo
del 12%).

Una vez establecido el rango de concentraciones no citotxicas de los diferentes
diterpenos sobre la lnea celular PC12, se ha evaluado el efecto de estos compuestos en el
dao celular inducido por H2O2 mediante los ensayos de MTT y de LDH.
Las clulas PC12 se preincuban durante 24 h con los compuestos objeto de estudio a
concentraciones no citotxicas (1; 2,5; 5 y 10 M), y se tratan a continuacin durante 30
minutos con H2O2 (0,1 mM) como agente inductor de estrs oxidativo.
Como se puede observar en la Fig.17., la exposicin de las clulas PC12 solamente a
H2O2 lleva a una prdida de la funcionalidad mitocondrial de un 43% comparado con las
clulas control y a una alteracin de la integridad de la membrana (45% comparado con el
mximo, correspondiente a las clulas tratadas con Tritn X-100).
Al evaluar el efecto de las preincubaciones con los diterpenos (condiciones
anteriormente descritas) sobre el dao celular, se aprecia un aumento de los valores de
reduccin de MTT, reflejo de una mayor actividad de las mitocondrias, y una disminucin de
los valores de liberacin de LDH, reflejo de una menor alteracin de la integridad de la
membrana
celular. Concretamente, andalusol
linearol
ejercen
el
mayor efecto
citoprotector, al mostrar una proteccin concentracin-dependiente significativa para todas

las concentraciones ensayadas. Conchitriol, lagascatriol y sidol muestran un efecto
citoprotector intermedio, mientras que foliol es el diterpeno menos activo de los estudiados.
H2O2 (0,1 mM)
##
# # #
80
60
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Andalusol (M)
1 2,5 5 10
Andalusol (M)
120
H2O2 (0,1 mM)
100
#
#
80
60
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
1 2,5 5 10
Conchitriol (M)
Conchitriol (M)
120
100
H2O2 (0,1 mM)
80
60
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
100
120
Resultados
50
**
40
H2O2 (0,1 mM)
30
##
##
20
10
50
Control H2O2
#
30
60
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Foliol (M)
1 2,5 5 10
Foliol (M)
20
10
50
Control H2O2
1 2,5 5 10
1 2,5 5 10
Conchitriol (M)
Conchitriol (M)
**
H2O2 (0,1 mM)
40
# #
30
20
10
Control H2O2
1 2,5 5 10
1 2,5 5 10
Lagascatriol (M) Lagascatriol (M)

H2O2 (0,1 mM)
80
1 2,5 5 10
Andalusol (M)
H2O2 (0,1 mM)
**
100
1 2,5 5 10
Andalusol (M)
40
1 2,5 5 10
120
50
H2O2 (0,1 mM)
**
40
30
20
10
Control H2O2
1 2,5 5 10
Foliol (M)
1 2,5 5 10
Foliol (M)
Fig.17. Efecto protector frente a la toxicidad inducida por H2O2. Contina en la pgina siguiente.
137
H2O2 (0,1 mM)

100
##
#
80
60
##
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Linearol (M)
1 2,5 5 10
Linearol (M)
120
H2O2 (0,1 mM)
100
80
60
#
#
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Sidol (M)
120
1 2,5 5 10
Sidol (M)
Resultados
138
50
**
H2O2 (0,1 mM)
40
30
##
##
20
10
50
Control H2O2
1 2,5 5 10
Linearol (M)
**
1 2,5 5 10
Linearol (M)
H2O2 (0,1 mM)
40
#
#
30
20
10
Control H2O2
1 2,5 5 10
Sidol (M)
1 2,5 5 10
Sidol (M)
Fig.17. Efecto protector frente a la toxicidad inducida por H2O2. Continuacin. Las clulas PC12 se incuban
con los diterpenos (rango de concentraciones de 1 10 M; 24 h) y con H2O2 (0,1 mM; 30 minutos) como nico
tratamiento o bien con ambos. El efecto protector de los diterpenos se ha determinado midiendo la capacidad
de reduccin celular de MTT como indicador de la actividad mitocondrial y midiendo la actividad enzimtica
de la enzima LDH liberada al medio de cultivo como indicador de la lisis de la membrana. La reduccin celular
de MTT se expresa como % respecto al control, definindose como 100% la viabilidad de las clulas sin tratar,
mientras que la liberacin de LDH se expresa como % respecto al mximo, definindose como 100% la
liberacin del enzima al medio provocada por Tritn X-100. Los resultados se expresan como media
Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos independientes. ** p < 0,01 versus control; # p < 0,05 y ## p <
0,01 versus H2O2.
El estudio de la actividad neuroprotectora de los diterpenos se ha continuado

evaluando el efecto sobre la morfologa celular. Para ello se han seleccionado las
concentraciones de 5 y 10 M, por ser aquellas que no han mostrado efectos citotxicos y que
adems han mostrado el mayor efecto citoprotector para todos los compuestos en los ensayos
de MTT y LDH. Estas concentraciones se utilizan tambin en los sucesivos ensayos para
evaluar los posibles mecanismos mediante los cuales los diterpenos protegen a las clulas
PC12 del dao inducido por H2O2.
Como se observa en las imgenes de la Fig.18., las clulas PC12 control adoptan una
morfologa esfrica y se encuentran formando agrupaciones. Cuando estas clulas son
tratadas con H2O2 (0,1 mM, 30 minutos), las membranas de la mayora de ellas desarrollan
Resultados
pequeas evaginaciones esfricas, adems de apreciarse una significativa disminucin en el

nmero de clulas y una prdida de la agrupacin caracterstica de las mismas. Sin embargo,
la preincubacin de las clulas PC12 con los diterpenos en estudio a las concentraciones de 5
y 10 M atena los daos morfolgicos y los cambios en el nmero de clulas, siendo este
efecto protector especialmente destacable para andalusol y linearol, seguido de lagascatriol,
conchitriol y sidol, y por ltimo, foliol.
Control
Andalusol 5 M + H2O2
Lagascatriol 5 M + H2O2
Linearol 5 M + H2O2
Linearol 10 M + H2O2
H2O2
Conchitriol 5 M + H2O2
Foliol 5 M + H2O2
Sidol 5 M + H2O2
Foliol 10 M + H2O2
Sidol 10 M + H2O2
Fig.18. Efecto sobre la morfologa celular. Las clulas PC12 se preincuban con los diterpenos (5 y 10 M)
durante 24 h previo a la exposicin a H2O2 (0,1 mM) durante 30 minutos. Las fotografas corresponden a
imgenes representativas de cada uno de los tratamientos, utilizando una cmara Moticam 2500 (Motic)
acoplada a un microscopio.
139
140
Resultados

El estrs oxidativo es una de las principales causas de muerte celular en las
enfermedades neurodegenerativas. El H2O2 adems de ser la especie reactiva de oxgeno
mayoritaria en el organismo, es fuente de otras ROS. Por ello, se ha evaluado el efecto del
H2O2 exgeno sobre el nivel de ROS intracelular durante 2 h utilizando el ensayo de la
diclorofluorescena.
En la Fig.19. se recogen los resultados del tratamiento de las clulas PC12 con H2O2
(0,1 mM). Tal como se observa, los niveles intracelulares de ROS se ven aumentados de
manera significativa en comparacin con las clulas control, lo que confirma que el H2O2, en
las condiciones experimentales establecidas, es un inductor de estrs oxidativo. A las 2 h del
ensayo, la concentracin de ROS intracelulares es un 80% mayor en las clulas tratadas slo
con H2O2 en relacin con las clulas control.
El tratamiento slo con los diterpenos en estudio (5 y 10 M) no causa cambios en los
niveles intracelulares de ROS en comparacin con las clulas control. Esto indica que los
diterpenos no inducen la produccin de ROS ni tampoco reaccionan con compuestos del medio
de cultivo favoreciendo la formacin de ROS (Clment et al., 2001; Halliwell, 2003).
Sin embargo, el tratamiento de las clulas PC12 con andalusol, conchitriol,
lagascatriol, linearol y sidol, previo a la exposicin con H2O2, reduce de manera significativa
la generacin intracelular de ROS, lo que puede suponer que el efecto protector de estos
compuestos observado en los ensayos anteriores, se debe al menos en parte, a un efecto a
nivel de la va de estrs oxidativo. Andalusol y linearol, a las concentraciones de 5 y 10 M,
han sido los compuestos ms activos. Foliol ha sido el menos activo de todos, al no reducir de
manera significativa los niveles de ROS inducidos H2O2.
Resultados
H2O2 0,1mM
A)
Control
5 M
10 M
5 M + H2O2 0,1mM
10 M + H2O2 0,1mM
**
180
160
##
120
100
80
0
20
40
60
80
100
**
180
160
140
120
100
80
120
20
40
Tiempo (min)
Produccin de ROS intracelulares (%)
FOLIOL
**
180
160
140
120
100
80
20
40
80
100
200
**
180
160
##
140
120
100
80
0
120
20
60
80
Tiempo (min)
100
**
180
160
##
120
100
80
0
120
20
40
60
60
80
Tiempo (min)
100
120
200
**
160
140
120
100
80
0
20
40
Produccin ROS intracelulares (%)
H2O2 (0,1 mM)

H2O2 (0,1 mM)
80
100
120
H2O2 (0,1 mM)
##
##
60
5 M
10 M
H2O2 (0,1 mM)
150
120
Tiempo (min)
200
H2O2 (0,1 mM)
100
180
B)
**
80
SIDOL
LINEAROL
200
140
40
Tiempo (min)
Tiempo (min)
200
60
140
LAGASCATRIOL
CONCHITRIOL
200
ANDALUSOL
200
H2O2 (0,1 mM)
##
##
##
##
100
50
Control H2O2 Andalusol Conchitriol
Lagascatriol
Foliol
Linearol
Sidol
Fig.19. Efecto sobre la produccin de ROS intracelular. Las clulas PC12 se incuban con los diterpenos (5 y
10 M; 24 h) y con H2O2 (0,1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. La produccin
intracelular de ROS se mide mediante el ensayo de la diclorofluorescena durante 2 horas. A) Curvas de
produccin de ROS intracelulares (%) versus tiempo. B) Porcentaje de ROS intracelulares a las 2 h del ensayo
de la diclorofluorescena. Los resultados se expresan como % de produccin de ROS intracelulares respecto al
control. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos
independientes. ** p < 0,01 versus control; # p < 0,05 y ## p < 0,01 versus H2O2.
141
Resultados
142

La peroxidacin lipdica es uno de los principales mecanismos de dao celular
producido por ROS. Para valorar el grado de degradacin oxidativa de los lpidos, se han
cuantificado los niveles del producto secundario malondialdehdo (MDA) por cromatografa
lquida de alta eficacia (HPLC). Tanto el mtodo analtico utilizado como la recta de calibrado
realizada para la cuantificacin de la concentracin de MDA en las muestras celulares de PC12
se incluyen en el apartado 2.2.5. del material y mtodos.
Como se muestra en la Fig.20., en las clulas PC12 expuestas a H2O2 (0,1 mM, 30
minutos) se produce un aumento significativo de la concentracin de MDA (1,33 nmoles/mg
protena) respecto a las clulas control (0,27 nmoles/mg protena). El tratamiento de las
clulas PC12 con los diterpenos (24 h) no induce peroxidacin lipdica, siendo los niveles de
MDA obtenidos similares a los de las clulas control. Sin embargo, el pretratamiento con los
diterpenos como paso previo al tratamiento con H 2O2 reduce la peroxidacin de los lpidos
inducida por H2O2. Esta reduccin es significativa para todos los compuestos, a excepcin de
foliol, y para las dos concentraciones ensayadas. Linearol (0,40 nmoles/mg protena) y
andalusol (0,51 nmoles/mg protena), a la concentracin de 10 M, han sido los compuestos
que presentan el mayor efecto protector, seguidos de linearol (0,54 nmoles/mg protena; 5
M), sidol (0,59 nmoles/mg protena; 10 M), andalusol (0,63 nmoles/mg protena; 5 M) y
1,0
0,8
##
##
0,6
0,4
0,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
H2O2
**
1,4
Andalusol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
Control
MDA (nmoles / mg protena)
Control
1,2
Control
H2O2
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
1,0
0,8
##
##
0,4
0,2
Control
H2O2
Linearol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
1,2
1,0
0,8
##
0,6
0,4
0,2
Control
H2O2
H2O2 (0,1 mM)
1,2
0,6
**
1,4
0,0
Conchitriol
**
1,4
0,0
0,0
H2O2
1,2
5 M
10 M
**
1,4
5 M
10 M
**
1,4
lagascatriol (0,65 nmoles/mg protena; 10 M).
Lagascatriol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
**
1,4
1,2
1,0
0,8
##
0,6
0,4
0,2
0,0
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.20. Efecto sobre la peroxidacin lipdica. Las clulas PC12 se incuban con los diterpenos (5 y 10 M; 24
h) y con H2O2 (0,1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. El grado de peroxidacin
lipdica se cuantifica midiendo los niveles de MDA en los extractos celulares totales por HPLC. Los resultados
se expresan como nmoles/mg protena. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar de tres
experimentos independientes. ** p < 0,01 versus control; # p < 0,05 y ## p < 0,01 versus H2O2.
Resultados

El glutation, en su estado reducido (GSH), es el principal antioxidante endgeno del
organismo; cuando los niveles de GSH bajan o se producen cambios en el ratio GSH/GSSG, las
clulas experimentan un mayor dao oxidativo. Por ello, es relevante estudiar el efecto que
puede tener los distintos tratamientos, bajo las condiciones experimentales establecidas,
sobre los niveles de GSH y GSSG.
Como se muestra en la Fig.21., las clulas control presentan niveles de GSH y GSSG
de 43 y 5,36 nmoles/mg de protena, respectivamente; el valor del ratio GSH/GSSG es de
8,02. La exposicin de las clulas PC12 a H2O2 (0,1 mM, 30 min) causa una reduccin
significativa de 13 unidades en los niveles de GSH (29,9 nmoles/mg de protena), y un
aumento significativo en los niveles de GSSG del orden de unas 4,5 unidades (9,02 nmoles/mg
de protena); estos cambios hacen que el ratio GSH/GSSG se vea afectado (valor del ratio
GSH/GSSG de 3,31). Por otro lado, el tratamiento de las clulas PC12 con los diterpenos (5 y
10 M, 24 h) no influye en los niveles de GSH ni GSSG, siendo los valores de estos parmetros
anlogos a los de las clulas control. Sin embargo, el pretratamiento de las clulas con los
diterpenos en estudio, previo a la incubacin con H2O2, previene de los cambios en los niveles
de GSH y GSSG inducidos por esta especie reactiva de oxgeno. El ratio GSH/GSSG aumenta de
manera significativa cuando las clulas PC12 se preincuban con los diterpenos, a excepcin de
foliol. Andalusol es el diterpeno que ejerce el mayor efecto sobre los cambios referidos al
equilibrio GSH y GSSG, al restablecer los niveles de glutation prcticamente hasta los valores
de las clulas control (valores de GSH de 37,3 y 39,9 nmoles/mg de protena y valores de
GSSG de 6,15 y 6,05 nmoles/mg de protena, para las concentraciones de 5 y 10 M,
respectivamente).
143
30
20
10
H2O2
5 M
10 M
40
30
20
10
Control
H2O2
Control
H2O2
10
Control
H2O2
40
30
20
10
0
Control
H2O2
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
Andalusol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
**
Control
H2O2
Control
Conchitriol
H2O2
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
5 M
10 M
**
Conchitriol
6
4
Control
**
H2O2
Lagascatriol
H2O2 (0,1 mM)
Control
H2O2
Lagascatriol
H2O2 (0,1 mM)
5M
5 M
10 M
10 M
10
8
6
4
**
2
0
2
0
Lagascatriol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
50
H2O2
GSH / GSSG
20
10
GSSG (nmoles / mg protena)
30
5 M
10 M
Control
H2O2 (0,1 mM)
GSH ( nmoles / mg protena)
40
5 M
10 M
Andalusol
H2O2 (0,1 mM)
**
**
H2O2 (0,1 mM)
50
##
##
10
Conchitriol
Andalusol
H2O2 (0,1 mM)
50
Control
GSH / GSSG
40
5 M
10 M
GSH / GSSG
5 M
10 M
GSH / GSSG
50
10
GSH (nmol / mg protena)
5 M
10 M
Resultados
144
Control
H2O2
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
Control
H2O2
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.21. Efecto sobre los niveles de GSH, GSSG y ratio GSH/GSSG. Contina en la pgina siguiente.
20
10
H2O2
40
30
20
10
0
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
6
4
5 M
10 M
**
Control
H2O2
Linearol
Control
H2O2
10
5 M
10 M
**
Linearol
H2O2 (0,1 mM)
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
6
4
**
2
0
Linearol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
50
10 M
Control
5 M
GSH / GSSG
30
10
GSH / GSSG
40
5 M
10 M
50
Resultados
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.21. Efecto sobre los niveles de GSH, GSSG y ratio GSH/GSSG. Continuacin. Las clulas PC12 se incuban
con los diterpenos (5 y 10 M; 24 h) y con H2O2 (0,1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con
ambos. Los niveles de GSH y GSSG se determinan por fluorescencia. Los resultados de los niveles de GSH y
GSSG se expresan como nmoles/mg protena y se determina el ratio GSH/GSSG. Los resultados se expresan
como media Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos independientes. * p < 0,05 versus control; # p <
0,05 y ## p < 0,01 versus H2O2.
1.1.6. Capacidad "scavenger" de los diterpenos

Los compuestos con potencial antioxidante pueden interaccionar con las ROS
(mecanismo de accin directo o "scavenger"), reduciendo as el dao oxidativo. La actividad
"scavenger" de los diterpenos objeto de estudio se ha evaluado por el mtodo ORAC (ensayo in
vitro).
Como se muestra en la Fig.22.A., la cada de la fluorescencia a lo largo del tiempo es
mucho ms rpida para cualquiera de los diterpenos que para el compuesto de referencia
utilizado (Trolox) (para la misma concentracin de 8 M). Esto nos indica que los diterpenos
no presentan una alta capacidad para capturar los radicales peroxilo generados por la
descomposicin trmica del AAPH, en trminos de comparacin con Trolox; estos radicales
peroxilo al no ser neutralizados de forma tan marcada como Trolox por los compuestos en
estudio, degradan a la fluorescena dando lugar a productos no fluorescentes, observndose
una cada ms rpida de la fluorescencia.
145
Resultados
Los valores del rea bajo la curva (AUC) para todas las cinticas frente a la
concentracin de los diterpenos y Trolox ensayadas (Fig.22.B.), demuestra de nuevo que los
diterpenos son compuestos "scavengers" ms dbiles que el compuesto de referencia Trolox.
De acuerdo a los valores ORAC (Fig.22.C.), la capacidad "scavenger" de los diterpenos
estudiados presenta el orden decreciente siguiente: linearol > foliol > sidol > conchitriol >
andalusol > lagascatriol.
Intensidad relativa de fluorescencia
A)
Control
Trolox
Andalusol
Conchitriol
Foliol
Lagascatriol
Linearol
Sidol
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
2000
4000
6000
8000
10000
Tiempo (seg)
B)
C)
Compuestos
Trolox
Andalusol
Conchitriol
Foliol
Lagascatriol
Linearol
Sidol
40
30
AUC
146
(moles Trolox /
mg muestra)
20
10
0
Valor ORAC
Andalusol
0,51 0,05
Conchitriol
0,73 0,08
Foliol
0,98 0,02
Lagascatriol
0,07 0,01
Linearol
1,28 0,07
Sidol
0,76 0,02
Concentracin (M)
Fig.22. Evaluacin de la actividad scavenger. La actividad scavenger de los diterpenos en estudio se ha

determinado por el mtodo ORAC. A) Cintica de descenso de la fluorescena (2 h y media) en ausencia
(control) y en presencia de los diterpenos y de Trolox (compuesto de referencia) (concentracin 8 M). B)
Representacin grfica del rea bajo la curva (AUC) en funcin de la concentracin de diterpenos y del
compuesto de referencia. C) Valor ORAC para los diterpenos. Los resultados se expresan como media
Desviacin Estndar (n=6) de tres experimentos independientes.
Resultados

Una vez evaluada la actividad "scavenger" de los diterpenos se ha determinado si la
disminucin significativa en los niveles de ROS observada en clulas PC12 pretratadas con los
diterpenos es debida a la activacin o induccin de las enzimas antioxidantes del organismo
(mecanismo de accin indirecto). Para ello, se ha determinado la actividad enzimtica de las
principales enzimas antioxidantes CAT, SOD, GR, GPx y HO-1, y se ha completado el estudio
midiendo los niveles de expresin proteica de las mismas mediante Western-blot.
Como se puede observar en la Fig.23., en las clulas PC12 expuestas a H2O2 (0,1 mM,
30 min), tanto la actividad como la expresin de protenas de la enzima CAT disminuyen de
manera significativa, aproximadamente 3 unidades en el caso de la actividad y
aproximadamente un 42% en el caso de la expresin de protenas. El pretratamiento con los
diterpenos andalusol, conchitriol, lagascatriol, linearol y sidol estimula y aumenta la
actividad y expresin de protenas de CAT. Linearol, a la concentracin de 10 M, ha sido el
diterpeno ms activo, al aumentar unas 6 unidades la actividad CAT y un 70% la expresin de
sus protenas, seguido de andalusol y lagascatriol.
La actividad y la expresin de protenas de la enzima SOD tambin disminuyen
significativamente en las clulas PC12 expuestas a H2O2 (0,1 mM, 30 min). La actividad
disminuye aproximadamente 3 unidades y la expresin de protenas un 26%, comparando
ambas con las clulas control. Todos los diterpenos (pretratamiento de 24 h), a excepcin de
foliol, aumentan la actividad y la expresin de protenas de SOD a alguna o a las dos
concentraciones ensayadas (5 y 10 M). Andalusol y linearol son los que ejercen el mayor
efecto
al
aumentar
significativamente
ambos
parmetros
enzimticos
las
dos
concentraciones de 5 y 10 M (Fig.24.).
En la Fig.25. se muestran los resultados correspondientes a la actividad y expresin
de la enzima antioxidante GPx. El tratamiento con H2O2 causa una disminucin significativa de
la actividad de GPx-dependiente de selenio y de GPx total en 15 y 12 unidades,
respectivamente. El pretratamiento de las clulas PC12 durante 24 h con los diterpenos,
excepto foliol, y a ambas concentraciones ensayadas, aumenta significativamente la actividad
de GPx (tanto la dependiente de selenio como la total), comparado con las clulas tratadas
slo con H2O2. La medida de la expresin de protenas confirma estos efectos. Como se
observa en la membrana de Western blot y en el anlisis densitomtrico, el tratamiento con
H2O2 (0,1 mM, 30 min) reduce significativamente la expresin proteica de GPx, siendo esta
disminucin marcadamente atenuada por el pretratamiento de las clulas con andalusol,
147
148
Resultados
conchitriol, lagascatriol, linearol y sidol (5 y 10 M).

En relacin con el estudio enzimtico de la enzima GR, se observa una significativa
disminucin de la actividad (que puede llegar a ser unas 8 veces menor que la de las clulas
control) y de la expresin de protenas (un 13% menor comparado con las clulas control) en
las clulas PC12 tratadas con H2O2 (0,1 mM, 30 min) (Fig.26.). La actividad y expresin de
protenas de GR aumentan significativamente en comparacin al H2O2 en aquellas clulas que
han sido pretratadas durante 24 h con los compuestos objeto de estudio, excepto foliol, a las
concentraciones de 5 y 10 M.
Por ltimo, se ha cuantificado la actividad y la expresin de protenas de la enzima de
fase II con propiedades antioxidantes HO-1 (Fig.27.). Al tratar las clulas con H2O2 (0,1 mM;
30 minutos), la actividad y la expresin de protenas de esta enzima se ven disminuidas 2 y
1,3 veces, respectivamente. Sin embargo, al pretratar las clulas durante 24 h con los
diterpenos, todos ellos son capaces de inducir y estimular la actividad y la expresin de
protenas de la HO-1. Una vez ms, andalusol y linearol son los ms activos, al ejercer un
significativo efecto tanto en la actividad como en la expresin de protenas, a ambas
concentraciones ensayadas (5 y 10 M), seguidos de lagascatriol, sidol y conchitriol.
Los resultados expuestos hasta ahora muestran que los diterpenos aumentan la
actividad y la expresin de las enzimas antioxidantes CAT, SOD, GR, GPx y HO-1, asocindose
este efecto a la inhibicin de la produccin de ROS intracelulares inducida por H2O2 y
demostrada previamente (apartado 1.3. de resultados).
Resultados
#
5 M
10 M
14
Actividad CAT
(UI / mg protena)
12
10
8
# #
# #
6
4
14
2
0
10
8
6
4
2
0
Control H2O2 Andalusol Conchitriol Lagascatriol
Control H2O2
Linearol
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
Andalusol
Control
H2O2
10
H2O2
Conchitriol
5
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
H2O2
B)
10
Lagascatriol
10
Foliol
Control
(M)
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
CAT
-Actina
5 M
10 M
Intensidad banda CAT (%)
# #
100
60
40
20
0

H2O2 (0,1 mM)
##
140
#
#
80
5 M
10 M
##
12
Actividad CAT
(UI / mg protena)
A)
149
5 M
10 M
120
#
100
80
60
40
20
0
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.23. Efecto en la actividad y expresin de la enzima CAT. Las clulas PC12 se preincuban con los
diterpenos (5 y 10 M) durante 24 h previo a la exposicin a H2O2 (0,1 mM) durante 30 minutos. A) La actividad
de la enzima CAT se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos celulares totales. Los
resultados de la actividad enzimtica se expresan como UI/mg protena. B) La expresin de protenas se
determina mediante Western blot en extractos celulares totales. Los resultados de la expresin de protenas
se expresan como % de intensidad de la banda, considerndose como 100% las clulas control. La -actina se
utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de CAT (n=3).
Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar de tres experimentos independientes. * p < 0,05
versus control; # p < 0,05 y ## p < 0,01 versus H2O2.
Resultados
150
A) 20
5 M
10 M
#
#
15
Actividad SOD
(UI / mg protena)
Actividad SOD
(UI / mg protena)
# #
10
5 M
10 M
20
15
10
Control H2O2
Linearol
Foliol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
H2O2 (0,1 mM)
B)
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
H2O2
Conchitriol
10
10
Lagascatriol
10
Foliol
Control
(M)
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
SOD
-Actina
5 M
10 M
#
#
150
100
50

H2O2 (0,1 mM)
200
Intensidad banda SOD (%)
200
150
100
5 M
10 M
50
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.24. Efecto en la actividad y expresin de la enzima SOD. Las clulas PC12 se preincuban con los
de la enzima SOD se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos celulares totales. Los
utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de SOD (n=3).
versus control; # p < 0,05 versus H2O2.
Resultados
5 M
10 M
# #
Actividad GPx-Se
(nmol NADPH / min. mg protena)
Actividad GPx-Se
A)
30
#
#
20
*
10
20
*
10
Control H2O2
Actividad GPx total
#
#
20
10
0
Actividad GPx total
#
#
Control
H2O2
# #
30
20
10
0
Control H2O2
Linearol
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
H2O2 (0,1 mM)
H2O2
H2O2
Andalusol
10
Conchitriol
5
10
Lagascatriol
10
(M)
5 M
10 M
##
40
B)
Sidol
H2O2 (0,1 mM)

5 M
10 M
30
Linearol
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
#
#
40
5 M
10 M
30
Foliol
Control
H2O2
10
Sidol
Linearol
5
Sidol
10
10
GPx
5 M
10 M
##
80
60
40
##
**
20
0

H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
Intensidad banda GPx total (%)
-Actina
100
151
##
100
##
#
80
#
60
40
**
20
0
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.25. Efecto en la actividad y expresin de la enzima GPx. Las clulas PC12 se preincuban con los diterpenos
(5 y 10 M) durante 24 h previo a la exposicin a H2O2 (0,1 mM) durante 30 minutos. A) La actividad de la enzima
GPx-dependiente de selenio y GPx total se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos celulares
totales. Los resultados de la actividad enzimtica se expresan como nmol NADPH/min mg protena. B) La expresin
de protenas se determina mediante Western blot en extractos celulares totales. Los resultados de la expresin de
protenas se expresan como % de intensidad de la banda, considerndose como 100% las clulas control. La -actina
se utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de GPx (n=3). Los
resultados se expresan como media Desviacin Estndar de tres experimentos independientes. * p < 0,05 y ** p <
0,01 versus control; # p < 0,05 y ## p < 0,01 versus H2O2.
(M)
Resultados
5 M
10 M
5 M
10 M
30
#
# #
25
Actividad GR
Actividad GR
A)
20
15
10
5
0

H2O2 (0,1 mM)
30
25
20
15
10
5
0
Control H2O2
Linearol
Foliol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
B)
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
10
H2O2
Conchitriol
5
10
Lagascatriol
10
(M)
Foliol
Control
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
GR
-Actina
120
# #
# #
80
60
40
20
0

H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
#
Intensidad banda GR (%)
140
100
5 M
10 M
160
152
140
120
100
160
80
60
40
20
0
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.26. Efecto en la actividad y expresin de la enzima GR. Las clulas PC12 se preincuban con los
de la enzima GR se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos celulares totales. Los resultados
de la actividad enzimtica se expresan como nmol NADPH/min mg protena. B) La expresin de protenas se
utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de GR (n=3).
Actividad HO-1
(pmoles bilirrubina / mg protena /h)
A)
5 M
10 M
30
25
#
#
20
15
10
5
0
Actividad HO-1
Resultados
153
5 M
10 M
30
# #
25
# #
20
15
10
5
0
Control H2O2
Linearol
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
B)
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
10
H2O2
Conchitriol
5
10
Lagascatriol
10
(M)
Foliol
Control
H2O2
Linearol
10
10
Sidol
5
10
HO-1
-Actina
# #
140
120
80
60
40
20
0

H2O2 (0,1 mM)
160
Intensidad banda HO-1 (%)
160
100
5 M
10 M
5 M
10 M
140
#
# #
120
100
80
60
40
20
0
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.27. Efecto en la actividad y expresin de la enzima HO-1. Las clulas PC12 se preincuban con los
de la enzima HO-1 se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos celulares totales. Los
resultados de la actividad enzimtica se expresan como pmoles bilirrubina/mg protena/h. B) La expresin de
protenas se determina mediante Western blot en extractos celulares totales. Los resultados de la expresin
de protenas se expresan como % de intensidad de la banda, considerndose como 100% las clulas control. La
-actina se utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de
HO-1 (n=3). Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar de tres experimentos
independientes. * p < 0,05 versus control; # p < 0,05 versus H2O2.
(M)
Resultados

Como se ha comentado explcitamente en la revisin bibliogrfica, el factor de
transcripcin Nrf2 modula la expresin inducible de numerosos genes de enzimas
detoxificantes y antioxidantes, incluidas las estudiadas en este trabajo.
Para establecer si esta va Nrf2 es la implicada en el proceso de induccin de las
enzimas antioxidantes por los diterpenos objeto de estudio, se han evaluado a continuacin
los niveles de protena Nrf2 en el ncleo y en el citoplasma mediante la tcnica de Western
blot.
Como puede apreciarse en la Fig.28., los niveles de expresin de protena nuclear
Nrf2 son mayores en las clulas PC12 pretratadas con los diterpenos (24 h) que en las
expuestas a H2O2 (0,1 mM, 30 min); concretamente, se observa un aumento significativo para
andalusol y linearol a las concentraciones de 5 y 10 M y para conchitriol, lagascatriol y sidol
a la concentracin de 10 M. Esto sugiere que uno de los principales mecanismos implicados
en la citoproteccin demostrada por los diterpenos, es a travs de la estabilizacin de Nrf2 en
el ncleo y la consiguiente activacin de los genes de las enzimas implicadas en la defensa
antioxidante endgena.
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
10
H2O2
Conchitriol
5
10
Lagascatriol
10
(M)
Foliol
Control
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
Nrf2
nuclear
-Actina
5 M
10 M
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
Intensidad banda Nrf2 nuclear (%)
154
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.28. Efecto en la expresin de la protena nuclear y citoplasmtica de Nrf2. Contina en la pgina

siguiente.
Resultados
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
10
H2O2
Conchitriol
5
10
Lagascatriol
10
Foliol
Control
(M)
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
Nrf2
citoplsmico
5 M
10 M
100
Intensidad banda Nrf2 citoplasmtico (%)
-Actina
80
60
40
20
0

H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
100
80
60
40
20
0
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
Nrf2 nuclear / Nrf2 citoplasmtico
2,5
#
#
2,0
#
#
#
1,5
1,0
*
0,5
0,0
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.28. Efecto en la expresin de la protena nuclear y citoplasmtica de Nrf2. Continuacin. Las clulas
PC12 se preincuban con los diterpenos (5 y 10 M) durante 24 h previo a la exposicin a H2O2 (0,1 mM) durante
30 minutos. La expresin de protenas se determina mediante Western blot en extractos celulares
citoplasmticos y nucleares. Los resultados de la expresin de protenas se expresan como % de intensidad de
la banda, considerndose como 100% las clulas control. La -actina se utiliza como normalizador de carga. Se
muestra una membrana representativa de la expresin de Nrf2 nuclear y citoplasmtico (n=3). Los resultados
se expresan como media Desviacin Estndar de tres experimentos independientes. * p < 0,05 versus control;
#
p < 0,05 versus H2O2.
155
156
Resultados

La mitocondria es un orgnelo especialmente susceptible al dao oxidativo.
Modificaciones oxidativas en la misma pueden ocasionar la alteracin de su funcionalidad, de
vital importancia para las clulas, pudiendo inducir disfuncin mitocondrial y acentuando el
estrs oxidativo.
Los siguientes estudios van encaminados a evaluar, en las condiciones experimentales
establecidas, el efecto de los diterpenos en el modelo de estrs oxidativo inducido por H2O2
sobre los marcadores bioqumicos de la funcin mitocondrial. Para este fin, se ha evaluado el
efecto sobre:
potencial de membrana mitocondrial
niveles de calcio citoslico y mitocondrial
niveles de ATP
actividad caspasa-3

La alteracin de la permeabilidad mitocondrial que resulta en la disipacin del
potencial de membrana mitocondrial (m) es uno de los acontecimientos tempranos
descritos como consecuencia del estrs oxidativo.
En la Fig.29., se muestra el efecto de los diferentes tratamientos sobre el potencial
de membrana mitocondrial. La exposicin de las clulas PC12 a H2O2 (0,1 mM, 30 min) tiene
como consecuencia una significativa reduccin del potencial de membrana mitocondrial de un
84% respecto a las clulas control. La preincubacin de las clulas PC12 durante 24 h con
andalusol, conchitriol, lagascatriol, linearol y sidol, aumenta de manera significativa la
disminucin en el potencial de membrana mitocondrial ocasionada por H2O2. Linearol, a la
concentracin de 10 M, prcticamente inhibe esta disminucin (81,2% respecto al control).
##
60
40
***
20
0
Control
H2O2
Andalusol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
120
##
60
#
40
***
20
0
Control
H2O2
Conchitriol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
100
100
80
60
40
***
20
0
80
Control
H2O2
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
###
###
80
60
40
***
20
0
Control
H2O2
Linearol
H2O2 (0,1 mM)
Potencial membrana mitocondrial

(% respecto al control)
###
5 M
10 M
100
5 M
10 M
100


80

5 M
10 M
100


Resultados
###
80
##
60
40
***
20
0
Control
H2O2
Lagascatriol
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
100
80
## ##
60
40
***
20
0
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.29. Efecto sobre el potencial de membrana mitocondrial. Las clulas PC12 se incuban con los diterpenos
(5 y 10 M; 24 h) y con H2O2 (0,1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. Los cambios en
el potencial de membrana mitocondrial se determinan por fluorescencia empleando el catin lipoflico
fluorescente ster metlico de tetrametilrodamina (TMRM). Los resultados del potencial de membrana
mitocondrial se expresan como % respecto al control. Los resultados se expresan como media Desviacin
Estndar (n=9) de tres experimentos independientes. *** p < 0,001 versus control; # p < 0,05, ## p < 0,01 y ### p
< 0,001 versus H2O2.

La alteracin de la homeostasis del calcio celular es una de las seales tempranas al
estrs oxidativo.
Como se muestra en la Fig.30., cuando las clulas PC12 se tratan durante 24 h con los
diterpenos, los valores de la concentracin de calcio citoslico obtenidos son similares a los
de las clulas control, lo que indica que estos compuestos no alteran la homeostasis del calcio
celular. Por otro lado, el tratamiento de las clulas con H2O2 (0,1 mM; 30 min) causa un
aumento significativo del calcio citoslico comparado con las clulas control (395,9 nmoles
versus 51,3 nmoles). Los pretratamientos con los diterpenos, previo a la exposicin a H2O2,
inhiben de manera significativa, a excepcin de foliol, la elevacin de la concentracin
citoslica de calcio. El mayor efecto observado corresponde a linearol (10 M) el cual reduce
hasta 3,5 veces la concentracin de calcio citoslico.
157
Resultados
158
A)
MnCl2
Control
H2O2 (0,1 mM)
140
Andalusol (5 M) + H2O2 (0,1 mM)

100
H2O2 (0,1 mM)
Conchitriol (5 M) + H2O2 (0,1 mM)
120
100
200
400
600
Tiempo (seg)
800
200
400
600
Control
800
Foliol (5 M)
140
Foliol (10 M) + H2O2 (0,1 mM)
100
600
800
1000
800
1000
MnCl2
160
Linearol (5 M)
Sidol (5 M)
Ionomicina
Sidol (10 M)
Linearol (10 M)
120
Linearol (5 M) + H2O2 (0,1 mM)
Ionomicina
Control
H2O2 (0,1 mM)
140
Sidol (5 M) + H2O2 (0,1 mM)
120
Sidol (10 M) + H2O2 (0,1 mM)
100
80
80
400
600
Control
100
80
400
H2O2 (0,1 mM)
140
F410 nm
Foliol (5 M) + H2O2 (0,1 mM)
120
200
200
Tiempo (seg)
Foliol (10 M)
Ionomicina
Lagascatriol (10 M) + H2O2 (0,1 mM)
100
1000
MnCl2
160
H2O2 (0,1 mM)
Ionomicina
Tiempo (seg)
MnCl2
160
1000
Lagascatriol (10 M)
120
80
80
80
Lagascatriol (5 M)
140
Conchitriol (5 M)
Ionomicina
Conchitriol (10 M)
F410 nm
F410 nm
Ionomicina
Control
MnCl2
160
H2O2 (0,1 mM)
Andalusol (10 M)
120
F410 nm
Control
MnCl2
160
Andalusol (5 M)
F410 nm
140
F410 nm
160
Tiempo (seg)
200
400
600
800
1000
200
400
600
800
1000
Tiempo (seg)
Tiempo (seg)
400
Control
H2O2 (0,1 mM)
***
5 M
10 M
5 M + H2O2 (0,1 mM)
10 M + H2O2 (0,1 mM)
###
###
100
##
200
##
300
##
[Ca2+]citoslico (nM)
B)
ol
l
l
ol
l
tri
io
s
r
a
ro
t
ol
io
u
hi
sc
id
ol
ea
al
c
a
F
S
n
d
n
g
Li
An
La
Co
Fig.30. Efecto sobre los niveles de calcio citoslico. Las clulas PC12 se incuban con los diterpenos (5 y 10
M; 24 h) y con H2O2 (0,1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. Los cambios en los
niveles de calcio citoslico se determinan por fluorescencia empleando el catin lipoflico fluorescente Indo1/AM. A) Grficas representativas de las medidas de fluorescencia correspondientes al calcio citoslico para
los tiempos indicados. El calcio citoslico se mide antes y despus de la adicin de ionomicina (fluorescencia
mxima) y de MnCl2 (fluorescencia mnima) (indicado con flechas en las grficas) para determinar la
concentracin de calcio citoslico. B) Niveles de calcio citoslico. Los resultados de los niveles de calcio
citoslico se expresan como concentracin (nM). Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar
(n=9) de tres experimentos independientes. *** p < 0,001 versus control; ## p < 0,01 y ### p < 0,001 versus H2O2.
Resultados

Las mitocondrias juegan un papel primordial en el mantenimiento de la homeostasis
del calcio celular. Una vez determinados los efectos sobre el potencial de membrana
mitocondrial y sobre los niveles de calcio citoslico, evaluamos la capacidad de aclaramiento
del calcio por las mitocondrias y la acumulacin del mismo en estos orgnulos despus de los
diferentes tratamientos.
En la Fig.31., se muestra que ninguno de los diterpenos, a las concentraciones y
tiempo de tratamiento ensayados, aumentan la concentracin de calcio mitocondrial. Por
otro lado, el H2O2 produce una significativa acumulacin de calcio en la mitocondria (unas 0,7
veces respecto a las clulas control). Cuando las clulas se tratan durante 24 h con los
diterpenos objeto de estudio, previo a la exposicin a H 2O2, se observa una disminucin en los
niveles de calcio mitocondrial; concretamente, este efecto es significativamente marcado
para linearol, andalusol (5 y 10 M) y conchitriol (10 M), los cules provocan una reduccin
de los niveles de calcio mitocondrial a niveles muy semejantes a los de las clulas control.
159
Resultados
160
A)
140
140
140
Control
A23187
F581 nm
H2O2 (0,1 mM)
100
Andalusol (5 M)
100
H2O2 (0,1 mM)
A23187
Conchitriol (5 M)
Conchitriol (10 M)
80
Andalusol (10 M)
80
Control
120
H2O2 (0,1 mM)
A23187
F581 nm
120
F581 nm
Control
120
100
Lagascatriol (5 M)
Lagascatriol (10 M)
80
60
60
60
40
40
40
0
200
400
600
800
1000
200
400
600
800
1000
200
400
600
800
1000
Tiempo (seg)
Tiempo (seg)
Tiempo (seg)
140
180
140
160
Control
120
Foliol (5 M)
100
Foliol (10 M)
80
100
Linearol (5 M)
Linearol (10 M)
80
60
Foliol (10 M) + H2O2 (0,1 mM)
20
200
400
600
800
1000
200
400
600
800
Sidol (5 M) + H2O2 (0,1 mM)

Sidol (10 M) + H2O2 (0,1 mM)
60
200
400
600
800
1000
Tiempo (seg)
B)
Control
H2O2 (0,1 mM)
5 M
10 M
5 M + H2O2 (0,1 mM)
**
1,6
1,4
10 M + H2O2 (0,1 mM)
#
1,2
Nivel Ca2+mitocondrial
(relativo al control)
Sidol (10 M)
1000
Tiempo (seg)
Tiempo (seg)
1,8
Sidol (5 M)
80
40
40
100
Foliol (5 M) + H2O2 (0,1 mM)
60
40
H2O2 (0,1 mM)
A23187
F581 nm
A23187
120
Control
120
H2O2 (0,1 mM)
H2O2 (0,1 mM)
F581 nm
F581 nm
140
Control
A23187
1,0
o
us
al
nd
ol
l
tri
io
ca
itr
s
h
a
g
nc
La
Co
l
lio
Fo
ol
ar
ne
Li
l
do
Si
Fig.31. Efecto sobre los niveles de calcio mitocondrial. Las clulas PC12 se incuban con los diterpenos (5 y
10 M; 24 h) y con H2O2 (0,1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. Los cambios en los
niveles de calcio mitocondrial se determinan por fluorescencia empleando el catin lipoflico fluorescente
Rhod-2. A) Grficas representativas de las medidas de fluorescencia correspondientes al calcio mitocondrial
para los tiempos indicados. El calcio mitocondrial se mide antes y despus de la adicin del ionforo A23187
(indicado con flechas en las grficas) para determinar la concentracin de calcio mitocondrial. B) Niveles de
calcio mitocondrial. Los resultados de los niveles de calcio mitocondrial se expresan como nivel de calcio
mitocondrial relativo al control. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres
experimentos independientes. ** p < 0,01 versus control; # p < 0,05 versus H2O2.
Resultados

La principal funcin de las mitocondrias es la de producir energa en forma de ATP va
fosforilacin oxidativa y consumo de oxgeno.
La mitocondria acumula calcio en forma de fosfatos, de manera que una excesiva
acumulacin del mismo a nivel mitocondrial puede llevar a un desacoplamiento de la funcin
de la fosforilacin oxidativa. Por tanto, a fin de determinar el efecto de los diferentes
tratamientos sobre los niveles de ATP, hemos medido la cantidad de este nucletido de
adenina mediante cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC). El mtodo analtico y la
recta de calibrado realizada para la cuantificacin de ATP en las clulas PC12 se incluyen en
el apartado 2.2.14. del material y mtodos.
5 M
10 M
80
**
60
40
20
0
Control
H2O2
100
#
80
60
**
40
20
0
Andalusol
Control H2O2
H2O2 (0,1 mM)
20
0
Control
H2O2
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
60
40
20
0
Control H2O2
Lagascatriol
H2O2 (0,1 mM)
100
80
60
**
40
20
0
Control H2O2
5 M
10 M
Niveles de ATP (%)
40
**
5 M
10 M
Niveles de ATP (%)
Niveles de ATP (%)
**
80
H2O2 (0,1 mM)
100
60
100
Conchitriol
5 M
10 M
80
5 M
10 M
Niveles de ATP (%)
Niveles de ATP (%)
Niveles de ATP (%)
100
5 M
10 M
Linearol
H2O2 (0,1 mM)
100
#
80
**
60
40
20
0
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.32. Efecto sobre los niveles de ATP. Las clulas PC12 se incuban con los diterpenos (5 y 10 M; 24 h) y
con H2O2 (0,1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. Los niveles de ATP se miden por
HPLC. Los resultados de los niveles de ATP se expresan como %, considerndose como 100% los niveles de ATP
en las clulas control. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres
Como se observa en la Fig.32., ninguno de los diterpenos, bajo las condiciones

experimentales ensayadas, afecta a los niveles de ATP en comparacin con las clulas
control. Tras la incubacin con H2O2 durante 30 min, el nivel de produccin de ATP por la
161
Resultados
mitocondria se reduce significativamente un 41%, lo que indica una alteracin de la funcin

mitocondrial. El pretratamiento de las clulas con los diterpenos objeto de estudio provoca
una normalizacin de los niveles de ATP en todos los casos a excepcin de foliol. Este efecto
es especialmente notable en el caso de linearol y andalusol.

La muerte celular desencadenada por estrs oxidativo, se produce fundamentalmente
por mecanismos de apoptosis. En este mecanismo, la enzima efectora principal es caspasa-3.
A continuacin, hemos abordado el estudio del efecto de los diferentes tratamientos sobre la
actividad de esta enzima.
100
50
Control
H2O2
100
50
H2O2
Control
Foliol
H2O2 (0,1 mM)
H2O2
5 M
10 M
200
#
150
100
50
0
Control
H2O2
Linearol
H2O2 (0,1 mM)
200
150
100
50
Conchitriol
H2O2 (0,1 mM)
*
Actividad caspasa-3
100
Control
50
5 M
10 M
150
150
Andalusol
H2O2 (0,1 mM)
200
5 M
10 M
*
Actividad caspasa-3
#
150
5 M
10 M
*
200
Control
H2O2
Lagascatriol
H2O2 (0,1 mM)
*
Actividad caspasa-3
5 M
10 M
200
Actividad caspasa-3
Actividad caspasa-3
Actividad caspasa-3
162
5 M
10 M
200
150
100
50
0
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (0,1 mM)
Fig.33. Efecto sobre la actividad caspasa-3. Las clulas PC12 se incuban con los diterpenos (5 y 10 M; 24 h)
y con H2O2 (0,1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. La actividad caspasa-3 se
determina en extractos celulares totales por fluorimetra y utilizando el sustrato especfico Ac-DEVD-AMC. Los
resultados se expresan como % respecto al control, correspondiendo el 100% a las clulas sin tratar. Los
resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos independientes. * p <
0,05 versus control; # p < 0,05 versus H2O2.
La actividad caspasa-3 se ha determinado utilizando el sustrato especfico

fluorognico Ac-DEVD-AMC. Como se muestra en la Fig.33., el tratamiento durante 24 h de
las clulas PC12 con cada uno de los diterpenos, a las concentraciones ensayadas de 5 y 10 M
no afecta a la actividad caspasa-3, en comparacin con las clulas control. Por otro lado, la
Resultados
actividad caspasa-3, despus de la exposicin a H2O2 (0,1 mM, 30 minutos), aumenta un 103%
comparado con las clulas sin tratar, lo que sugiere que la muerte celular ocasionada por este
inductor de estrs oxidativo se produce por mecanismos de apoptosis. Los pretratamientos de
las clulas (24 h) con los diferentes diterpenos atenan el aumento en la actividad de esta
enzima efectora de la apoptosis. Particularmente, linearol y andalusol han sido los
compuestos ms efectivos, al inhibir la actividad caspasa-3 un 64% y un 73% (linearol), y un
56% y un 69% (andalusol), a las concentraciones de 5 y 10 M, respectivamente.
1.2. Resultados sobre la lnea celular U373-MG

Una vez evaluado y demostrado el efecto protector de los compuestos objeto de
estudio, aislados de especies del gnero Sideritis, en clulas PC12 (modelo neuronal), se ha
procedido a estudiar si estos diterpenos poseen efecto sobre astrocitos, las clulas
mayoritarias del SNC. Para ello, como modelo de astrocitoma, utilizamos clulas U373-MG.
1.2.1. Citotoxicidad celular

El efecto de diferentes concentraciones de los diterpenos (rango de concentraciones
de 1 a 100 M) sobre la viabilidad de las clulas U373-MG despus de 24 h de tratamiento se
ha evaluado mediante el ensayo de reduccin de MTT (cuantifica la funcin mitocondrial) y
mediante el ensayo de liberacin de LDH (cuantifica la prdida de integridad de la
membrana, tal como se recoge en el material y mtodos).
Como se observa en la Fig.34., tras 24 h de tratamiento, ninguna de las
concentraciones ensayadas del diterpeno andalusol (1; 2,5; 5; 10; 25 y 100 M) afecta a la
viabilidad de las clulas U373-MG en trminos de alteracin de la funcin mitocondrial y de la
integridad de la membrana.
En el caso de lagascatriol, se observan efectos citotxicos a concentraciones
superiores a 50 M (24 h de tratamiento). A partir de esta concentracin se obtienen valores
de reduccin de MTT por debajo del 90% respecto al control y valores de liberacin de LDH
por encima del 20% respecto al mximo (correspondiente al Tritn X-100).
163
Resultados
Para el resto de los diterpenos ensayados (conchitriol, foliol, linearol y sidol) se

observa que concentraciones superiores a 10 M, bajo las condiciones experimentales
establecidas, disminuyen la funcin mitocondrial as como la integridad de la membrana
celular de una manera concentracin dependiente. El tratamiento (24 h) con concentraciones
inferiores a 10 M de estos compuestos no induce cambios en la funcin mitocondrial, tal y
como se observa en los valores del porcentaje de reduccin de MTT obtenidos (son iguales o
superiores al 90% del control), ni alteran la integridad de la membrana celular (valores
40
40
20
20
0
0
20
40
60
80 100
Andalusol (M)
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
20
40
60
80 100
Foliol (M)
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
20
40
60
80 100
Conchitriol (M)
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
20
40
60
80 100
Linearol (M)
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
20
40
60
80 100
Lagascatriol (M
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
120
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
0
20
40
60
80 100
Sidol (M)
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
100
60
120
100
60
80
80
120
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
100
120
100
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
120
Reduccin de MTT
Liberacin de LDH
menores del 10% del total de LDH liberado).
164
Fig.34. Citotoxicidad celular. La citotoxicidad de los diterpenos sobre la lnea celular U373-MG se ha
determinado midiendo la capacidad de reduccin celular de MTT como indicador de la actividad mitocondrial
y midiendo la actividad enzimtica de la enzima LDH liberada al medio de cultivo como indicador de la lisis de
la membrana. Las clulas se tratan con diferentes concentraciones de los diterpenos (rango de
concentraciones de 1100 M) durante 24 h. La reduccin celular de MTT se expresa como % respecto al
control, definindose como 100% la viabilidad de las clulas sin tratar, mientras que la liberacin de LDH se
expresa como % respecto al mximo, definindose como 100% la liberacin del enzima al medio provocada por
Tritn X-100. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos
independientes.

El rango de concentraciones seleccionado para realizar los estudios de proteccin
Resultados
celular de los diterpenos frente al dao inducido por H2O2 ha sido de 1 a 10 M dado que
dichas concentraciones no han resultado citotxicas en los estudios previos realizados con las
clulas U373-MG.
Para este fin, la lnea celular U373-MG se trata con los diterpenos objeto de estudio
(24 h) y con H2O2 (30 min), como inductor de estrs oxidativo. Como primer paso se
determina el efecto sobre la viabilidad celular, midiendo la capacidad de reduccin celular de
MTT como indicador de la actividad mitocondrial y midiendo la actividad enzimtica de LDH
liberada al medio de cultivo como indicador de la lisis de la membrana.
Como se puede apreciar en la Fig.35., tras 24 h de tratamiento ninguno de los
diterpenos objeto de estudio a ninguna de las concentraciones ensayadas (de 1 a 10 M) tiene
efecto sobre la viabilidad de las clulas U373-MG.
El tratamiento de las clulas con H2O2 (1 mM, 30 minutos) provoca una significativa
disminucin de la actividad mitocondrial (45% de reduccin de MTT respecto a las clulas
control) y una significativa prdida de la integridad de la membrana, tal y como se refleja en
el porcentaje de liberacin de la enzima citoslica LDH al medio (48% del mximo,
correspondiente al Tritn X-100).
Sin embargo, la preincubacin de las clulas U373-MG con los diterpenos (24 h),
previo a la exposicin de las clulas al inductor de estrs oxidativo (H 2O2; 1 mM; 30 min),
tiene como consecuencia una proteccin frente a la prdida de actividad mitocondrial de la
clula y de integridad de la membrana celular.
Concretamente, andalusol y lagascatriol han sido los que ejercen el mayor efecto
protector. Todas las concentraciones ensayadas de andalusol protegen significativamente a
los astrocitos frente a la citotoxicidad ocasionada por H2O2, incrementando la actividad
mitocondrial y recuperando la integridad de la membrana celular. El lagascatriol ejerce un
efecto protector estadsticamente significativo de manera concentracin-dependiente a partir
de 2,5 M.
Linearol y sidol ejercen un efecto protector, que podemos considerar moderado si lo
expresamos en trminos de comparacin con los ms activos, andalusol y lagascatriol. Ambos
diterpenos de tipo kaurano incrementan la actividad mitocondrial de manera concentracindependiente a partir de 2,5 M. Adems, a las concentraciones ms altas ensayadas de 5 y 10
165
Resultados
M (24 h de tratamiento), estos diterpenos disminuyen significativamente la liberacin de la

enzima LDH, recuperndose as la integridad de la membrana previamente afectada por la
exposicin a H2O2.
Foliol y conchitriol ejercen un efecto protector bajo expresado siempre en trminos
comparativos con los diterpenos ms activos. Este efecto es apreciable, pero no significativo,
a las concentraciones de 5 y 10 M. A ambas concentraciones, el tratamiento durante 24 h
con ambos compuestos, tiene como consecuencia la recuperacin de la actividad mitocondrial
H2O2 (1 mM)
100
##
#
#
60
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Reduccin de MTT ( % respecto al control )
Andalusol (M)
120
100
H2O2 (1 mM)
80
60
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
1 2,5 5 10
Conchitriol (M)
Conchitriol (M)
120
H2O2 (1 mM)
100
80
60
##
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5
10
50
1 2,5 5 10
**
H2O2 (1 mM)
40
#
#
30
##
##
20
10
0
1 2,5 5 10
Andalusol (M)
Liberacin de LDH ( % respecto al mximo )
80
60
Liberacin de LDH ( % respecto al mximo )
120
Control H2O2
1 2,5 5 10
Andalusol (M)
60
1 2,5 5 10
Andalusol (M)
H2O2 (1 mM)
**
50
40
30
20
10
Liberacin de LDH ( % respecto al mximo)
y la integridad de la membrana celular, si bien en pequeo porcentaje.
166
Control H2O2
1 2,5 5 10
Conchitriol (M)
1 2,5 5 10
Conchitriol (M)
60
50
**
H2O2 (1 mM)
40
##
30
##
20
10
0
Control H2O2
1 2,5 5
10
Lagascatriol (M)
1 2,5 5 10
Lagascatriol (M)
Fig.35. Efecto protector frente a la toxicidad inducida por H2O2. Contina en la pgina siguiente.
100
H2O2 (1 mM)
60
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Foliol (M)
1 2,5 5 10
120
100
H2O2 (1 mM)
80
60
# #
**
40
20
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Linearol (M)
1 2,5 5 10
Linearol (M)
100
H2O2 (1 mM)
80
# #
**
40
20
0
H2O2 (1 mM)
**
50
40
30
20
10
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Foliol (M)
60
50
Control H2O2
1 2,5 5 10
Sidol (M)
1 2,5 5 10
Sidol (M)
1 2,5 5 10
Foliol (M)
H2O2 (1 mM)
**
#
#
40
30
20
10
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Linearol (M)
50
1 2,5 5 10
Linearol (M)
H2O2 (1 mM)
60
120
60
60
Foliol (M)
80
120
Resultados
**
#
#
40
30
20
10
0
Control H2O2
1 2,5 5 10
Sidol (M)
1 2,5 5 10
Sidol (M)
Fig.35. Efecto protector frente a la toxicidad inducida por H2O2. Continuacin. Las clulas U373-MG se
incuban con los diterpenos (rango de concentraciones de 1 10 M; 24 h) y con H2O2 (1 mM; 30 minutos) como
nico tratamiento o bien con ambos. El efecto protector de los diterpenos se ha determinado midiendo la
capacidad de reduccin celular de MTT como indicador de la actividad mitocondrial y midiendo la actividad
enzimtica de la enzima LDH liberada al medio de cultivo como indicador de la lisis de la membrana. La
reduccin celular de MTT se expresa como % respecto al control, definindose como 100% la viabilidad de las
clulas sin tratar (control), mientras que la liberacin de LDH se expresa como % respecto al mximo,
definindose como 100% la liberacin del enzima al medio provocada por Tritn X-100. Los resultados se
expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos independientes. ## p < 0,01 y # p < 0,05
versus H2O2.
Para confirmar el efecto protector de los diterpenos observado, se ha procedido a

evaluar el resultado de los diferentes tratamientos sobre la morfologa de las clulas U373MG. De acuerdo a los resultados obtenidos en los ensayos de reduccin de MTT y de liberacin
de la enzima LDH, las concentraciones no citotxicas de 5 y 10 M ensayadas para todos los
167
168
Resultados
diterpenos ejercen el mayor efecto protector. Por ello, estas concentraciones han sido las
empleadas para el estudio de la morfologa celular as como para los consiguientes ensayos.
Control
H2O2
Foliol 5 M + H2O2
Foliol 10 M + H2O2
Linearol 10 M + H2O2
Sidol 5 M + H2O2
Sidol 10 M + H2O2
Linearol 5 M + H2O2
Fig.36. Efecto sobre la morfologa celular. Las clulas U373-MG se preincuban con los diterpenos (5 y 10 M)
durante 24 h previo a la exposicin a H2O2 (1 mM) durante 30 minutos. Las fotografas corresponden a
imgenes representativas de cada uno de los tratamientos, utilizando una cmara Moticam 2500 (Motic)
acoplada a un microscopio.
En la Fig.36. se muestran imgenes representativas del efecto de cada uno de los

tratamientos sobre la morfologa de las clulas U373-MG. Como se aprecia en la imagen
Resultados
correspondiente al control, las clulas estn constituidas por un ncleo del que surgen un
conjunto de prolongaciones, grandes y numerosas, que confieren un aspecto estrellado a su
morfologa. El tratamiento celular con H 2O2 (1 mM, 30 min) causa no slo una disminucin en
el nmero de clulas sino que tambin da lugar a apreciables cambios morfolgicos, en
concreto, reduccin del tamao celular y prdida de las ramificaciones. La preincubacin de
las clulas U373-MG con los diterpenos del estudio, previo a la exposicin con H 2O2, evita la
aparicin de estos cambios. En este ensayo, al igual que lo observado en los ensayos de MTT y
de LDH, andalusol y lagascatriol son los de mayor actividad en la prevencin de los cambios
poblaciones y estructurales, seguidos de linearol y sidol y por ltimo, conchitriol y foliol cuyos
efectos resultan prcticamente inapreciables.

Como ya se ha comentado de forma extensa en la revisin bibliogrfica, excesivas
cantidades de ROS conducen a una situacin de estrs oxidativo, pudiendo el H2O2 promover
la generacin endgena de ROS en diferentes tipos celulares. Teniendo esto en cuenta hemos
estudiado en primer lugar si este agente oxidante, bajo las condiciones experimentales
establecidas en nuestro trabajo, es capaz de inducir la produccin de ROS.
Se ha realizado para ello el ensayo de la diclorofluorescena, cuyos resultados
mostrados en la Fig.37., revelan que los niveles de ROS en clulas U373-MG tratadas con H2O2
aumentan significativamente, en concreto 2,8 veces respecto al control (medida realizada
tras finalizar las 2 horas del ensayo). De forma paralela se ha determinado si los diterpenos
objeto de estudio son capaces de estimular la produccin de ROS intracelular, aprecindose
que ninguno de ellos, a las concentraciones empleadas en el estudio, ocasiona este efecto.
Establecidas estas condiciones previas, procedimos a determinar si la preincubacin
de las clulas U373-MG con los diterpenos, previo a la exposicin a H2O2, protege a las clulas
del dao generado por una sobreproduccin de ROS. Andalusol, a la concentracin de 10 M,
es el diterpeno que ejerce el mayor efecto inhibidor, al reducir 1,4 veces el nivel de ROS en
comparacin con las clulas tratadas slo con H2O2.
169
Resultados
170
H2O2 1mM
A)
Control
5 M
10 M
5 M + H2O2 1mM
10 M + H2O2 1mM
FOLIOL
FOLIOL
ANDALUSOL
CONCHITRIOL
250
200
##
150
100
20
40
60
80
100
250
200
150
100
0
120
20
40
***
250
200
150
100
0
20
40
80
100
250
200
##
150
100
120
20
40
60
80
Tiempo (min)
100
250
##
200
150
100
0
120
20
40
60
80
100
120
SIDOL
***
300
60
Tiempo (min)
LINEAROL
FOLIOL
300
60
***
300
Tiempo (min)
Tiempo (min)
LAGASCATRIOL
***
300
***
ANDALUSOL
300
80
100
120
***
300
250
##
200
150
100
0
20
40
Tiempo (min)
60
80
100
120
Tiempo (min)
5 M
10 M
Produccin de ROS intracelulares ( % )
B)
300
***
H2O2 (1 mM)
H2O2 (1 mM)
H2O2 (1 mM)
250
H2O2 (1 mM)
200
H2O2 (1 mM)
##
##
H2O2 (1 mM)
##
##
##
##
##
##
150
100
50
Control H2O2 Andalusol Conchitriol
Lagascatriol
Foliol
Linearol
Sidol
Fig.37. Efecto de sobre la produccin de ROS intracelular. Las clulas U373-MG se incuban con los
diterpenos (5 y 10 M; 24 h) y con H2O2 (1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. La
produccin intracelular de ROS se mide mediante el ensayo de la diclorofluorescena durante 2 horas. A)
Curvas de produccin de ROS intracelulares (%) versus tiempo. B) Porcentaje de ROS intracelulares a las 2 h
del ensayo de la diclorofluorescena. Los resultados se expresan como % de produccin de ROS intracelulares
respecto al control. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos
independientes. *** p < 0,001 versus control; ## p < 0,01 versus H2O2.
Resultados

La peroxidacin lipdica es el marcador bioqumico ms comnmente utilizado para
determinar el estrs oxidativo. En este trabajo este parmetro lo hemos determinado
cuantitativamente determinando el contenido de malondialdehdo (MDA) y utilizando la
cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) como tcnica analtica (en el apartado 2.2.5.
del material y mtodos se incluye el mtodo analtico desarrollado y la recta de calibracin
realizada para la cuantificacin de los niveles de MDA en clulas U373-MG).
Tal y como se observa en la Fig.38., la concentracin de MDA en las clulas U373-MG
expuestas a H2O2 (1 mM, 30 min) resulta ser significativamente superior a la de las clulas
control (0,31 nmoles/mg protena para las clulas control y 0,95 nmoles/mg protena para las
clulas tratadas con H2O2). Tal como hemos podido determinar en este estudio, ninguno de
los diterpenos provoca la degradacin de las membranas biolgicas por peroxidacin lipdica,
ya que no se observan aumentos en los valores de MDA en comparacin con las clulas
control. Sin embargo, el pretratamiento con estos compuestos terpnicos da lugar a la
inhibicin de la formacin de MDA como subproducto de la peroxidacin lipdica en las
condiciones de estrs oxidativo inducido por H2O2. Esta inhibicin es significativa para
andalusol y lagascatriol a ambas concentraciones ensayadas (5 y 10 M) y para linearol y sidol
5 M
10 M
0,6
0,4
0,2
0,8
0,6
0,4
0,2
Control
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
5 M
10 M
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Control
H 2 O2
Foliol
H2O2 (1 mM)
0,6
0,4
0,2
Conchitriol
Control
H2O2
1,0
5 M
10 M
0,8
0,6
0,4
0,2
Lagascatriol
H2O2 (1 mM)
H2O2 (1 mM)
MDA (nmol / mg protena)
H2O2 (1 mM)
1,0
0,8
0,0
0,0
0,0
5 M
10 M
1,0
0,8
1,0
5 M
10 M
1,0
a la concentracin de 10 M.
1,0
5 M
10 M
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
Control
H2O2
Linearol
H2O2 (1 mM)
Control
H 2 O2
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.38. Efecto sobre la peroxidacin lipdica. Las clulas U373-MG se incuban con los diterpenos (5 y 10 M;
24 h) y con H2O2 (1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. El grado de peroxidacin
lipdica se cuantifica midiendo los niveles de MDA en los extractos celulares totales por HPLC. Los resultados
se expresan como nmoles/mg protena. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de
tres experimentos independientes. * p < 0,05 versus control; # p < 0,05 versus H2O2.
171
Resultados
172

En la Fig.39., se muestran los niveles de GSH, GSSG y el ratio GSH/GSSG. En las
clulas control, as como en las clulas tratadas con los diterpenos objeto de estudio (5 y 10
M, 24 h), casi todo el glutation detectado ha sido en su estado reducido (GSH). Al incubar las
clulas con H2O2 (1 mM, 30 min), los niveles de GSH disminuyen de manera significativa (17,1
nmoles/mg de protena) respecto al control (46,3 nmoles/mg de protena), mientras que los
niveles de la especie oxidada (GSSG) aumentan tambin significativamente (6,3 nmoles/mg
de protena para las clulas control y 9,2 nmoles/mg de protena para las clulas tratadas con
H2O2). Cuando las clulas se incuban con los compuestos en estudio, concretamente con
andalusol, lagascatriol, linearol y sidol (5 y 10 M, 24 h), el ratio GSH/GSSG aumenta
significativamente comparado con las clulas tratadas slo con H2O2. As pues, sobre la base
de estos resultados, los diterpenos evitan la disminucin de la concentracin de GSH,
acompaado del aumento de la concentracin de GSSG, que se produce como consecuencia
del tratamiento con el inductor de estrs oxidativo, el H2O2. De todos los diterpenos,
andalusol es el ms activo, al restaurar los niveles de GSH y GSSG de manera similar a los de
##
40
##
30
**
20
10
0
Control
H2O2
30
**
20
10
0
Control
H2O2
Conchitriol
H2O2 (1 mM)
##
**
Control
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
10
**
Andalusol
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
5 M
10 M
8
8
GSH / GSSG
40
##
H2O2 (1 mM)
GSSG (nmol / mg protena)
5 M
10 M
5 M
10 M
H2O2 (1 mM)
50
Andalusol
5 M
10 M
**
10
GSH / GSSG
5 M
10 M
50
las clulas control.
Control H2O2
Conchitriol
H2O2 (1 mM)
**
Control H2O2
Conchitriol
H2O2 (1 mM)
Fig.39. Efecto sobre los niveles de GSH, GSSG y ratio GSH/GSSG. Contina en la pgina siguiente.
40
#
#
30
**
20
10
0
Control
H2O2
**
10
Control
H2O2
**
20
10
H2O2
Control
H2O2
**
20
10
0
H2O2
H2O2
30
20
**
10
0
10
Sidol
H2O2 (1 mM)
**
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
Control H2O2
Linearol
H2O2 (1 mM)
**
5 M
10 M
Control H2O2
#
4
Linearol
GSH / GSSG
40
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
Foliol
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
Control
H2O2
H2O2 (1 mM)
50
Control
5 M
10 M
Linearol
**
**
10
Control
Foliol
H2O2 (1 mM)
GSH / GSSG
30
40
5 M
10 M
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
Lagascatriol
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
Foliol
50
H2O2
Control
Control
GSH / GSSG
30
**
Lagascatriol
**
10
40
#
4
H2O2 (1 mM)
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
2
0
5 M
10 M
Lagascatriol
50
5 M
10 M
GSH / GSSG
5 M
10 M
50
Resultados
**
Control H2O2
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.39. Efecto sobre los niveles de GSH, GSSG y ratio GSH/GSSG. Continuacin. Las clulas U373-MG se
incuban con los diterpenos (5 y 10 M; 24 h) y con H2O2 (1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con
ambos. Los niveles de GSH y GSSG se determinan por fluorescencia. Los resultados de los niveles de GSH y
GSSG se expresan como nmoles/mg protena y se determina el ratio GSH/GSSG. Los resultados se expresan
como media Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos independientes. ** p < 0,01 versus control; # p <
0,05 versus H2O2.
173
174
Resultados

Tras evaluar el efecto protector de los diterpenos aislados de Sideritis frente al dao
oxidativo (niveles de ROS, peroxidacin lipdica y cambios en el ratio GSH/GSSG) inducido por
H2O2, se ha analizado a continuacin si estos compuestos inducen la actividad y expresin de
las principales enzimas antioxidantes en la lnea celular U373-MG, tal y como hemos
observado en las clulas PC12. La actividad de las enzimas antioxidantes CAT, SOD, GR, GPx y
HO-1 se ha determinado empleando mtodos espectrofotomtricos y el nivel de expresin de
protenas mediante la tcnica de Western blot.
Cuando las clulas se tratan durante 30 min con H2O2 1 mM, se observa (Fig.40.) una
disminucin significativa en la actividad y en la expresin de protenas en comparacin con
las clulas control (actividad: 24,2 UI/mg protena versus 18,9 UI/mg protena; expresin de
protenas: 100% versus 69,4%). Los diterpenos andalusol, lagascatriol, linearol y sidol
(pretratamiento de 24 h) inducen un aumento significativo en la actividad y expresin de
protenas de la enzima CAT en clulas U373-MG, mientras que ningn efecto ha sido
observado para conchitriol y foliol.
Como se aprecia en la Fig.41., al tratar las clulas U373-MG con H2O2 (1 mM, 30 min)
se produce una disminucin significativa en la actividad y en la expresin de protenas de la
enzima SOD, de 6,2 UI/mg protena y de un 25%, respectivamente, respecto a las clulas
control. Al pretratar las clulas durante 24 h con andalusol, lagascatriol, linearol y sidol a las
concentraciones de 5 y 10 M, tanto la actividad como la expresin de protenas de la enzima
SOD aumentan respecto a las clulas tratadas slo con H 2O2. Andalusol a la concentracin de
10 M es el compuesto ms activo de los ensayados.
Los resultados de la actividad y expresin de protenas de la enzima GPx muestran
(Fig.42.) que ambos parmetros disminuyen de manera significativa en las clulas U373-MG
tratadas con H2O2 (1 mM, 30 min). La actividad de GPx-dependiente de selenio disminuye
aproximadamente un 49%, la actividad de GPx total aproximadamente un 65% y la expresin
de protenas de GPx total un 21,8% comparado con las clulas en su estado basal. Todos los
diterpenos, a excepcin de conchitriol y foliol, y a ambas concentraciones ensayadas,
aumentan de manera significativa la actividad y la expresin de la enzima GPx, tomando
siempre como referencia las clulas expuestas a H2O2.
Resultados
En relacin con el estudio de actividad de los compuestos sobre GR, cuando las
clulas U373-MG son tratadas con H2O2, se observa que la actividad y la expresin de
protenas de la enzima GR es de 2 veces y 1,6 veces menor que las determinadas en las
clulas control (Fig.43.). Un efecto protector, manifestado como aumento de la actividad y
de la expresin de protenas de la enzima GR, se observa en aquellas clulas U373-MG
pretratadas durante 24 h con los compuestos andalusol, lagascatriol, linearol y sidol (5 y 10
M).
Finalmente, en relacin con el estudio enzimtico, en la Fig.44. se muestran los
resultados de la actividad y expresin de protenas de la enzima HO-1. Como se puede ver, en
las clulas U373-MG tratadas con H2O2 se produce una disminucin significativa de la
actividad, concretamente de 1,8 veces, y de la expresin de protenas, de 1,4 veces,
comparadas ambas con las clulas sin tratamiento. Andalusol y lagascatriol son los diterpenos
ms activos ya que aumentan significativamente la actividad y la expresin de protenas de la
enzima HO-1 tras 24 h de pretratamiento con los mismos previo a la exposicin a H2O2.
Los resultados de la actividad y expresin de protenas de las enzimas antioxidantes
CAT, SOD, GR, GPx y HO-1 revelan una importante actividad de los compuestos estudiados
sobre las mismas. Estos efectos observados, los cuales son concordantes con los resultados
obtenidos en clulas PC12, fundamentan la disminucin de la produccin de ROS ocasionada
por los diterpenos que se ha demostrado en el apartado correspondientes (1.2.3.). Todos
estos aspectos sern relacionados y discutidos en profundidad en la discusin de este trabajo.
175
Resultados
176
5 M
10 M
A)
#
#
20
15
10
5
0
25
Actividad CAT
(UI / mg protena)
Actividad CAT
(UI / mg protena)
25
5 M
10 M
20
15
10
5
0
H2O2
H2O2
Andalusol
H2O2
10
Linearol
Foliol
H2O2 (1 mM)
B)
Control
Control H2O2
H2O2 (1 mM)
Conchitriol
5
10
Lagascatriol
10
(M)
Foliol
Control
H2O2
10
Sidol
Linearol
5
10
Sidol
5
10
CAT
-Actina
5 M
10 M
##
140
##
120
100
80
60
40
20
0

H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
140
##
160
#
#
120
100
80
60
40
20
0
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.40. Efecto en la actividad y expresin de la enzima CAT. Las clulas U373-MG se preincuban con los
diterpenos (5 y 10 M) durante 24 h previo a la exposicin a H2O2 (1 mM) durante 30 minutos. A) La actividad
de la enzima CAT se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos celulares totales. Los
utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de CAT (n=3).
versus control; # p < 0,05 y ## p < 0,01 versus H2O2.
(M)
Resultados
A)
30
5 M
10 M
20
15
10
# #
20
15
10
5
5
0
25
Actividad SOD
(UI / mg protena)
Actividad SOD
(UI / mg protena)
25
5 M
10 M
30
Control H2O2
Foliol
H2O2 (1 mM)
B)
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
10
Sidol
H2O2
Conchitriol
5
Linearol
H2O2 (1 mM)
10
Lagascatriol
10
Foliol
(M)
Control
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
SOD
-Actina
160
140
# #
120
100
80
60
40
20
0
5 M
10 M
160

H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
140
120
100
80
60
40
20
0 Control H O
2 2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.41. Efecto en la actividad y expresin de la enzima SOD. Las clulas U373-MG se preincuban con los
de la enzima SOD se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos celulares totales. Los
utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de SOD (n=3).
177
Resultados
178
Actividad GPx-Se
5 M
10 M
Actividad GPx-Se
A)
#
30
20
10
5 M
10 M
30
# #
#
20
10
Control H2O2

H2O2 (1 mM)
Linearol
Foliol
Sidol
H2O2 (1 mM)
5 M
10M
Actividad GPx total

Actividad GPx total

5 M
10M
#
#
80
*
60
40
20
60
40
20
0
Control H2O2
Foliol
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
10
Sidol
H2O2
Conchitriol
5
Linearol
H2O2 (1 mM)
H2O2 (1 mM)
B)
# #
# #
80
10
Lagascatriol
10
(M)
Foliol
Control
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
GPx
-Actina
5 M
10 M
#
#
120
100
80
60
40
20
0

H2O2 (1 mM)
#
140
5 M
10 M
140
# #
120
100
80
60
40
20
0
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.42. Efecto en la actividad y expresin de la enzima GPx. Las clulas U373-MG se preincuban con los
diterpenos (5 y 10 M) durante 24 h previo a la exposicin a H 2O2 (1 mM) durante 30 minutos. A) La actividad de la
enzima GPx-dependiente de selenio y GPx total se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos
celulares totales. Los resultados de la actividad enzimtica se expresan como nmol NADPH/min mg protena. B) La
expresin de protenas se determina mediante Western blot en extractos celulares totales. Los resultados de la
expresin de protenas se expresan como % de intensidad de la banda, considerndose como 100% las clulas control.
La -actina se utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de GPx
(n=3). Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar de tres experimentos independientes. * p < 0,05
Resultados
5 M
10 M
25
# #
20
15
*
10
5
0 Control H O Andalusol Conchitriol Lagascatriol
2 2
Actividad GR
Actividad GR
A)
5 M
10 M
25
# #
20
15
*
10
5
0
Control H2O2
Linearol
Foliol
H2O2 (1 mM)
Sidol
H2O2 (1 mM)
B)
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
10
H2O2
Conchitriol
5
10
Lagascatriol
10
Foliol
(M)
Control
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
GR
-Actina
5 M
10 M
120
#
100
80
60
40
20
0
140
#
140
5 M
10 M
120
# #
100
80
60
40
20
0

H2O2 (1 mM)
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.43. Efecto en la actividad y expresin de la enzima GR. Las clulas U373-MG se preincuban con los
de la enzima GR se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos celulares totales. Los resultados
de la actividad enzimtica se expresan como nmol NADPH/min mg protena. B) La expresin de protenas se
utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de GR (n=3).
179
5 M
10 M
40
30
20
10
Actividad HO-1
Actividad HO-1
Resultados
5 M
10 M
40
30
*
20
10
0
Control H2O2
Foliol
Control
H2O2
10
Sidol
H2O2
Conchitriol
5
Linearol
H2O2 (1 mM)
H2O2
Andalusol
H2O2 (1 mM)
10
Lagascatriol
10
(M)
Foliol
Control
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
HO-1
-Actina
140
5 M
10 M
##
#
120
100
80
60
40
20
0
5 M
10 M

H2O2 (1 mM)
##
160
180
140
120
100
80
60
40
20
0 Control
H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.44. Efecto en la actividad y expresin de la enzima HO-1. Las clulas U373-MG se preincuban con los
de la enzima HO-1 se cuantifica por mtodos espectrofotomtricos en extractos celulares totales. Los
resultados de la actividad enzimtica se expresan como pmoles bilirrubina/mg protena/h. B) La expresin de
protenas se determina mediante Western blot en extractos celulares totales. Los resultados de la expresin
de protenas se expresan como % de intensidad de la banda, considerndose como 100% las clulas control. La
-actina se utiliza como normalizador de carga. Se muestra una membrana representativa de la expresin de
HO-1 (n=3). Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar de tres experimentos
independientes. * p < 0,05 versus control; # p < 0,05 y ## p < 0,01 versus H2O2.
Resultados

Con el fin de comprobar si la induccin de las enzimas antioxidantes por los
diterpenos se produce a travs de la activacin de la va Nrf2 en clulas U373-MG, se ha
evaluado el efecto de los diferentes tratamientos en la expresin del factor Nrf2 a nivel
nuclear y citoplasmtico mediante Western blot.
Como se puede observar en la Fig.45., los pretratamientos (24 h) con andalusol,
lagascatriol, linearol y sidol (5 y 10 M), inducen la expresin de la protena nuclear Nrf2 de
manera significativa en clulas U373-MG, lo que indica que la actividad de estos compuestos a
nivel de las enzimas antioxidantes se debe a la activacin de la va Nrf2. Los diterpenos
conchitriol y foliol no aumentan de manera significativa la expresin de esta protena a nivel
nuclear. Por otro lado, en las clulas tratadas con H2O2 (1 mM, 30 min), los niveles de Nrf2 en
el ncleo son menores que en el citoplasma lo que muestra que, bajo las condiciones
experimentales ensayadas, el H2O2 no induce la expresin de Nrf2 nuclear en clulas U373MG. Por tanto, los resultados obtenidos confirman que en clulas U373-MG, al igual que lo
observado en clulas PC12, uno de los principales mecanismos de accin frente a situaciones
de estrs oxidativo de aquellos diterpenos aislados de Sideritis que han mostrado actividad
protectora, es a travs de la estabilizacin del factor Nrf2 en el ncleo y la consiguiente
activacin de los genes de las enzimas implicadas en la defensa antioxidante endgena.
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
H2O2
Conchitriol
10
10
Lagascatriol
10
(M)
Foliol
Control
H2O2
10
Linearol
5
10
Sidol
5
10
(M)
Nrf2
nuclear
-actina
5 M
160
# #
140
120
100
80
60
40
20
0

H2O2 (1 mM)
10 M
5 M
10 M
160
140
# #
120
100
80
60
40
20
0
Control H2O2
Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.28. Efecto en la expresin de la protena nuclear y citoplasmtica de Nrf2. Contina en la pgina

siguiente.
181
182
Resultados
H2O2
Andalusol
Control
H2O2
10
H2O2
Conchitriol
5
10
Lagascatriol
10
Foliol
Control
(M)
H2O2
Linearol
10
10
Sidol
5
10
Nrf2
citoplasmtico
5 M
10 M
120
100
80
# #
60
40
20
0

H2O2 (1 mM)
-Actina
5 M
10 M
100
80
# #
#
60
40
20
0
Control H2O2
Linearol
Foliol
Sidol
H2O2 (1 mM)
Nrf2 nuclear / Nrf2 citoplasmtico
5 M
10 M
#
2,5
#
#
#
2,0
#
#
# #
1,5
1,0
*
0,5
0,0
Control H2O2 Andalusol Conchitriol Lagascatriol Foliol
Linearol
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.45. Efecto en la expresin de la protena nuclear y citoplasmtica de Nrf2. Continuacin. Las clulas
U373-MG se preincuban con los diterpenos (5 y 10 M) durante 24 h previo a la exposicin a H 2O2 (1 mM)
durante 30 minutos. La expresin de protenas se determina mediante Western blot en extractos celulares
citoplasmticos y nucleares. Los resultados de la expresin de protenas se expresan como % de intensidad de
la banda, considerndose como 100% las clulas control. La -actina se utiliza como normalizador de carga. Se
muestra una membrana representativa de la expresin de Nrf2 nuclear y citoplasmtico (n=3). Los resultados
se expresan como media Desviacin Estndar de tres experimentos independientes. * p < 0,05 versus control;
#
p < 0,05 versus H2O2.
(M)
Resultados

A continuacin, se ha evaluado el efecto protector de los diterpenos en estudio sobre
el dao por estrs oxidativo inducido por H2O2 en mitocondrias de las clulas U373-MG. Para
ello, se han determinado los siguientes marcadores bioqumicos de la funcin mitocondrial:
potencial de membrana mitocondrial
niveles de calcio citoslico y mitocondrial
niveles de ATP
actividad caspasa-3

La mitocondria es una de las principales dianas intracelulares del H2O2. La medida de
los cambios en el potencial de membrana es uno de los parmetros bioqumicos relacionados
con el estrs oxidativo que se producen a nivel mitocondrial.
80
60
40
20
0
Control
H2O2
Andalusol
100
80
60
40
20
0
Control
H 2O2
5 M
10 M
100
80
60
40
20
0
Control
H 2O2
Foliol
H2O2 (1 mM)
Conchitriol
100
80
5 M
10 M
100
80
60
40
20
0
Control
H2O2
Linearol
H2O2 (1 mM)
60
40
20
0
Control
H2O2
H2O2 (1 mM)


H2O2 (1 mM)

5 M
10 M
Lagascatriol
H2O2 (1 mM)

100
5 M
10 M


5 M
10 M
5 M
10 M
100
#
80
60
40
20
0
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.46. Efecto sobre el potencial de membrana mitocondrial. Las clulas U373-MG se incuban con los
diterpenos (5 y 10 M; 24 h) y con H2O2 (1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. Los
cambios en el potencial de membrana mitocondrial se determinan por fluorescencia empleando el catin
lipoflico fluorescente ster metlico de tetrametilrodamina (TMRM). Los resultados del potencial de
membrana mitocondrial se expresan como % respecto al control. Los resultados se expresan como media
Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos independientes. * p < 0,05 versus control; # p < 0,05 versus
H2O2.
183
184
Resultados
Usando la sonda fluorescente TMRM, se ha determinado el potencial de membrana

mitocondrial en clulas U373-MG. Como se muestra en la Fig.46., el tratamiento de las
clulas con H2O2 (1 mM, 30 minutos) induce una despolarizacin mitocondrial que resulta en
una disminucin de la fluorescencia intracelular de un 33% comparado con las clulas control.
Al tratar las clulas durante 24 h previo a la exposicin a H 2O2, andalusol, lagascatriol,
linearol y sidol, previenen la prdida del potencial de membrana mitocondrial inducida por
H2O2 a ambas concentraciones ensayadas y de manera significativa. Andalusol y lagascatriol
son los compuestos ms activos.

La funcin e integridad de las mitocondrias puede verse afectada por el incremento
de calcio citoslico por estrs oxidativo. En el apartado 1.1.9.2.1. hemos comprobado que el
H2O2, bajo las condiciones experimentales ensayadas, produce aumento de los niveles de
calcio citoslico en las clulas PC12 en comparacin con las clulas control.
Como se observa en la Fig.47., el H2O2 (1 mM, 30 min) aumenta tambin de manera
significativa los niveles de calcio citoslico en las clulas U373-MG respecto a las clulas
control (482,7 nM versus 91,1 nM). En las clulas tratadas slo con los diterpenos no se
aprecian cambios en los niveles de calcio en comparacin con los niveles basales observados,
lo que indica que estos ltimos compuestos y en las condiciones ensayadas no alteran la
homeostasis del calcio.
El pretratamiento (24 h) de las clulas con andalusol, lagascatriol, linearol y sidol
inhibe de forma significativa el aumento en los niveles de calcio citoslico causado por H 2O2;
el mayor efecto se observa en las clulas pretratadas con andalusol y lagascatriol, que
producen una reduccin de los niveles de calcio citoslico de 2,5 y 2,2 unidades,
respectivamente, a la concentracin de 5 M, y de 2,9 y 2,3 unidades, respectivamente, a la
concentracin de 10 M. En las clulas pretratadas con conchitriol y foliol no se han
apreciado cambios significativos en los niveles de calcio citoslico en comparacin con las
clulas expuestas slo a H2O2 (Fig.47.).
Resultados
A)
Control
600
600
Andalusol (10 M)
Andalusol (5 M) + H2O2 (1 mM)
400
300
F410 nm
Conchitriol (5 M) + H2O2 (1 mM)
400
200
100
100
0
200
400
600
800
400
600
800
1000
MnCl2
MnCl2
Control
MnCl2
Foliol (5 M) + H2O2 (1 mM)
400
F410 nm
Foliol (10 M)
Ionomicina
500
Ionomicina
Linearol (5 M) + H2O2 (1 mM)
400
200
200
200
100
800
1000
500
400
600
800
1000
***
200
400
600
Tiempo (seg)
800
1000
Control
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
400
[Ca2+]citoslico (nM)
200
Tiempo (seg)
200
5 M + H2O2 (1 mM)
10 M + H2O2 (1 mM)
300
##
B)
Sidol (10 M) + H2O2 (1 mM)
100
Tiempo (seg)
Sidol (5 M) + H2O2 (1 mM)
##
600
Sidol (10 M)
400
300
400
Ionomicina
500
300
200
Control
Sidol (5 M)
600
Linearol (10 M)
500
300
100
1000
H2O2 (1 mM)
700
Linearol (5 M)
F410 nm
600
800
800
H2O2 (1 mM)
700
Foliol (5 M)
600
Control
800
700
400
Tiempo (seg)
H2O2 (1 mM)
200
Tiempo (seg)
800
F410 nm
Lagascatriol (10 M) + H2O2 (1 mM)
100
200
Tiempo (seg)
600
400
200
1000
Lagascatriol (10 M)
500
300
300
200
Lagascatriol (5 M)
Ionomicina
600
Conchitriol (10 M)
Ionomicina
500
Control
H2O2 (1 mM)
700
Conchitriol (5 M)
F410 nm
500
MnCl2
800
H2O2 (1 mM)
700
Andalusol (5 M)
Ionomicina
Control
MnCl2
800
H2O2 (1 mM)
F410 nm
MnCl2
700
100
0
l
ol
l
ol
io
l
tri
ol
ro
itr
io
us
a
l
h
c
ea Sid
ol
a
c
s
n
F
d
n
Li
ga
An
Co
La
Fig.47. Efecto sobre los niveles de calcio citoslico. Las clulas U373-MG se incuban con los diterpenos (5 y
10 M; 24 h) y con H2O2 (1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. Los cambios en los
niveles de calcio citoslico se determinan por fluorescencia empleando el catin lipoflico fluorescente Indo1/AM. A) Grficas representativas de las medidas de fluorescencia correspondientes al calcio citoslico para
los tiempos indicados. El calcio citoslico se mide antes y despus de la adicin de ionomicina (fluorescencia
mxima) y de MnCl2 (fluorescencia mnima) (indicado con flechas en las grficas) para determinar la
concentracin de calcio citoslico. B) Niveles de calcio citoslico. Los resultados de los niveles de calcio
citoslico se expresan como concentracin (nM). Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar
(n=9) de tres experimentos independientes. *** p < 0,001 versus control; # p < 0,05 y ## p < 0,01 versus H2O2.
185
186
Resultados

La homeostasis del calcio mitocondrial tambin puede verse alterada por estrs
oxidativo.
A continuacin, con el fin de comprobar si el H2O2 como inductor de estrs altera la
homeostasis del calcio mitocondrial, bajo las condiciones experimentales ensayadas, y si el
pretratamiento con los diterpenos previene de estas alteraciones, se ha procedido a
determinar los niveles de calcio en las clulas U373-MG por tcnicas de fluorescencia
utilizando la sonda especfica Rhod-2. Como se observa en la Fig.48., ninguno de los
diterpenos produce cambios en dichos niveles en comparacin con las clulas control. El
tratamiento con H2O2 (1 mM, 30 min) aumenta de manera significativa los niveles de calcio
mitocondrial en estas clulas. Este aumento ha sido reducido significativamente con el
pretratamiento de las clulas, previo a la exposicin a H 2O2, con andalusol, lagascatriol y
linearol (5 y 10 M) y sidol (5 M).
Resultados
A)
140
140
140
Control
120
Control
120
Andalusol (10 M)
80
Conchitriol (5 M)
Conchitriol (10 M)
80
400
600
800
1000
200
400
600
800
1000
F581 nm
Foliol (10 M)
80
100
Linearol (10 M)
80
Sidol (5 M)
Sidol (10 M)
80
Sidol (5M) + H2O2 (1 mM)
40
0
1000
Sidol (10M) + H2O2 (1 mM)
60
60
200
400
600
800
1000
200
400
600
800
1000
Tiempo (seg)
Tiempo (seg)
Control
H2O2 (1 mM)
1,8
5 M
10 M
5 M + H2O2 (1 mM)
1,6
10 M + H2O2 (1 mM)
**
1,2
1,4
Nivel Ca2+mitocondrial
(relativo al control)
A23187
100
Tiempo (seg)
B)
Control
H2O2 (1 mM)
Linearol (5 M)
40
40
800
1000
120
A23187
600
800
H2O2 (1 mM)
Foliol (5 M)
60
600
140
Control
120
H2O2 (1 mM)
A23187
100
400
Tiempo (seg)
140
Control
120
400
200
Tiempo (seg)
140
200
40
0
Tiempo (seg)
Lagascatriol (10 M)
60
40
200
Lagascatriol (5 M)
80
Conchitriol (10M) + H2O2 (1 mM)
60
40
0
100
60
F581 nm
Andalusol (5 M)
H2O2 (1 mM)
A23187
F581 nm
F581 nm
F581 nm
A23187
100
100
Andalusol (5M) + H2O2 (1 mM)
F581 nm
Control
120
H2O2 (1 mM)
A23187
H2O2 (1 mM)
1,0
l
so
alu
d
An
l
rio
hit
nc
Co
ol
sc
ga
La
ri
at
l
lio
Fo
l
ro
ea
n
i
L
l
do
Si
Fig.48. Efecto sobre los niveles de calcio mitocondrial. Las clulas U373-MG se incuban con los diterpenos (5
y 10 M; 24 h) y con H2O2 (1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. Los cambios en los
niveles de calcio mitocondrial se determinan por fluorescencia empleando el catin lipoflico fluorescente
Rhod-2. A) Grficas representativas de las medidas de fluorescencia correspondientes al calcio mitocondrial
para los tiempos indicados. El calcio mitocondrial se mide antes y despus de la adicin del ionforo A23187
(indicado con flechas en las grficas) para determinar la concentracin de calcio mitocondrial. B) Niveles de
calcio mitocondrial. Los resultados de los niveles de calcio mitocondrial se expresan como nivel de calcio
mitocondrial relativo al control. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres
187
188
Resultados
La mitocondria genera la mayor parte de ATP del organismo por la va de la

fosforilacin oxidativa. El deterioro de la funcin mitocondrial, lleva implcito la disminucin
de la fosforilacin oxidativa y por tanto la reduccin de la formacin de ATP.
A continuacin, se ha estudiado el efecto de los diferentes tratamientos en el
contenido de ATP celular mediante HPLC segn las condiciones descritas en el material y
mtodos (apartado 2.2.13.). En este apartado tambin se incluye la recta de calibrado
obtenida para la cuantificacin de la concentracin de ATP en las muestras celulares de U373MG.
En la Fig.49. observamos que al tratar las clulas con H2O2 (1 mM, 30 min) se produce
una disminucin significativa en el contenido de ATP celular de un 31% en comparacin con
los niveles observados en las clulas control. Ninguno de los diterpenos ensayados muestra
efecto en los niveles de ATP celular. Sin embargo, como se observa en la mencionada figura
el pretratamiento de las clulas U373-MG (24 h) con andalusol, lagascatriol, linearol (5 y 10
M) y sidol (10 M) ha mostrado un efecto protector significativo frente a la exposicin a H2O2
(1 mM, 30 min). Se observa el mximo efecto con andalusol 10 M. Los diterpenos conchitriol
y foliol, a ninguna de las dos concentraciones ensayadas, han mostrado efecto protector sobre
las concentraciones de ATP intracelulares.
Resultados
5 M
10 M
5 M
10 M
60
40
20
0
Control
H2O2
80
60
40
20
0
Andalusol
100
Niveles de ATP (%)
80
100
H2O2
H2O2 (1 mM)
Niveles de ATP (%)
Niveles de ATP (%)
60
40
20
0
Control
H2O2
80
60
40
20
0
Foliol
40
20
Control
H2O2
Lagascatriol
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
5 M
10 M
100
H2O2 (1 mM)
100
100
H2O2 (1 mM)
Linearol
80
60
40
20
0
Control H2O2
60
Conchitriol
5 M
10 M
80
80
0
Control
Niveles de ATP (%)
Niveles de ATP (%)
Niveles de ATP (%)
100
5 M
10 M
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (1 mM)
H2O2 (1 mM)
Fig.49. Efecto sobre los niveles de ATP. Las clulas U373-MG se incuban con los diterpenos (5 y 10 M; 24 h)
y con H2O2 (1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. Los niveles de ATP se miden por
HPLC. Los resultados de los niveles de ATP se expresan como %, considerndose como 100% los niveles de ATP
en las clulas control. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres
experimentos independientes. * p < 0,05 versus control; # p < 0,05 versus H2O2.

La caspasa-3, enzima efectora esencial de los procesos de apoptosis, puede ser
activada por mecanismos de estrs oxidativo, tal y como hemos demostrado en el apartado
1.1.9.4. en clulas PC12. Bajo las condiciones experimentales establecidas, se ha estudiado a
continuacin el efecto de los diferentes tratamientos sobre la actividad de la enzima caspasa3 en clulas U373-MG.
Como se muestra en la Fig.50., la exposicin de las clulas U373-MG a H2O2 (1 mM)
durante 30 minutos ocasiona a una elevacin significativa de la actividad de caspasa-3,
concretamente de 2,6 veces respecto a las clulas control. Por otro lado, el tratamiento de
las clulas con los diterpenos no activa la caspasa-3, lo que indica que estos compuestos, bajo
las condiciones experimentales establecidas, no inducen la actividad de esta enzima
activadora del proceso de la apoptosis. Cuando las clulas son pretratadas con los diferentes
diterpenos objeto de estudio (5 y 10 M) durante 24 h, previo a H2O2, se produce una
189
Resultados
inhibicin en la elevacin de la actividad de la caspasa-3 inducida por H2O2. Esta actividad

protectora ha sido significativa y de manera concentracin-dependiente para los compuestos
andalusol, lagascatriol, linearol y sidol.
5 M
10 M
#
#
150
100
50
0
Control H2O2
*
200
150
100
50
Control
H2O2
200
150
100
50
5 M
10 M
250
250
Andalusol
H2O2 (1 mM)
Foliol
H2O2 (1 mM)
Actividad caspasa-3
200
Control
H2O2
5 M
10 M
200
#
#
150
100
50
250
Linearol
H2O2 (1 mM)
150
100
50
Control
H2O2
Lagascatriol
H2O2 (1 mM)
5 M
10 M
250
200
150
100
50
0
Control H2O2
200
Conchitriol
H2O2 (1 mM)
250
5 M
10 M
Actividad caspasa-3
250
Actividad caspasa-3
5 M
10 M
Actividad caspasa-3
Actividad caspasa-3
Actividad caspasa-3
190
Control
H2O2
Sidol
H2O2 (1 mM)
Fig.50. Efecto sobre la actividad caspasa-3. Las clulas U373-MG se incuban con los diterpenos (5 y 10 M; 24
h) y con H2O2 (1 mM; 30 minutos) como nico tratamiento o bien con ambos. La actividad caspasa-3 se
determina en extractos celulares totales por fluorimetra y utilizando el sustrato especfico Ac-DEVD-AMC. Los
resultados se expresan como % respecto al control, correspondiendo el 100% a las clulas sin tratar. Los
resultados se expresan como media Desviacin Estndar (n=9) de tres experimentos independientes. * p <
0,05 versus control; # p < 0,05 versus H2O2.
2. BARRERA HEMATOENCEFLICA
Los estudios para evaluar la capacidad de paso de los diterpenos objeto de estudio a
travs de la BHE, realizados en este trabajo, incluyen mtodos tanto in silico como in vitro.
2.1. Estudios in silico

Los estudios in silico tienen como objetivo predecir el perfil farmacocintico in vivo
de las molculas. El primer paso para la realizacin de estos estudios es determinar las
propiedades fsico-qumicas y descriptores moleculares de las molculas que se relacionan
Resultados
ms directamente con el paso de molculas a travs de la BHE. Para ello, se han utilizado
diferentes recursos computacionales: ALOGPS 2.1., Molinspiration, Daylight Chemical y pCELX.
Estructuralmente los compuestos objeto de estudio en esta Tesis Doctoral, de
naturaleza terpnica todos ellos, se diferencian en el nmero y posicin de los dobles
enlaces, en el nmero de ciclos que los componen, en el nmero y posicin de grupos
hidroxilos y en la presencia de otros grupos funcionales como son los acilos en el caso de los
diterpenos linearol y sidol. Estas diferencias van a determinar las propiedades fsico-qumicas
ms importantes de los mismos, entre ellas la lipofilia.
En la Tabla 2 se muestran los valores log P, log D, rea topolgica de la superficie
polar de una molcula (TPSA), peso molecular, volumen, nmero de enlaces rotables y
nmero de grupos donantes y de grupos aceptores de enlace de hidrgeno de cada uno de los
diterpenos del trabajo. Estos diferentes parmetros han sido estimados utilizando los recursos
computacionales ALOGPS 2.1., Molinspiration y Daylight Chemical tal y como se detalla en el
material y mtodos en el apartado 2.3.1.
Todos los diterpenos estudiados tienen peso molecular bajo (menor de 365 Da), siendo
conchitriol y foliol los de menor tamao (320,5 Da) y linearol y sidol los de mayor (362,5 Da),
lo que, a priori, les confiere capacidad de paso.
Los valores del log P, comn descriptor cuantitativo de lipofilia, varan en los
diferentes compuestos evaluados entre 2,88 y 3,59, correspondiendo estos lmites a los
diterpenos foliol y andalusol, respectivamente. Otro descriptor de lipofilia muy utilizado es el
coeficiente de distribucin (log D), que a diferencia del log P que slo considera las formas
neutras, este coeficiente tiene en cuenta todas las formas inicas de las especies. Los valores
estimados del log D a pH 7,4 (pH fisiolgico) han sido iguales a los del log P, lo que indica que
ninguno de los diterpenos presenta grupos ionizables; al ser compuestos neutros, su paso a
travs de la BHE no va a ser, por tanto, dependiente del pH.
En cuanto a los valores del rea topolgica de la superficie polar (TPSA), stos son de
60,60 para andalusol, conchitriol, foliol y lagascatriol, y de 66,76 para linearol y sidol.
El nmero de grupos donantes y de grupos aceptores de enlaces de hidrgeno para
andalusol, conchitriol, foliol y lagascatriol ha sido de 3 y 3, respectivamente, y para linearol y
191
192
Resultados
sidol de 4 y 2. Respecto al nmero de enlaces rotables, andalusol presenta 5, linearol y sidol

3, lagascatriol 2 y conchitriol y foliol slo 1.
As pues teniendo en cuenta los valores obtenidos para estos parmetros y en base a
estudios previos experimentales en los que se relaciona los valores establecidos con su
capacidad de atravesar la BHE, los resultados del estudio in silico sugieren que los diterpenos
estudiados podran presentar un perfil farmacocintico ptimo para atravesar la BHE por
mecanismos de difusin pasiva.
Andalusol
Conchitriol
Foliol
Lagascatriol
Linearol
Sidol
C20H34O3
C20H32O3
C20H32O3
C20H34O3
C22H34O4
C22H34O4
Peso molecular
(Da)
322,54
320,52
320,52
322,54
362,56
362,56
Volumen
molecular
(m3 mol-1)
337,76
321,36
322,24
332,26
357,01
357,01
log Poct
3,59
3,06
2,88
3,31
3,36
3,36
log Doct
3,59
3,06
2,88
3,31
3,36
3,36
log Poct / Peso

molecular
0,011
0,009
0,009
0,010
0,009
0,009
TPSA ()
60,69
60,69
60,69
60,69
66,76
66,76
HA (O + N)
HD (OH + NH)
Enlaces
rotables
COMPUESTOS
Estructura
Frmula
molecular
Tabla 2. Propiedades fsico-qumicas y descriptores moleculares de los diterpenos. El peso molecular, el

log P y el log D se han determinado mediante ALGOPS 2.1. (http://www.vcclab.org); el rea topolgica de la
superficie polar (TPSA) (http://www.daylight.com) se ha estimado utilizando Daylight Chemical y el volumen
molecular y el nmero de grupos donantes (HD) y de grupos aceptores de enlace de hidrgeno (HA) as como
el nmero de enlaces rotables se han calculado mediante el software Molinspiration
(http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties).
Para completar este estudio in silico, procedimos a estimar los posibles mecanismos
de transporte de los diterpenos a travs de la BHE, en base a datos estructurales 2D y a varios
descriptores de Abraham y utilizando el programa pCEL-X, tal como ha sido detallado en el
material y mtodos.
Resultados
Para ello se ha representado grficamente el perfil de permeabilidad versus pH

(Fig.51.). Como se muestra en la citada figura este perfil es el mismo para ambas direcciones
[apical (A)-basal (B) y basal (B)-apical (A)]. Como se puede observar, el paso de los diterpenos
a travs de la BHE no es dependiente del pH, ya los valores de la permeabilidad son
constantes en todo el rango de pH estudiado (linealidad), confirmndose de nuevo la
naturaleza no inica de estos compuestos (lnea slida P o de la figura). En cuanto al alto valor
terico del log Po de la permeabilidad aparente obtenido para cada diterpeno, del orden de
-4, sugiere que estos compuestos podran atravesar la BHE mediante mecanismos de difusin
pasiva transcelular.
El transporte paracelular es prcticamente insignificante para estos compuestos como
se muestra en los valores tericos obtenidos de log Ppara (del orden de -6,5) (lnea punteada
Ppara), lo que se puede atribuir a su naturaleza lipoflica. Se sabe que el transporte
paracelular es utilizado por compuestos de pequeo tamao de naturaleza hidrosoluble como
sacarosa. Adems, en este caso, tanto la llamada resistencia ejercida por el agua (ABL) (capa
de agua estancada adyacente a la superficie de la membrana) como la resistencia ejercida
por el filtro no parecen comprometer la permeabilidad de los diterpenos a travs de la BHE
(lnea de rayas PABL y lnea de puntos Pfiltro de la figura), al no encontrarse prximas a Po.
As pues, el mecanismo de transporte pasivo, tericamente dominante en cada uno de
los diterpenos del estudio, expresado en porcentajes, representara respecto al transporte
total, un 73% para el linearol y el sidol, un 76% para andalusol y lagascatriol, un 79% para
conchitriol y un 80% para foliol. No existira transporte paracelular para los compuestos
linearol y sidol, y para el resto, este tipo de transporte sera insignificante (1%).
En cuanto a la resistencia ejercida por el agua (ABL) y a la resistencia ejercida por el
filtro, ambos factores que pueden influir en el transporte de compuestos por ofrecer una
resistencia mecnica, representan un 20-22% y un 3-4% respectivamente del transporte total,
pudiendo concluir por tanto que su contribucin es pequea.
Diversos estudios han demostrado que el transporte a travs de la BHE limitado por
ABL depende de las condiciones de pH para las molculas ionizables. De modo, que para cada
molcula ionizable existe un valor de pH ptimo en el que el factor ABL carece prcticamente
de influencia. Los diterpenos del presente estudio son compuestos no ionizables, por tanto,
no hay un valor de pH para el cul las condiciones de transporte se vean favorecidas. Por ello
y entre otras razones, nuestros estudios in vitro se llevarn a cabo a pH fisiolgico de 7,4.
193
Resultados
log Permeabilidad (cm/s)
ANDALUSOL
-3
Pfiltro
-4
PABL
Po
-5
OH
-6
-7
HOH2C
OH
-2
-2
Ppara
-3
Pfiltro
-4
PABL
OH
-5
Po
CH2OH
-6
-7
10 11 12
CONCHITRIOL
OH
Ppara
pH
Pfiltro
-4
PABL
Po
-5
OH
-3
HO
10 11 12
LAGASCATRIOL
FOLIOL
-6
7
pH
-2
-2
-3
Pfiltro
-4
PABL
Po
OH
H
-5
CH2OH
HO
-6
OH
-7
Ppara
-7
10 11 12
Ppara
-2
-2
-3
Pfiltro
-4
PABL
Po
-5
HO
OH
OAc
-7
LINEAROL
-6
7
pH
10 11 12
SIDOL
-3
Pfiltro
PABL
-4
Po
-5
AcO
OH
-6
OH
Ppara
6
pH
pH
194
10 11 12
-7
Ppara
10 11 12
pH
Resistencia ejercida por el filtro

Transporte paracelular
Resistencia ejecida por el agua (ABL)
Transporte por difusin pasiva transcelular
Fig.51. Representacin del log permeabilidad versus pH. Prediccin de los posibles mecanismos de
transporte de los diterpenos a travs de la BHE utilizando el programa pCEL-X. ( ) Permeabilidad aparente
(Po); (---) permeabilidad paracelular (Ppara); (-----) resistencia ejercida por el agua (P ABL); ()
permeabilidad del filtro de policarbonato. En los grficos circulares se muestran los porcentajes que
representan la resistencia que ejercera el filtro, el transporte paracelular, la resistencia ejercida por el agua
y el transporte por difusin pasiva transcelular, respecto al transporte total.
Resultados
2.2. Estudios in vitro

Los estudios in silico son de gran utilidad para predecir y caracterizar el
comportamiento farmacocintico de las molculas. Sin embargo, estos estudios no
reemplazan a los estudios experimentales, requirindose por tanto la realizacin de ensayos
in vitro e in vivo.
As pues, la segunda etapa de los estudios de BHE con los compuestos investigados, ha
consistido en la realizacin de una serie de estudios in vitro para evaluar si los diterpenos son
capaces de atravesar la BHE y por tanto alcanzar el SNC. Se han llevado a cabo estudios de
captacin de los diterpenos por clulas endoteliales de cerebro RBE4, as como estudios de
permeabilidad utilizando un modelo de cocultivo celular constituido por clulas endoteliales
ECV304 y clulas gliales C6.
2.2.1. Estudios de viabilidad

Como paso previo a los estudios in vitro, se ha evaluado si los compuestos pueden
tener algn efecto citotxico en las clulas endoteliales RBE4 y ECV304 utilizadas en estos
experimentos. Para ello, ambos tipos celulares se incuban con los diterpenos a la
concentracin de 25 M durante 24 h (concentracin y tiempo de tratamiento que se
corresponden a los mximos ensayados).
Los resultados han mostrado que ninguno de los compuestos en estudio, en
comparacin con las clulas control y bajo las condiciones experimentales utilizadas,
producen cambios significativos en el metabolismo celular, y por tanto en la viabilidad de las
clulas (Fig.52.).
195
Resultados
RBE4
ECV304
120
100
Viabilidad celular (%)
196
80
60
40
20
0
Control Andalusol Conchitriol Foliol
Lagascatriol Linearol
Sidol
Fig.52. Efecto de los diterpenos sobre la viabilidad de las clulas RBE4 y ECV304. Las clulas RBE4 y
ECV304 se tratan con andalusol, conchitriol, foliol, lagascatriol, linearol y sidol a la concentracin final de 25
M durante 24 h. La viabilidad celular se ha determinado mediante el ensayo de MTT. Los resultados se
expresan como media desviacin estndar correspondiente a tres experimentos independientes.
2.2.2. Estudios de captacin

La captacin por las clulas endoteliales RBE4 se ha analizado midiendo la
concentracin intracelular de los diterpenos por cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC)
en las condiciones analticas establecidas en trabajos previos por el grupo de investigacin
(Gmez-Serranillos et al. 2004) detallados en el apartado del material y mtodos 2.3.2.5. Las
clulas se incuban con los diterpenos durante 0,5; 6, 18 y 24 horas, a las concentraciones
finales de 5, 10 y 25 M.
Segn los resultados representados en la Fig.53. (grfico de lneas), la captacin de
los diterpenos es dependiente del tiempo y de la concentracin. Cuando las clulas se tratan
con los diterpenos a la concentracin de 5 M no se detectan niveles de ninguno de ellos
despus de 30 minutos de tratamiento. La presencia intracelular de andalusol, lagascatriol,
linearol y sidol (5 M) comienza a detectarse a partir de las 6 h de tratamiento, mientras que
para la deteccin de conchitriol y foliol se requieren tiempos de incubacin mayores (18 h).
Para la concentracin de 10 M, se detectan niveles de todos los compuestos desde los 30
minutos de incubacin, excepto en el caso de conchitriol y foliol que se detectan en las
Resultados
clulas despus de 6 h de incubacin. Para la concentracin de 25 M, se cuantifican niveles

intracelulares de todos los compuestos desde la media hora de incubacin. Andalusol y
lagascatriol muestran los mayores niveles de captacin por RBE4, mientras que conchitriol y
foliol se acumulan en menor cantidad.
Se observa, adems, que la captacin a las concentraciones de 5 y 10 M es en lneas
generales prcticamente lineal. La concentracin de 25 M, presenta una captacin que sigue
un modelo lineal y de meseta. Para todos los diterpenos, esta captacin es lineal al menos
hasta las 6 horas de incubacin, presentando una meseta a partir de este tiempo.
Al evaluarse la eficiencia de captacin de cada diterpeno en funcin de cada intervalo
de tiempo (Fig.53. -grfico de barras-), se observa que para las concentraciones de 5 y 10 M
la captacin se produce de una manera prcticamente constante a lo largo del tiempo, lo que
explica la linealidad en la respuesta de captacin observada. Sin embargo, para la
concentracin de 25 M se observa que se alcanza un mximo valor de captacin a las 6 h de
incubacin, de manera que a partir de este momento prcticamente no se produce captacin
de los diferentes diterpenos, lo que se refleja en una disminucin de la eficiencia de
captacin. Esto sugiere que, a altas concentraciones, las clulas RBE4 estn prximas a
alcanzar su capacidad de saturacin y por tanto son incapaces de captar mayores cantidades
de estas molculas.
197
Resultados
198
200
**ANDALUSOL
Eficiencia de captacin ( % )
250
80
CONCHITRIOL
60
40
55M
M
10
10M
M
25
25M
M
20
0
0.5
18
24
Tiempo (h)
150
100
50
0
0
10
15
20
Concentracin ( ng / mg de protena )
ANDALUSOL
250
200
80
CONCHITRIOL
**
60
40
0
0.5
50
0
0
FOLIOL
**
5
m
M
5 M
1
0
m
M
10 M
2
5
m
M
25 M
40
20
0
0.5
18
24
Tiempo (h)
150
100
50
0
0
10
15
20
250
200
LAGASCATRIOL
20
0
18
24
Tiempo (h)
100
50
0
0
10
15
20
Tiempo de incubacin ( horas )
18
24
100
50
0
0
20
10
15
20
25
55 mM
M
10
10mM
M
25
25mM
M
40
55mM
M
10
10mM
M
25
25mM
M
40
Tiempo (h)
25
25
**
0.5
150
25
60
0.5
LINEAROL
LINEAROL
200
20
150
80
60
15
LAGASCATRIOL
**
80
250
10
200
24
100
25
250
18
150
FOLIOL
60
Tiempo (h)
80
55mM
M
10
10mM
M
25
25mM
M
20
250
200
SIDOL
SIDOL
80
**
60
5 mM
M
10 mM
10
M
25 mM
25
M
40
20
0
0.5
150
18
24
Tiempo (h)
100
50
0
0
10
15
20
25
Fig.53. Captacin en modelo celular RBE4. El grfico de lneas muestra la captacin de los diterpenos
(concentraciones 5, 10 y 25 M) a lo largo del tiempo (0,5; 6; 18 y 24 h). El grfico de barras muestra la
eficiencia de captacin, calculndose dicha eficiencia en base a (cantidad de diterpeno captado a un tiempo
determinado/cantidad de diterpeno a tiempo cero) x 100. Los niveles intracelulares de los diterpenos se
analizan por HPLC. Los resultados se expresan como media Desviacin Estndar correspondiente a tres
experimentos independientes. ** Representa aumentos significantes en la captacin versus tiempo de
incubacin a p < 0,01.
Resultados
2.2.3. Efecto del transportador de eflujo, gp-P, sobre la captacin

La glicoprotena-P (gp-P), protena transportadora presente en la BHE, acta
bombeando fuera de las clulas xenobiticos y otras sustancias antes de que puedan ejercer
su accin, siendo por tanto este transportador responsable de la prdida de efectividad de
algunos compuestos a nivel del SNC.
La influencia del transportador de eflujo, gp-P, en la captacin por clulas RBE4 se ha
evaluado utilizando tariquidar (inhibidor no competitivo de la gp-P que se une en la regin del
adenosn trifosfato (ATP), inhibiendo la actividad ATPasa de sta). Al comparar los resultados
de captacin, en presencia y ausencia de dicho inhibidor, no se observan diferencias
significativas para ninguno de los diterpenos. Esto sugiere que la gp-P no juega un papel
importante en la mediacin del transporte de estos compuestos por clulas endoteliales RBE4,
ya que, como queda demostrado en este estudio los diterpenos no seran sustrato de la
mencionada gp-P (Fig.54.).
Sin inhibidor
Con inhibidor (Tariquidar)
Concentracin (ng / mg de protena)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Andalusol Conchitriol Foliol
Lagascatriol Linearol
Sidol
Fig.54. Efecto del transportador de eflujo P-gp sobre la captacin por clulas RBE4. Las clulas se tratan
con los diterpenos durante 6 h, en ausencia y en presencia del inhibidor de la gp-P, tariquidar (1,7 M).
199
200
Resultados
2.2.4. Estudios de permeabilidad

La BHE posee una permeabilidad selectiva. Los estudios de permeabilidad de BHE
tienen como finalidad evaluar si la BHE puede restringir o no el paso de molculas al tejido
nervioso as como estudiar los mecanismos de transporte presentes en la barrera e implicados
en el transporte de las molculas en estudio.
La permeabilidad aparente (Papp) de los diterpenos se ha determinado en direccin
apical a basal (A-B) y en direccin basal a apical (B-A) utilizando el modelo celular de cocultivo formado por clulas endoteliales ECV304 y clulas gliales C6. El tiempo de ensayo ha
sido de 6 horas y la concentracin de los diterpenos evaluada de 25 M, tiempo y
concentracin a las que se observaron la mxima captacin de los mismos.
La integridad de las uniones estrechas entre las clulas endoteliales se ha
comprobado midiendo la resistencia elctrica transendotelial (TEER), la cul es inversamente
proporcional a la permeabilidad. Slo aquellas monocapas celulares cuyos valores de TEER
alcanzan 100 x cm2 son utilizadas para los estudios de paso a travs de BHE. La media de los
valores de TEER registrados a lo largo de los experimentos ha sido de 127,3 9,7 x 10-6 x
cm2.
Adems, la integridad fsica del modelo celular tambin se ha evidenciado
determinando el valor de la permeabilidad aparente del marcador fluorescente paracelular,
fluorescena de sodio. El valor de Papp para la fluorescena de sodio ha sido de 2,04 1,3 x 10-6
cm/s.
Los valores de permeabilidad aparente de los diterpenos y de los compuestos de
referencia atenolol (compuesto de clase III - alta solubilidad y baja permeabilidad) y
propranolol (compuesto de clase I - alta solubilidad y alta permeabilidad) se muestran en la
Tabla 3. Los valores de permeabilidad del control positivo propanolol han sido de 14,3 1,1 x
10-6 cm/s (direccin A-B) y de 14,8 0,7 x 10-6 cm/s (direccin B-A), mientras que los valores
de permeabilidad del control negativo atenolol han sido de 0,7 0,4 x 10-6 cm/s (direccin AB) y de 0,8 0,3 x 10-6 cm/s (direccin B-A).
En cuanto a los diterpenos, se ha observado un transporte bidireccional de todos ellos
a travs del modelo celular ECV304/C6. Los valores de P app de todos los compuestos son
similares tanto en la direccin absortiva como secretora. Andalusol y lagascatriol presentan
Resultados
los mayores valores de Papp, mientras que conchitriol y foliol, los ms pequeos. El valor de la
permeabilidad aparente de todos los compuestos es menor que el del control positivo
propranolol, pero mayor que el del control negativo atenolol.
Para determinar los mecanismos de transporte implicados en el paso de los
compuestos objeto de estudio a travs de la BHE, se ha determinado el ratio de
permeabilidad aparente entre ambas direcciones. El ratio obtenido ha sido en todos los casos
prximo a la unidad, lo que sugiere que los diterpenos no son sustrato de transportadores
eflujo como gp-P, confirmndose los resultados obtenidos de captacin en las clulas RBE4.
Teniendo en cuenta la destacable naturaleza lipoflica de estos diterpenos, se ha
determinado tambin el porcentaje de recuperacin de los mismos. Este porcentaje no ha
sido inferior al 79% para ninguno de ellos.
El conjunto de los resultados obtenidos del estudio de permeabilidad indica que los
diterpenos objeto de estudio atravesaran la BHE por mecanismos de difusin pasiva va
transcelular.
Compuesto
Papp (x 10-6 cm/s)
Pappcorregido(x 10-6 cm/s)
Ratio
Ratiocorregido
% Recuperacin
A-B
B-A
A-B
B-A
Andalusol
9,1 1,1
9,5 2,8
11,4 2,1
11,6 2,6
0,9
1,0
78,8 3,1
Conchitriol
4,6 0,9
4,8 1,4
4,8 1,1
4,9 1,6
0,9
1,0
88,1 2,2
Foliol
3,8 1,3
3,7 1,9
4,0 1,2
4,2 1,5
0,9
0,9
90,5 2,3
Lagascatriol
8,8 0,3
8,9 0,5
10,7 1,8
10,8 1,5
1,0
1,0
81,5 2,9
Linearol
6,3 0,5
6,6 1,1
8,2 1,1
8,3 0,9
0,9
1,0
83,6 3,3
Sidol
6,9 1,4
7, 2 0,5
8,5 1,7
8,6 0,9
0,9
1,0
84,5 2,8
Propranolol
14,3 1,1
14,8 0,7
15,1 1,3
15,6 1,5
0,9
1,0
95,6 1,9
Atenolol
0,7 0,4
0,8 0,3
0,7 0,6
0,8 0,5
0,9
0,9
98,4 2,1
Tabla 3. Transporte a travs del modelo de co-cultivo celular ECV304/C6. El transporte de los diferentes
diterpenos se ha evaluado durante 6 horas en las direcciones absortiva (A-B) y secretora (B-A). Los compuestos
de referencia propranolol y atenolol se utilizan como control positivo y negativo, respectivamente. El ratio se
determina como Papp (B-A)/Papp (A-B). El porcentaje de recuperacin se calcula como 100 Mclulas, siendo
Mclulas la cantidad de compuesto retenido en las membranas. ) [Mclulas = MD0 (MDt + MR)] (ver material y
mtodos 2.3.2.4.). Los datos se expresan como media Desviacin Estndar.
201
Resultados
202
Por ltimo, como se muestra en la Fig.55. se han establecido correlaciones entre el

valor de Papp y los diferentes parmetros fsico-qumicos (ver resultados 2.1.) determinantes
del paso de compuestos por mecanismos de difusin pasiva va transcelular. La mayor
correlacin se establece con la lipofilia, lo que sugiere que este parmetro es determinante
en la capacidad de estos compuestos para atravesar la BHE.
1234-
andalusol
conchitriol
foliol
lagascatriol
5- linearol
6- sidol
7- propanolol
8- atenolol
18
18
A-B
B-A
16
10
Papp
5
6
1
4
12
corregido
12
corregido
A-B
B-A
14
14
Papp
16
10
2
3
2
0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
240
4,0
260
280
18
16
380
A-B
B-A
12
10
corregido
1
4
5
6
8
6
Papp
corregido
360
14
12
Papp
340
A-B
B-A
14
2
3
5
6
8
6
2
3
30
40
50
60
70
80
10
90
240
260
280
TPSA
300
320
340
360
380
Volumen molecular
18
18
16
A-B
B-A
16
14
A-B
B-A
14
1
4
10
12
corregido
12
5
6
8
6
Papp
corregido
320
18
7
16
Papp
300
Peso molecular
Log P
2
3
1
4
10
5
6
8
6
2
3
2,8
3,0
3,2
3,4
3,6
3,8
N grupos aceptores de hidrgeno
4,0
4,2
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
N grupos donadores de hidrgeno
Fig.55. Correlacin entre la permeabilidad aparente y diferentes parmetros fsico-qumicos.
5,0
5,5
DISCUSIN
Discusin
Las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la

enfermedad de Parkinson, la Esclerosis Lateral Amiotrfica y la enfermedad de Huntington
son procesos crnicos caracterizados por la prdida progresiva de las neuronas y la
consiguiente alteracin de las funciones motora, sensorial y cognitiva. Estas enfermedades
constituyen un problema de salud pblica a nivel mundial, que crece da a da debido al
vertiginoso envejecimiento de la poblacin. La investigacin bsica y clnica ana esfuerzos
para conocer mejor la fisiopatologa de estas enfermedades as como para desarrollar nuevas
estrategias teraputicas tanto para paliar como para frenar la progresin de las mismas
(Ehrnhoefer et al., 2011; Katsuno et al., 2012).
Durante las ltimas dcadas, numerosos estudios experimentales in vitro e in vivo as
como estudios post mortem en tejidos cerebrales humanos, apoyan la implicacin del estrs
oxidativo en la patogenia de diversas enfermedades neurodegenerativas, incluidas las
anteriormente mencionadas (Barnham et al., 2004; Hayashi et al., 2012). El estrs oxidativo,
definido como una alteracin de la homeostasis xido-reduccin intracelular consecuencia de
una excesiva produccin de ROS y/o de una deficiencia en los mecanismos antioxidantes
endgenos de tipo enzimtico y/o no enzimtico, puede conllevar un dao celular irreversible
e irreparable por mecanismos como son la peroxidacin lipdica en las membranas celulares,
la modificacin de las bases de los cidos nucleicos, la inactivacin de las enzimas y la
oxidacin de las protenas; incluso conducir a la muerte celular, principalmente por apoptosis
(Valko et al., 2005; Avery, 2011). Las estrategias farmacolgicas de eleccin para prevenir
y/o disminuir el dao oxidativo ocasionado por un exceso de ROS consisten en reducir el nivel
de estas especies reactivas y en reforzar el sistema antioxidante endgeno mediante el uso de
compuestos con propiedades antioxidantes a nivel celular (Firuzi et al., 2011; Speciale et al.,
2011).
Los productos naturales constituyen una importante y virtualmente ilimitada fuente
de nuevos compuestos con un amplio rango de actividades biolgicas, entre las que se incluye
la actividad antioxidante. Estos compuestos de origen natural siguen constituyendo hoy en da
la principal fuente de innovadores agentes teraputicos, adems de servir de base para el
desarrollo de nuevos y eficaces derivados tanto hemi-sintticos como sintticos (Newman and
Cragg, 2007).
El grupo de los compuestos diterpnicos ha sido objeto de creciente inters en los
ltimos 15 aos por su posible papel como potenciales antioxidantes en modelos de estrs
oxidativo. Mediante estudios qumicos, principalmente por el mtodo DPPH, se han
205
206
Discusin
identificado toda una serie de diterpenos con capacidad captadora de radicales libres, en su
mayora diterpenos tipo abietano fenlicos como cido carnsico, ferruginol, parvifloron D e
inuroileanol, entre otros varios, aislados de diferentes especies vegetales (Rosmarinus
officinalis L., Salvia barrelieri Etlinger y Plectranthus nummularius Briq., entre otras) (Wang
et al., 2002; Luis and Johson, 2005; Kabouche et al., 2007; Rijo et al., 2009). Estudios in
vitro con clulas de diferente origen y estudios in vivo, han demostrado la capacidad
protectora de diterpenos con distintos esqueletos qumicos (kaurano, clerodano, labdano,
pimarano, abietano, casano...), en base a sus propiedades antioxidantes, frente al dao
oxidativo inducido por agentes citotxicos como MPP +, H2O2 o CCl4 (Koul and Kapil, 1994;
Sotelo-Flix et al., 2002; Choi et al., 2006; Koo et al., 2006; Tang et al., 2007; Dong et al.,
2009; Liu et al., 2010; Wu et al., 2010; Guo et al., 2011; Wang et al., 2011; Xu et al., 2011a;
Xu et al., 2011b).
En lnea con estos trabajos, y con la trayectoria cientfica de nuestro grupo de
investigacin, hemos realizado por primera vez el estudio de la actividad neuroprotectora de
los diterpenos andalusol, conchitriol, lagascatriol, foliol, linearol y sidol, frente al estrs
oxidativo inducido por exposicin a H2O2 en los modelos celulares PC12 (modelo neuronal) y
U373-MG (modelo de astrocitoma). Estos diterpenos aislados de las partes areas de
diferentes especies del gnero Sideritis, en un previo trabajo de colaboracin con el CSIC,
constituyen los ms abundantes en aquellas especies que se utilizan a nivel popular por sus
propiedades farmacolgicas (Gonzlez-Burgos et al., 2011).
Este trabajo de Tesis Doctoral se ha planteado como el estudio de la actividad de los
diterpenos anteriormente mencionados frente al dao oxidativo a nivel cerebral y su posible
aplicacin en aquellos procesos neurodegenerativos que cursen con dao celular. Para llevarlo
a cabo hemos establecido, en primer lugar, las condiciones de dao oxidativo para pasar
posteriormente a determinar si las molculas en estudio protegen frente al mismo. En el
estudio sobre proteccin celular hemos evaluado el efecto sobre la viabilidad celular, los
cambios sobre la morfologa celular, el nivel de ROS intracelular, los cambios sobre los
marcadores de estrs oxidativo (peroxidacin lipdica y ratio GSH/GSSG) y sobre la actividad y
expresin de las protenas de las principales enzimas antioxidantes implicadas en el sistema
de defensa. El efecto de los diterpenos sobre diferentes marcadores de disfuncin
mitocondrial como son los niveles de calcio citoslico y mitocondrial, el potencial de
membrana mitocondrial y los niveles de ATP tambin han sido evaluados. Los posibles
mecanismos implicados en la proteccin de los diterpenos en estudio frente al dao celular
inducido por H2O2 han sido asimismo elucidados. Finalmente, se ha realizado el estudio y
posible mecanismo de paso de los diterpenos a travs de la BHE.
Discusin
El estudio de la actividad protectora de los diterpenos sobre los dos modelos

celulares, neuronas y astrocitos, viene determinado por la importancia funcional de estos dos
tipos celulares en el SNC y su implicacin en la patologa de aquellas enfermedades
neurodegenerativas asociadas al estrs oxidativo. En estas enfermedades, la caracterstica
muerte progresiva de las neuronas, unidad morfolgica y funcional del SNC, suele ir tambin
acompaada de la muerte de los astrocitos. Los astrocitos, clulas mayoritarias del cerebro,
ofrecen apoyo estructural, metablico y trfico a las neuronas, adems de participar
activamente en diferentes procesos como la transmisin sinptica, el mantenimiento de la
homeostasis inica y el desarrollo, actividad, plasticidad, diferenciacin y maduracin
neuronal, entre otras funciones (Gee and Keller, 2005; Fields and Burnstock, 2006; Maragakis
and Rothstein, 2006; Theodosis et al., 2008). Adems, diversos estudios en cultivos mixtos de
neuronas y astrocitos han demostrado que, en ciertas condiciones de estrs oxidativo, los
astrocitos preservan la supervivencia neuronal, accin relacionada con la captacin de ROS
(Drukarch et al., 1998), as como con la regulacin al alza de la actividad de transporte del
aminocido cistena, esencial para la sntesis del antioxidante no enzimtico glutation
(Dringen et al., 1999; Dringen, 2000). Teniendo en cuenta todo lo mencionado anteriormente,
ambos tipos celulares, astrocitos y neuronas, constituyen una potencial e importante diana
teraputica para el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas.
Los dos modelos celulares utilizados en nuestro trabajo (PC12 y U373-MG) son
ampliamente utilizados para estudiar mecanismos de proteccin de compuestos bioactivos de
origen natural frente al estrs oxidativo, para identificar posibles dianas teraputicas y
evaluar nuevas estrategias neuroprotectoras (Hwang and Yen, 2011; Lee et al., 2011; Mao et
al., 2011; Martn et al., 2011).
El H2O2 ha sido la molcula utilizada como agente generador de estrs oxidativo. Es
una especie reactiva de oxgeno mayoritaria en el organismo que tiene un papel dual: a
concentraciones fisiolgicas participa en los procesos de sealizacin celular (Stone and Yang,
2006; Holmquist et al., 2007; Veal and Day, 2011), mientras que a altas concentraciones es
capaz de inducir estrs oxidativo (Halliwell, 1992). En modelos experimentales de isquemia
cerebral se han detectado niveles de H2O2 superiores a 100 M (Han et al., 1997). La
formacin de elevadas concentraciones de H2O2 tambin se ha descrito en las fibrillas de
amiloide formadas por la protena beta-amiloide en la enfermedad de Alzheimer y, por la
protena alfa-sinuclena en la enfermedad de Parkinson, implicndose a esta especie reactiva
de oxgeno como posible mecanismo causal en la muerte celular que ocurre en ambas
enfermedades neurodegenerativas (Tabner et al., 2001; 2002). Estudios in vitro realizados en
207
208
Discusin
diferentes tipos celulares han demostrado que la citotoxicidad inducida por H2O2 se debe, en
gran medida, a una alteracin del balance redox celular y a la generacin de otras ROS
(Dumont et al., 1999). Se ha visto que, al aplicar H2O2 extracelular, dada su naturaleza
soluble tanto en medio acuoso como lipdico, es capaz de atravesar las membranas celulares
produciendo dao celular en presencia de metales de transicin intracelulares al ser
convertido no enzimticamente en especies reactivas como el radical hidroxilo y el radical
superxido (Halliwell, 1992). Las consistentes evidencias de la estrecha implicacin del H2O2,
va estrs oxidativo, en la etiologa o desarrollo de varios desrdenes neurodegenerativos,
fundamentan la eleccin e inters de esta especie reactiva por nuestro grupo de investigacin
como inductor de estrs oxidativo en los modelos celulares desarrollados.
En este trabajo de investigacin, las clulas PC12 y U373-MG se han tratado durante
30 minutos con H2O2 a las concentraciones de 0,1 mM y 1 mM, respectivamente, para generar
situaciones de estrs oxidativo. Estas concentraciones utilizadas fueron establecidas en
trabajos previos del grupo (Naval, 2007; Martin, 2009). En stos se han establecido los valores
de la concentracin de los inductores de estrs oxidativo sulfato ferroso, H2O2 y la
combinacin de ambos (reactivo de Fenton) que producen aproximadamente el 50% de la
muerte
de
las
clulas
PC12
U373-MG
mediante
el
estudio
de
la
relacin
concentracin/efecto sobre la viabilidad celular. La diferente concentracin empleada de

H2O2 necesaria para inducir estrs oxidativo en los dos tipos celulares (de unas 10 veces), y
para el mismo tiempo de tratamiento, responde al hecho de que las clulas PC12 son ms
sensibles a los efectos citotxicos del H2O2 que las clulas U373-MG. Las evidencias que
pueden explicar este hecho son diversas, incluyndose la diferente eficiencia de
detoxificacin del H2O2 extracelular, atribuido a una mayor actividad de las enzimas catalasa
y glutation peroxidasa, entre otras, as como a un mayor nivel de molculas antioxidantes
como glutation y vitamina E en los astrocitos (Halliwell and Gutteridge, 1999).
Nuestros resultados sugieren que, bajo las condiciones experimentales del presente
estudio, el dao oxidativo inducido por exposicin a H2O2 en las clulas PC12 y U373-MG es
semejante a las alteraciones que tienen lugar durante el desarrollo de algunos procesos
neurodegenerativos, in vivo, en las neuronas y en los astrocitos. El H2O2 causa una
significativa disminucin de la viabilidad celular en base al anlisis de la actividad metablica
de la clula (ensayo de MTT) y a la integridad de la membrana plasmtica (ensayo de LDH) en
ambos tipos celulares investigados. Adems, se ha estudiado si el efecto negativo observado
sobre la viabilidad celular viene acompaado de cambios en la morfologa celular. La
observacin al microscopio muestra que el tratamiento de las clulas PC12 con H2O2 causa
Discusin
cambios morfolgicos como la aparicin de unas pequeas evaginaciones esfricas en la

membrana as como una prdida de la estructura grupal caracterstica de estas clulas. Las
clulas U373-MG tambin experimentan cambios significativos en su morfologa tras el
tratamiento con H2O2, concretamente, reduccin del tamao celular y prdida de las
ramificaciones que les confieren su particular aspecto estrellado. Estudios previos a nivel
subcelular en astrocitos han demostrado que el H2O2 ocasiona una prdida de la superficie
ciliar, una disminucin en el nmero de ramificaciones, y prdida de la fluidez de la
membrana, a la vez que promueve la reorganizacin del citoesqueleto, aumentando la
polimerizacin de la actina, as como la formacin de citonemas y conexiones clula a clula
tipo tnel (Zhu et al., 2005; L et al., 2008).
Segn queda reflejado en el ttulo de la Tesis, se ha evaluado la actividad
neuroprotectora de seis diterpenos andalusol, conchitriol, lagascatriol, foliol, linearol y sidol
aislados del gnero Sideritis. Cuando realizamos el pretratamiento de cualquiera de las dos
lneas celulares (PC12 y U373-MG) durante 24 h con concentraciones no citotxicas de estos
compuestos, como paso previo a la exposicin a H2O2, se observa una proteccin de las
clulas frente a las reacciones nocivas que esta especie reactiva de oxgeno mayoritaria
provoca, lo que se pone de manifiesto como un aumento de la viabilidad celular y una
atenuacin de los cambios morfolgicos.
Teniendo en cuenta que el principal mecanismo de dao celular inducido por H2O2
implica la va del estrs oxidativo (Halliwell, 1992), procedimos a estudiar el efecto de la
exposicin a H2O2 sobre el nivel de ROS intracelular mediante el ensayo de la
diclorofluorescena. En este estudio, el H2O2 induce produccin de ROS intracelular en ambos
tipos celulares de manera significativa, lo que sugiere que los cambios observados tanto sobre
la viabilidad como en la morfologa celular, se correlacionan con un aumento en la generacin
intracelular de ROS.
El pretratamiento de las clulas PC12 y U373-MG con los diterpenos ocasiona una
inhibicin de la produccin de ROS intracelular, de manera significativa para andalusol,
lagascatriol, linearol y sidol en los astrocitos y adems para conchitriol, en las neuronas a las
concentraciones de 5 y 10 M.
Una vez demostrada la capacidad de induccin de ROS por H2O2, el estudio de los
diterpenos sobre proteccin se ha realizado, en primer lugar, sobre los lpidos, componentes
fundamentales de las membranas y una, y quizs la primera, diana biolgica de los radicales
209
210
Discusin
libres. El dao en la membrana se ha determinado midiendo los niveles del producto final de
la peroxidacin lipdica malonildialdehido (MDA), ampliamente utilizado como biomarcador
de estrs oxidativo en varias enfermedades neurodegenerativas (Reed, 2011; Hayashi et al.,
2012). Los resultados de este estudio indican que la exposicin a H2O2 en clulas PC12 y U373MG produce una peroxidacin lipdica significativa comparado con las clulas control. El
pretratamiento celular con los diterpenos objeto de estudio, en concreto andalusol y linearol
(en clulas PC12) y, andalusol y lagascatriol (en clulas U373-MG) protege frente a la
peroxidacin de lpidos de membrana inducida por H2O2, lo que por un lado confirma que
estos compuestos son capaces de inhibir el dao oxidativo inducido por especies reactivas
como ROS y por otro lado, se demuestra la capacidad de estos compuestos para interaccionar
y penetrar las bicapas lipdicas, lo que le confiere valor aadido a su actividad protectora. De
acuerdo con Pavlica and Gebhardt (2010) la accin antioxidante de un compuesto no viene
determinada slo por su potencial antioxidante, sino tambin por su capacidad para atravesar
las membranas plasmticas, ya que para ejercer un efecto protector frente al dao oxidativo
debe alcanzar tanto los compartimentos hidroflicos como hidrofbicos celulares. Este efecto
protector de los diterpenos frente a la peroxidacin lipdica previene de la alteracin en la
estructura y funcin de las membranas por prdida de fluidez, de la inactivacin de la
membrana de las enzimas, as como del aumento de la permeabilidad de iones y de la
disrupcin de la membrana (Negre-Salvayre et al., 2010; Bartsch et al., 2011).
El ratio GSH/GSSG es otro de los marcadores de estrs oxidativo, adems de la
peroxidacin lipdica. El glutation, en su forma reducida (GSH), es el principal antioxidante no
enzimtico del organismo. En condiciones fisiolgicas este ratio se encuentra en una relacin
molar de alrededor de 10:1 (Pajares et al., 1992). Los niveles de GSH y GSSG medidos en
condiciones basales fisiolgicas en las clulas PC12 y U373-MG cumplen esta relacin,
confirmndose una vez ms la idoneidad de estos dos modelos celulares para estudios de
estrs oxidativo. Por otro lado, estudios previos han demostrado que la concentracin de GSH
en astrocitos es mayor que en neuronas, explicacin fundamentada en el hecho de que las
neuronas requieren de distintos precursores para las sntesis de glutation que les son
aportados por los astrocitos (Dringen et al., 1999; Dringen, 2000). Tambin se ha reportado
que los niveles intracelulares de GSH entre los astrocitos y las neuronas, pueden variar
notablemente en funcin de las condiciones experimentales (Gegg et al., 2005). Cuando las
clulas PC12 y U373-MG se tratan con H2O2, el ratio GSH/GSSG se ve modificado de manera
significativa al disminuir los niveles de GSH y aumentar los de GSSG. El pretratamiento con los
diterpenos previene de manera significativa las alteraciones en el ratio GSH/GSSG
ocasionadas por H2O2; concretamente andalusol (5 y 10 M) restaura prcticamente hasta
Discusin
valores de normalidad los niveles de glutation en ambos tipos celulares investigados. Tambin
resultan muy activos linearol en clulas PC12 y lagascatriol en clulas U373-MG.
Una vez determinado el efecto protector de los diterpenos frente al dao oxidativo
inducido por H2O2, se ha establecido el/los posibles mecanismos de accin de estos
compuestos. Uno de los posibles y principales mecanismos de accin de las molculas con
actividad antioxidante consiste en la interaccin directa con las ROS, previniendo el inicio
y/o propagacin de los procesos oxidativos que afectan a los sustratos biolgicos (ej.:
peroxidacin lipdica) (Battin and Brumaghim, 2009). Con objeto de establecer el posible
mecanismo por el que los diterpenos del estudio protegen a las clulas del dao oxidativo
producido por exposicin a H2O2, se ha cuantificado la capacidad captadora de radicales
libres. El ensayo qumico utilizado ha sido el de Capacidad de Absorcin de Radicales de
Oxgeno (ORAC). Este ensayo presenta la ventaja respecto a otros similares de que los
radicales generados son de tipo peroxilo, de gran relevancia en los procesos de peroxidacin
lipdica in vivo (Prior and Cao, 1999). La medida directa de la capacidad "scavenger" de los
seis diterpenos, ha mostrado una baja actividad de los mismos en relacin con el compuesto
utilizado como referencia (-tocoferol). Comparando estructuralmente los diterpenos y el tocoferol, la diferencia ms apreciable y directamente relacionada con la actividad
"scavenger" es el anillo bencnico del -tocoferol. Como ya se ha comentado ampliamente en
el material y mtodos, el mtodo ORAC se fundamenta en el mecanismo de trasferencia de un
tomo de hidrgeno (HAT) de un compuesto al radical peroxilo para su estabilizacin. La
reactividad de los grupos funcionales con los radicales peroxilo viene determinada por la
energa de disociacin del enlace O-H, en este caso, as como por la estabilizacin por
resonancia del radical resultante. En los diterpenos estudiados, en relacin con la sustancia
de referencia -tocoferol, la fuerza de los enlaces O-H es mayor y la falta de un anillo
bencnico en su estructura no favorece la deslocalizacin de los electrones en sus tres dobles
enlaces conjugados. La importancia de la relacin estructura-actividad "scavenger" ha sido
tambin descrita para otros diterpenos, concretamente los diterpenos abietano fenlicos, que
han demostrado ser potentes "scavengers" del radical DPPH, lo que se atribuye a su grupo
fenol (Wang et al., 2002; Luis et al., 2005; Kabouche et al., 2007; Rijo et al., 2009). Por
tanto, la baja actividad captadora de radicales libres por parte de los diterpenos estudiados
no explicara su marcado efecto inhibidor en la produccin de ROS inducida por H2O2
demostrado en las clulas PC12 y U373-MG y medida mediante el ensayo de la
diclorofluorescena.
Adems de la actividad captadora de ROS va interaccin directa con los mismos, la
211
212
Discusin
activacin de las enzimas antioxidantes es otro de los mecanismos que explica la accin de
los compuestos antioxidantes. Cambios en los patrones enzimticos de catalasa (CAT),
superxido dismutasa (SOD), glutation peroxidada (GPx), glutation reductasa (GR) y
hemooxigenasa-1 (HO-1), entre otras, se traducen en variaciones del balance redox celular,
constituyendo, por tanto, un biomarcador esencial del estrs oxidativo (Wang et al., 2006;
Jazwa and Cuadrado, 2010). As, con objeto de profundizar en el/los mecanismos de accin
de los diterpenos del presente trabajo, procedimos a estudiar el papel de estos compuestos
en
la
actividad
expresin
de
las
enzimas
antioxidantes,
mediante
tcnicas
espectrofotomtricas y de Western-blot, respectivamente. En nuestro trabajo, el tratamiento

de las clulas con H2O2 produce una significativa disminucin tanto en la actividad como en la
expresin de las enzimas anteriormente mencionadas. Las alteraciones en estas enzimas
aumentan la susceptibilidad de las clulas al dao inducido por H2O2 (Liddell et al., 2006).
El pretratamiento celular con los diterpenos de Sideritis produce un aumento de la
actividad y de la expresin de las enzimas antioxidantes endgenas evaluadas (excepto foliol
en clulas PC12 y conchitriol y foliol en clulas U373-MG), comparado con las clulas
expuestas a H2O2 como nico tratamiento, lo que sugiere que la disminucin en la produccin
de ROS intracelular demostrada en estudios anteriores, puede deberse muy probablemente a
la accin antioxidante de los diterpenos al actuar sobre los sistemas enzimticos. Estos
resultados concuerdan con los obtenidos en investigaciones previas en las que se ha
demostrado la eficacia de determinados diterpenos con estructuras variadas y procedentes de
otras especies vegetales, para regular al alza las enzimas antioxidantes y as proteger del
dao ocasionado por inductores de estrs oxidativo (Koul and Kapil, 1994; Choi et al., 2006;
Dong et al., 2009; Liu et al., 2010; Sahu et al., 2011).
La expresin de estas enzimas antioxidantes est regulada por el factor de
transcripcin celular Nrf2. En condiciones basales, este factor se encuentra inactivo por la
unin a la protena Keap 1 en el citoplasma. La liberacin de Nrf2 de Keap 1 (va proten
quinasa, electrfilos o compuestos citoprotectores), hace que este factor se dirija al ncleo
donde se une a elementos de respuesta antioxidante (ARE), que ocasionan la activacin
coordinada de una batera de genes defensivos implicados en la induccin de las enzimas
antioxidantes estudiadas (Lee and Johnson, 2004). Dado que los resultados obtenidos en este
trabajo han puesto de manifiesto que los diterpenos estudiados de Sideritis son capaces de
inducir la actividad y la expresin de las enzimas antioxidantes, procedimos a evaluar a
continuacin el efecto de los diterpenos en los niveles de expresin Nrf2 en el mismo sustrato
celular empleado para los estudios anteriores. Los resultados obtenidos sugieren que todos los
Discusin
diterpenos, a bajas concentraciones, a excepcin de foliol en clulas PC12 y de foliol y de

conchitriol en clulas U373-MG, son capaces de activar significativamente la expresin del
factor Nrf2 a nivel nuclear y, por tanto, activar la expresin de las enzimas antioxidantes.
Estos resultados apoyan investigaciones previas que han identificado varios compuestos de
naturaleza terpnica como inductores de la expresin de genes ARE (Kim et al., 2011; Lyu et
al., 2011; Neymotin et al., 2011; Tsai et al., 2011) incluyndose algunos diterpenos como los
de tipo kaurano oridonin (Du et al., 2008), cido ent-kaur-16-en-19-oico (Lyu et al., 2011),
kahweol y cafestol (Higgins et al., 2007; Hwang and Jeong, 2008) y diterpenos tipo abietano
como carnosol (Martn et al., 2004) y cido carnsico (Satoh et al., 2008), y que, por tanto,
son capaces de activar la va de sealizacin Nrf2 en distintos tipos celulares ejerciendo un
papel protector frente a situaciones de estrs oxidativo. Los resultados de la presente
investigacin, no slo confirman que algunos diterpenos de tipo kaurano (foliol, linearol and
sidol) son capaces de inducir la va Nrf2, sino que adems se identifican diterpenos con otras
estructuras como rosano (lagascatriol), labdano (andalusol) y beyerano (conchitriol), capaces
de activar esta va citoprotectora.
Modelos in vitro e in vivo han demostrado de forma evidente una asociacin entre
estrs oxidativo y disfuncin mitocondrial. Tal como demostr Kourie (1998), las especies
reactivas de oxgeno pueden alterar los sistemas transportadores de calcio, ocasionando un
aumento incontrolado del calcio intracelular. La captacin de calcio por la mitocondria
estimula la respiracin y la sntesis de ATP; no obstante, la acumulacin de cantidades
masivas de calcio en la mitocondria, como ocurre durante el estrs oxidativo, puede conducir
a una disfuncin mitocondrial (colapso del potencial de membrana mitocondrial, apertura del
poro de transicin mitocondrial (PTP), e incluso muerte celular) (Perez-Pinzon et al., 2012).
En esta etapa del trabajo y, teniendo en cuenta las investigaciones precedentes,
hemos abordado el estudio de la posible actividad de los diterpenos a nivel mitocondrial. Los
datos experimentales obtenidos indican que el H2O2 a altas concentraciones conduce a un
aumento significativo de los niveles de calcio citoslico en ambos tipos celulares utilizados.
Estas observaciones se corresponden con las realizadas previamente por otros autores quienes
describen que la toxicidad del H2O2 viene determinada no slo por su capacidad para generar
ROS, sino tambin para producir cambios en la homeostasis de calcio celular (Duchen, 2000;
Wang et al., 2006). Tras comprobar que el H2O2, en las condiciones experimentales definidas,
aumenta significativamente la concentracin de calcio citoslico, hemos evaluado el impacto
de esta elevacin a nivel de la mitocondria. Se observa que el tratamiento con H2O2 produce
una disminucin del potencial de membrana mitocondrial,
213
214
Discusin
acompaado de un aumento de los niveles de calcio mitocondrial y de una reduccin de la

generacin de ATP, llevando en ltimo trmino a la activacin de la caspasa-3. Estos efectos
a nivel de la mitocondria pueden atribuirse no slo al aumento del calcio citoslico, sino
tambin a los efectos del propio H2O2.
Como previamente ha quedado demostrado, el H2O2 induce peroxidacin lipdica,
pudiendo llevar a la prdida de la fluidez de las membranas biolgicas, incluida la
mitocondrial. La progresiva prdida de la fluidez de la membrana puede llevar a un aumento
de la permeabilidad del calcio, y, con ello, comprometerse el mantenimiento de la
homeostasis de calcio celular por la mitocondria. Por tanto, la prevencin del estrs oxidativo
puede prevenir la disfuncin mitocondrial mediada por ROS. Al analizar el efecto de los
diferentes diterpenos sobre la mitocondria se observa que andalusol, conchitriol, lagascatriol,
linearol y sidol, en clulas PC12, y estos mismos diterpenos, excepto conchitriol, en clulas
U373-MG, atenan de manera significativa los cambios en la homeostasis del calcio
intracelular, y provocan una inhibicin de la despolarizacin de la membrana y la prdida de
la funcin mitocondrial medida en trminos de sntesis de ATP. El conjunto de efectos a nivel
mitocondrial demostrado (calcio mitocondrial y citoslico, potencial de membrana
mitocondrial, niveles de ATP y actividad caspasa-3) tiene como resultado final la proteccin
celular (neuroproteccin) frente a la toxicidad inducida por H2O2. Este efecto protector a
nivel de la mitocondria est directamente relacionado con la capacidad de estos compuestos
para inhibir la produccin de ROS intracelulares, mediado al menos en parte por la activacin
de la va del factor de transcripcin Nrf2.
De forma global, al comparar la eficiencia protectora de los 6 diterpenos de Sideritis
spp. frente al estrs oxidativo inducido por H2O2, se observa un patrn de actividad similar
pero no idntico para todos estos compuestos en las dos lneas celulares estudiadas. As, en la
lnea celular PC12, los diterpenos andalusol y linearol han sido los ms activos, seguidos de
sidol, lagascatriol y conchitriol, y por ltimo, el compuesto menos activo ha sido foliol. En los
estudios realizados sobre la lnea celular U373-MG, los diterpenos que han ejercido el mayor
efecto citoprotector han sido andalusol y lagascatriol, seguidos de linearol y sidol, y por
ltimo, de conchitriol y foliol.
Estructuralmente, los diterpenos foliol, linearol y sidol, pertenecen al tipo kaurano.
Los diterpenos linearol y sidol difieren estructuralmente en la posicin del grupo acetoxi, que
en el linearol ocupa la posicin 18 y en el sidol la posicin 3. La diferente posicin de este
grupo en sus estructuras qumicas causa una moderada diferencia en sus actividades
Discusin
biolgicas, especialmente en clulas PC12 en las que linearol ha sido ms activo que sidol.
Por otro lado, foliol, que se diferencia estructuralmente de linearol y sidol en que en vez de
un grupo acetilo tiene un grupo hidroxilo, ha sido el menos activo de todos los diterpenos
estudiados y en ambos tipos celulares investigados. Esto puede ser justificado en trminos de
que ese grupo hidroxilo le aporta una mayor hidrofilia (el log Poct de foliol es 2,88, mientras
que para linearol y sidol es 3,36), por lo que se sugiere que la actividad de estos compuestos
est directamente relacionada con la lipofilia (Hansch and Clayton, 1973; Takahashi et al.,
2008).
La mayor lipofilia de andalusol (log Poct 3,59), en comparacin con el resto de
diterpenos estudiados, explicara tambin en gran medida, el que sea uno de los compuestos
ms activos de los estudiados tanto en la lnea celular PC12 como en la lnea celular U373MG.
En resumen, los datos obtenidos en este trabajo sugieren que la accin antioxidante
de los diterpenos estudiados aislados de Sideritis spp., puede proteger a las clulas PC12 y
U373-MG del estrs oxidativo y de la disfuncin mitocondrial inducida por H2O2. Estos
compuestos, tal y como se ha demostrado experimentalmente, actuaran inhibiendo la
produccin intracelular de ROS y la peroxidacin lipdica, atenuando los cambios en los
niveles de GSH y GSSG, as como aumentando la actividad y la expresin de las principales
enzimas antioxidantes endgenas; a nivel mitocondrial, los diterpenos estudiados reducen los
cambios en el potencial de membrana mitocondrial, atenan los cambios en los niveles de
ATP y alteraciones de la homeostasis del calcio, as como inhiben la activacin de caspasa-3.
El conjunto de estas acciones tendra como resultado final la prevencin de los efectos
patolgicos derivados de las ROS que se producen durante el desarrollo fisiopatolgico de
diversas enfermedades neurodegenerativas.
En la segunda parte de esta Tesis Doctoral, una vez demostrado el potencial
antioxidante de los diterpenos en estudio, procedimos a evaluar si estos compuestos son
capaces de atravesar la BHE.
Las caractersticas fsicas, metablicas y de transporte de la BHE hacen que un
elevado nmero de molculas con actividad neurofarmacolgica tengan dificultades para
penetrar en el SNC y as ejercer su accin. Se estima que ms de un 98% de las molculas
pequeas y casi el 100% de las molculas grandes que se descubren con actividad en el SNC no
pueden atravesar la BHE. Esta principal limitacin explica el hecho de que frmacos con
215
216
Discusin
resultados experimentales prometedores no consigan los efectos teraputicos deseados en

estudios pre-clnicos y clnicos (Gabathuler, 2010). Es por ello, por lo que actualmente los
estudios de farmacocintica de las molculas a travs de la BHE constituyen uno de los pilares
fundamentales de la investigacin neurofarmacolgica.
La mayor parte de los trabajos de investigacin en este rea evalan la permeabilidad
a travs de la BHE tanto de molculas activas en el cerebro para tratar trastornos del SNC (ej.
frmacos antiepilpticos carbamazepina o fenobarbital) (Luna-Torts et al., 2008) como de
molculas activas en otros campos de actividad farmacolgica que producen importantes
efectos secundarios a nivel del SNC (Andr et al., 2009). Existen estudios que, si bien no van
encaminados a determinar la actividad farmacolgica, son interesantes ya que persiguen
determinar el paso a travs de la BHE de compuestos neurotxicos a los que se expone el ser
humano diariamente como son los metales pesados, los cules son agentes contaminantes del
medio ambiente, y los organofosforados, presentes en la composicin de muchos pesticidas
(Fitsanakis et al., 2006; Balbuena et al., 2010).
En el caso de los productos naturales son escassimos los trabajos tanto in vitro como
in vivo realizados con objeto de evaluar la capacidad de paso a travs de la BHE. Adems, de
ser pocos los trabajos publicados, la mayora de ellos se han realizado con productos
naturales disponibles comercialmente, particularmente flavonoides como catequina o
epicatequina (Youdim et al., 2003a; Faria et al., 2011). En el caso del grupo de los terpenos,
son escasos los trabajos publicados y, adems, todos ellos son muy recientes; concretamente,
hay estudios de permeabilidad para los terpenos salvinorina A (diterpeno de tipo
neoclerodano aislado de Salvia divinorum Epling et Jtiva) (Teksin et al., 2009), cido
valernico (sesquiterpeno aislado de Valeriana officinalis L.) (Neuhaus et al., 2008), y
ginkglidos y bilobalido (lactonas terpnicas y sesquiterpeno, respectivamente, aislados del
Ginkgo biloba L.) (Madgula et al., 2010), entre otros.
As pues como etapa final, en el presente trabajo de Tesis Doctoral, procedimos a
evaluar la capacidad de paso de los diterpenos en estudio a travs de la BHE utilizando
tcnicas in silico e in vitro.
Los estudios in silico constituyen una herramienta muy til en el descubrimiento y
desarrollo de nuevos frmacos activos a nivel del SNC. Estos estudios, basndose en
determinadas propiedades fsico-qumicas y descriptores moleculares de los compuestos,
permiten establecer modelos predictivos de molculas altamente permeables a travs de la
Discusin
BHE. Numerosos estudios experimentales han demostrado que la permeabilidad de los

compuestos a travs de la BHE es inversamente proporcional al tamao molecular, al volumen
molecular, al rea topolgica de la superficie polar (TPSA) y al nmero de tomos de
nitrgeno y oxgeno, mientras que es directamente proporcional a la lipofilia (Banks, 2009;
Mensch et al., 2009; Abbott et al., 2010).
Mediante la utilizacin de diferentes modelos computacionales (ALOGPS 2.1.,
Molinspiration y Daylight Chemical) se ha estimado como paso previo a los estudios in vitro, el
valor de cada una de estas propiedades de los diterpenos con el fin de caracterizar su posible
comportamiento farmacocintico.
En la literatura cientfica son diversas las denominadas "reglas del pulgar" enunciadas
(expresin procedente del ingls rules of thumb, que se refiere a aquellos principios de
amplia aplicacin que no necesariamente son estrictamente precisos), basadas todas ellas en
ensayos in vivo, que tienen por objeto establecer categoras de compuestos en base a su baja
y alta capacidad de atravesar la BHE por mecanismos de difusin pasiva. Norinder and
Haeberlein (2002) establecieron que si la suma de los tomos de N + O en una molcula fuera
menor o igual a 5 y si el log P (N + O) fuera mayor de 0, la probabilidad de que esa molcula
pueda pasar la BHE es alta. Van de Waterbeemd et al. (1998) consideran como requerimientos
fsico-qumicos determinantes, que el rea topolgica de la superficie polar de una molcula
(TPSA) debe ser menor o igual que 90 , el peso molecular menor de 450 Da y el log D a pH
7,4 debe encontrarse dentro del rango de 1 y 3. Adems, estos investigadores observaron en
el trabajo anteriormente mencionado, y tras evaluar la forma molecular de toda una serie de
compuestos capaces de atravesar la BHE, que la mayora de ellos tenan una proporcin entre
los ejes principales (longitud/anchura) menor de 5. Por otro lado, Kelder et al., (1999)
atribuyeron gran importancia al parmetro de la superficie polar de una molcula (TPSA), y
establecieron unos valores lmite diferentes a los establecidos por Van de Waterbeemd et al.
(1998), siendo estos valores menores o iguales a 60-70 .
Todos estos planteamientos son de gran utilidad cientfica ya que orientan sobre el
posible comportamiento de una molcula a travs de la BHE. Sin embargo, como su propio
nombre indica, rules of thumb, no son estrictamente precisas ni fiables, por lo que son
necesarios estudios experimentales. Adems, estas reglas caracterizan exclusivamente el
comportamiento de compuestos que utilizan mecanismos de difusin pasiva para atravesar las
clulas endoteliales, no teniendo en cuenta los otros tipos de transporte.
217
218
Discusin
En el caso concreto de los diterpenos del presente estudio, al aplicar la regla del
pulgar enunciada por Norinder and Haeberlein, todos ellos cumplen la primera premisa; as,
la suma de los tomos de N + O de los diterpenos ha sido menor de 5, siendo concretamente
este valor de 3 para andalusol, conchitriol, foliol y lagascatriol y de 4 para linearol y sidol. Sin
embargo, la segunda premisa de esta regla slo es cumplida por andalusol, conchitriol y
lagascatriol (Norinder and Haeberlein, 2002). Para los otros tres diterpenos, el log P (N + O)
es menor de 0. En el caso de la regla del pulgar enunciada por Van de Waterbeemd y
colaboradores, slo foliol cumple todas las caractersticas. El resto de diterpenos satisfacen
todas las propiedades a excepcin del valor de log D que es superior a 3 en todos. Por otro
lado, la regla de Kelder et al., es cumplida por todos los diterpenos, los cules presentan
valores del rea topolgica de la superficie polar (TPSA) menores de 70 .
Adems de las propiedades anteriormente comentadas, el estudio in silico revela que
ninguno de los diterpenos presenta grupos ionizables. En la BHE, el pH a ambos lados, apical y
basal, es aproximadamente 7,4. A este valor de pH, muchos grupos de las molculas se
encuentran ionizados, siendo la carga un impedimento para el paso de compuestos por
mecanismos de difusin pasiva (Youdim et al., 2003b).
Teniendo en cuenta la informacin obtenida del estudio in silico, se puede afirmar
que los diterpenos en estudio presentan un perfil de permeabilidad favorable para atravesar
la BHE por mecanismos de difusin pasiva.
Una vez caracterizado el perfil farmacocintico de los diterpenos mediante estudios
in silico, procedimos a realizar estudios in vitro de captacin y permeabilidad utilizando los
modelos celulares RBE4 y ECV304/C6.
Para los estudios de captacin se seleccion la lnea celular RBE4. Esta lnea celular
expresa toda una serie de propiedades especficas de la BHE, incluidos enzimas (fosfatasa
alcalina, gamma-glutamiltranspeptidasa) y transportadores (GLUT1, LAT1, gp-P) (Roux et
Couraud, 2005), por lo que es frecuentemente utilizada para estudios mecansticos y
bioqumicos de BHE.
Los estudios realizados demuestran que los diterpenos en estudio son captados por las
clulas RBE4 de una manera concentracin y tiempo dependiente. A la mxima concentracin
utilizada (25 M), se observa que, a partir de las 6 horas de incubacin, se produce un
significante descenso en la eficiencia de captacin, lo que sugiere que las clulas estn
Discusin
alcanzando ndices de saturacin. La captacin de los diterpenos es mayor para andalusol y

lagascatriol, mientras que conchitriol y foliol son los menos captados. Atendiendo a la lipofilia
de estos compuestos se sugiere que la lipofilia puede ser el factor o propiedad fsico-qumica
determinante en la captacin de compuestos diterpnicos.
En relacin con los estudios de permeabilidad a travs de la BHE, las clulas RBE4
no estn consideradas un buen modelo celular ya que presentan la importante limitacin de
que no establecen uniones estrechas restrictivas, siendo este requisito fundamental para su
uso en estudios de permeabilidad. Por esta razn, esta lnea celular fue descartada para el
estudio del transporte de los diterpenos a travs de la BHE (Youdim et al., 2003a).
Entre la gran diversidad de modelos celulares para los estudios de permeabilidad de
BHE (capilares cerebrales aislados, cultivos primarios de clulas endoteliales de capilares
cerebrales, clulas endoteliales de cerebro inmortalizadas y modelos celulares de origen no
cerebral) se ha seleccionado el modelo celular de co-cultivo ECV304/C6 (clulas
endoteliales/clulas de la glia). Recientemente, Garberg y colaboradores (2005) en un estudio
comparativo de los diferentes modelos celulares de BHE disponibles, observaron que existe
una buena correlacin entre los resultados de permeabilidad in vivo y los obtenidos in vitro
utilizando el modelo celular ECV304/C6. Las clulas endoteliales ECV304 expresan los
receptores de transferrina, glucosa (GLUT-1) y el transportador del aminocido leucina, as
como el transportador de eflujo gp-P y la enzima gamma-glutamil transpeptidasa (Dolman et
al., 1998; Kuchler-Bopp et al., 1999). Adems establecen uniones estrechas, lo que se refleja
en los valores de resistencia elctrica transendotelial (TEER). En este estudio, la media de los
valores TEER ha sido de 127 x 10-6 x cm2, valor similar al obtenido en estudios previos
(Youdim et al., 2003a), lo que confirma la fiabilidad del modelo.
La importancia de co-cultivar las clulas endoteliales con astrocitos se debe al hecho
de que diversos estudios han demostrado, que como consecuencia de los pases celulares
necesarios para su mantenimiento, las clulas endoteliales de cerebro van perdiendo
propiedades de la BHE como la integridad de las uniones estrechas o la expresin de
determinadas enzimas y transportadores (Krmer et al., 2001). Los astrocitos liberan factores
solubles que recuperan estas propiedades de barrera (DeBault and Cancilla, 1980), adems de
aumentar
la
expresin
de
determinados
transportadores
como
la
gamma-glutamil
transpeptidasa (El Hafny et al., 1996), GLUT-1, los carriers de aminocidos leucina y alanina
(El Hafny et al., 1997; Bauer and Bauer, 2000), as como el receptor de transferrina (Dehouck
et al., 1994). Adems, los astrocitos inducen a las clulas endoteliales de los capilares
219
220
Discusin
cerebrales a formar uniones estrechas. Los co-cultivos clulas endoteliales-astrocitos

permiten conseguir una restringida permeabilidad similar a la mostrada in vivo (Youdim et
al., 2003a), por tanto, constituyen buenos modelos para estudiar el paso de compuestos a
travs de BHE.
El estudio de permeabilidad revela que los valores de permeabilidad aparente de
todos los diterpenos son menores que los del compuesto de referencia positivo, propranolol, y
mayores que los del compuesto de referencia negativo, atenolol. Estudios previos han
establecido que valores de permeabilidad (Papp) mayores de 3 x 10-6 cm/s indican que los
compuestos pueden penetrar eficientemente la BHE (Magdula et al., 2010). Por tanto, el
valor de Papp de los diferentes diterpenos sugiere que stos pueden atravesar la BHE va
transcelular por mecanismos de difusin pasiva. Andalusol y lagascatriol presentan los valores
ms altos de Papp, linearol y sidol tienen valores moderados y foliol y conchitriol, los ms
bajos. Al establecer correlaciones entre los valores de Papp y los diferentes factores fsicoqumicos determinantes en la difusin pasiva (lipofilia, peso molecular, volumen molecular,
rea topolgica de la superficie polar (TPSA) y nmero de tomos de nitrgeno y oxgeno) se
observa que la mayor correlacin se establece con la lipofilia. Esto confirma que la lipofilia
determina el paso de compuestos a travs de la BHE.
Esta elevada lipofilia de los diterpenos tambin explica el hecho de que una fraccin
de los mismos pueda quedar retenido en la barrera (Youdim et al., 2003a). Andalusol, el
compuesto ms lipfilo de los estudiados, es el que queda ms retenido en el modelo de BHE.
Sin embargo, la alta lipofilia de andalusol compens otras caractersticas negativas del
compuesto como el destacable nmero de enlaces rotables (5).
El hecho de que la permeabilidad de linearol y sidol sea mucho mayor que la de foliol,
todos ellos diterpenos tipo ent-kaureno, puede atribuirse a la estructura qumica de las
molculas. Como previamente hemos comentado a lo largo de esta Tesis Doctoral, linearol y
sidol son muy semejantes estructuralmente, encontrndose la nica diferencia en la posicin
del grupo acetoxi. Esta diferencia no parece influir en la permeabilidad de estos compuestos
a travs de BHE. Sin embargo, foliol presenta un grupo hidroxilo, en vez de un acetilo, siendo
este grupo polar posible responsable de que la permeabilidad de este compuesto sea mucho
menor en comparacin con compuestos de su mismo grupo. Estos datos concuerdan con
diversos estudios previos que muestran que la presencia de un grupo polar en una molcula
puede dar lugar a que la permeabilidad de la misma sea hasta de una unidad menor (Diamond
and Wright, 1969; Pardridge and Mietus, 1979).
Discusin
La gp-P, transportador eflujo dependiente de ATP, puede interaccionar con

determinados compuestos, devolvindolos a la circulacin sangunea; de esta manera se
limita el paso de muchos agentes teraputicos hacia el SNC (Schinkel et al., 1997). En el caso
del amplio y diverso grupo de los terpenos, se ha demostrado que algunos son sustrato de la
gp-P, otros actan como inhibidores y hay otros cuyo transporte no se ve influenciado por la
expresin de dicho transportador en las clulas endoteliales. En general, el papel del
transportador eflujo gp-P en el transporte de terpenos, parece venir determinado no slo por
la naturaleza de cada compuesto sino tambin por las condiciones experimentales ensayadas
(tipo celular, concentracin, tiempo de estudio). Madgula y colaboradores (2010) demostraron
en un estudio de transporte durante 2 horas utilizando las clulas MDR1-MDCK, que los
ginkglidos A, B, C y J (lactonas terpnicas) y el bilobalido (sesquiterpeno) a la concentracin
de 100 M eran sustrato de la gp-P. Por otro lado, en un estudio reciente (Teksin et al., 2009)
de transporte (2 h) del diterpeno de tipo neoclerodano, salvinorina A, utilizando tambin el
modelo celular MDR1-MDCK, se ha demostrado que la influencia del transportador de gp-P era
dependiente de la concentracin del compuesto. A concentraciones bajas, de 5 y 10 M,
salvinorina A es sustrato de la gp-P, pero ningn efecto se observa a concentraciones mayores
del compuesto. Adems, hay otros estudios que muestran un papel inhibidor de los diterpenos
(Corea et al., 2003).
En el caso de los diferentes diterpenos en estudio, utilizando el tariquidar como
inhibidor, se ha demostrado que ninguno de ellos es sustrato de la gp-P expresada en la lnea
celular RBE4. Adems, los estudios de permeabilidad utilizando el modelo celular ECV304/C6,
muestran que el valor del ratio de los valores de permeabilidad en ambas direcciones es
prximo a la unidad, lo que confirma que bajo las condiciones experimentales establecidas
(estudio de transporte durante 6 h y concentracin de los diterpenos de 25 M), ninguno de
los diterpenos en estudio son sustrato de la gp-P. Se sugiere que en el supuesto caso de que el
transportador gp-P pudiera tener algn efecto en el transporte de los diterpenos en estudio,
la alta lipofilia de los compuestos (rango del log P 2,88-3,59) as como las condiciones
ensayadas, que se corresponden con el tiempo y la concentracin a la que se produce la
mayor eficiencia y captacin de los diferentes diterpenos, podran compensar el posible papel
de la gp-P el efecto en el transporte.
Como consecuencia de lo anteriormente expuesto, podramos afirmar que todos los
diterpenos evaluados utilizan el transporte por difusin pasiva va transcelular como
mecanismo predominante de paso a travs de la BHE.
221
CONCLUSIONES/CONCLUSIONS
Conclusiones/Conclusions
El presente trabajo de Tesis Doctoral "Estudio de la actividad neuroprotectora de

diterpenos aislados del gnero Sideritis" se ha llevado a cabo con el objetivo de estudiar el
potencial efecto protector de los diterpenos andalusol, conchitriol, lagascatriol, foliol,
linearol y sidol, mayoritarios en las especies medicinales del gnero Sideritis, sobre el estrs
oxidativo a nivel cerebral inducido por H2O2 y los mecanismos que regulan la defensa frente al
mismo en un modelo in vitro en clulas PC12 (modelo neuronal) y U373-MG (modelo de
astrocitoma). Se han estudiado tambin los mecanismos de paso de estos diterpenos a travs
de la barrera hematoenceflica (BHE).
En base a los resultados obtenidos en el desarrollo experimental, se presentan las
siguientes conclusiones:
1. La exposicin a altas concentraciones de H2O2 induce dao por estrs oxidativo "in
vitro" en clulas PC12 y U373-MG como se refleja en el estudio de los marcadores de estrs
oxidativo celular: peroxidacin lipdica, relacin GSH/GSSG, niveles de ROS intracelulares y
actividad y expresin de las principales enzimas antioxidantes. Este dao oxidativo se
acompaa de alteraciones en la estructura y funcin mitocondrial (fallo en el potencial de
membrana, cambios en la homeostasis de calcio intracelular, afectacin de la sntesis de ATP,
y aumento de la actividad de la enzima caspasa-3), lo que pone de manifiesto la estrecha
relacin entre disfuncin mitocondrial y estrs oxidativo.
2. Se ha observado un efecto protector de los diterpenos estudiados frente al dao

celular inducido por H2O2. De los seis compuestos, andalusol y linearol han sido los
antioxidantes ms efectivos en clulas PC12, mientras que andalusol y lagascatriol lo fueron
sobre clulas U373-MG.
La accin protectora de estos compuestos se manifiesta como:
2.1. Atenuacin de los cambios inducidos por H2O2 en la integridad y actividad
mitocondrial, en la integridad de las membranas celulares y en la morfologa
celular.
2.2. Reduccin del dao oxidativo al inhibir la produccin intracelular de ROS y la
peroxidacin lipdica as como normalizacin en los niveles de GSH y GSSG.
2.3. Aumento en la actividad y la expresin de las principales enzimas antioxidantes
endgenas (catalasa, superxido dismutasa, glutation reductasa, glutation peroxidasa
y hemooxigenasa-1).
225
226
2.4. Atenuacin de los cambios derivados del estrs oxidativo a nivel mitocondrial,
concretamente en la homeostasis de calcio, el potencial de membrana mitocondrial
y los niveles de ATP.
3. La actividad protectora demostrada por los diterpenos objeto de estudio se debe, al

menos en parte, a su capacidad para inducir la expresin del factor de transcripcin
eritroide-2 nuclear (Nrf2), y por tanto activar la expresin de genes de enzimas
antioxidantes.
4. El estudio de paso de los diterpenos a travs de la BHE, utilizando tcnicas "in silico"
e "in vitro" (clulas RBE4 y co-cultivo celular ECV304/C6), demuestra que estos compuestos
utilizan el transporte por difusin pasiva va transcelular como mecanismo predominante.
5. El transporte de estos diterpenos no se ve influido por el transportador de salida

glicoprotena-P.
6. La lipofilia es el factor determinante implicado en el paso de estos compuestos a

travs de la BHE.
This Doctoral Thesis "Study of the neuroprotective activity of diterpenes isolated from
the genus Sideritis" has been carried out in order to study the potential protective effect of
the diterpenes andalusol, conchitriol, lagascatriol, foliol, linearol and sidol, which are major
compounds in the medicinal species of the genus Sideritis, on H2O2 induced oxidative stress in
the brain and the mechanisms that regulate the defense against it in an in vitro model on
PC12 cells (neuronal model) and on U373-MG (astrocytoma model). We have also studied the
mechanisms involved in the passage of these diterpenes through blood brain barrier (BBB).
Based on the results of the experimental work undertaken, the following conclusions
are made:
1. Exposure to high concentrations of H2O2 induced "in vitro" oxidative stress damage in
PC12 cells and U373-MG as reflected in the analysis of cellular markers of oxidative stress
including lipid peroxidation, GSH/GSSG, intracellular ROS levels and activity and expression
of the main antioxidant enzymes. This oxidative damage is associated with alterations in
mitochondrial structure and function (failure of the mitochondrial membrane potential,
changes in intracellular calcium homeostasis, impaired ATP synthesis and increased activity
of caspase-3), which highlights the close relationship between mitochondrial dysfunction
and oxidative stress.
2. A protective effect of diterpenes studied has been observed against H2O2-induced cell
damage. Of the six compounds, andalusol and linearol were the most effective antioxidants
in PC12 cells, whereas andalusol and lagascatriol were the most effective in U373-MG cells.
The protective action of these compounds is expressed as:
2.1. Attenuation of H2O2-induced changes in mitochondrial activity and integrity, in
cell membrane integrity and cell morphology.
2.2. Reduction of oxidative damage by inhibiting intracellular ROS production and
lipid peroxidation as well as normalization in GSH and GSSG levels.
2.3. Increased activity and protein expression of the main endogenous antioxidant
enzymes (catalase, superoxide dismutase, glutathione reductase, glutathione
peroxidase and hemooxigenase-1).
2.4. Attenuation of changes caused by oxidative stress in mitochondria, particularly
in calcium homeostasis, mitochondrial membrane potential and ATP levels.
227
228
3. The protective activity demonstrated by the diterpenes studied is attributed, at least

in part, to its ability to induce the transcription factor nuclear erythroid-2 (Nrf2)
expression, and thus activate gene expression of antioxidant enzymes.
4. The study for determining whether the diterpenes pass through the BBB, using "in
silico" and "in vitro" (RBE4 cells and cell culture co-ECV304/C6) techniques, shows that these
compounds are transported predominantly via transcellular passive diffusion.
5. The transport of these diterpenes is not influenced by the efflux transporter pglycoprotein.
6. Lipophilicity appears as the determining factor involved in the passage of these

compounds across the BBB.
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Elena M Gonzlez Burgos

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

ELENA M GONZLEZ BURGOS

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Dra. Da. M Pilar Gmez-Serranillos Cuadrado, Profesora Titular, y Dra.

Departamento de Farmacologa de la Facultad de Farmacia de la Universidad

Que la presente Tesis Doctoral presentada por Da. Elena M Gonzlez

presentacin para que sea juzgada por el Tribunal correspondiente.

Madrid, Junio 2012

M Pilar Gmez-Serranillos Cuadrado

M Emilia Carretero Accame

Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Farmacologa de la

Durante el desarrollo de la Tesis Doctoral se han realizado dos estancias breves

A lo largo de estos aos he recibido el apoyo de muchas personas que de alguna

1.1. Clasificacin botnica

1.2. Distribucin geogrfica

1.3. Descripcin botnica

1.4. Nombres comunes

1.5. Usos en medicina tradicional

1.6. Composicin qumica

3.1.1. Radical hidroxilo

3.1.2. Radical anin superxido

3.1.3. Perxido de hidrgeno

3.1.4. ROS y mitocondria

3.2. Sistemas antioxidantes

3.2.1. Enzimas antioxidantes

3.2.1.1. Enzima catalasa (CAT)

3.2.1.2. Enzima superxido dismutasa (SOD)

3.2.1.3. Enzima glutation peroxidasa (GPx)

3.2.1.4. Enzima glutation reductasa (GR)

3.2.1.5. Enzima hemooxigenasa-1 (HO-1)

3.2.2. Antioxidantes de bajo peso molecular. Sistema no enzimtico

4.1. El estrs oxidativo en la Enfermedad de Alzheimer (EA)

4.2. El estrs oxidativo en la Enfermedad de Parkinson (EP)

4.3. El estrs oxidativo en la Esclerosis lateral amiotrfica (ELA)

4.4. El estrs oxidativo en la Enfermedad de Huntington (EH)

5. La barrera hematoenceflica (BHE)

5.2. Tipos de barreras en el SNC

5.3.1. Propiedades de la BHE

5.3.2. Complejos de unin intercelulares: uniones estrechas y uniones adherentes

5.3.2.1. Uniones estrechas

5.3.2.2. Uniones adherentes

5.3.3. Rutas de transporte a travs de la BHE

5.3.3.1. Transporte pasivo

5.3.3.2. Transporte mediado por protenas

5.3.3.2.1. Transporte de entrada

5.3.3.2.2. Transporte de eflujo o de salida

5.3.3.3.1. Endocitosis mediada por receptores

5.3.3.3.2. Endocitosis mediada por adsorcin

5.3.4. Estrategias para la administracin de frmacos en el cerebro

1.1. Equipo instrumental

1.2. Productos qumicos y enzimticos

1.3.1. Compuestos en estudio: Diterpenos

1.3.2. Lneas celulares

1.3.2.1. Lneas celulares utilizadas en los estudios de estrs oxidativo y disfuncin

1.3.2.2. Lneas celulares utilizadas en estudios de paso a travs de BHE

2.1.1. Mantenimiento de los cultivos

2.1.2. Subcultivos celulares

2.1.3. Congelacin celular o criopreservacin celular

2.1.4. Descongelacin celular

2.1.5. Recuento celular

2.2. Mtodos para el estudio de estrs oxidativo y disfuncin mitocondrial