TEMA 1A: ASPECTOS BSICOS DEL CULTIVO IN VITRO DE CLULAS Y TEJIDOS

VEGETALES
1. Plasticidad vegetal
2. Totipotencia
3. Diferenciacin y desdiferenciacin celular
4. Mtodos de propagacin invitro
4.1. Morfognesis indirec
ta
4.2. Embriones adventicios
4.3. Yemas axilares preexistentes
5. Asepsia
TEMA 1B. FACTORES QUE DETERMINAN EL CRECIMIENTO IN VITRO
1. Caractersticas del material vegetal
1.1. Genotipo
1.2. Edad de la planta, rgano, tejido
1.3. Tipo de explanto
1.4. Posicin del explanto
1.5. Estado fisiolgico y fitosanitario
1.6. Origen
1.7. Tamao del explanto
2. Factores nutricionales y hormonales
2.1. Agua
2.2. Azcares
2.3. Micronutrientes y macronutrientes
2.4. Reguladores del crecimiento
2.4.1. Auxinas
2.4.2. Citoquininas
2.4.3. Giberelinas
2.4.4. cido abscsico
2.4.5. Balance Auxinas/Citoquininas
2.5. Otros compuestos
2.6. Agar
2.7. Potencial osmtico y pH
3. Factores ambientales
3.1. Interaccin de factores
TEMA 1C: TRASPLANTE A CONDICIONES EXVITRO
1. Condiciones de cultivo invitro
1.1. Movimiento del agua en la planta
2. Causas del fracaso en el trasplante de las plantas obtenidas invitro
2.1. Factores que afectan a las relaciones hdricas de las plantas
2.2. Factores que afectan a la fotosntesis invitro.
2.2.1. Factores internos
2.2.2. Factores externos
3. Aclimatizacin previa al trasplante
3.1. Procesos de la aclimatizacin
TEMA 2A: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS PLANTAS. CULTIVO CELULAR
1

1. Introduccin
2. Iniciacin y establecimiento de una suspensin celular
3. Cultivo de clulas en suspensin
3.1. Sistemas estticos o cerrados
3.1.1. Dinmica del crecimiento en cultivos estticos
3.2. Sistemas dinmicos o abiertos
4. Cultivos a gran escala: Biorreactores
4.1. Factores a considerar cuando una suspensin celular se cultiva en
grandes volmenes
4.2. Componentes de un biorreactor
4.3. Medio de cultivo
5. Aplicaciones
TEMA 2B: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS PLANTAS
1. Introduccin/Historia
2. Regulacin de la produccin invitro de metabolitos secundarios
2.1. Factores biolgicos
2.1.1. Crecimiento
2.1.2. Diferenciacin
2.1.3. Compartimentacin
2.1.4. Variacin en la actividad biosinttica
2.2. Factores ambientales
3. Optimizacin de la produccin invitro de metabolitos secundarios
3.1. Seleccin clonal
3.2. Precursores
3.3. Elicitores
3.4. Cultivo de clulas inmovilizadas
4. Transformacin gentica
5. Biotransformacin
5.1. Obtencin de rendimientos industriales
6. Avances y perspectivas
TEMA 3A: CULTIVO DE PROTOPLASTOS E HIBRIDACIN SOMTICA
1. Introduccin
2. Aislamiento y purificacin
2.1. Material inicial
2.2. Mtodos de aislamiento
2.3. Purificacin
2.4. Comprobacin de la viabilidad
3. Cultivo y desarrollo
3.1. Medio de cultivo y condiciones fsicas
3.2. Cultivo de protoplastos
4. Mtodos de hibridacin somtica
4.1. Fusin qumica
4.2. Electrofusin
4.3. Factores que determinan la fusin
4.4. Productos de fusin
5. Seleccin tras la fusin
2

6. Limitaciones de la hibridacin somtica

TEMA 3B: PLANTAS GENTICAMENTE MODIFICADAS PARA LA OBTENCIN DE
COMPUESTOS DE INTERS FARMACUTICO, BIOSANITARIO O INDUSTRIAL O
CULTIVOS CON VENTAJAS AGRONMICAS Y NUTRICIONALES
1. Introduccin
2. Origen y evolucin de las plantas genticamente modificadas
3. Plantas biofactora
TEMA 3C: PROTENAS RECOMBINANTES
1. Eleccin de la especie hospedadora
2. Transformacin
2.1. Genes caracterizados
2.2. Promotores potentes
2.3 Marcadores
2.4. Construccin del vector de transferencia
2.4.1. Transferencia indirecta de genes
2.4.2. Transferencia directa de genes
2.4.3. Mtodos indirectos vs mtodos directos
2.5. Transformacin nuclear
2.6. Transformacin plastidial
2.6.1. Ventajas respecto de la transformacin nuclear
2.6.2. Inconvenientes de la transformacin de cloroplastos:
3. Seleccin y regeneracin de la planta
4. Purificacin
TEMA 3D: INGENIERA METABLICA
1. Introduccin
1.1. Estrategias que emplea la ingeniera metablica
1.2. Factores condicionantes
2. Manipulacin del metabolismo de carbohidratos
3. Manipulacin del metabolismo lipdico
4. Manipulacin del metabolismo secundario
5. Aspectos legales, ticos, sociales y de mercado

La biotecnologa, de forma general, es el empleo de clulas vivas para la

obtencin y mejora de productos tiles tales como alimentos y medicamentos.
La asignatura se divide en 3 grandes bloques:
1. Aspectos bsicos de cultivo invitro en plantas: factores que influyen,
aclimatizacin de esas plantas
2. Potencial bioqumico de las clulas vegetables que nos pueden interesar para
obtener metabolitos secundarios.
3. Transformacin gentica: transformando genticamente las plantas, podemos
hacer que sinteticen compuestos de inters industrial.

TEMA 1A: ASPECTOS BSICOS DEL CULTIVO

IN VITRO DE CLULAS Y TEJIDOS VEGETALES
1. Plasticidad vegetal
Existen importantes diferencias entre las clulas animales y vegetales que hacen
que a partir de una clula vegetal pueda surgir un individuo completo (esta es la
diferencia bsica). Esto ocurre siempre que cultivemos esa clula en un determinado
medio y con unos estmulos adecuados.
Las plantas son organismos inmviles, aguantan lo que les caiga: nieve, sequa,
viento. Al no poder moverse, no les queda ms remedio que adaptarse a cualquier
cambio que haya por medio.
Aqu es donde entra el concepto de plasticidad. La plasticidad fenotpica se
define como la capacidad que tienen las plantas de alterar su estructura, alterar su
metabolismo y su desarrollo para poder adaptarse a cualquier cambio que se produzca
en el medio.
Las plantas son seres con propiedades plsticas porque pueden alterar sus rutas
metablicas y su desarrollo en respuesta a estmulos.
Las clulas cultivadas invitro son enormemente plsticas: nos permiten
regenerar una planta a partir de una clula.

2. Totipotencia
Otro concepto importante relacionado con el tema de la plasticidad es la
totipotencia vegetal: es la capacidad que tiene una clula de crecer y multiplicarse
y diferenciarse dando lugar a un individuo concreto.
NO todas las clulas animales son totipotentes, en el caso de las plantas todas
las clulas son totipotentes, es decir, todas las clulas vegetales tienen la informacin
gentica necesaria para poder desarrollar un individuo concreto a partir de ellas
4

aunque no lo manifiesten.
Cmo regenerar o generar una planta a partir de una clula? Aislamos una
clula de una zanahoria (por ejemplo) que dar lugar a un embrin y producir, al
cabo de un tiempo, una nueva zanahoria (Fig. 1). Para que esa clula se transforme en
una planta entera es necesaria la presencia de estmulos (por lo general son
compuestos: cules deben ser y a qu concentracin tienen que estar)

Fig. 1: Organognesis a partir de callo de zanahoria

3. Diferenciacin y desdiferenciacin celular

Cmo una clula da lugar a una planta entera? Principalmente ocurren dos
procesos: para que una clula se transforme en un individuo tiene que dividirse
(multiplicacin/proliferacin celular) y en segundo lugar tiene que diferenciarse
La diferenciacin celular es un proceso por el cual una clula adquiere unas
propiedades estructurales, metablicas, funcionales, distintas a las de la clula madre
que la origin. El proceso de diferenciacin es un proceso reversible en el caso de las
plantas (en el caso de los animales es irreversible ya que una neurona no puede dejar
de ser neurona).
Sin embargo, la planta puede sufrir el efecto contrario, es decir,
desdiferenciacin: es un proceso de rejuvenecimiento en el que la planta adquiere
capacidad de multiplicacin y comienza a hacerlo.
Cuando un tejido se rejuvenece y se multiplica, se obtiene como resultado un
callo (es una masa amorfa o un conjunto de clulas desdiferenciadas). Una vez que
tenemos el callo se puede inducir una diferenciacin (una rediferenciacin), que puede
5

ir dirigida a la formacin de rganos (organognesis) o a la formacin de un embrin

(embriognesis).
Si aislamos la clula diferenciada y la colocamos en un medio adecuado,
empezar a dividirse y rejuvenecerse (se dice que vuelve al estado meristemtico) y
el nuevo conjunto de clulas formar el callo. A partir de aqu puede iniciarse una
rediferenciacin; la planta se regenera, volvemos a aislar una clula y se cierra el
ciclo.

4. Mtodos de propagacin invitro

Los principales mtodos de micropropagacin que existen son 3:
1. Un primer grupo consiste en la propagacin a partir de yemas axilares
o apicales (situadas en la base de las hojas).
2. Otro gran grupo consiste en la propagacin a travs de la formacin de
tallos u rganos adventicios (un rgano adventicio es aquel que se
desarrolla en un lugar que no es el habitual para ese rgano en concreto). La
formacin de tallos u rganos adventicios se divide en dos: va directa (tambin
llamada de embriones adventicios; sin paso previo por callo) o va indirecta
(implica proceso de diferenciacin a callo y posterior rediferenciacin).
3. Propagacin mediante morfognesis indirecta (es la va indirecta de la
formacin de tallos u rganos adventicios, pero en este caso, implica un
proceso de diferenciacin a callo): a partir de un fragmento de la planta (se
denomina explanto) se induce una desdiferenciacin de ese tejido de modo que
se forma un callo (tejido desdiferenciado) a partir de este callo se induce una
rediferenciacin, o bien hacia la formacin de tallos y races (formacin de
rganos u organognesis indirecta), o bien hacia la formacin de embriones
(embriognesis somtica).
Existen dos posibles vas implicadas en la diferenciacin de novo de brotes (vas
morfognicas), stas son: organognesis y embriognesis.
En la organognesis se parte de un grupo de clulas del explanto inicial
que se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un
rgano vegetal.
En la embriognesis se parte de una nica clula que se asla y
constituye el punto de partida para la formacin de un embrin somtico. El
resultado es una planta completa.

4.1. Morfognesis indirecta

La micropropagacin vegetal mediante morfognesis indirecta presenta una

desventaja y es que existe una probabilidad alta de que se produzca variacin
gentica (suelen aparecer mutaciones que no interesan). Por tanto el producto final
puede no ser igual al inicial. En los mtodos indirectos no se conserva la fidelidad
genotpica.
La morfognesis indirecta, como hemos dicho, puede estar encaminada a la
6

organognesis o a la embriognesis.
Procedimiento para la organognesis: sobre la superficie celular del callo
encontramos clulas meristemticas superficiales, a partir de stas clulas se
desarrollan las yemas y tallos. En la organognesis indirecta, en funcin de lo que se
desarrolle, hablamos de: caulognesis o formacin de tallo, y rizognesis o formacin
de races.
Ej: A partir de mdula de tabaco, la sembramos y al cabo de un tiempo tenemos
un callo que producir un tallo (caulognesis)

Caulognesis en tabaco
La embriognesis somtica es la otra variacin morfolgica, adems de la
organognica. En las plantas no se forman de manera natural embriones, pero
podemos obtener embriones a partir de una clula somtica (esto es lo que se conoce
como embriognesis somtica).
La nica diferencia entre la embriognesis cigtica y la somtica es el choque
inductor (de esa embriognesis): para los animales el choque es la fusin de gametos
y para las plantas la presencia de auxinas en el medio de cultivo, que har que un
callo se convierta en un embrin somtico.
Por lo dems son idnticas y las fases de desarrollo son iguales (Fig 2): a partir
de una clula, sta se multiplica y se forma un agregado celular que dar lugar a un
embrin globular, ste a su vez sufre un proceso de polarizacin (va madurando y se
distinguen dos polos: pice radicular y caulinar - se dice que est en fase de corazn
por la forma que tiene). Posteriormente el embrin sigue desarrollndose y la parte
que est debajo de los cotiledones se alarga (fase de torpedo: aqu se empiezan a
diferenciar los diferentes tejidos: como los vasculares, que darn lugar al xilema y
floema). Finalmente se nos formar una planta.

Fig. 2: Fases de desarrollo de embriognesis

La presencia de auxinas en el medio induce la formacin de masas
proembrinicas (son unos agregados celulares en cuyo interior se han empezado a
desarrollar los embriones) en el tallo.
Estas masas presentan 2 tipos de clulas: unas vacuoladas (grandes) en el
exterior y otras en el interior ms pequeas (con citoplasma ms denso) que darn
lugar a los embriones. Se encuentran rodeadas (las masas) de una capa de cutina.
Las masas proembrinicas se degradan porque en el medio de cultivo hay
auxinas que son inductoras del etileno (hormona gaseosa), que producir enzimas
(cutinasas, pectinasas, celulasas) que van a degradar las masas proembrinicas (la
degradacin y regeneracin constituyen el ciclo de las auxinas).
Hay un momento en el cual la auxina ha producido el choque inductor y
comienza el crecimiento, en este momento hay que retirarlas para que no destruyan
las masas. Al eliminar las auxinas del medio de cultivo conseguimos que los
embriones puedan seguir su desarrollo completo.

4.2. Embriones adventicios

Segunda ruta de micropropagacin a travs de embriones adventicios: Es

normal que un embrin salga de un tallo? NO, por eso se llaman embriones
adventicios: surgen de rganos o tejidos (y esto no es normal).
No necesariamente necesitamos pasar por una fase de callo (podemos coger un
explanto, cultivarlo y que se desarrollen tallos que se enraizarn; o bien que a partir
del explanto se desarrolle un embrin).
La ventaja es que las probabilidades de mutaciones no son altas (se conserva
algo ms la fidelidad genotpica).

4.3. Yemas axilares preexistentes

El tercer gran bloque de mtodo de micropropagacin invitro es la propagacin a

partir de yemas axilares: aqu ya no cogemos un explanto cualquiera (hay que coger
un explanto que contenga una yema).
Hay 3 modalidades posibles: segmentos nodales (1), pices o yemas (2) y
meristemos (3).
Segmentos nodales (1): a partir de un tallito de la planta podemos
obtener una yema que se siembra en el agar y va a desarrollarse para dar lugar
a una parte area y una raz que posteriormente dar lugar a una planta entera.
No necesariamente tenemos que sembrar el tallo entero, podemos sembrar la
yema. No se debe sembrar toda la yema sino una parte llamada tomo
meristemtico (que es lo que est entre las 2 pequeas hojas de la yema). La
principal ventaja es que las plantas obtenidas son clones idnticos de la
planta madre (no hay apenas variacin gentica).
El mtodo anterior es adecuado para los que tienen entrenudos
separados. Para plantas con entrenudos juntos es mejor el cultivo de pices o
yemas (2).
El cultivo invitro de meristemos (3) comprende el aislamiento de los
mismos y se introducen en un medio de cultivo, con nutrientes, en el cual
crecern.

5. Asepsia
La asepsia es uno de las aspectos ms importantes del cultivo invitro. La
contaminacin que nos podemos encontrar en cultivo invitro se debe,
fundamentalmente, a hongos y bacterias. Estos seres son omnipresentes. Si una
bacteria cae sobre un tubo o cultivo, se encontrara en condiciones ideales para crecer,
va a proliferar y va a acabar con nuestra planta (no permiten que el explanto se
desarrolle correctamente).
Por eso es muy importante mantener condiciones de asepsia: hay que
esterilizar los instrumentos y todo el material con el que trabajamos: esterilizar el
medio de cultivo, esterilizar el rea de trabajo (cmara de flujo laminar) y finalmente
desinfectar el material antes de empezar a trabajar con l.
Se suele emplear hipoclorito sdico como agente desinfectante: la
concentracin y tiempo de desinfeccin depende del explanto, del tejido (si es
sensible o no) y tambin depende de su origen (los rganos subterrneos tienen
mayor contenido microbiano y hay que esmerarse ms en desinfectar)

TEMA 1B. FACTORES QUE DETERMINAN EL

CRECIMIENTO IN VITRO
1. Caractersticas del material vegetal
1.1. Genotipo
Hace referencia a qu especie se est cultivando in vitro. No es lo mismo
cultivar una patata que una zanahoria. Las especies dicotiledneas tienen una
capacidad regenerativa mucho ms alta que las monocotiledneas (cebada, maz..).
Las conferas tienen una muy baja capacidad regenerativa, salvo que se empleen
explantos muy jvenes. Generalmente, una especie que tiene una buena capacidad
morfognica ex-vitro tambin la tiene in-vitro (hiedras, geranios..), pero hay
excepciones como la Calanchoe farinacea, que en ex-vitro tiene poca capacidad
regenerativa pero in-vitro esta capacidad es mucho mayor (se debe a su gran
capacidad de absorcin de sustancias del medio).

1.2. Edad de la planta, rgano, tejido

Los individuos jvenes tienen habitualmente una mayor capacidad morfognica.

Es un aspecto muy importante cuando se trabaja con especies arbustivas. Hay que
tener en cuenta tambin que si un tejido es viejo y se cultiva in-vitro, ste no se
vuelve joven sino que mantiene las caractersticas de tejido adulto. Siempre es mejor
emplear tejidos jvenes (embrionarios, meristemticos..), aunque existen subcultivos
que pueden hacer que los tejidos adultos rejuvenezcan.

1.3. Tipo de explanto

Se denomina explanto a aquel fragmento de la planta que se asla y se cultiva
in-vitro. El tipo de explanto va a condicionar su desarrollo en estos tipos de cultivo, y
adems su eleccin se realizar en funcin del objetivo de dicho cultivo. Tipos de
explanto:
Semillas.
Embriones.
Microesporas: Granos de polen, son haploides y se emplean para
programas de mejora gentica. A partir de ellos crecen plantas haploides.
Ovarios.
pices de tallo: Para propagar una determinada planta y obtener clones.
Meristemos: Para propagar especies libres de virus, ya que los
meristemos son una parte interna protegida de las yemas de la planta.
pices de raz.
Callo.
Clulas: Para obtener compuestos de inters, metabolitos secundarios.
Protoplastos: Son las clulas vegetales sin pared celular. Se emplean para
hacer transformaciones genticas.
10

1.4. Posicin del explanto

Hace referencia a dnde est situado dentro de la planta. Existe un fenmeno

llamado topfisis, que es el fenmeno por el cual la posicin de un explanto dentro
de la planta condiciona su desarrollo in-vitro. Por ejemplo: si se toma un explanto
desde la base de la planta, ser mucho ms fcil formar una raz que una parte area.

1.5. Estado fisiolgico y fitosanitario

Con estado fisiolgico se hace referencia a la fase de desarrollo de la planta
(vegetativa, reproductiva...). Si se toma un explanto en la fase de desarrollo
vegetativo, la capacidad de desarrollo del explanto es mayor in-vitro que la de un
explanto en fase reproductiva.

1.6. Origen

Hace referencia a si ha crecido en un invernadero o en el campo. Se ha visto

que las plantas de invernadero tienen una mayor capacidad regenerativa que las que
vienen del campo. Tambin afecta la historia de la planta, es decir, si anteriormente
sufri estrs hdrico o nutricional, etc.

1.7. Tamao del explanto

Cuanto ms pequeo sea el explanto, ms difcil ser su desarrollo. Las reservas
endgenas que tiene ese explanto (energticas, hormonales) van a facilitar su cultivo.
Por eso, explantos de rganos de reserva son mucho ms fciles de cultivar que otros
tipos. Adems, cuanto ms pequeo es el explanto, se desecar con ms facilidad; y
tambin hay que tener en cuenta las superficies de corte, que son muy importantes
porque son zonas a travs de las cuales el explanto va a absorber las sustancias del
medio, pero por otro lado por esas mismas superficies se pueden producir sustancias
que no interesan (como el etileno) y que pueden pasar al medio, afectando al cultivo.

2. Factores nutricionales y hormonales

2.1. Agua

El agua es la base del medio de cultivo, supone el 95% de la composicin del

mismo. Tiene que ser agua purificada, que haya sido tratada para eliminar
contaminantes con mtodos como la destilacin o la smosis inversa, entre otros.
Sobre esta base se van aadiendo los otros componentes del medio de cultivo.

2.2. Azcares
Los hidratos de carbono son esenciales porque las clulas no pueden realizar la
fotosntesis mientras estn siendo cultivadas in-vitro, son hetertrofas en ese estado
porque:
- Puede que se est cultivando un explanto que no es fotosintticamente activo
11

(grano de polen, raz). Por tanto requiere un aporte exgeno de glcidos.

- Aunque sea un segmento fotosintticamente activo (hoja), en las condiciones
in-vitro la fotosntesis est muy limitada: el CO 2 se agota rpidamente, la intensidad de
luz es muy baja, etc.
Los tipos de azcares que se aportan al medio, as como su concentracin,
dependen del tipo de explanto. El azcar ms empleado es la sacarosa porque es el
que usan las plantas normalmente. La concentracin en el medio de cultivo suele ser
al 5% m/v, y hay que tener en cuenta que un explanto jven va a necesitar ms
cantidad de azcares que uno viejo, etc.
Con la sacarosa hay que tener cuidado porque puede degradarse en el medio
de cultivo en dos puntos:
- En la esterilizacin del medio de cultivo, ya que se autoclava y en esas
condiciones puede tener lugar el desdoblamiento o la caramelizacin de la sacarosa.
- El explanto puede segregar enzimas (invertasas) que pueden degradar la
sacarosa.

2.3. Micronutrientes y macronutrientes

En el medio de cultivo hay que aportar estos nutrientes en forma de sales

solubles. Una misma sal puede aportar varios elementos (Nitrato potsico aporta
nitrgeno y potasio), o un mismo elemento puede ser aportado en forma de diferentes
sales (Nitrgeno en forma de nitrato o sales de amonio). Las sales se preparan en
forma de soluciones stock, es decir, soluciones muy concentradas de las cuales se
emplean diluciones segn se necesite.
Existen muchas recetas que pueden emplearse y funcionar bien para la
mayora de cultivos, aunque la ms comn es la receta Murashige Skoog porque es la
que mejor funciona para todas las especies aunque se puede modificar dependiendo
de la sensibilidad de cada especie vegetal respecto de un nutriente. Es muy
importante tambin cuidar la absorcin de nitrgeno, que comnmente se hace en
forma de nitrato, pero existen especies que lo absorben mejor en forma de sal de
amonio (ms raro).

2.4. Reguladores del crecimiento

Los reguladores son compuestos clave que van a permitir el desarrollo del
cultivo hacia una ruta morfognica u otra.
Las hormonas (citohormonas) son compuestos orgnicos que se encuentran
presentes de forma natural en las plantas y que regulan el crecimiento y el desarrollo
de sus rganos. Habitualmente se encuentran en una concentracin muy baja en la
planta, y normalmente ejercen su funcin en un lugar distinto al de su sntesis.
Existen compuestos sintticos con las mismas propiedades que las hormonas
pero que adems tienen otras ventajas: son mucho ms estables (no se degradan con
12

facilidad) y ms activos (se requiere menos concentracin), y por ello son mucho ms
usados en los cultivos in-vitro que las hormonas naturales.
El conjunto de hormonas y estos compuestos sintticos anlogos a ellas se
denominan reguladores de crecimiento, y los dos grupos ms empleados son las
auxinas y las citoquininas.
Por otro lado, ya en desuso, se empleaban mezclas indefinidas de sustancias
(zumo de pomelo, leche de coco..) para aadirlas al medio de cultivo porque vean que
funcionaban bien. Son compuestos de composicin desconocida y muy variable, y por
eso su uso no es prctico.
2.4.1. Auxinas
El cido 3-Indolactico (AIA) es la auxina natural que se encuentra en las
plantas (generalmente en el tallo pero ejerce su efecto a nivel de la raz), mientras
que en el cultivo in-vitro se suelen emplear las sintticas (IBA, NAA). El AIA es muy
sensible a las peroxidasas, al pH bajo, etc. sin embargo las sintticas son mucho
menos sensibles y adems son ms eficaces a menor concentracin. Habitualmente
se suelen preparar en soluciones stock. Son insolubles en agua, por lo que es
necesario disolverlas en etanol o agua bsica (con NaOH).
Funciones:
- Inducen el crecimiento de la raz.
- Inducen la dormancia apical. La dormancia es el perodo del ciclo biolgico en el
que las funciones de crecimiento, desarrollo y actividad fsica cesan temporalmente.
- Inducen la divisin y la elongacin celular.

2.4.2. Citoquininas
La Zeatina es la citoquinina natural que se sintetiza en la raz (pero ejerce su
funcin a nivel del tallo). El resto son sintticas y se emplean muchsimo ms (BAP o 6BenzilAminoPurina). Tambin se preparan en soluciones stock y son insolubles en
agua, por lo que hay que disolverlos en agua cida (HCl) a diferencia de las auxinas.
Funciones:
- Inducen la formacin de los tallos adventicios.
- Inhiben la dormancia apical.
- Inducen la divisin celular (especialmente en combinacin con auxinas)

2.4.3. Giberelinas
No son muy habituales en los medios de cultivo. Se emplean en cultivos
especficos.
Funciones:
- Elongacin del tallo.
- Rompen la dormancia de embriones y semillas.
13

2.4.4. cido abscsico

Su diminutivo es ABA, suele sintetizarse por el explanto, y si se sintetiza en
gran cantidad, junto al etileno, llega a ser perjudicial para el cultivo.

2.4.5. Balance Auxinas/Citoquininas

Gracias a la plasticidad fenotpica y la totipotencia, manipulando el balance

hormonal entre auxinas y citoquininas se puede modular el desarrollo del explanto.
Dependiendo de la proporcin de estas hormonas, se inducir la formacin de un
determinado tejido u otro.

2.5. Otros compuestos

Diversos aminocidos se han empleado como fuente orgnica de nitrgeno. El

nitrgeno se aporta al medio a partir de sales.
Vitaminas: suele ser habitual aadir inositol (mioinositol, constituyente de la
vitamina B), cido flico (vitamina B9), la tiamina (B1), el cido ascrbico (C, se aade
por su capacidad antioxidante). Los explantos suelen tener capacidad para sintetizar
vitaminas y por eso se aaden en cantidades muy bajas.
A veces suele aadirse carbn activo: el carbn activo es un compuesto que
tiene una enorme cantidad de poros capaces de absorber gases, lquidos e incluso
sustancias slidas. Es interesante su adicin porque a veces cuando sembramos un
explanto, cuando envejece o si tiene falta de nutrientes, suele excretar compuestos
fenlicos al medio. Estos compuestos cuando se oxidan (al estar en contacto con el
oxgeno) adquieren un color marrn (reaccin de pardeamiento). El carbn activo
retira estos compuestos fenlicos que son txicos para la planta.

2.6. Agar
Los medios de cultivo pueden ser lquidos, semislidos o slidos. El agar es un
ejemplo de un medio de cultivo slido.
14

Necesitamos aadir al medio de cultivo un agente gelificante: uno muy comn es

el agar (es un polisacrido de origen natural, en concreto lo sintetizan las algas) y
tiene como ventajas que es un buen agente gelificante porque: no reacciona con el
medio de cultivo (no reacciona con hormonas, vitaminas ni sales minerales), es muy
estable (no se degrada fcilmente a altas temperaturas: ni cuando se esteriliza, ni
por enzimas) y no es citotxico (ni para las clulas ni para los tejidos).
El agar es insoluble a temperatura ambiente. Para disolverlo es necesario
calentarlo: se disuelve a vapor fluente (el autoclave se deja abierto y el vapor que sale
es el que lo calienta). Una vez caliente se deja enfriar y forma una red tridimensional
capaz de retener el agua, las sales minerales y todos los componentes del medio de
cultivo; los retiene pero adems los pone a disposicin de la planta.
La concentracin de agar es importante ajustarla porque si ponemos poco agar,
el medio no nos va a solidificar. Hay que poner la cantidad mnima pero sin pasarse
porque si ponemos altas concentraciones de agar el medio queda extremadamente
slido. El contacto entre el medio y el explanto va a ser ms difcil (porque no penetra)
y adems nos va a retener con demasiada fuerza el agua y el explanto va a sufrir
deficiencias.
Cada proceso invitro tiene sus propias necesidades especficas (No existe un
medio satisfactorio/universal para todo tejido o proceso)
Los requerimientos nutricionales son funcin de la especie vegetal (si es
sensible a las sales no podremos poner sales en concentracin elevada; hay especies
que para un mismo proceso requieren ms concentracin de hormonas que otras), el
tipo de explanto (si es fotosintticamente activo o no), la edad de la planta, el
rgano a partir del cual obtenemos el explanto (el jven requiere ms sacarosa que
los adultos al tener mayor actividad metablica y suelen tener un menor
requerimiento hormonal para desarrollarse), y el tamao del explanto (dependiendo
de si es grande o pequeo tendr mayor o menor reserva).

2.7. Potencial osmtico y pH

Lo habitual es esterilizar el medio de cultivo por los procedimientos normales,

pero existen otros mtodos como la filtracin: ideal cuando el medio de cultivo es
sensible a la alta temperatura.
Dentro de los factores nutricionales y hormonales, estudiamos dos factores que
realmente son ambientales, pero como estn tan relacionadas con el medio de cultivo
lo explicamos en este apartado:
El pH: no se conoce demasiado el efecto del pH sobre el crecimiento de
la planta. Solo se sabe que hay un rango ptimo entre 5 y 6.5.
El pH cido (<4) hace que el agar no solidifique; inhiben la
absorcin de amonio (NH4+) y las citoquininas y las auxinas se degradan a
pH bajo. El proceso de autoclavado reduce un poco el pH (cuando
estemos ajustando el pH hay que tener en cuenta esto y habr que
ajustar el pH por encima)
A pH alto la dureza del agar aumenta considerablemente y
adems precipitan las sales minerales del medio de cultivo (si precipitan
dejan de estar disponibles porque el tejido no puede absorberlas)
El potencial osmtico. El potencial hdrico es la fuerza con la que el
suelo retiene agua. El potencial osmtico es un componente del potencial
15

hdrico que hace referencia a la fuerza con la que los solutos, presentes en un
medio de cultivo, retienen el agua. El agar contribuye al potencial osmtico
hacindolo muy negativo (0 es poca retencin // muy negativo es indicatorio de
mucha retencin). Es inevitable que el potencial osmtico sea negativo en un
medio de cultivo porque hay muchos nutrientes pero hay que evitar, en la
medida de lo posible, que no se acerque a 0 . La idea es que si el potencial
osmtico es muy negativo, el medio retendr el agua con tanta fuerza que la
planta no va a poder absorberla, por ello es bueno que el potencial osmtico
sea prximo a 0, para que el agua pueda ser absorbida por la planta y no quede
retenida en el medio.

3. Factores ambientales
Los factores ambientales en el interior del recipiente de cultivo son funcin del
exterior. La radiacin en el interior depende de la que haya fuera; lo mismo pasa con
la temperatura.
Por tanto es importante controlar estos factores ambientales ya que afectarn
directamente al desarrollo del cultivo.
Los factores ambientales invitro que tienen efecto en el crecimiento, desarrollo y
morfognesis se pueden dividir en 2:
1.
Factores ambientales de la parte area: luz, temperatura, oxgeno,
etileno, difusin de aire (movimiento), presin.
2.
Factores ambientales de las races: potencial hdrico, temperatura,
difusin de gas en el lquido, compactacin del medio, componentes qumicos, pH,
oxgeno disuelto.
Temperatura: est en torno a los 22C. Hay que tener en cuenta que son
22 en el exterior del tubo. La temperatura en el interior ser 2 o 3 grados ms
que la del exterior (25C aprox). Puede mantenerse constante a lo largo del da
o con termoperiodos: temperaturas diferentes por el da que por la noche (esto
ocurre en la naturaleza). El termoperiodo es crtico en algunas especies: si no
hay termoperiodo no forman races (por ejemplo).
Luz: hay tres aspectos a tener en cuenta. La intensidad (irradiancia), la
calidad (composicin espectral) y el fotoperiodo.
No se sabe demasiado del efecto fotoperiodo en desarrollo
invitro pero se suele mimetizar lo que ocurre en la naturaleza (14h de
luz). Hay procesos que requieren oscuridad total (las primeras fases de la
embriognesis)
La intensidad luminosa o irradiancia es muy baja
habitualmente. No se puede cultivar invitro a la misma intensidad
luminosa que hay en el ambiente exterior por dos motivos: las plantas se
achicharran de calor (adems de que es imposible alcanzar la misma
intensidad lumnica que el sol) y se daa el aparato fotosinttico (se
inhibe la fotosntesis). Si el explanto es fotosintticamente no activo, le
da igual no tener luz (no va a necesitar la fotosntesis), pero si es
fotosintticamente activo, como la patata, nos podemos permitir
aumentar un poco la intensidad luminosa para que realice correctamente
16

la fotosntesis
La composicin espectral o la calidad de la luz: afecta a dos
procesos. Afecta a la fotosntesis y a la morfognesis o desarrollo de
rganos. La radiacin ultravioleta tiene efecto fotodestructivo y aumenta
el calor. La radiacin fotosintticamente activa (380-710: rango de
longitudes que la planta emplea para realizar la fotosntesis // 400-460:
azul // 620-680: roja): tiene efecto significativo a nivel de la
morfognesis. El infrarrojo (750-4000) tiene efecto morfognico y
aumenta la temperatura. La longitud de onda que llega al tubo no es
idntica a la de origen (dependiendo de los materiales que tenga que
atravesar, se nos modificar un poco el espectro de luz)
Humedad relativa: si es muy alta no se van a cerrar los estomas. En
invitro es 100% (saturante). En la cmara de cultivo no se suele controlar la
humedad. La humedad que haya en la cmara va a modificar la humedad de los
tubos, pero hay que evitar que no sea excesiva en la cmara porque acarrea
problemas de contaminacin.
El oxgeno: depende de la concentracin exterior (exvitro), de la
velocidad de difusin al tubo (recipiente de cultivo), y de cmo se bifurca en el
agar y en los tejidos. La concentracin en el exterior es elevada y va
disminuyendo a medida que se adentra en el tejido. Para comprobar la
composicin gaseosa se utilizan unos aparatos que agitan la atmsfera para
que el oxgeno se renueve.
El CO2: aumenta por la noche. Cuando realiza la fotosntesis (por el da)
no hay apenas niveles de CO 2 (se utiliza para la fotosntesis). Para que un
cultivo sea auttrofo se requiere un mnimo de 65 micromoles de CO 2. Cuando
amanece, el CO2 acumulado se agota rpidamente porque comienza la
fotosntesis y al no quedar CO2, se para. La planta tendr que esperar hasta la
noche para acumular CO2 y tendr que esperar hasta el siguiente da para
hacer la fotosntesis.
Etileno: los explantos sintetizan etileno de forma natural. El
inconveniente es que su acumulacin es daina para el cultivo.

3.1. Interaccin de factores

La expresin gnica puede verse afectada por factores fsicos y
fisicoqumicos (concentracin de sales, etc)
El pH y los nutrientes. A pH cidos, se inhibe la absorcin (porque se
solidifica el agar). Si el pH es alto, precipitan los nutrientes.
Los reguladores de crecimiento y la temperatura. El desarrollo del
explanto se da a expensas de que los reguladores estn en el medio de cultivo
y a expensas de las hormonas que sintetice. La temperatura aumenta las
sntesis de hormonas.
La luz y el AIA. El AIA es sensible a la luz.
Azcar, luz y CO2: Si empleamos intensidad luminosa suficiente y en el
interior del recipiente invitro tenemos concentraciones de CO 2 aceptables, no
ser necesario aportar tanta sacarosa (cultivo auttrofo). Si falla uno de los dos:
1. Luz baja (pero suficiente), pero muy poco CO 2, el cultivo ser
mixtrofo y necesitaremos aportar azcares.
2. Si no hay apenas luz, pero s CO 2, el cultivo ser mixtrofo y
17

necesitamos aumentar el nivel de azcares.

18

TEMA 1C: TRASPLANTE A CONDICIONES

EXVITRO
Los mtodos de micropropagacin tienen que hacer reto a la baja supervivencia
que tienen las plantas cultivadas invitro. Son muy eficientes (podemos obtener
masivamente una determinada planta) pero tiene como inconveniente la baja
supervivencia al traspasarse a un ambiente exvitro.

1. Condiciones de cultivo invitro

La planta invitro se encuentra en un determinado ambiente: el intercambio
gaseoso es mnimo; la humedad relativa es saturada (100%); los gases se acumulan:
el etileno se acumula y el CO 2 es escaso; el potencial osmtico es muy negativo en el
medio de cultivo debido a la cantidad de solutos que contiene; la luz y la temperatura
son dependientes de lo que queramos.

1.1. Movimiento del agua en la planta

El potencial hdrico refleja la fuerza con la que el suelo retiene agua. Tiene 3
componentes: potencial osmtico, de presin y matricial. La suma de estos tres
componentes da lugar a un valor que es siempre negativo (va de 0 a menos infinito).
Cuanto ms negativo es, mayor es la fuerza con la que retiene agua.
El agua siempre se mueve siempre hacia potenciales ms negativos (de
potenciales hdricos cercanos a 0 a otros ms negativos). Esto es lgico ya que si el
potencial hdrico es muy negativo, y por tanto el agua est muy retenida, no ir hacia
sitios donde est menos retenida (precisamente porque est retenida)
El movimiento de agua en la planta siempre ser suelo-planta-atmsfera puesto
que el orden de potencial hdrico es: suelo>raz>tallo>hojas>atmsfera (se cuantifica
siempre el valor absoluto del potencial, es decir, segn ese orden de potenciales, la
atmsfera tiene el potencial hdrico ms bajo, pero no quiere decir que sea cercano a
0 sino todo lo contrario, que es muy negativo. Por el contrario el suelo tendr el
potencial hdrico ms cercano a 0)
Cuanto mayor sea la diferencia entre el potencial hdrico entre el suelo y la
atmsfera, mucho ms fcil se mover el agua a travs de todo el sistema.
A travs de los estomas, el agua sale a la atmsfera. Este proceso se llama
transpiracin. Es necesario que los estomas estn abiertos.
En un ambiente exvitro la diferencia de potencial hdrico entre el aire y el suelo
(es decir, la diferencia entre el potencial hdrico del aire menos el potencial hdrico del
suelo) es de casi 100 megaPascales.
En un ambiente invitro, el potencial hdrico del medio de cultivo no es 0: es 0.4
megaPascales. Hay -1.4 MPa en la parte area (invitro) y -1 MPa en el medio de
cultivo, por tanto: 1.41=0.4 MPa . Como el gradiente de potencial es muchsimo
ms pequeo que en exvitro, hay muy poca transpiracin y hay dificultad para
absorber nutrientes a travs de las races.

Podemos concluir que cuanto mayor es la humedad relativa, menor es la

19

transpiracin.
A menor CO2, menor actividad fotosinttica.
A menor intensidad de luz, menor actividad fotosinttica.
La presencia de sacarosa hace que la fotosntesis se vea inhibida.
El potencial osmtico es negativo e inhibe la absorcin de agua y
nutrientes (esta dificultad de absorcin tambin viene favorecida por un bajo
tirn transpiratorio). El tirn transpiratorio se traduce en la velocidad con la
que circula el agua a travs del sistema sueloplantaatmsfera. Cuanto
mayor sea el tirn respiratorio, es decir, cuanto mayor sea la diferencia de
potencial hdrico, tanto mayor ser la velocidad con la que circule el agua.

2. Causas del fracaso en el trasplante de las plantas obtenidas

invitro
Aspectos morfolgicos y fisiolgicos que se ven afectados:

2.1. Factores que afectan a las relaciones hdricas de las plantas

Cuando traspasamos una planta invitro a un ambiente exvitro, lo primero que le

ocurre es que se deshidrata. Esta rpida deshidratacin se debe a la apertura de
estomas (ms que a la apertura es que los estomas no se cierran)
Estructura del estoma: son poros que se encuentran en el envs de las hojas. El
poro u ostiolo es por donde entra el agua. Presenta 2 clulas oclusivas en forma de
rin. Rodeando a estas clulas oclusivas puede haber clulas acompaadas (sin
importancia). Un estoma se abre o se cierra porque las clulas oclusivas cambian su
turgencia: hay un paso de iones al interior de la clula oclusiva y con el paso de iones,
tambin hay un paso de agua (debido a la diferencia de potencial osmtico que se
genera) y se abren. Cuando el estoma se cierra lo que ocurre es que los iones salen y
el agua tiende a salir por diferencia de potencial osmtico.
Baja funcionalidad estomtica: las plantas invitro tienen baja funcionalidad
estomtica. No se cierran porque no responde ante estmulos externos ni internos
para que los estomas se cierren, por tanto, estn permanentemente abiertos: se
traduce en una salida masiva de agua.
Morfolgicamente el estoma invitro y exvitro son diferentes:
Invitro: Son mas redondeados, prominentes y grandes (a diferencia del exvitro
que es elptico y pequeo). No acumulan potasio y cloro que hace que aumente la
turgencia de la clula (las funciones inicas estn alteradas). El sistema de
microfibrillas (tiene que estar organizado para una buena apertura del ostiolo) no est
bien organizado.
Adems de los estomas: las ceras epicuticulares son diferentes. Encima de la
epidermis existe una capa de cera llamada cera epicuticular. La planta no slo pierde
agua a travs de los estomas (es por donde ms transpira pero no es el nico mtodo
de transpiracin), tambin puede perder agua por toda la superficie de la epidermis.
Para evitar esto, se cubre con una capa de cera. Esta capa de cera epicuticular es
prcticamente inexistente invitro mientras que en exvitro si que existe y cumple su
funcin de evitar la salida del agua.
20

Tambin hay cambios en la composicin de las ceras: las invitro tienen una
enorme proporcin de lpidos polares en relacin a una exvitro donde la proporcin de
grupos polares es menor. Esto indica que los lpidos invitro son menos hidrfobos y por
tanto ms permeables al agua.

2.2. Factores que afectan a la fotosntesis invitro

2.2.1. Factores internos
Caractersticas del material vegetal. El material vegetal afecta a la
fotosntesis invitro. Hay genotipos que sintetizan ms que otros y el grado de
diferenciacin va a afectar a la capacidad de realizar la fotosntesis. Si el material es
muy desdiferenciado (callo) tendr un aparato fotosinttico poco estructurado (no
estar bien formado y por ello su capacidad fotosinttica va a ser baja).
La clorofila tambin influye: los niveles de clorofila de una planta invitro suelen
ser bastante parecidos a una exvitro, pero cuando la transferimos a condiciones
exvitro, sus pigmentos son ms sensibles a la intensidad lumnica natural (sol) y se
degradan con facilidad.
Modificaciones anatmicas: morfolgicamente tambin son diferentes. La
estructura de una hoja en corte transversal de una exvitro presenta: cutcula,
epidermis, parnquima o mesfilo foliar (es lo mismo), parnquima en empalizada,
parnquima esponjoso, epidermis y cutcula. En la planta invitro se observan
diferencias: no tiene parnquima en empalizada (slo tiene el esponjoso), las clulas
epidrmicas son ms irregulares, el mesfilo esponjoso tiene menor densidad celular
(hay mucho ms espacio intercelular). Esto afecta a la fotosntesis de la siguiente
forma: los espacios intercelulares disminuye la disponibilidad de CO 2. La fotosntesis se
desarrolla en el mesfilo, si est disminuido (el mesfilo) la fotosntesis tambin lo
estar.
A nivel celular tambin existen diferencias: invitro vemos grandes vacuolas y
muchos espacios intercelulares, la membrana interna del cloroplasto no est ordenada
y no tiene agrupamientos granales.
Rubisco: es la enzima que cataliza la fijacin de CO 2 en una primera molcula de
6 carbonos. Est demostrado que en plantas invitro, la concentracin de rubisco es
menor a la concentracin de rubisco de plantas exvitro. Adems tienen la rubisco
menos activa (su estado de activacin es menor). Estas plantas con menos rubisco y
poco activa darn lugar a una baja actividad fotosinttica. Les falta sustrato (por bajo
CO2 durante el da) y las estamos haciendo crecer con sacarosa (la presencia de
sacarosa en el medio se ha visto que produce una retroalimentacin del ciclo de krebs;
les damos el producto del ciclo de calvin, que se traduce en una disminucin en la
fotosntesis).
2.2.2. Factores externos
El primero de los factores invitro es la luz (intensidad luminosa): se saturan a
muy baja intensidad luminosa. La fotosntesis neta ex-vitro: conforme aumenta la
intensidad luminosa, aumenta la fotosntesis hasta que se satura (hasta 1200). En una
21

invitro: conforme aumenta la intensidad luminosa, aumenta la saturacin pero se

satura mucho antes (mucho menos de 1200).
Este inconveniente no es reparable puesto que si aumentamos mucho la luz la
planta invitro se achicharra y adems su aparato fotosinttico no est preparado para
recibir tanta luz. El exceso de energa canaliza la formacin de especies reactivas de
oxgeno (dainas para la planta).
El CO2 invitro por la noche es muy alto, pero al comienzo del da disminuye hasta
ser un factor limitante (se agota rpidamente y escasea en todo el da)
La sacarosa es otro factor limitante de la fotosntesis invitro: si a una planta
invitro se le da carbohidratos ya no necesita la fotosntesis. Los carbohidratos
disminuyen la rubisco y aumentan el producto del ciclo de calvin.

3. Aclimatizacin previa al trasplante

Conclusin de todo lo anterior: se necesita adaptar la planta al medio exvitro.
La aclimatacin es la adaptacin de una planta a un nuevo ambiente.
La aclimatizacin consiste en el proceso por el cual el hombre favorece/acelera
la adaptacin al nuevo ambiente.

3.1. Procesos de la aclimatizacin

Incrementar la intensidad luminosa (diferentes bandas)
Eliminar los restos de agar (aumentaremos la diferencia de potencial
hdrico entre el suelo y la atmsfera. Eliminar la sacarosa del medio que incita a
la planta a activar su fotosntesis)
Reduccin de la humedad relativa (para favorecer la activacin de
estomas)

22

TEMA 2A: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS

PLANTAS. CULTIVO CELULAR
En este bloque nos centramos en el potencial bioqumico de las plantas. Se
estudia qu aplicacin se le puede dar al cultivo invitro.
El sistema de cultivo habitualmente empleado para explotar el potencial
bioqumico es el cultivo celular.

1. Introduccin
El primer cientfico que intent obtener cultivos celulares fue Haberlandt en 1902
(principios del siglo XX). Este cientfico fue el primero en estudiar esto y fracas
porque empez por lo ms difcil: el cultivo celular (es ms fcil cultivar un callo o un
tejido que iniciar un cultivo celular). No obstante los intentos que realiz sirvieron de
experiencia para el resto de cientficos.
No fue hasta los aos 70 que no se logr obtener el primer cultivo celular.
Aplicaciones (Para qu sirve un cultivo?):
Puede ser un sistema para realizar estudios bsicos de metabolismo
celular.
Puede servir como mtodo de micropropagacin de plantas (obtencin de
rganos y plantas)
Puede ser empleado con fines industriales (obtencin de sustancias de
alto valor aadido). Nos vamos a centrar en esta aplicacin.

2. Iniciacin y establecimiento de una suspensin celular

Cmo empezamos? Partimos de un explanto (trozo de zanahoria por ejemplo).
Inducimos la formacin de un callo, para lo cual hay que cultivarlo en un medio con
auxinas y citoquininas (equilibrado).
Existen dos tipos de callos: los callos compactos (aquel en el que las clulas
estn fuertemente unidas entre s; con pocos espacios intercelulares) y los friables
(callo en el cual las clulas estn formando agregados mucho ms laxos, con ms
espacios intercelulares).
Seleccionamos un callo friable, el cual se introduce en un medio lquido. Por las
caractersticas (por la propia estructura) de ese callo, si se agita, se va a ir
disgregando en ese medio de cultivo lquido. La suspensin que se nos forma la
filtramos. Una vez filtrada tendremos la suspensin celular lista.
Slo es posible obtener suspensiones celulares a partir de un callo? NO, se
puede partir directamente de un tejido diferenciado y obtener la suspensin
directamente (pero en este caso hay que emplear un tejido apto para ello, no vale
cualquiera). Para iniciar directamente la suspensin a partir de un tejido se requiere de
una serie de materiales: *mesfilo foliar (parnquima), *fragmento de cotiledn, callo
friable, protoplastos y granos de polen
23

*El mesfilo foliar y el fragmento de cotiledn requieren un mayor tiempo para

establecer el cultivo y tambin requieren tratamientos enzimticos (celulasas y
peptidasas)
Las suspensiones son bastante heterogneas. La proliferacin celular en cultivo
celular es elevadsima. Puede duplicarse el nmero de clulas en cuestin de 20-60h
(esto tiene una consecuencia: mutagnesis, es decir, alta variabilidad gentica,
incluso mayor que la que encontramos en los callos)

3. Cultivo de clulas en suspensin

Qu sistemas de cultivo podemos emplear para cultivar clulas?

3.1. Sistemas estticos o cerrados

En un cultivo esttico o cerrado, el crecimiento de las clulas se da en un

volumen fijo de cultivo (con agitacin: el hecho de que sea esttico no es que est
quieto; la agitacin no falta nunca en un cultivo celular: primero porque si no se agita,
las clulas se agregan; y en segundo lugar porque la agitacin evita las condiciones de
anoxia, es decir, favorece el contacto del medio de cultivo con el oxgeno). Principales
caractersticas de este sistema:
Como es cerrado no entra ni sale ningn componente del sistema.
El crecimiento es limitado: no se puede tener un sistema cerrado
indefinidamente. Las clulas agotarn los nutrientes y las toxinas se
acumularn
El cultivo no es equilibrado.
3.1.1. Dinmica del crecimiento en cultivos estticos
Se observa el peso fresco y el volumen que ocupa. Una primera fase inicial (o
fase de latencia) en la cual todava no ha comenzado a aumentar el nmero de
divisiones mitticas (se mantiene constante). En esta fase las clulas se adaptan para
la siguiente fase: comienzan a sintetizar protenas (sntesis proteica elevada), enzimas
(implicadas en sntesis de pared celular).
Posteriormente se inicia una segunda fase de crecimiento exponencial en la
cual se inician las divisiones mitticas. En esta fase el metabolismo celular que
predomina es el metabolismo primario (destinado a sntesis de protenas, hidratos de
carbono, lpidos). En esta fase las clulas estn desdiferenciadas hasta que llega un
momento en el que comienza la tercera fase o fase estacionaria.
Durante la fase estacionaria las divisiones celulares cesa. Es una fase en la
cual el metabolismo primario deja paso al secundario (es lo habitual) y las clulas
comienzan a diferenciarse.
Esquema de las 3 fases (representadas en rojo):

24

Cmo se puede controlar el crecimiento de un cultivo esttico? Mediante una

serie de mtodos: contar el nmero de clulas (por microscopio), se puede calcular el
peso fresco o seco celular (en microgramos/mililitro), el volumen despus de la
centrifugacin, se puede estudiar la actividad celular (viabilidad celular: respiracin,
fotosntesis), conductividad elctrica y densidad ptica (meterlo en un
espectrofotmetro: a mayor clulas, mayor absorbancia)

3.2. Sistemas dinmicos o abiertos

En los sistemas dinmicos o abiertos se produce una renovacin del medio de

cultivo y de clulas sin interrumpir el cultivo. La dinmica del cultivo esttico durante
la tercera fase era en cada (con respecto a la segunda fase - realmente no cae sino
que disminuye la tasa de crecimiento). En este sistema dinmico abierto podemos
mantener cualquiera de las 3 fases en el tiempo (la que ms nos interese).
Los cultivos dinmicos o abiertos pueden ser de dos tipos: semicontinuos o
continuos.
En los semicontinuos la renovacin se realiza en intervalos regulares de tiempo.
Tenemos un erlenmeyer con nuestro cultivo, cuando estimamos que estamos en la
fase que nos interesa, cada 10 das (X tiempo), cogemos una alcuota de esa
suspensin celular y la llevamos a un nuevo medio de cultivo lquido, de esta manera
no se agotan los nutrientes, la densidad celular no aumenta continuamente, no se
acumulan los compuestos txicos, etc. Esto se hace cada semana.
En los cultivos continuos hay un sistema automatizado: un bombeo continuo de
medio de cultivo. Si aadimos un nuevo medio de cultivo tenemos que desplazar un
volumen igual (de cultivo viejo) al que introducimos (puesto que sino se acumula). Se
puede ajustar la velocidad de crecimiento celular con mucha ms precisin que en un
25

semicontinuo. Es necesario tener una monitorizacin de la cantidad de clulas (es lo

que determina la velocidad con la que metemos medio nuevo y con la que extraemos
clulas viejas).
Para determinar la frecuencia con la que renovamos el cultivo acudimos al
clculo de dos parmetros:
En el caso de que determinemos un parmetro qumico (pH,
conductividad elctrica), los cultivos continuos reciben el nombre de
quimiostatos. Son parmetros proporcionales a la cantidad de clulas del
medio.
Si monitorizamos la turbidez del medio de cultivo, en ese caso hablamos
de turbidostatos: son sistemas de cultivo continuos en los que controlamos la
densidad celular para saber con qu frecuencia renovamos el cultivo.

4. Cultivos a gran escala: Biorreactores

Para aplicaciones industriales, los sistemas de cultivo que se han estudiado
anteriormente no son vlidos.
Cmo se aumenta la escala de cultivo? Cultivando en biorreactores. Al aumentar
la escala, comienzan a aparecer problemas que antes no aparecan cuando la escala
es pequea: el aporte de nutrientes es ms o menos homogneo (la homogeneidad es
difcil de conseguir si la cantidad es muy grande), se necesita un aporte ptimo de
oxgeno y de CO2, aparecen problemas de sedimentacin y de contaminacin.
La viscosidad del cultivo depende de la composicin del medio, de la densidad
celular y de la excrecin de polisacridos (proporcionalmente).
Las espumas aparecen cuando se agitan polisacridos y protenas. Aparecen
generalmente en la superficie, van decantando, provocan agregados celulares y las
clulas sedimentan.
La formacin de espumas supone un problema. Existen mtodos para evitar esto:
variar la composicin del medio de cultivo (la cantidad de carbohidratos usados, la
concentracin de calcio, etc), o bien aadir agentes antiespumantes.

4.1. Factores a considerar cuando una suspensin celular se cultiva en

grandes volmenes
En lo que respecta a las condiciones de la suspensin celular, considerar: el
grado de dao fsico inducido a las clulas, el grado de transferencia de oxgeno desde
la bombona hasta el medio lquido (para que este bien oxigenado), el intercambio de
sustancias, el grado de difusin de los componentes disueltos (de oxgeno, de
nutrientes y productos de desecho).
En lo que respecta a las condiciones de cultivo: la densidad celular debe ser tan
alta como sea posible (pero dentro de unos mrgenes), tener en cuenta los procesos
de crecimiento y produccin, composicin del medio de cultivo, consumicin de los
nutrientes, materiales del reactor (inerte/ estable), la estabilidad de los productos.

4.2. Componentes de un biorreactor

El biorreactor tiene una entrada de medio de cultivo (que lo renueva) y una salida
26

(por donde sale el medio viejo).

Como hay que controlar la temperatura, se circula agua fra o caliente por tubos
en funcin de la que se quiera mantener).
Tambin se controla la presin de oxgeno, de CO 2 y el pH (puede ir variando en
funcin de cmo crezcan las clulas o como est el metabolismo secundario - esta
regulacin se hace a tiempo real).
Dado que tenemos el problema de las espumas, siempre habr que controlar la
formacin de espumas aadiendo agentes antiespumantes con el fin de evitar la
sedimentacin celular y la formacin de agregados celulares. Para que esto no ocurra
es necesario agitar (mediante un sistema de paletas o de difusin de aire).
Finalmente, antes hablbamos de turbidostatos y quimiostatos. Cmo sabemos
cada cunto se renueva el medio? Se controla mediante, por ejemplo, la
determinacin de la densidad ptica (determinamos la concentracin de clulas).

4.3. Medio de cultivo

Qu composicin debe tener un medio de cultivo? La composicin depende de

una serie de factores: del genotipo (de la especie, unas requieren ms o menos
concentracin de sales), de la densidad celular (alta/baja), caractersticas del reactor,
dinmica del crecimiento (abierto o cerrado), manipulacin del metabolismo (si
queremos tener un cultivo celular para obtener metabolitos secundarios deberemos
optimizar la composicin del medio para que sea la ms adecuada para estimular la
sntesis de esos metabolitos secundarios).
Sobre la densidad celular: hay veces en las que cuando la densidad es baja, es
complicado hacer que funcione el cultivo y que las clulas se dividan. Para paliar esto
y que comience a funcionar y se dividan las clulas se emplean lo que se llaman
medios acondicionados: estos medios son medios de cultivos que adems de los
componentes habituales de un medio (sales, hormonas, vitaminas), presentan
compuestos que ayudan a que la suspensin celular comience a proliferar (algunos
compuestos como el cido nicotnico suelen emplearse como medios acondicionados).
Incluso empleando medios acondicionados no se logra que el cultivo sea
totalmente funcional. En estos casos, introducimos en el medio un fragmento de un
callo (colgado de un hilo se sumerge en el medio), tambin se puede suspender una
suspensin de alta densidad celular. Ese fragmento de tejido sumergido en la
suspensin celular exuda una serie de compuestos muchas veces de naturaleza
desconocida, pero que favorecen y estimulan la divisin y el crecimiento celular.

5. Aplicaciones
Una vez que tenemos nuestro cultivo, se realiza una seleccin de lneas celulares
(seleccionamos la que nos interese) y la seleccin debe realizarse en base a distintos
criterios (en funcin del objetivo que tengamos):
Un objetivo puede ser obtener plantas con significacin agronmica: obtener
plantas con tolerancia al estrs o para mejorar sus caractersticas nutricionales.
Otro objetivo (ms interesante) es disear lneas celulares aptas o adecuadas
para aplicaciones industriales.

27

Con la suspensin celular seleccionamos la lnea celular adecuada para obtener

un producto de inters o para que realice biotransformaciones (se ve en el tema
siguiente).
A partir de un explanto, va callo, obtenemos la suspensin celular. Las
suspensiones celulares tienen el inconveniente de que en ellas la probabilidad de que
ocurran variaciones somaclonales es alta (la alta tasas de divisin produce elevadas
alteraciones genticas y obtendremos lneas celulares de todo tipo).
Por tanto, despus de la suspensin necesitamos hacer una seleccin o un
cribado y posteriormente, o bien obtenemos plantas de significacin agronmica o
bien obtenemos plantas con aplicaciones industriales.
La seleccin no es lo mismo que el cribado. La seleccin es un proceso activo, es
decir, se ejerce una presin que favorece el crecimiento de una determinada lnea
celular. El cribado es un proceso pasivo: analiza las clulas visualmente o mediante
otro tipo de tcnicas: analizamos por HPLC todas las lneas y nos quedamos con la que
produzca un determinado compuesto en mayor cantidad.

28

TEMA 2B: POTENCIAL BIOQUMICO DE LAS

PLANTAS
En este tema vamos a ver para qu nos sirve el cultivo celular obtenido.
Estudiaremos qu factores regulan la produccin invitro de metabolitos secundarios
(factores biolgicos o ambientales), estos factores como veremos, controlan la
produccin de metabolitos secundarios.
Veremos cmo podemos optimizar la produccion invitro de metabolitos
secundarios (se ven diferentes tipos). Se hablar de la biotransformacin (no confundir
con transformacin gentica que es la optimizacin de la produccin invitro; en la
biotransformacin no hay modificacin gentica). Por ltimo se vern los avances
sufridos y las perspectivas de cara al para el futuro.

1. Introduccin/Historia
Las plantas se han empleado para curar enfermedades desde la antigedad
(2500 a.C, el chino Pen tsao). En 1500 apareci el papiro de Ebers con 500 remedios
basados en plantas medicinales.
A principios de siglo XX la industria farmacutica se encontraba dominada por la
sntesis qumica de compuestos.
En la dcada de los 70 irrumpe la biologa molecular en la industria farmacutica
mediante la ingeniera gentica. Gracias a sta se obtienen compuestos que eran muy
complicados de extraer o de sintetizar. En este momento se desarrollan sistemas de
cultivo de levaduras y hongos para la sntesis de estos compuestos.
Ms recientemente se emplean cultivos vegetales para la obtencin de estos
productos. Estos productos vegetales presentan ventajas frente a los animales: no
presentan contaminacin por priones, ventajas en determinados sistemas
microbianos...
En los ltimos aos se utiliza el concepto de plantas como biorreactores para la
sntesis de un amplio abanico de compuestos como vacunas, productos teraputicos,
nutrientes, etc.
Qu tipo de molculas podemos obtener? Por un lado tenemos compuestos
sintetizados de forma natural por las plantas (metabolitos secundarios). Adems de
estos metabolitos secundarios, mediante transformacin gentica (produciendo genes
exgenos a las especies vegetales), podemos hacer que la planta sintetice protenas
recombinantes para vacunas, anticuerpos, frmacos, etc), as como otro tipo de
compuestos como carbohidratos, lpidos de inters biosanitario e industrial (todo
esto se ve en el tema 3).
Nos centramos en la obtencin de metabolitos secundarios. El metabolismo
secundario es aquel que no es primario. El metabolismo primario es aquel que va
dirigido a la sntesis de aminocidos, protenas, nucletidos, cidos nucleicos,
azcares simples, cidos grasos, etc.
En los metabolismo secundario se sintetizan: alcaloides, terpenos, polifenoles,
etc, estos compuestos tienen la particularidad de que son especficos de cada especie,
29

es decir, no todas las especies vegetales sintetizan los mismos metabolitos

secundarios.
Adems tienen una clara funcin ecolgica, esto quiere decir que la planta lo
sintetiza en respuesta a un estrs (como mecanismo de adaptacin a un estrs), como
respuesta a la presencia de un patgeno (un hongo), etc.
Se han identificado unos 25000, de los cuales un 30% se han descrito con
aplicaciones teraputicas (codena, morfina, diosgenina).
La sntesis de metabolitos secundarios est estrechamente ligada a la
diferenciacin celular. Esto supone un inconveniente para los cultivos celulares puesto
que estos compuestos estn regulados espacialmente (en diferentes sitios) y
temporalmente (en periodos determinados): un cultivo celular no es adecuado para la
produccin de estos compuestos ya que no hay diferenciacin celular (y por tanto no
habr produccin de metabolitos secundarios (existe una correlacin entre
diferenciacin y presencia de metabolitos secundarios)
Ventajas in vitro de estos metabolitos secundarios:
Obtener in vitro un compuesto es independiente de adversidades
climticas y econmicas.
Se incrementa el rendimiento (mayor produccin).
Nos permite buscar nuevos compuestos (cuando cultivamos una planta
invitro nos podemos encontrar con que no sintetiza el compuesto que
esperbamos y en su lugar sintetiza otro que es ms interesante).
Nos permiten biotransformar. Gracias a la ingeniera gentica podemos
transformar genticamente estas clulas para aumentar el rendimiento
(transformacin gentica).
Nos permite conservar especies en vas de extincin.
Finalmente se emplean en investigacin para estudiar las rutas
biosintticas y su regulacin.

2. Regulacin de la produccin invitro de metabolitos secundarios

Qu factores afectan a la produccin de metabolitos secundarios?

2.1. Factores biolgicos

2.1.1. Crecimiento
La dinmica de crecimiento celular afecta a la produccin de metabolitos
secundarios. Existen diferentes patrones de sntesis para un metabolito
secundario: Hay metabolitos secundarios que siguen un factor de sntesis paralelo a la
dinmica de crecimiento que sigue un cultivo esttico (lnea roja), es decir, es
parecido al crecimiento celular (por ejemplo la nicotina). Hay otro comportamiento en
el cual la mayor produccin de metabolitos secundarios se da en la fase estacionaria
(en la ltima fase, como es el caso de los polifenoles). Existen otros bifsicos (se
producen en diferentes fases de desarrollo, en azul). Es importante que uno conozca
bien cul es la pauta de produccin o de sntesis de un metabolito porque de esta
manera podemos fijar la fase de desarrollo en la que sea altamente productiva.

30

2.1.2. Diferenciacin
La diferenciacin celular est estrechamente ligada a la sntesis de metabolitos
secundarios. No obstante, podemos iniciar una suspensin celular de una especie
vegetal y observar que el metabolito secundario que buscbamos no aparece (invitro
no sintetiza el metabolito que buscbamos).
Por qu ocurre esto? En primer lugar, hablbamos de que muchas veces este
tipo de compuestos se sintetizan en rganos especializados (los azcares se sintetizan
en las glndulas; los alcaloides aromticos en la raz...) y en un cultivo celular no hay
rgano ni tejido ni nada.
Las clulas, cuando se encuentran formando parte de un tejido, se encuentran en
un ambiente muy particular y diferente al ambiente que rodea a una clula en un
cultivo celular. Ese cambio de ambiente pueden provocar que el cultivo celular no
sintetice el metabolito que estemos buscando.
La sntesis de metabolitos secundarios est ligada a la diferenciacin
celular, en un cultivo celular no disponemos de tejido diferenciado y esto afecta a
nuestra sntesis.
Uno de los retos actuales es poder desacoplar los mecanismos tan complejos que
regulan o que conexionan la diferenciacin celular con la produccin de metabolitos
secundarios. Una vez desacoplado, podremos cultivar clulas y obtener los
metabolitos que buscamos.
2.1.3. Compartimentacin
La ruta de sntesis de muchos metabolitos secundarios est compartimentada
celularmente e incluso tisularmente, es decir, que parte de la ruta (o toda) puede
darse en varios tejidos.
Ejemplo: los alcaloides indlicos tienen su importancia por su accin tumoral. Su
31

ruta de biosntesis es compleja y se da en el citosol, en la vacuola, en los cloroplastos

y en otros orgnulos.
2.1.4. Variacin en la actividad biosinttica
El cultivo celular es altamente inestable desde el punto de vista gentico.
Podemos tener un cultivo que comience muy bien pero que luego decaiga por tener
afectaciones genticas.

2.2. Factores ambientales

1. Condiciones fsicas
a. Luz, temperatura, pH, aireacin y agitacin (especialmente
importante en los biorreactores).
b. Densidad de cultivo: en funcin de la densidad de clulas en
el cultivo el CO2 estar ms o menos limitado, la densidad afecta al
exudado de compuestos al medio y a la disponibilidad de nutrientes (a
mayor nmero de clulas, menor disponibilidad)
2. Formulacin del medio de cultivo
a. Reguladores del crecimiento: influye el tipo y la
concentracin de auxinas y de citoquinas. La sntesis de nicotina est
inhibida por la presencia de auxina, pero est estimulada por la presencia
de citoquinas.
b. Nutrientes presentes en el medio, nitrgeno, carbohidratos,
fsforo.

3. Optimizacin
secundarios

de

la

produccin

invitro

de

metabolitos

Cmo podemos aumentar el rendimiento de un sistema celular?

3.1. Seleccin clonal

Seleccionar dentro del cultivo celular aquellas lneas celulares que sean ms
productivas. Elegiremos una especie altamente productora del metabolito de inters.
Procedimiento a seguir: a partir del explanto altamente productivo iniciamos la
formacin de un callo, a partir del callo generamos una suspensin celular que tendr
muchas lneas celulares y mediante un cribado analtico vemos cules son las
productivas y cules no.
Es caro y va ligado a la variacin gentica: podemos tener lneas altamente
productivas que pueden dejar de funcionar con el tiempo.
La seleccin clonal puede llegar a aumentar la produccin del metabolito 7 veces.

3.2. Precursores

Un precursor es un compuesto que est ms arriba en la va metablica.

Empleando estos precursores se puede multiplicar el rendimiento por 4 e incluso por
100.
Tenemos que emplear un precursor que no sea muy caro (de nada vale aumentar
mucho el rendimiento si no se puede costear). El precursor debe ser cercano al
metabolito secundario a obtener (no puede estar muy arriba de la va metablica).

3.3. Elicitores
32

Los metabolitos secundarios suelen tener una funcin ecolgica (se sintetizan
frente a un estrs, frente al ataque de un patgeno, etc). Los elicitores son
compuestos o factores que interactan con receptores de la planta, activando en
ella respuestas de defensa (generalmente metabolitos, que sern de inters) y la
reaccin de hipersensibilidad. Pueden ser:
1. Agentes abiticos: metales pesados, radiacin UV, presin osmtica
(aadir alta concentracin de sales), ultrasonido, metil violgeno (es una
molcula qumica que se emplea en investigacin porque provoca estrs
oxidativo).
2. Agentes biticos: extractos de paredes de hongos o bacteria. Los
metabolitos secundarios se sintetizaban frente al ataque de una bacteria (la
bacteria o un extracto de la misma sera el elicitor); si aadimos al medio un
extracto de un componente de la bacteria, la planta reconoce esa parte y
sintetiza el metabolito de inters, que ser un antibitico natural frente a esa
bacteria. La ventaja que tiene es que el extracto del componente del hongo o
bacteria no es daino para la planta.
Ancdota: el revidox es un complemento alimenticio que est compuesto a base de
resveratrol (es un compuesto fenlico, es decir, es un metabolito secundario y lo
sintetizan pocas especies vegetales como el cacahuete: Arachis hypogaea). La planta
sintetiza el resveratrol frente al ataque de hongos. Un elicitor potente del resveratrol
es la radiacin UV: la radiacin UV aumenta la produccin de resveratrol.

3.4. Cultivo de clulas inmovilizadas

Este tipo de cultivo no es una suspensin celular. Los hay de dos tipos:
Cultivo en lecho plano: un recipiente con una membrana permeable
sobre la que se disponen las clulas; el medio de cultivo cae por la parte
superior y es recogido en la parte inferior de la membrana (membrana basal).
En el cultivo en columna las clulas se encuentran retenidas en un gel
(funcionamiento similar al anterior. En el cultivo en columna se pueden usar
dos tipos de materiales:
Polimerizacin activa de geles: se emplean geles como el
agar, alginatos, poliacrilamida y agarosa. Se aade agar en polvo a la
suspensin celular y una vez que se disuelve se deja enfriar y solidifica
con las clulas embebidas dentro de l.
Polimerizacin pasiva: se utiliza una espuma de poliuretano
o una membrana de fibra hueca, es decir, un soporte con poros en los
que las clulas van a quedar retenidas.
Ventajas de la inmovilizacin de clulas
Facilidad de manipulacin (el intercambio de medio de cultivo se produce
apenas sin prdidas: no se pierden clulas al ser un sistema cerrado). Adems
permite hacer tratamientos secuenciales de forma ms sencilla (cuando
interesa que las clulas crezcan ponemos medio de cultivo; cuando interesa que
crezca un metabolito concreto se cambia el cultivo, etc. Todo segn lo que se
necesite)
Contacto entre clulas: en estos cultivos de clulas inmovilizadas las
clulas estn en contacto unas con otras y puede haber una comunicacin
33

(imita mucho ms a un tejido que un cultivo de clulas en suspensin),

Tienen una mejor respuesta a los estmulos del medio
Se ampla el perodo de productividad
Se facilita la liberacin y extraccin de compuestos (metabolitos
secundarios) al medio
Permite realizar co-inmovilizaciones con otras lneas celulares: diferentes
lneas celulares en un mismo cultivo (por ejemplo, una lnea fotosintticamente
activa que aporte oxgeno para que pueda ser empleado por otra lnea celular
presente en el medio).
Todo ello conlleva a la mayor produccin de metabolitos secundarios

4. Transformacin gentica
Qu estrategias se pueden seguir para aumentar el rendimiento mediante
transformacin?
Podemos completar rutas metablicas mediante insercin de genes
heterlogos: insertamos el gen que codifica enzimas necesarias para el
metabolito.
Amplificar rutas normales (con esto se aumenta el nivel de expresin de
las enzimas de la ruta)
Bloquear rutas alternativas para maximizar el rendimiento (se evita
ramificacin de la ruta principal de inters).
Bloquear rutas de degradacin o catablicas.
Neutralizar mecanismos de retroalimentacin negativa por acumulacin
de producto.
Modificar los mecanismos de secrecin y exportacin: favorecer que el
metabolito salga de la clula.

5. Biotransformacin
No tiene nada que ver con la transformacin gentica. La clula vegetal posee
una maquinaria bioqumica muy compleja de tal manera que puede producir una gran
cantidad de compuestos qumicos.
Algunas de las rutas son imposibles de realizar en el laboratorio (de forma
sinttica) como la glucosilacin. Con la biotransformacin se pretende aprovechar
este potencial bioqumico de la planta que no se puede mimetizar en el laboratorio.
La biotransformacin consiste en la transformacin por parte de la planta (de las
clulas vegetales) de un compuesto orgnico en otro compuesto orgnico ms
complejo y con un mayor valor aadido. Lo interesante de la biotransformacin es que
cuando biotransformamos un compuesto orgnico, ste no tiene porqu estar
presente en la planta (podemos glucosilar un compuesto qumico sinttico, es decir,
que no sea conocido por la planta).
La Papaver somniferum puede transformar codeinona en codena
mediante una hidroxilacin. Si este sistema se realiza en un sistema de clulas
inmovilizadas, se aumenta el rendimiento en un 73%.
La Mallotus japonicus permite transformar el cido saliclico en la salicina
mediante glucosilacin. La salicina tiene una accin mucho ms potente.

5.1. Obtencin de rendimientos industriales

34

Cuando estamos pensando en aumentar la escala (rendimiento industrial),

debemos mirar que la tasa de crecimiento celular sea alta (no interesa tener un
biorreactor para un compuesto que no se sintetiza con buen rendimiento)
Es necesario tratar de mantener la mayor estabilidad gentica posible (es
imposible en al actualidad). Podemos ayudarnos de la criopreservacin: cuando
tenemos la lnea la podemos guardar una solucin stock del cultivo a -180C
(criopreservacin). Esto ayuda a mantener la estabilidad gentica con el tiempo pero
no una vez que est en el biorreactor.
Otro aspecto a tener en cuenta es la liberacin de compuestos al medio de
cultivo: debe ser muy elevada: para evitar el catabolismo de la clula (si el metabolito
se queda dentro de la clula puede sufrir su degradacin), para evitar la
retroalimentacin de la ruta biosinttica (feedback) y para favorecer la purificacin.
El coste del biorreactor debe ser minimizado al mximo: podemos ahorrar en el
medio de cultivo (componentes y precursores baratos), ahorrar energticamente:
acortando la fase productiva de crecimiento (tener siempre el cultivo en la fase
productiva).

6. Avances y perspectivas
El cultivo de clulas vegetales permite la obtencin de compuestos de
inters biosanitario con un rendimiento igual o superior al cultivo invitro.
Se han descubierto nuevas sustancias (no se produce el metabolito que
esperbamos pero se produce otro nuevo que puede ser mejor).
Se ha conseguido obtener compuestos en ausencia de organizacin
celular.
La biotransformacin es una de las reas ms prometedoras de la
biotecnologa vegetal.
A da de hoy podemos encontrar plantas como biofactoras para la sntesis de
compuestos de inters.

35

TEMA 3A: CULTIVO DE PROTOPLASTOS E

HIBRIDACIN SOMTICA
1. Introduccin
El protoplasto es una clula vegetal que carece de pared celular. Es esfrica
y un poco ms grande que la clula vegetal normal. Qu aplicaciones tienen los
protoplastos?:
1. Fundamentalmente se utilizan para la hibridacin somtica. El
cruzamiento entre dos individuos est restringido a individuos dentro de una
misma especie (no podemos cruzar una amapola con un girasol porque existen
barreras de compatibilidad gentica). Sin embargo, acudiendo a tcnicas como
la hibridacin somtica podemos cruzar o combinar el material gentico de dos
clulas que pertenezcan a especies diferentes.
2. Estudios de biosntesis y deposicin de la pared celular: en los cultivos
de protoplastos, ellos solos comienzan a fabricar su propia pared celular de
forma espontnea.
3. Endocitosis: los protoplastos, mediante estos procesos, pueden
incorporar material gentico del exterior y convertirse en un protoplasto
transgnico.
4. Ingeniera gentica: podemos emplear protoplastos como material de
partida para insertan genes en una determinada especie.

2. Aislamiento y purificacin
2.1. Material inicial

El material inicial puede ser diverso: tejido, callo o un cultivo celular.

El mejor tejido para obtener protoplastos es la hoja, en concreto el mesfilo
lagunar (esponjoso), tiene una alta densidad celular (a mayor densidad celular,
mayor nmero de protoplastos tendremos), sus clulas son muy homogneas
(similares) y adems tiene una estructura bastante laxa (muchos espacios
intercelulares, facilita la obtencin de protoplastos).
Tambin podemos obtener protoplastos a partir de un callo. Cmo debe ser el
callo para obtener protoplastos? Recordar que haba dos tipos de callos, los friables y
los compactos. Se ha demostrado que los callos friables son los ms adecuados, y es
importante que sean jvenes.
En cuanto a la produccin de protoplastos a partir de cultivos celulares.
Deben ser jvenes y es importante que estn en la fase de crecimiento exponencial.

2.2. Mtodos de aislamiento

Qu mtodos podemos emplear para obtener protoplastos? Pueden ser de dos
tipos: mecnico o enzimtico.
En el mtodo mecnico primero se esteriliza, se lava y se incuba la hoja (o el
tejido que sea) en un medio plasmolizante para provocar una plasmlisis incipiente.
En un estado de hidratacin normal de una clula vegetal, la membrana plasmtica
est adherida a la pared celular. Con este medio plasmolizante, con alta concentracin
36

de solutos como el PEG (polietilenglicol) o sacarosa, se pretende despegar la

membrana de la clula. Al introducirse el medio plasmolizante, el agua tiende a salir
por diferencial osmtico perdiendo su turgencia y, progresivamente, la membrana
plasmtica comienza a separarse de la pared celular. El siguiente paso requiere de
bistur, se realizan cortes en el tejido para romper las paredes celulares (de ah que el
mtodo se denomine mecnico) y liberar los protoplastos (es verdad que se pueden
romper algunas clulas). Es un mtodo muy artesanal, con una eficiencia muy baja
(10%).
El segundo mtodo es el enzimtico: es muy rpido y exitoso, aunque tiene el
problema de que los compuestos (enzimas) que digieren la pared celular pueden ser
citotxicos (evitar usar este mtodo con especies muy sensibles).
Se parte de un tejido (hoja limpia) a la cual se le elimina la epidermis. Luego se
sumerge la hoja en un medio plasmolizante y se les aaden las enzimas para digerir la
pared celular. La adicin de las enzimas puede hacerse de dos maneras: en un solo
paso (se aaden pectinasas, celulasas y hemicelulasas) o en dos pasos, aadiendo
primero las pectinasas y posteriormente las celulasas y las hemicelulasas.
La adicin de enzimas en dos pasos consiste en digerir la lmina media
(compuesta por pectinas, se sita entre las clulas: es una capa intermedia que
separa las paredes celulares de dos o ms clulas vegetales) y posteriormente aadir
el resto de enzimas que degradarn la pared celular directamente.
Se deben aadir al medio elementos estabilizantes (azcares, sales minerales,
polietilenglicol) porque, al eliminar la pared celular y con ella el potencial de pared, el
protoplasto podra estallar por el potencial de turgencia (es una fuerza que ejerce la
clula hacia el exterior y para contrarrestar esta fuerza, la pared vegetal ejerce una
fuerza de igual intensidad pero sentido contrario, denominada potencial pared. Si no
hay pared vegetal, el protoplasto explota porque el potencial de turgencia no est
siendo contrarrestado).
La mayora de enzimas son de origen bacteriano (T. viride). Los estabilizadores
son solutos.
Qu condiciones de incubacin deben respetarse en el mtodo enzimtico? Para
que la incubacin de la solucin enzimtica se pueda dar correctamente, se deber
utilizar un medio de cultivo nutritivo lquido (no podemos utilizar agua como medio)
con un estabilizador osmtico, a una temperatura de 26-30 grados, pH ligeramente
cido, en agitacin para que no se formen agregados (velocidad de agitacin baja
porque son sensibles), y con iluminacin baja.

2.3. Purificacin

Tras la digestin se debe pasar por filtros e incubaciones para eliminar restos de
tejido y de pared.

2.4. Comprobacin de la viabilidad

Se debe comprobar si tenemos protoplastos viables o si se han destruido en el
proceso. Para ello existen diferentes formas:
1. Mediante tinciones vitales: para diferenciar entre clulas vivas y
muertas. El FDA (Diacetato fluorescena) tie protoplastos vivos (protoplastos
viables); fenilsafranina y azul evans tien clulas muertas (protoplastos no
37

viables)
2. Test de actividad metablica: medicin de niveles de oxgeno
consumidos (electrodos) o de CO2 producido para ver la actividad celular.
3. Observacin de ciclosis: la ciclosis son las corrientes citoplasmticas.
La visualizacin de estas corrientes a microscopio indican protoplastos viables.

3. Cultivo y desarrollo
3.1. Medio de cultivo y condiciones fsicas

Se cultivan en medios con las sustancias nutritivas tpicas (sales minerales,

nutrientes, vitaminas, carbohidratos, hormonas) y sobre todo el estabilizador
osmtico (se emplea manitol entre otros): que no puede desaparecer hasta que no se
regenere la pared celular.
El cultivo se realiza en unas determinadas condiciones fsicas como la baja
intensidad luminosa. Siempre hay que procurar mantener la menor densidad
posible de protoplastos.

3.2. Cultivo de protoplastos

Una vez dentro del cultivo, comienzan a regenerar su pared celular porque sin
ella no pueden dividirse (es vital para la mitosis), y posteriormente comienza su
divisin. Conforme se van multiplicando se forman colonias (microcallos), y luego se
puede regenerar la planta mediante la estimulacin de la formacin de embriones
(embriognesis) y rganos (organognesis). Existen muchas especies, muy variadas, a
partir de las cuales se pueden obtener protoplastos.

4. Mtodos de hibridacin somtica

4.1. Fusin qumica

Consiste en desestabilizar la membrana plasmtica de los protoplastos,

alterando sus cargas negativas (que impide que se unan) de manera que se
permita un acercamiento mucho ms ntimo entre las membranas de los dos
protoplastos. Aadiendo un fusgeno (producto) qumico se pueden eliminar esas
cargas negativas de repulsin. Una vez eliminadas las cargas, se forman unos puentes
interprotoplastos (poros citoplasmticos) a travs de los cuales se puede intercambiar
el contenido celular.
Algunos ejemplos de fusgenos: PEG, nitrato sdico, etc.
Problema: hay especies sensibles a los fusgenos que no aguantan este
procedimiento, y el rendimiento es muy bajo (1-10%).

4.2. Electrofusin
Consiste en la fusin de los protoplastos mediante descargas elctricas.
Se colocan los protoplastos en una cmara de fusin, con dos electrodos que van
unidos a dos generadores de corriente: uno de corriente alterna y otro de corriente
contnua. En primer lugar se produce una descarga de corriente alterna de baja
intensidad, con esto se consigue que los protoplastos comiencen a migrar dentro de la
cmara de fusin (como en una electroforesis) y se alinean uno detrs de otro
formando una estructura de collar de perlas. Luego se aplica un pulso de corriente
continua de alta intensidad, y eso va a provocar que en las membranas plasmticas se
38

formen unos pequeos poros a travs de los cuales se va a dar la fusin de los
protoplastos. Esos poros son reversibles y se forman puntualmente (despus de la
fusin se regeneran). Es mucho ms efectivo que la fusin qumica (40-50%), no hay
problemas de citotoxicidad pero es necesario tener la cmara de fusin.

4.3. Factores que determinan la fusin

Material parental: hay genomas de ms fcil aislamiento que otros.

Tamao del protoplasto: a mayor tamao, mejor fusin.
Medio de electrofusin
Potencial osmtico del medio: debe ser muy bajo, va a favorecer la
fusin.
Enzimas empleadas en la digestin de la pared celular (pueden a veces
provocar daos en la membrana plasmtica).

4.4. Productos de fusin

Cuando se produce la fusin, tenemos un compuesto que contiene los dos
ncleos parentales y los orgnulos. Si el material gentico fusionado es diferente se
habla de heterocarionte. Si los protoplastos que se han fusionados son de genotipos
idnticos, se habla de homocarionte.
3 posibles productos:
El siguiente paso es la hibridacin: el material gentico de los dos ncleos se
mezcla (se hibrida). Los productos obtenidos tras la hibridacin son muy variables:
hbrido completo (contiene todo el material gentico). Si uno de los dos ncleos
pierde cromosomas, la hibridacin no es total: se habla de hibridacin parcial (ideal
cuando hibridamos protoplastos de un tejido joven con otro viejo).
Puede suceder que aparezcan protoplastos con material gentico de uno de los
parentales y los orgnulos del otro parental (o de los dos): cbrido (son
particularmente interesantes cuando nos interesa transferir una caracterstica, que
est modificada por el genoma mitocondrial o cloroplasto, de un protoplasto a otro).
Existen tcnicas exclusivas para obtener cbridos.
Un citoplasto es un protoplasto que slo contiene el orgnulo de inters. Un
protoplasto puede incorporar un orgnulo por endocitosis.

5. Seleccin tras la fusin

1. Manualmente: separar con micropipeta uno a uno (si hay diferencias
visuales).
2. Seleccin por complementacin gnica de resistencias o de
deficiencias: se realiza un cultivo entre dos especies que presenten: uno
resistencia frente a al germicida1 y otro resistencia al germicida2. En un medio
que presente los 2 germicidas, solo sobrevivirn los recombinantes totales.
Resumen del tema: partimos de una planta, se esteriliza, se elimina la epidermis, se
coloca en un medio para plasmolizar las clulas, se aplican las enzimas para digerir la
pared celular (con esto se asla el protoplasto), se colocan los protoplastos en un
medio para que se produzca la fusin, se cultivan para que regeneren su pared, se
dividen y forman agregados, posteriormente se forma callo y luego se diferencia para
39

regenerar la planta.

6. Limitaciones de la hibridacin somtica

Regenerar una planta a partir de protoplastos es muy complicado. Es
habitual que las plantas obtenidas presenten malformaciones.
Cuando regeneramos una planta a partir de protoplasto es habitual que
sea estril (no se reproduce y por tanto no se podr micropropagar)
Ausencia de una seleccin eficiente
Quimeras: aquellos individuos que tienen material gentico distinto (en
la misma clula o en el mismo tejido). La fusin de protoplastos produce
quimeras: si una vez que se forma el heterocarionte no se produce la correcta
fusin de los ncleos, cada uno de los dos ncleos empiezan a dividirse
independientemente: tendremos un callo que va a contener mezcladas clulas
de un parental y de otro parental.
El carcter de inters que se transfiere de un protoplasto a otro, a
veces, no se expresa.
Presentan baja estabilidad gentica (variaciones genticas)

40

TEMA 3B: PLANTAS GENTICAMENTE

MODIFICADAS PARA LA OBTENCIN DE
COMPUESTOS DE INTERS FARMACUTICO,
BIOSANITARIO O INDUSTRIAL O CULTIVOS CON
VENTAJAS AGRONMICAS Y NUTRICIONALES
1. Introduccin
La seleccin gentica de plantas existe desde tiempos ancestrales (antiguos
agricultores despus de una plaga o un invierno duro, recogan las semillas de las
plantas que haban resistido para cultivarlas de nuevo).
Ms tarde llega la revolucin verde, que consiste en cultivar variedades vegetales
mejoradas aplicando riego y fertilizantes.
En 1950 se descubre el ADN. En el 60 los plsmidos. Ms tarde se intentan
aplicar tcnicas para regenerar una planta.
En 1985 llega la revolucin gentica (diapositiva 3 con los logros)

2. Origen y evolucin de las plantas genticamente modificadas

1. La primera generacin de plantas transgnicas se estudiaban con el fin
de conseguir ciertas ventajas agronmicas: tolerancia a herbicidas,
resistencia a plagas y patgenos, tolerancia a condiciones adversas como
salinidad o sequa, maduracin retardada. O bien para obtener mayor
rendimiento y menor coste de produccin. Principalmente se transformaban
alimentos destinados al consumo humano y animal.
2. En la segunda generacin de plantas transgnicas se intent obtener
cultivos que presentaran aspectos cualitativos mejorados: valor nutricional
adicional, mejor digestibilidad, propiedades funcionales. En este caso se trataba
de modificaciones ms complejas (estas caractersticas estn gobernadas por
un gran nmero de genes: polignicas).
3. Tercera generacin de plantas transgnicas: plantas modificadas
genticamente para producir compuestos de alto valor aadido. En este
punto se piensa en la planta como una biofactora para la produccin industrial
de compuestos. Aplicaciones en la ingeniera metablica (alterar rutas
metablicas presentes en la planta o insertar nuevas rutas con el fin de obtener
el producto de inters) y agricultura molecular (empleo de las plantas para
obtener protenas recombinantes: para vacunas, anticuerpos, frmacos, etc).

3. Plantas biofactora
Dentro de la tercera generacin hablamos de plantas como biofactora que tiene
como objetivo la obtencin de protenas u otro tipo de productos de inters
teraputico o industrial.
Presenta una serie de ventajas: un alto rendimiento (se puede producir
una enorme cantidad de biomasa), permite obtener protenas animales con
41

modificaciones postransduccionales (mediante glicosilaciones), hay ausencia de

contaminacin microbiolgica (ventaja frente a animales), presenta una fcil
distribucin y administracin (se puede incorporar la vacuna a una patata e
ingerir la patata para vacunarse), alta relacin coste/beneficio
Inconvenientes: presenta diferentes patrones de glicosilacin (frente a
animales), deficiencia en la expresin (a veces la expresin de la protena no es
muy alta), presenta riesgo de contaminacin ambiental.
Las molculas de inters pueden ser protenas recombinantes (de inters
biosanitario industrial) o ingeniera metablica (modificacin de rutas enzimticas o
introduccin de nuevas rutas).
En la modificacin de rutas se alteran los niveles de expresin de los genes
endgenos.
En la introduccin de nuevas rutas y en la produccin de vacunas, anticuerpos y
frmacos es necesario la introduccin de genes heterlogos (diapositiva 13).

42

TEMA 3C: PROTENAS RECOMBINANTES

1. Eleccin de la especie hospedadora
Hay que tener en cuenta una serie de aspectos a la hora de elegir: el tipo de
protena recombinante que quiero obtener (dependiente de la especie vegetal), el
ciclo de vida de la especie vegetal (ciclos cortos: crecimiento rpido), si tenemos
protocolos que nos permitan la transformacin (se puede o no transformar la
especie?), el rendimiento del cultivo y de la protena (que tengamos mucha biomasa
en poco tiempo y que la protena tambin sea en grandes cantidades), que presente
un coste bajo (a escala de laboratorio y a nivel industrial), procesamiento posterior
de la protena (especies de tipo oleaginoso son adecuadas para producir una protena
recombinante: podemos hacer que las especies acumulen las protenas en las semillas
y as se facilita la purificacin posterior), riesgos ambientales posteriores (escape de
genes a travs del polen: ser mejor acumular la protena en las hojas en vez de en
las semillas. El escape de genes es que se transfiere el gen a travs del polen a otras
especies y esto esto hay que evitarlo por el efecto medioambiental que podra causar)

2. Transformacin
Elementos bsicos para la obtencin de plantas transgnicas: genes
caracterizados, promotores potentes, marcadores, construccin del vector y la propia
tcnica de transformacin.

2.1. Genes caracterizados

En el extremo 5 existe una regin promotora que contiene los elementos que
regulan la transcripcin del gen que viene despus (que es la regin codificante),
contiene elementos potenciadores o silenciadores de esa transcripcin; la caja TATA
que marca el inicio de la transcripcin. A continuacin viene la zona codificadora, con
un punto de inicio, un codn de inicio de la traduccin y una serie de exones e
intrones (los exones son secuencias que van a traducirse). En el extremo 3 estn los
elementos que finalizan la traduccin.

2.2. Promotores potentes

Los promotores son los elementos que regulan espacial y temporalmente la

expresin de un gen. Los hay de tres tipos:
1. De tipo constitutivo mediante el cual la expresin del gen se produce
en todos los tejidos de la planta en cualquier momento. y de forma permanente.
2. Promotores especficos de tejidos: nos permiten que el gen se exprese
en un tipo de tejido concreto (un rgano determinado)
3. Inducibles: son aquellos que permiten la expresin tras la aplicacin de
un determinado factor que los induce. A su vez pueden ser de tipo fsico o
qumico.
Los interesantes son los especficos de tejido (que la protena est en un fruto
que luego ser comestible) y los inducibles.

2.3 Marcadores
43

No todas las clulas del tejido incorporan la transformacin. Debemos incluir un

elemento en la transformacin para que podamos distinguir los que se han
transformado de los que no.
Tipos: seleccionables e informadores.
1. Los seleccionables son genes confieren a la clula la capacidad de
resistir a un antibitico o germicida (las clulas que resistan a un medio con el
antibitico sern las que nos interesen). El principal problema que presenta es
el escape de genes: puede transferir el gen marcador al ecosistema (problemas
de bioseguridad) por eso muchos de ellos estn prohibidos. A veces se
incorporan los genes y luego se eliminan una vez que se ha producido la
transformacin para evitar estos problemas
2. Los genes informadores son genes que codifican un compuesto
coloreado. Ej: genes que codifican protenas fluorescentes.

2.4. Construccin del vector de transferencia

Uno de los vectores de transferencia ms empleados es el plsmido. Se replican

de forma independiente al DNAg. Se introduce el mdulo de expresin en el plsmido
obtenindose un plsmido recombinante. ste se introduce en una bacteria y se
transforma la planta mediante diferentes tcnicas de transformacin.
2.4.1. Transferencia indirecta de genes
Agrobacterium tumefaciens: es una bacteria que est presente de forma natural
en el campo y que infecta las plantas (es un parsito de las plantas). Penetra a travs
de las heridas de las plantas y provoca tumores. Presenta un cromosoma bacteriano y
un plsmido, que tiene el nombre de plsmido Ti (inductor de tumores). La bacteria es
capaz de transferir un fragmento del plsmido Ti a la clula vegetal, ese fragmento de
plsmido se inserta al azar, pero de forma estable, dentro del genoma del ncleo de la
planta. La planta comienza a expresar toda la informacin que contiene ese fragmento
del plsmido dando lugar a tumores.
Estructura del plsmido Ti
Qu contiene el plsmido Ti para producir tumores? Tiene una regin virulenta,
que contiene unos genes llamados vir, que son los responsables de insertar un
segmento de ese plsmido (en la regin de T-DNA) en el genoma vegetal, y en
concreto unos genes vir clave van a reconocer los dos bordes (izquierdo y derecho) del
T-DNA que son secuencias de restriccin. El T-DNA tambin tiene genes que codifican
la sntesis de hormonas (auxinas y citoquininas) y opinas, que son unos aminocidos
que van a servir como fuente de C y N para la bacteria.

44

Agrobacterium, gracias a la regin de virulencia, va a cortar el plsmido Ti por el

borde derecho e izquierdo (ver en la imagen la lnea fina superior dibujada en azul)
para comenzar a sintetizar de forma masiva los genes del inserto. Cuando comienzan
a expresarse los genes y a sintetizarse auxinas y citoquininas, las clulas de la planta
comienzan a dividirse formando un callo. Adems se sintetizan opinas, que servirn de
alimento a las clulas.
Cuando la planta tiene una herida, comienza a sintetizar compuestos como la
acetosiringona y la excreta al suelo. Este compuesto es una molcula seal que
desencadena todo el proceso, y provoca que se vayan expresando en cascada todos
los genes vir que contiene el plsmido Ti y en concreto, el primero en activarse es el
gen VIR-A que va a codificar una protena que es un receptor de la acetosiringona, se
inicia la expresin del gen VIR-D que codifica unas endonucleasas que reconocen los
bordes izquierdo y derecho del T-DNA, se corta a ese nivel, y otras protenas VIR-D
sintetizan una hebra-T (sencilla) complementaria al T-DNA. Luego se expresa el gen
VIR-E2, que codifica la protena E2 y va a ir unindose a la hebra T formndose el
complejo hebraT-protena E2 para proteger la hebra de la degradacin. A continuacin
entran en accin los vir-B, estos genes van a controlar la transferencia del complejo
desde Agrobacterium a la clula vegetal a travs de canales transmembrana (muy
complejos). Ahora la hebra T se encuentra en el ncleo de la clula vegetal, y se
incorpora dentro del genoma vegetal tras la sntesis de la hebra complementaria a la
hebra-T. La planta comienza a expresar el DNA recin incorporado y sintetiza opinas
para la manutencin de Agrobacterium, ms hormonas que provocarn la aparicin
del tumor.
Aplicacin biotecnolgica
Podemos utilizar Agrobacterium como un vector natural de genes. Como
podemos aprovechar esta capacidad de Agrobacterium? Cogemos el plsmido Ti de
Agrobacterium y se desarma, es decir, se elimina toda la regin de T-DNA
manteniendo los bordes derecho e izquierdo. A continuacin, en esa regin ocupada
por el T-DNA se inserta el gen que se desea expresar en la planta, con su gen
marcador y sus promotores (mdulo de expresin). As se obtiene un plsmido Ti
recombinante. Posteriormente se vuelve a incluir en Agrobacterium para que infecte la
planta mediante el mecanismo anteriormente descrito.
Vector cointegrado
Cmo se integra el plsmido Ti y se le incluye el gen de inters? Lo que puede
hacerse es emplear vectores cointegrados, es decir: se parte del plsmido Ti (FALTA)
en el cual se ha incluido el trasgen. Por recombinacin homloga se puede combinar
ambos plsmidos creando un vector cointegrado, es decir, un plsmido que contiene
la regin de virulencia del plsmido Ti, el borde izquierdo y derecho, el origen de
replicacin; y entre los dos bordes: el promotor, el gen de inters, etc.
Tiene un tamao muy grande que lo hace inestable y difcil de manejar. Por ello,
es una tcnica complicada.
Existe otra alternativa: a raz de que se descubriera que la regin VIR y la zona
45

del T-DNA del plsmido Ti podan operar perfectamente sin estar en un mismo
plsmido, se desarrollaron los vectores binarios. Tenemos dos plsmidos, que se
insertan en Agrobacterium: el primero es un plsmido Ti desarmado (solo tiene la
regin vir, que es lo que interesa), y por otro lado se tiene un plsmido ms pequeo
en el que se incluye el transgn flanqueado por los bordes izquierdo y derecho que
ser reconocido por las protenas de la regin vir. Una vez interaccione la
acetosiringona y se expresen los genes vir, se cortarn los bordes, se sintetizar la
hebra-T, se formar el complejo con vir-E2, pasar al ncleo vegetal y se expresar el
gen de inters. Ventajas: se emplean plsmidos ms pequeos, por tanto ms
estables y ms fciles de manipular.
Inoculacin
Cmo lo inoculamos en la planta y qu caractersticas tiene que tener el explanto? El
explanto puede ser una suspensin de protoplastos, suspensin celular, un callo, un
rgano, etc.
La inoculacin se puede hacer de varias maneras:
- Herir la planta e infectarla in vivo, o decapitar semillas y sumergirlas en una
suspensin con Agrobacterium. Aqu en la herida se sintetiza acetosiringona.
- Co-cultivo de protoplastos en suspensin con Agrobacterium. Hay que aadir de
forma exgena la acetosiringona en este mtodo y el siguiente.
- Cultivo de protoplastos en suspensin con Agrobacterium.
- Una forma de inoculacin sencilla con Arabidopsis: se puede aplicar una
suspensin de Agrobacterium en la inflorescencia, ah van a desarrollarse las semillas
y la bacteria infectar directamente a los cigotos. Se obtienen semillas transformadas.
2.4.2. Transferencia directa de genes
La principal desventaja del anterior mtodo es que Agrobacterium solamente
infecta a especies dicotiledneas (espectro pequeo, quedan fuera todas las
monocotiledneas). Se idearon otros mtodos que permitieran transformar
genticamente especies monocotiledneas.
Transformacin biolstica
Consiste en bombardear el tejido vegetal, con las clulas vegetales, con unos
microproyectiles (de 0.1 micras de dimetro), suelen ser de oro o tungsteno, y van a
estar recubiertos de DNA (concretamente plsmidos con nuestro transgn). Gracias a
un impulso conseguido con He o H2 se lanzan estos microproyectiles, alcanzando
velocidades de 100 m/s, y penetran en el tejido vegetal hasta el ncleo de las clulas
y depositan ah los plsmidos. Los plsmidos se integran en el genoma vegetal y
comienzan a expresarse. El tejido empleado para esta transformacin puede ser
desde una suspensin de protoplastos, de clulas, fragmento de tejidos hasta una
planta completa o un callo.
Ventajas con respecto al mtodo anterior: permite transformar especies
monocotiledneas.
Desventajas: en primer lugar es que existen especies que son reticentes
a ser atravesadas por estos microproyectiles (con paredes celulares muy
gruesas o con cutculas gruesas); se introducen un elevado nmero de copias
del transgn en cada clula (se bombardean miles de proyectiles con plsmido),
y puede provocarse silenciamiento gnico; y que el porcentaje de
transformacin es muy bajo (eficiencia baja).
46

Transformacin de protoplastos
Los protoplastos, al carecer de pared celular, son capaces de incorporar
elementos externos por endocitosis. Existen mtodos para favorecer que los
protoplastos endociten plsmidos del medio de cultivo. Mtodos:
- Electroporacin (recordar fusin de protoplastos mediante corriente
elctricas): En este caso se aplica un pulso de corriente continua de alta intensidad
para formar poros en la membrana, da igual si se alinean o no porque ese no es el
objetivo.
- Tratamiento qumico: se consigue desestabilizar la membrana plasmtica
para favorecer la incorporacin del plsmido. Se aplica PEG, por ejemplo.
Inconvenientes de la transformacin de protoplastos: el principal inconveniente
proviene de la utilizacin de protoplastos, que suelen venir de unas pocas especies
capacitadas, llamadas especies de lite (ya que es una tcnica de cultivo muy
sofisticada); es muy complejo regenerar una planta a partir de un protoplasto, por lo
tanto si se desea transformar un protoplasto para conseguir una planta, va a ser muy
difcil. Tercer inconveniente: la baja eficiencia del proceso.
Microinyeccin
A partir de un porta en el que hay una suspensin de protoplastos o clulas, se va
clula a clula introduciendo los plsmidos en su interior. Inconveniente: tcnica muy
compleja y tediosa, con un bajo porcentaje de transformacin (a diferencia de los
mtodos directos) que puede llevar das y semanas en llevarla a cabo. Adems, si se
emplean protoplastos existen todos los inconvenientes inherentes a ellos.
2.4.3. Mtodos indirectos vs mtodos directos
En el cuadro se reflejan las diferencias principales entre los dos tipos de transferencia
(muy importante).
- Especies a transformar: Agrobacterium permite transformar bsicamente
dicotiledneas y muy pocas monocotiledneas. Sin embargo, el mtodo biolstico
puede aplicarse a cualquier especie vegetal.
- Eficiencia en la transformacin: La eficiencia con Agrobacterium es muy alta, en los
mtodos directos el rendimiento es muy bajo.
- Tipo de integracin del transgn en el genoma vegetal: Con Agrobacterium la
integracin del DNA se realiza al azar en regiones con transcripcin, el nmero de
copias integrado es muy bajo (se colocan de forma independiente en el genoma), y es
precisa (solamente se inserta el T-DNA junto a la protena E2). Con el mtodo biolstico
la integracin es totalmente al azar, el nmero de copias integrado es muy alto
(propensas al silenciamiento gnico) y se colocan en tndem (una copia tras otra), y
es una integracin imprecisa (DNA parcialmente degradado)
- Construccin de vectores: Con Agrobacterium es una construccin compleja
(cointegracin, plsmido grande e inestable) mientras que en el mtodo directo es
mucho ms simple ya que los plsmidos son mucho ms pequeos.
- Dependencia del genotipo vegetal: Con Agrobacterium hay una gran dependencia
porque tiene que haber compatibilidad (dicotiledneas). El mtodo directo tiene
menos restricciones.

2.5. Transformacin nuclear

Ventajas

47

- Protocolos de transformacin adaptados para muchas especies.

Inconvenientes
- Silenciamiento gnico: por la insercin de un elevado nmero de copias, y por el
efecto de posicin en la insercin del DNA (la posicin afectar al mayor o menor
grado de expresin del inserto: zonas ms cercanas al telmero condicionan una
expresin muy alta mientras que en regiones donde queda flanqueado DNA de origen
bacteriano o microsatlites ser ms probable que se produzca silenciamiento gnico).
- Efectos pleiotrpicos: El inserto se transcribe y se traduce en una protena. Si esa
protena recombinante es citotxica, afectar a la viabilidad de la clula.
- Riesgo de escape de genes: a travs del polen.

2.6. Transformacin plastidial

Los plastos son orgnulos con material gentico propio (plastoma), y ste consiste en
mltiples copias de un DNA circular de doble cadena llamado nucleoide (100
nucleoides).
Tipos
de
plastos:
cromoplastos,
leucoplastos
(amiloplastos,
oleoplastos,
proteinoplastos y cloroplastos. Los cloroplastos se han podido transformar de manera
ms efectiva.
2.6.1. Ventajas respecto de la transformacin nuclear
- Hiperexpresin: para una clula que tiene 100 cloroplastos (con 100 nucleoides cada
uno) se obtienen miles de copias del gen por clula (10.000 en este caso).
- No se han descrito casos de silenciamiento gnico en este tipo de transformacin.
- Herencia materna y contencin gnica: los plastos, al igual que el resto de orgnulos,
se hereda va materna. Cuando el grano de polen fecunda al oocito se eliminan los
rganos del polen y as se evita el escape de genes va polen.
- No hay efectos pleiotrpicos: las protenas codificadas por el genoma del cloroplasto
se sintetizan en el propio cloroplasto, ya que tiene sus propios ribosomas, y se quedan
en el orgnulo. As no se produce citotoxicidad celular.
- No hay efectos de posicin: en este caso la insercin del gen NO es al azar sino que
se produce en lugares concretos del nucleoide porque esa insercin se hace por
recombinacin homloga.
Protenas expresadas utilizando transformacin de cloroplastos de tabaco (diapositiva)
2.6.2. Inconvenientes de la transformacin de cloroplastos
- Riesgo de transferencia horizontal de genes a bacterias debido a la homologa que
presentan el genoma bacteriano y cloroplastos. Hay que recordar que las
cianobacterias dieron lugar a orgnulos como los plastos.
- Los cloroplastos no son capaces de llevar a cabo algunas modificaciones posttraduccionales como la glicosilacin. Las clulas vegetales s que son capaces de
glicosilar las protenas cuando la transformacin es nuclear, pero en el cloroplasto esto
no pasa y no se obtiene la protena activa. (Tambin tener en cuenta que no todas las
protenas necesitan modificaciones post-traduccionales)
- No se produce la exportacin de las protenas sintetizadas hacia otros orgnulos o
compartimentos celulares.
- Mtodos de transferencia limitados y baja frecuencia de transformacin.
48

3. Seleccin y regeneracin de la planta

Hay que seleccionar las clulas transformadas mediante un marcador informador (gen
que produce pigmentacin) o un marcador seleccionable (resistencia a antibiticos),
para separarlas de las no transformadas y cultivarlas. Una vez seleccionadas tenemos
dos opciones:
- Cultivo celular en un biorreactor para producir la protena recombinante en
cantidad industrial.
- Regenerar la planta (vacunas comestibles, etc.)
No todas las tcnicas de transformacin son compatibles con las tcnicas de
regeneracin de plantas. [Esquema de seleccin y regeneracin de planta]

4. Purificacin
Los costos de purificacin pueden reducirse explotando caractersticas propias de la
planta:
- Rizosecrecin en cultivos hidropnicos y secrecin en clulas en suspensin: el gen
de inters se fusiona a una secuencia seal de transporte al retculo endoplasmtico
para redireccionar la protena por va secretora para que salga al cultivo hidropnico.
- Acumulacin en semillas u rganos de almacenamiento para la co-extraccin con
productos convencionales como almidn o aceites.
- Produccin directa en partes comestibles de la planta.
- Protenas de fusin a oleosinas: en las plantas oleaginosas las clulas de las
semillas tienen unos orgnulos que se llaman cuerpos grasos, en cuyo interior se
acumulan aceites y que tienen anclados a la membrana unas protenas denominadas
oleosinas (color prpura en dibujo). Lo que se hace es fusionar el gen de inters con el
de la secuencia de codificacin de una oleosina, separado por una secuencia de
reconocimiento para una proteasa. Esto va a hacer que se sinteticen oleosinas
recombinantes (unidas a la protena de inters), ancladas cuerpos grasos. Esto se
hace porque es muy sencillo aislar los cuerpos grasos y con ellos la oleosina
recombinante, que se trata con una proteasa para que separe la oleosina de la
protena de inters.
Protenas recombinantes producidas en sistemas vegetales
Son 3: antgenos vacunales, anticuerpos biofrmacos
a) Antgenos vacunales
1. Hepatitis B, C, agentes causales de diarreas (rotavirus, E.Coli, virus
Norwalk). Se ha logrado expresar antgenos de estos virus en clulas vegetales.
2. Otros se encuentran en fase de ensayo clnico como vacunas comestibles
contra hepatitis B y rabia (lechuga - Antgeno HBsAg). Se han transformado
clulas de lechuga para producir antgenos de este virus. Se hizo un estudio
administrando a varias personas estas hojas de lechuga. Transcurridos unas
semanas se les determinaba la concentracin de Ac contra esos antgenos en
sangre. Al cabo de 10 semanas de recibir la primera dosis de esta vacuna se
observa un aumento muy significativo en 2/3 voluntarios del antgeno.
b) Anticuerpos (planticuerpos)
1. Produccin de anticuerpos

en

clulas

vegetales.

Se

ha

logrado
49

transformar genticamente plantas (FALTA) una glicoprotena capaz de

reconocer el antgeno del virus de la hepatitis B y el herpes humano.
2. Otros se encuentran a nivel de ensayo clnico: anticuerpo obtenido de
plantas (de tabaco) capaz de reconocer un antgeno de la bacteria
Streptococcus mutans (causante de la caries dental). En concreto, se ha
comprobado que administrando de forma tpica el anticuerpo producido por
estas plantas de tabaco, la recolonizacin de los dientes por parte de la bacteria
se retrasa 4 meses
c) Biofrmacos
1. El primero es la glucocerebrosidasa: es un enzima cuya deficiencia
provoca la enfermedad de Gauchers (enfermedad muy rara con pocos casos en
el mundo). La sintomatologa es variada: desarrollo anormal del bazo, deterioro
en los huesos, etc. Para curar la enfermedad se debe administrar
glucocerebrosidasa ya que el enfermo no la sintetiza. El problema que tiene es
que la glucocerebrosidasa es una enzima muy costosa de obtener: se puede
aislar del cordn umbilical. Es tan cara que es conocida como el frmaco ms
caro del mundo. Recientemente se ha logrado obtener glucocerebrosidasa
recombinante a partir de plantas reduciendo significativamente el coste de
produccin.
2. Se ha podido obtener la hormona de crecimiento humana
(somatotropina) realizando transformacin cloroplstica en plantas de tabaco.
3. Colgeno: compuesto muy empleado en la industria. Las plantas no son
capaces de sintetizar colgeno, es tpico de clulas animales. Gracias a la
tecnologa vegetal se han podido obtener plantas de tabaco productoras de un
precursor de colgeno (procolgeno), que posteriormente se transforma en
colgeno.
[Tabla diapositiva] Existe un amplio abanico de protenas de inters industrial: lacasa
del maz, amilasa de tabaco, xilanasa de tabaco, colza y guisante, etc.

50

TEMA 3D: INGENIERA METABLICA

1. Introduccin
En este tema estudiamos la otra rama de molculas de inters, provenientes de
la ingeniera metablica. La ingeniera metablica busca reorientar una o ms
reacciones metablicas con el fin de producir ms cantidad de un compuesto
natural, disminuir la produccin de compuestos indeseables (alterar rutas
metablicas) y tambin podemos producir nuevos compuestos: compuestos que la
planta es incapaz de sintetizar.

1.1. Estrategias que emplea la ingeniera metablica

- Introducir mayor cantidad de un compuesto natural: aumentar el flujo de la va
biosinttica (aumentar la expresin de genes), bloquear rutas alternativas (redirigimos
el precursor hasta el producto de inters), disminuir el flujo de vas catablicas
(tecnologa antisentido), incrementar el nmero de clulas productoras de la planta.
- Reducir los niveles de un compuesto: bloqueo de la ruta metablica (mediante
enzimas con tecnologa antisentido, expresin de anticuerpos contr enzimas),
diversificacin del flujo hacia una ruta competitiva, aumentar su catabolismo (lo
contrario del punto anterior).
- Expresin de nuevos compuestos (compuestos que de forma natural no se
pueden sintetizar): completar rutas metablicas a partir de precursores de la planta
(insercin de genes heterlogos. La planta tiene solo una parte de la ruta metablica;
se completa hasta la obtencin del compuesto de inters mediante la insercin de
genes heterlogos), crear rutas metablicas completas (tambin con la insercin de
genes heterlogos). Un gen heterlogo es un gen proveniente de otra especie (tanto
otra especie de planta como de bacteria, etc)

1.2. Factores condicionantes

- No siempre es posible predecir el efecto que las alteraciones realizadas puedan tener
sobre la va metablica completa. Mecanismos de control positivos y negativos
pueden reorientar la va de formas poco conocidas. Podemos insertar todos los genes
que queramos pero igual luego no vemos el producto que nosotros queremos
- La manipulacin sobre las vas del metabolismo primario, a menudo pueden tener
efectos detrimentales sobre el crecimiento y desarrollo de la planta: Si queremos
manipular el metabolismo de HC o lipdico puede hacer que la planta produzca menos
producto o que crezca menos (disminucin de la biomasa producida. Todo esto no
interesa), etc.
- Por muy bien que la planta transgnica est caracterizada en condiciones
experimentales, los cultivos en el campo estn sujetos a perturbaciones
ambientales que pueden afectar de forma impredecible a la acumulacin del
producto recombinante: Podemos transformar genticamente la planta, la cultivamos
en un invernadero y genera la molcula que necesitamos: se traslada al campo para
producir el compuesto a gran escala y la expresin ya no se da (importancia de
factores climticos)
- Es importante asegurar la correcta expresin espacial y temporal del producto
51

en los rganos y clulas adecuadas de las plantas transgnicas: Dnde queremos

que se exprese el compuesto? En la hoja, que se acumule en la raz, etc.

2. Manipulacin del metabolismo de carbohidratos

- Fructanos: son HC interesantes que contiene ingredientes nutricionales con efectos
beneficiosos sobre la salud humana. Hay plantas y especies que sintetizan fructano
pero son especies de bajo valor agronmico (producen poca biomasa, crecen muy
poco, etc). Se ha intentado que plantas con alto valor agronmico sean capaces de
sintetizar fructanos, para ello se les inserta el gen de la fructosil transferasa
(procedente de la Bacillus subtilis). Algunos ejemplos: patata, remolacha, tabaco.
- Ciclodextrinas: sirven para aumentar la solubilidad, son oligosacridos cclicos
capaces de complejar molculas. En la industria farmacutica se emplean para
complejar principios activos de manera que lleguen a la diana sin ser degradados,
permiten la liberacin lenta del frmaco, evitan incompatibilidades entre distintos
compuestos (frmacos con ms de un principio activo). No se producen en plantas,
slamente es sintetizada por bacterias. Recientemente se ha logrado transformar la
patata insertndole el gen de la ciclodextrina glicosil-transferasa de Klebsiella
pneumoniae con el promotor de la patatina (para la regulacin de la expresin
espacial y temporal del gen), eso va a hacer que el gen se exprese nicamente en el
tubrculo.

3. Manipulacin del metabolismo lipdico

- Modificacin de los niveles de monoinsaturacin de los cidos grasos
- Acumulacin de cidos grasos de inters industrial y farmacutico.

4. Manipulacin del metabolismo secundario

- El beta-caroteno es una vitamina (vitamina A). su deficiencia provoca defectos de
visin. Se estima que hay 120M de nios con deficiencia y se podran evitar 1-2M de
muertes al ao si hubiera un aporte adecuado de vitamina A. Se plante lo siguiente:
introduccin de vitamina A en alimentos tpicos tercermundistas (como el arroz, que
es deficiente en vitamina A, tiene la ruta metablica incompleta). A partir del isopentil
pirofosfato se sintetiza geranil-geranil difosfato (hasta aqu existe en la planta), las
rutas que le siguen no estn presentes en la planta porque faltan las enzimas (se
insertan a partir de bacterias que s que sintetizan estas enzimas). El resultado es un
arroz que acumula el beta-caroteno (y por tanto tambin su color: el arroz es
anaranjado -Golden rice-)
- Terpenoides: El Tocoferol es la vitamina E, hay distintos tipos (gamma tocoferol
tiene ms actividad que alfa tocoferol, que es el que producen las plantas). Se ha
logrado transformar Arabidopsis para que acumule gamma tocoferol en vez del alfa
tocoferol.
La Artemisina es un antimalrico sintetizado por la Artemisia. Se ha logrado
transformacin la Artemisia con un gen heterlogo para aumentar la produccin de
Artemisina.
52

- Polihidroxialcanoatos: polmeros plsticos con propiedades biodegradables

(utilizados en champs). Muy empleado el polihidroxibutirato (no lo puede sintetizar la
planta pero s algunos determinados tipos de bacterias). Se ha conseguido transformar
Arabidopsis thaliana para que incorpore toda la ruta de biosntesis de los
polihidroxibutiratos, obtenindose plantas cuyos cloroplastos que acumulan
polihidroxibutirato.

5. Aspectos legales, ticos, sociales y de mercado

Los organismos modificados genticamente (OMG) estn regulados por la ley, se
pretende asegurar la inocuidad de su uso.
La utilizacin de OGM plantea importantes problemas ticos:
- Quin se beneficia de esta tecnologa? Quin pierde?
- Cmo, para qu y para qun se est produciendo?
- Se puede plantear la constitucin gentica de los seres vivos?
- Cules son las consecuencias para el ambiente y la salud
- La mayor parte de los OGM no han sido destinadas para aumentar la cantidad de
alimentos, mejorar el valor nutricional de alimentos, etc. La realidad es que se han
desarrollado para aumentar los beneficios.
- Los pases subdesarrollados no pueden limitarse a ser meros consumidores
de los productos de los pases desarrollados.
- Necesidad de amortiguar los efectos socioeconmicos y culturales
desfavorables que la introduccin a gran escala de OGM puede plantear a amplios
estratos de la poblacin del planeta (abandono de cultivos.......)

53