CROMATOGRAFA DE GASES Y DE

LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN

TEMA VIII
CURSO DE POSTGRADO

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Cromatografa postgrado. JAP

TEMA VIII
Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR).
Cromatografa Lquida clsica.
Ventajas de la utilizacin de la alta presin.
Parmetros en CLAR.
Tipos de CLAR.
Polaridad y retencin.
Ionizacin en CLAR: par inico.
Diferencias con la Cromatografa de gases.

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Cromatografa postgrado. JAP

Cromatografa lquida clsica.

La cromatografa lquida desarrollada en columna
por gravedad es la tcnica que dio origen por
transformaciones y mejoras sucesivas a la actual
CLAR.
Aquella tcnica se empleaba con dos objetivos:
la separacin de los componentes de una mezcla
o la purificacin de un producto con pequeas
cantidades de impurezas, utilidad, sta ltima,
que todava hoy se practica en los laboratorios.

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Cromatografa postgrado. JAP

ORGENES DE LA CROMATOGRAFA LQUIDA

Bombeo por presin hidrosttica

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DESCRIPCIN :

Tubos cilndricos huecos de capacidad variable.

Tediosa y delicada preparacin.

Difcil depsito de la muestra y recuperacin de productos.

Empleo de partculas de 50 a 200 micras.

INCONVENIENTES :

Proceso muy lento y laborioso.

Baja reproducibilidad.

Flujo variable al ser controlado slo por gravedad.

Dificultades en Absorcin por fenmenos de arrastre.

Eficacia y resolucin bajas.

VENTAJAS :

Equipo sencillo.

Coste reducido.

til en todas las escalas: analtica, preparativa e industrial.

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ORGENES DE LA CROMATOGRAFA LQUIDA

O
NT
E
T
IN

RA
O
EJ
M
DE

Bombeo por aplicacin de vaco

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ORGENES DE LA CROMATOGRAFA LQUIDA

INTENTO DE MEJORA

Bombeo por aplicacin de presin con nitrgeno

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ORGENES DE LA CROMATOGRAFA LQUIDA

TO
N
TE
N
I

DE

RA
O
J
E
M

Bombeo mediante bomba peristltica

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PASO DEL PROCESO CLSICO A LA ALTA RESOLUCIN

La lentitud del proceso se remedi con el empleo de una bomba de
alta presin que controla con exactitud el flujo deseado.
La dificultad de desarrollar procesos de absorcin, un factor limitante
de primera magnitud al ser de cierta polaridad muchos compuestos
orgnicos, se solucion con la innovacin de las fases qumicamente
enlazadas sobre gel de slice que permiten una amplia gama de
polaridades al tiempo que ofrecen una resistencia fsica total al
arrastre.
La baja eficacia se solventa disminuyendo importantemente el tamao
de partcula, cosa que no se pudo ensayar hasta que no se dispuso de
una potente bomba que venciese la bajsima permeabilidad que el
compacto empaquetamiento de partculas tan pequeas confiere a la
columna.
Sumando estos efectos, resulta que el paso de cada por gravedad a
alta presin repercute muy positivamente en un cambio en la
capacidad de resolucin de las columnas de baja a muy alta.
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Cromatografa postgrado. JAP

Ventajas de la utilizacin de la Alta Presin.

1.

Columnas reutilizables.

2.

Trabajo posible en todas las escalas.

3.

Rellenos con tamao de partcula de 3 a 10 micras.

4.

Variedad disponible de polaridades en fases estacionarias.

5.

Flujo constante controlado por la bomba.

6.

Pequea cantidad de muestra y de fcil inyeccin.

7.

Anlisis muy rpidos.

8.

Alta eficacia y alta resolucin.

9.

Alta reproducibilidad al estar las condiciones controladas.

10.

Utilizable adsorcin, absorcin y otros sistemas.

11.

Existencia de detectores continuos, sensibles y variados.

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Cromatografa postgrado. JAP

Parmetros en CLAR.
Los parmetros cromatogrficos estudiados anteriormente en los
captulos de Cromatografa de Gases son aplicables, con las
adaptaciones propias del cambio del tipo de fase mvil, a la
Cromatografa de Lquidos. Conceptos como resolucin, nmero de
platos, tiempo de retencin, retencin relativa, factor capacidad,
ecuacin de van Deemter, etc., son de plena vigencia en CLAR.
Un ejemplo significativo de esta adaptacin necesaria lo ofrece el
tratamiento de la fase mvil. En esta cromatografa es un lquido y,
entre otras diferencias marcadas con la cromatografa en la que el
fluido es un gas, debe considerarse la difusividad del soluto en la fase
mvil. Este parmetro presenta un valor inferior al tratarse de un
lquido lo que tiene una repercusin importante en el trmino B de la
ecuacin de van Deempter que es relativo a la difusin del soluto en la
fase mvil y que resulta mucho mayor cuando el fluido es un gas que
cuando es un lquido, aunque los trminos A y C no se vean tan
afectados y permanezcan valores similares a la cromatografa gaseosa:
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Cromatografa postgrado. JAP

COMPARACIN DE EFICACIAS CL-CG

Difusin
molecular
en la FM

Resistencia a la
transferencia de
masa

CG

AEPT

CL
Difusin
parsita

Velocidad circulacin fluido

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TIPOS DE CROMATOGRAFA LQUIDA

Nmero

TIPO DE SOLUTOS

FASE
ESTACIONARIA

FASE MVIL

TIPO CLAR

Apolares

Polaridad Alta

Apolar

Fase Normal (1)

Polaridad Media

Polaridad
Baja / Media

Polaridad
Regulable

Fase Reversa (2)

Polaridad Alta
(No Ionizables)

Apolar

Polar

Fase Reversa (3)

Ionizables

Apolar

Polar

Fase Reversa (4)

Par Inico

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FASE NORMAL

(1) Slica / hexano para un proceso por adsorcin o una fase enlazada muy
polar, un glicol por ejemplo, y hexano como fase mvil para absorcin.
FASE REVERSA

(2) Para una separacin de teres, aldehidos, cetonas o steres, usar una fase
enlazada fenilo o ciano y una fase mvil de acetonitrilo y agua (75 : 25).
FASE REVERSA (solutos muy polares)

(3) Una separacin de alcoholes, amidas, fenoles, glicoles o nitrilos se puede

llevar a cabo con una fase estacionaria C-8 C-18 y una fase lquida de metanol
/ agua (60 : 40).
FASE REVERSA (par inico)

(4) Solutos ionizables en funcin del pH como aminas, aminocidos y cidos

carboxlicos, se cromatografan despus de inhibir la disociacin como se ha
indicado en 3.

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Tngase en cuenta que la modulacin de polaridad posible en la

fase mvil en Cromatografa Lquida hace que no sea tan importante
ajustar la polaridad de la fase estacionaria, mucho menos variable,
pues la separacin es el resultado de la conjuncin de ambas fases.
Los problemas a separar de solutos polares y apolares mezclados
pueden resolverse por aproximacin a cualquiera de los dos tipos
extremos.
En funcin de la relacin polaridad-retencin se pueden deducir
con facilidad los rdenes de elucin esperados en los distintos casos
que se han descrito, como norma general mayor retencin de los
solutos de polaridad similar a la fase estacionaria y menor retencin
para los componentes ms afines a la fase mvil.

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CROMATOGRAFA DE COMPUESTOS INICOS O IONIZABLES

Los compuestos orgnicos inicos o los que en ciertos medios o pHs se
ionizan con facilidad son difciles de cromatografiar directamente:
1. Presentan grandes retenciones, incluso irreversibles, en los
soportes silceos.
2. Forma asociada y disociada se detectan como distintas.
Para el anlisis de estos compuestos deben perder su carcter inico.
En los electrolitos ms dbiles se puede actuar sobre el equilibrio de
disociacin mediante la tcnica conocida como supresin de iones:
puede influirse sobre el equilibrio, forma inica
forma no inica,
modificando el valor de pH normalmente entre 2 y 8, de manera que se
favorezcan las formas no inicas (asociadas). As se actuara en los
siguientes casos que involucran a cidos y bases:
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Compuestos de carcter cido :

R-COOH + H2O

RCOO- + H3O+

en el equilibrio una disminucin del pH, mayor concentracin de

hidrogeniones, llevara a un desplazamiento hacia la izquierda,
es decir, hacia la forma asociada del cido evitando el problema.
Compuestos de carcter bsico :
R-NH2 + H2O

R-NH3+ + OH-

en el equilibrio un aumento del pH, mayor concentracin de

oxhidrilos, llevara a un desplazamiento hacia la izquierda, es
decir, hacia la forma asociada de la base eliminndose los
problemas de fijacin en el soporte.

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Los compuestos de carcter cido o bsico ms fuerte no

pueden ser separados por esta tcnica al no poderse conseguir la
asociacin total en el intervalo de pH indicado y resultar peligroso
emplear valores por encima o debajo de este intervalo para la
estabilidad qumica del relleno. En estos casos, puede emplearse la
tcnica denominada cromatografa de par inico para la
separacin de especies fuertemente inicas en fase reversa sin pH's
agresivos, sin excesivamente rgidos controles de temperatura y pH.
Se trata de aadir a la muestra un in de carga opuesta
(contrain) que tenga la propiedad de unirse inicamente al in
cuya forma libre se quiere eliminar con suficiente estabilidad (no
lbil) de manera que le mantenga asociado durante el proceso
cromatogrfico sin dar problemas de fijacin inica irreversible en el
soporte.
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Dos modelos de mecanismo de actuacin ms consistentes se han

propuesto para justificar el fundamento de este tipo de cromatografa en
fase reversa :
a) Apareamiento en el seno de la fase mvil, admitiendo la existencia del
par-inico como especie independiente, neutra, no polar y que puede
globalmente ser retenido por la fase estacionaria :
R-COO- (pH = 7.5) + CI+

[R-COO-CI]

R-NH3+ (pH = 3.5) + CI-

[R-NH3-CI]

b) Intercambio inico en la superficie, modelo terico que propugna la

fijacin de la parte orgnica del contrain aadido en la pseudocapa de C18
enlazado, exponiendo su parte inizada al exterior, fase mvil, llevndose a
cabo la separacin por intercambio inico, como si se tratara de la
conversin de la capa apolar de ODS en una capa polar, inica, por la
fuerte fijacin del contrain inico.
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Cromatografa postgrado. JAP

Los reactivos a emplear en la separacin de cidos (CI+) pueden ser

cationes de amonio cuaternario (R4N+) que pueden ser aportados por
sus sales solubles. Por ejemplo fosfato o sulfato cido de
trietiloctadecilamonio.
En el caso de separacin de bases los contraiones (CI-) adecuados son
aniones con una cadena carbonada apolar en cuyo extremo presenta el
grupo inico, por ejemplo de pentano a nonano sulfonato (R-SO3-) son
muy utilizados.

+
N
_

SO3

Na

_
HSO4

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Cromatografa postgrado. JAP

Las muestras para separacin cromatogrfica que contienen

sustancias anfteras o bien que contienen conjuntamente
sustancias de carcter cido y bsico se analizan tras la
adicin de un contrain cualquiera, en la prctica el que
produzca mejores resultados, de manera que si se aade un
CI- formar par inico con las bases y regulando despus el
pH a un valor bajo los cidos quedarn "suprimidos" no
quedando especies inicas en el medio. En el caso de aadir
un CI+ formar par inico con los cidos y subiendo el pH se
asocian las bases por lo que se puede llevar a cabo la
cromatografa en fase reversa.

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Los pares inicos son generalmente mejor detectados por su

mayor absorcin ultravioleta cuando se emplea este tipo de
detectores por encima de 200 nm por causa del contrain que
se adiciona, lo que es especialmente interesante con solutos de
baja absorcin. Este hecho apoyara el fundamento terico
citado como apareamiento.
Algunos ejemplos de empleo de contraiones son los siguientes
anlisis: Alcaloides. Codena. Analgsicos como indometacina,
aspirina, metadona y morfina. Antibiticos como cefalosporinas
y penicilinas. Germicidas como el cloruro de benzalconio y el
cloruro de cetilpiridinio. Simpaticomimticos como anfetamina,
efedrna y epinefrna.

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DIFERENCIAS CON LA CROMATOGRAFA DE GASES

Aplicabilidad
Limitaciones Operativas
Temperatura
Deteccin
Recogida de muestra
Optimizacin de Metdicas

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OPTIMIZACIN DE METDICAS
Por metdica se entiende el conjunto de equipos y parmetros
cromatogrficos seleccionados como ms adecuados para realizar
con xito una separacin dada. Para el diseo de una metdica en
ambas cromatografas existe un conjunto de factores a considerar
que son comparables y que podramos calificar como de ajuste
grueso y que se refieren al equipo: deteccin, inyeccin, columna
(fase estacionaria, fsica, tipo, etc., pero para el perfeccionamiento
u optimizacin de la metdica, lo que podramos llamar ajuste fino,
las estrategias a seguir son distintas en las dos cromatografas.
En CG resulta esencial el control de la temperatura, siendo la
fase mvil un mero transporte mientras que en CL es crtico el
control de la composicin de la fase mvil as como su
polaridad, mostrndose la temperatura como una ventaja
insignificante cara a mantener constancia en la viscosidad,
solubilidad y reproducibilidad. La participacin de la fase mvil en
la separacin es una peculiaridad de la CL y es otra de las causas
que permite en este tipo de cromatografa utilizar columnas de
menor longitud.
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Cromatografa postgrado. JAP

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Cromatografa postgrado. JAP