La Huella Dactilar de Plasmidos (PF)

La huella dactilar de plasmidos fue la primera tcnica molecular utilizada como

una herramienta de tipificacin. Los plasmidos son elementos de ADN
extracromosmico que estn presentes en muchos aislamientos clnicos y
pueden ser identificados por simples procedimientos de lisis de clulas
seguidos de electroforesis en gel de los lisados. El nmero y tamao de los
plasmidos presentes es utilizado como base para la identificacin de cepas.
Esta tcnica de tipificacin de cepas ha sido utilizada con xito en el anlisis de
brotes de infecciones nosocomiales y en infecciones adquiridas en comunidad
causadas por una variedad de especies de bacterias gram-negativas (Tenover
et al., 1997).

En general esta tcnica es ms utilizada para estudios epidemiolgicos que

estn limitados tanto temporalmente como geogrficamente y puede
complementar otras tcnicas como la PFGE, para proporcionar una base para
diferenciar aislamientos que estn relacionados genotpicamente pero que
estn separados epidemiolgicamente por periodos moderados de tiempo,
como a varios meses (Tenover et al., 1997).

Anlisis de Endonucleasas de Restriccin de ADN de Plasmidos (REAP).

En la actualidad esta tcnica es utilizada principalmente como una alternativa
para los aislamientos de estafilococos que contienen frecuentemente
plasmidos mltiples, y para seleccionar especies de Enterobacteriaceae que
tienen a menudo grandes plasmidos caractersticos.

Algunas cepas de bacterias contienen solamente un plasmido grande, de un

rango de tamao de 100 a 150 Kilobases (kb). Debido a que es difcil de
diferenciar plasmidos en este rango de tamao, especialmente los que varan
solamente de 10 a 15 kb, algunos investigadores han adicionado una
endonucleasa de restriccin para aumentar el poder de discriminacin de la
electroforesis en gel de agarosa. Esto puede ser til cuando los plasmidos
grandes producen muchos fragmentos de restriccin que puede hacer la
interpretacin ms difcil, especialmente cuando estn presentes plasmidos
mltiples grandes (Tenover et al., 1997).

Actualmente, la REAP ha mejorado en su reproducibilidad y poder de

discriminacin por lo que es la tcnica preferida de tipificacin de plasmidos y
es de particular inters para la realizacin de estudios epidemiolgicos de
infecciones institucionales con organismos resistentes a mltiples antibiticos.
Utilizado conjuntamente con delineacin clonal por tipificacin de ADN
cromosmico, es esencial para localizar la diseminacin de genes de
resistencia antibitica mviles como los que codifican los beta-lactamasa de
amplio espectro (Struelens, 2001).

Anlisis del Polimorfismo de Largos Fragmentos Amplificados (AFLP)

Una de las tcnicas nuevas y ms promisorias es el AFLP desarrollado por
Keygene BV, Wageningen, de Nueva Zelanda. Este mtodo combina una
aplicabilidad universal con alto poder de discriminacin y reproducibilidad. Un
gran nmero de reportes describen el uso de esta tcnica para plantas y
mapeo gentico animal, diagnsticos clnicos, estudios filogenticos, y
tipificacin de bacterias (Savelkoul et al., 1999).

Est basada en la deteccin de fragmentos de restriccin genomica por

amplificacin con reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y puede ser
utilizada para ADNs de cualquier origen o complejidad. La tcnica comprende
tres pasos: 1) la restriccin del ADN y la ligazn de adaptadores
oligonucletidos, 2) la amplificacin selectiva de juegos de fragmentos de
restriccin, y 3) anlisis del gel de los fragmentos amplificados (Vos et al.,
1995; Savelkoul et al., 1999; Struelens, 2001).

El ADN es cortado con enzimas de restriccin, y los adaptadores de la doble

hebra estn ligados al final de los fragmentos del ADN para generar la plantilla
de ADN para amplificacin. La secuencia de los adaptadores y el sitio de
restriccin adyacente sirve como sitios de unin de los primer para la
subsecuente amplificacin de los fragmentos de restriccin (Vos et al., 1995).

Para el anlisis del AFLP solamente se necesita una pequea cantidad de ADN
genomico purificado; este es digerido como ya se menciono con dos enzimas
de restriccin , una con una frecuencia media de corte (como la EcoRI) y una
segunda con una alta frecuencia de corte (como la MseI o TaqI) (Savelkoul et
al., 1999). La infrecuente restriccin de los sitios de amplificacin, o IRS-PCR,
es otra variacin de esta propuesta que esta basada en la amplificacin

selectiva de secuencias de ADN con sitios de restriccin infrecuentes a los

lados.

Tiene un alto poder discriminatorio que se ajusta fcilmente y un muy buen

nivel del patrn de reproducibilidad para un amplio rango de bacterias
patgenas tanto Gram positivas como negativas (Struelens, 2001).
Anlisis de la secuencia de los nucletidos
La secuenciacin de nucletidos de genes amplificados por PCR es el medio
ms preciso y sensitivo de indexar el polimorfismo del ADN localizado para la
tipificacin de cepas bacterianas. Sin embargo, el tiempo requerido y los costos
del procedimiento actualmente limitan el uso de este mtodo cuando se ha
aplicado a varios tipos de virus como el de la hepatitis y el VIH, pero tambin a
bacterias como los Streptococcus pyogenes. Con el rpido progreso de la
automatizacin, es probable que en los siguientes aos la resecuenciacin con
PCR pueda ser utilizada para la tipificacin epidemiolgica de virus, bacterias y
otros patgenos (Struelens, 1998).