Vidas Medias de Estados Excitados

INTRODUCCIN
La espectroscopa se dedica al estudio e interpretacin de los sistemas materiales
mediante la radiacin electromagntica con la que interaccionan. Es capaz de proporcionar
un gran nmero de propiedades estructurales, elctricas o energticas.
Espectro de absorcin: Espectro que presenta una secuencia de frecuencias, en un
intervalo relativamente ancho, correspondientes a los fotones absorbidos por una sustancia,

generalmente representando el coeficiente de absorcin en funcin de la frecuencia o

longitud de onda. El sistema sufre una transicin de un estado de menor energa En a una de
mayor energa Em, gracias a la energa del fotn (h ):

A( En ) hv A( Em )

Espectro de emisin: Espectro que presenta uma secuencia de frecuencias, en un

intervalo relativamente ancho, correspondiente a los fotones emitidos por uma fuente,
generalmente representando la potencia radiante emitida em funcin de la frecuencia o
longitud de onda. El sistema sufre uma transicin de um estado de mayor energia Em a uno
de menor energia En, emitiendo El exceso de energa (hn) em forma de fton:

A( Em ) hv A( En )

Espectmetro: Es el instrumento ptico que detecta las caractersticas de la luz

absorbida,

emitida

dispersada

por

una

muestra

atmica

molecular.

Componentes: A) Fuente (lmpara) estable, direccionable, de larga vida y con distribucin

de energa espectral continua. B) Monocromador para aislar las radiaciones de longitud de
onda deseada (luz monocromtica). Suele constar de rendijas, lentes y prismas. C) Celda
que alberga la muestra (depositada en una cubeta) y donde tiene lugar la interaccin
materia-radiacin. C) Detector, que responda al nmero de fotones (luz transmitida o no
absorbida), y los convierta en seal (voltaje) para procesar y mostrar su valor.
Luminiscencia: Emisin de luz desde un estado electrnicamente excitado. Se alcanza
el estado excitado por absorcin de luz en:

Fluorescencia: Cuando el tiempo de vida media de los estados excitados

involucrados es del orden de nanosegundos.

Fosforescencia: Cuando el tiempo de vida media es del orden de microsegundos

o ms (minutos, horas, das, etc.)
Espectrometra de fluorescencia

Las molculas tienen diferentes estados llamados niveles de energa. La espectrometra

de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrnicos. En
general, las especies objeto de examen tendrn un estado electrnico basal (un estado de
baja energa) de inters, y un estado electrnico excitado de mayor energa.
En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la
absorcin de un fotn de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos
estados vibracionales del estado electrnico excitado. Las colisiones con otras molculas
causan que la molcula excitada pierda energa vibracional hasta que alcanza el estado
vibracional ms bajo del estado electrnico excitado.
La molcula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibracin del estado
electrnico basal, emitiendo un fotn en el proceso. Como las molculas pueden caer a
cualquiera de los diferentes niveles de vibracin en el estado basal, los fotones emitidos
tendrn diferentes energas y, por lo tanto, frecuencias.
En un experimento tpico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida
por una muestra, manteniendo la luz de excitacin a una longitud de onda constante. A esto
se le llama espectro de emisin. Un espectro de excitacin se mide mediante el registro de
una serie de espectros de emisin utilizando luz de diferentes longitudes de onda. Los
dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluormetros o fluormetros.

Instrumentos
Un fluormetro (Figura 1) consta de una fuente de luz y de un sistema de seleccin de
longitud de onda de excitacin. Cuando la muestra es excitada con radiacin de energa
apropiada emite radiacin en todas las direcciones del espacio. No obstante la luz emitida
se detecta mejor en ngulo recto con respecto al haz de excitacin ya que se evitan
problemas de dispersin de la luz y tambin el haz de luz excitante que es de mucha mayor
intensidad que el haz de luz emitida. La luz emitida es recogida seleccionando una longitud

de onda apropiada y conducida a un detector donde queda registrada por sistemas similares
a los de un espectrofotmetro de absorcin.

Figura 1

En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos:

Fluormetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz

fluorescente.

Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo de difraccin para

aislar la luz incidente y la luz fluorescente.

Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de

excitacin pasa a travs de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una parte
de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las molculas de la muestra
producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte
de esta luz fluorescente pasa a travs de un segundo filtro o monocromador y llega a un
detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90 con respecto al haz de luz incidente para
minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o transmitida llegue al detector.
Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitacin, incluyendo el
lser, fotodiodos y lmparas; arcos de xenn y lmparas de vapor de mercurio. Un lser
slo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por lo
general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitacin o el filtro. La
desventaja de este mtodo es que la longitud de onda de un lser no se puede cambiar

mucho. Una lmpara de vapor de mercurio es una lmpara lineal, lo que significa que emite
luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un arco de xenn tiene un
espectro de emisin continuo con intensidad casi constante en el rango de 300-800 nm, y
una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo por encima de 200 nm.
En los fluormetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador
transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo ms comn de
monocromador utiliza un retculo de difraccin; es decir, la luz colimada entra en una
rejilla y sale con un ngulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El
monocromador puede entonces seleccionar qu longitudes de onda transmite. Para permitir
mediciones de anisotropa se aaden dos filtros de polarizacin: uno despus del
monocromador de excitacin o filtro, y otro antes del monocromador de emisin o filtro.
Como se mencion antes, la fluorescencia se mide ms a menudo en un ngulo de 90 en
relacin a la luz de excitacin. Esta geometra se utiliza en lugar de colocar el sensor en la
lnea de la luz de excitacin en un ngulo de 180 a fin de evitar la interferencia de la luz de
excitacin transmitida. El monocromador no es perfecto y transmitir la luz con otras
longitudes de onda diferentes a las establecidas. Un monocromador ideal slo transmite luz
en el rango especificado y tiene una transmisin independiente de la longitud de onda. Al
medir en un ngulo de 90, slo la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce
en una mejor relacin seal-ruido, y reduce el lmite de deteccin a un factor de
aproximadamente 10000, si se compara con la geometra de 180. Por otra parte, la
fluorescencia tambin puede ser medida desde la parte delantera, procedimiento que se
utiliza a menudo para las muestras turbias.
El detector puede ser de un solo canal o de mltiples canales. El detector de un nico
canal slo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento, mientras
que el de mltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes de onda
simultneamente, con lo que el monocromador de emisin o filtro es innecesario. Los
diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y desventajas.
El fluormetro ms verstil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de
excitacin continua, puede registrar tanto un espectro de excitacin como un espectro de
fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de

excitacin se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta absorcin,

y el monocromador de emisin escanea el espectro. Para medir los espectros de excitacin,
la longitud de onda que pasa a travs del filtro o monocromador de emisin se mantiene
constante y el monocromador de excitacin va escaneando. El espectro de excitacin
generalmente es idntico al espectro de absorcin, ya que la intensidad de la fluorescencia
es proporcional a la absorcin.

Vidas medias de estados excitados

Es el tiempo promedio que un fluorforo pasa en el estado excitado antes de volver al
estado basal (por cualquier va). La luminiscencia decae exponencialmente. Es corto en el
orden de 10 ns. Para determinarlo se usa un pulso de luz de alta intensidad y corta duracin
para excitar la muestra y luego se registra el nmero de fotones en funcin del tiempo,
visualizando un decaimiento lineal cuya pendiente nos permite calcular el tiempo de vida.
Los espectrgrafos actuales se encargan de hacer este proceso, solo hay que ingresar los
parmetros y configurar el software donde despus el espectrgrafo que est conectado a la
computadora se encarga del anlisis mostrando los resultados en pantalla.

APLICACIONES
La espectroscopa de fluorescencia tiene varias aplicaciones, por ejemplo:

Permite identificar molculas de forma especfica

Permite estudiar procesos dinmicos a nivel molecular:

Plegamiento de protenas

Comportamiento hidrodinmico de molculas en solucin

Interaccin entre ligandos

Determinacin fluorimtrica de especies inorgnicas

Determinacin fluorimtrica de especies orgnicas y bioqumicas

Medicin de espectros de emisin de fluorescencia de fluorforos orgnicos,

inorgnicos, nanopartculas o muestras biolgicas en cualquier disolvente,
acuoso u orgnico y en un rango entre el UV cercano y el infrarrojo.

Medicin de tiempos de vida media de estados excitados.

Medicin de espectros de emisin y tiempos de vida media de fosforescencia.

Anlisis de muestras a temperatura variable mediante el empleo del criostato

OptistatDN.

Secuenciacin de DNA

Seguridad alimentaria y medioambiental, mediante la deteccin de distintos

contaminantes de gran importancia en distintos mbitos

Estudio a travs de medidas de fluorescencia, de las velocidades y mecanismos

de reaccin que tienen en escalas ms rpidas que el microsegundo, as como el
estudio de los tiempos de vida de los reactivos.

Medicin de fluorescencia de materiales polimricos.

Caracterizacin precisa de nanomateriales y medidas relacionadas con la

fluorescencia resuelta en el tiempo.

deteccin de intermedios de reaccin con vidas medias cortas en los

correspondientes ciclos catalticos.

REFERENCIAS

A.P. Thorne. Spectrophysics. Second Edition. Academy Press.

A. Thulasiramudu, S. Buddhudu. Optical characterization of Mn2+, Ni2+ and

Co2+ ions doped zinc lead borate glasses. Journal of Quantitative Spectroscopy
& Radiative Tranfer.