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LASETAPASPREVIASDELANLISIS
AMBIENTALCONELUSODESISTEMAS
SUPRAMOLECULARES
TESISDOCTORAL
NoeliaLuquePlata
Crdoba,Juliode2012
TCNICASINTEGRADASSIMPLIFICADASENLASETAPASPREVIAS
DELANLISISAMBIENTALCONELUSODESISTEMAS
SUPRAMOLECULARES
MemoriapresentadaparaaspiraralgradodeDoctorpor
LADOCTORANDA,
quelofirmaenCrdoba,a2deJuliode2012
Fdo.:NoeliaLuquePlata
LicenciadaenCienciasAmbientales
ConelVBde
LADIRECTORA,
Fdo:Dra.Soledad.RubioBravo
CatedrticadelDepartamentodeQumicaAnaltica
delaUniversidaddeCrdoba
DOCTORANDO/A:NOELIALUQUEPLATA
INFORMERAZONADODEL/DELOSDIRECTOR/ESDELATESIS
Las investigaciones que se incluyen en esta Tesis Doctoral han tenido como
objetivo general simplificar e integrar las diferentes operaciones que constituyen la
etapa de tratamiento de muestras ambientales haciendo uso de disolventes y
adsorbentes supramoleculares. Se ha demostrado que estos sistemas extractantes
proporcionandiferentesmicroambientesdentrodesuestructuratridimensionaldonde
seincrementalaestabilidaddelamayoradeloscompuestosorgnicos.Estapropiedad,
unidaalagrancapacidaddeextraccindelossistemassupramoleculares,derivadade
losdiferentestiposdeinteraccionesqueestablecenyelgranelgrannmerodecentros
enlazantes que ofrecen, y su compatibilidad con cromatografa de lquidos y distintos
sistemas de deteccin, han hecho posible el desarrollo de metodologas analticas
simplesyrpidasparaladeterminacindecontaminantesprioritariosyemergentesen
muestrasambientales.Losobjetivoscientficosconcretosqueseplantearonaliniciode
laTesisfuerondosyenellossehacentradolalabordeladoctorandaDa.NoeliaLuque
Plataduranteeldesarrollodelamisma.
Elprimerobjetivotuvocomofinalidadexplorarlacapacidaddelosdisolventes
y adsorbentes supramoleculares para integrar las etapas de extraccin, estabilizacin,
preconcentracin y limpieza de contaminantes prioritarios. Se ha incidido en aquellos
contaminantes para los que las metodologas convencionales no ofrecen respuesta
adecuada para su monitorizacin en campaas ambientales en las que se requiere la
recogida y anlisis no inmediato de un gran nmero de muestras. Estos estudios han
permitido el desarrollo de tres mtodos analticos para la determinacin de
Elsegundoobjetivofuedesarrollarnuevasmetodologasbasadasenagregados
supramolecularesparaladeterminacindecontaminantesemergentes,concretamente
sustancias perfluoroalquiladas, en muestras biolgicas. Como resultado se pusieron a
punto dos mtodos simples, rpidos y con elevado rendimiento de extraccin para la
determinacindeestassustanciasentejidosdeavesypecesysuerosanguneo.Eneste
contexto, se desarroll una nueva metodologa para eliminar o reducir
considerablemente el efecto espacio carga frecuentemente presente en la
cuantificacin de contaminantes en muestras ambientales cuando se usa
espectrometrademasascontrampainica
Portodoello,seautorizalapresentacindelatesisdoctoral.
Crdoba,a2dejuliode2012
Fdo.:SOLEDADRUBIOBRAVO
CERTIFICA:QuelacitadaTesisDoctoralTcnicasintegradassimplificadasenlas
etapaspreviasdelanlisisambientalconelusodeagregadossupramoleculares
seharealizadoenloslaboratoriosdelDepartamentodeQumicaAnalticadela
Facultad de Ciencias de la Universidad de Crdoba y que, a mi juicio, rene
todoslosrequisitosexigidosaestetipodetrabajo.
Dra.Soledad.RubioBravo
CatedrticadelDepartamentodeQumicaAnaltica
delaUniversidaddeCrdoba
A mis padres,
que me lo han dado todo
Mis Agradecimientos:
En primer lugar quiero agradecer a M Dolores Prez Bendito y
Soledad Rubio Bravo la oportunidad que me dieron de formar parte de su
grupo de investigacin.
Asimismo, agradezco al Ministerio de Educacin y Ciencia la
concesin de una beca de Formacin de Profesorado Universitario (FPU), con
referencia AP-2004-3644, que me ha posibilitado la dedicacin a esta Tesis
Doctoral durante cuatro aos, as como el apoyo econmico del grupo de
investigacin FQM-186 que ha cubierto el resto del tiempo necesario hasta la
finalizacin de la misma.
Gracias a todas aquellas personas que han dedicado parte de su tiempo
a ensearme conocimientos de Qumica Analtica y sobre todo a investigar.
Mencin especial merece Ana Ballesteros por guiarme tan acertadamente en
nuestros ltimos trabajos de perfluoros y bisfenol A.
Estoy profundamente agradecida a todos mis compaeros y amigos
analticos por los momentos de discusin de resultados y bsqueda de
soluciones, por animarme y ayudarme cuando ya no poda ms, por las risas,
peroles, cafs y cervezas compartidas y por su paciencia conmigo. He
aprendido de todos, habis sido suelo en mi camino diario y peldaos en mis
ascensos durante esta etapa de mi vida. Me llevo grandes amigos y solo por eso
ya ha merecido la pena esta Tesis Doctoral. Sin nimo de ofender a nadie no
puedo pasar este prrafo sin nombrar a 4 analticos especiales para m. A
Antonio por sus infinitos consejos, por ser un amigo de verdad, de esas
personas tan honestas y tan autnticas que son difciles encontrar, que suerte
haberte conocido . A Amalia por llenar de alegra nuestro cuartito, por bailar
Jamiroquai como una loca o cantar La llorona de Chavela Vargas esas tardes
en las que las experiencias parecan no tener fin, porque hemos redo y llorado
muchas veces juntas y porque siempre te llevo en mi corazn. Y a Francisco y
Anita porque en los ltimos aos he pasado ms tiempo con ellos que con mi
familia y ya se sabe que el roce hace el cario!... y por muchas cosas ms que
no hace falta explicar me siento muy unida a vosotros dos.
Y no pueden faltar en estos agradecimientos mis nias y Rafita y
todos mis amigos fuera del labo (Eu y Mari vosotros tambin estis
incluidos), expertos muchos de ellos en coacervacin y espectrometra de masas
de tanto escuchar mis problemas analticos!. Como olvidar esas meriendas tan
riquisimas en Casa Molina-Barranco (centro neurlgico de operaciones), esas
etapas de senderismo que reconfortan cuerpo y alma despus de horas
caminando a vuestro lado, esas veladas en el bar de mi cochera despus de un
duro da de trabajo, esos conciertos de Take That en primera fila que pasamos
Lolita y yo todo un ao planeando, esos cumpleaos todos juntos y
ltimamente tambien bodas en definitiva mil gracias por estar siempre a mi
lado ao tras ao compartiendo las alegras y las penas, porque everything
changes but you Os quiero mucho, qu triste sera mi vida sin vosotros!
Gracias a mi Sito por soportarme, apoyarme y animarme en los
momentos de desanimo que no han sido pocos. Y sobre todo gracias por tener
tanta fe en mi, por quererme tal y como soy y por hacerme tan feliz.
Y a mis abuelos y mi hermano por estar siempre ah.
Por ltimo eternamente agradecida a mi amado y castigado planeta
Tierra por proporcionarme folios donde poder imprimir esta Tesis, energa para
encender mi ordenador, caf para despejarme y aire para poder respirar. Con la
esperanza de que algn da todos los recursos naturales estn protegidos y
alcancemos el desarrollo sostenible, because the earth matters.
Gracias a todos,
Noelia.
NDICE
OBJETO ...............................................................................................................1
CONTENIDO........................................................................................................7
INTRODUCCIN................................................................................................11
1. ANLISISAMBIENTAL:MARCOLEGISLATIVO...........................................13
2. RETOSYTENDENCIASENELANLISISAMBIENTAL .................................23
2.1.
Aspectosgenerales................................................................... 23
2.2.
Muestreoambiental................................................................. 25
2.3.
Preparacindemuestrasambientales..................................... 30
2.3.1.
Muestrasacuosas..................................................................... 30
Muestrasslidasambientalesybiolgicas .............................. 62
Compuestosvoltilesysemivoltiles....................................... 71
2.4.
Tcnicasdeseparacinydeteccin ......................................... 75
2.4.1.
Cromatografadegases/espectrometrademasas. ................ 75
2.4.2.
Cromatografadelquidos/espectrometrademasas. ............ 76
2.4.3.
Electroforesiscapilar. ............................................................... 79
CAPTULO3:Useofcoacervatesfortheonsiteextraction/preservation
ofpolycyclicaromatichydrocarbonsandbenzalkoniumsurfactants ........ 125
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.3.
2.3.1.
Estabilizacinenadsorbenteshemimicelares/admicelares .. 224
2.3.2.
2.4.
3. DESARROLLODENUEVASMETODOLOGASPARALADETERMINACIN
DESUSTANCIASPERFLUOROALQUILADASENMUESTRASBIOLGICAS. ... 238
3.1.
3.2.
3.2.1.
3.2.2.
Extraccinypreconcentracin............................................... 247
3.3.
Cuantificacin......................................................................... 255
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
3.3.4.
Veracidad................................................................................ 264
3.3.5.
3.3.6.
Anlisisdemuestras............................................................... 266
CONCLUSIONES ..............................................................................................269
APNDICES .....................................................................................................275
OBJETO
Objeto
El estudio de la calidad de ecosistemas naturales y contaminados
requiere el anlisis de un nmero elevado de muestras para la obtencin de
resultadosrepresentativosdadalagranvariabilidadespacialytemporalconla
que se distribuyen los contaminantes. Por otro lado, los contaminantes estn
presentes a muy baja concentracin en los sistemas acuticos lo que exige la
recogida de volmenes elevados de muestra para el anlisis y plantea serios
problemas de estabilidad. Por tanto, un aspecto clave en campaas de
monitorizacin es disponer de estrategias que simplifiquen e integren los
procesos de toma de muestra, transporte, conservacin y tratamiento de la
misma.Entrelasestrategiasquesehanpropuesto,elusodeextraccinenfase
slida on site ha adquirido gran aceptacin, dado los requerimientos mnimos
exigidos para el transporte, y en muchos casos para la conservacin de las
muestras. Es interesante por tanto investigar el uso de nuevas fases
adsorbentes para extraccin en fase slida, as como desarrollar nuevos
mediiosdeestabilizacin, conelfinde ampliarsuaplicacinal mayornmero
posibledecontaminantesytiposdemuestrasymejorarlasprestacionesdelos
sistemaspropuestoshastalafecha.
-3-
c) Lasntesisdelasestructurastridimensionalesqueconformanlosagregados
seproducedeformaespontneay,porlotanto,estalalcancedecualquier
laboratorio
d) Presentanbajavolatilidadeinflamabilidad,loquehacequelosprocesosde
extraccin sean menos contaminantes y ms seguros. Se adaptan a los
principiosdelaQumicaverde
e) Proporcionanmicroambientesqueevitanladegradacindelosanalitos.
f)
Seadaptanalosformatosconvencionalesyminiaturizadosdeextraccin
1) Evaluarlacapacidaddelossistemassupramolecularesparalasimplificacin
delasoperacionespreviasenladeterminacindecontaminantesorgnicos
prioritariosenmuestrasacuosas
-4-
Objeto
Paralelamente,laformacindeladoctorandamedianteeldesarrollo
deactividadescomplementariasalalaborinvestigadora,comolapublicacin
de artculos cientficos y la asistencia y presentacin de comunicaciones a
congresos,constituyeunobjetivofundamentaleneldesarrollodeestaTesis.
-5-
CONTENIDO
Contenido
ElcontenidodelaMemoriadeestaTesisDoctoralsehaestructuradoen
dos partes, precedidas de una Introduccin en la que se desarrolla el marco
legislativoylosretosytendenciasdelanlisisambiental.Enestaintroduccinse
profundizaenaspectostericosyprcticosrelacionadosconlosadsorbentesy
disolventes supramoleculares tales como tipos de agregados, formacin,
mecanismos de solubilizacin, modos de operacin y aplicaciones en procesos
deextraccin.
LoscontenidosdelasdospartesenlasquesehadivididoestaMemoria
sonlossiguientes:
PARTEI:Sistemassupramoleculares paralasimplificacindelasoperaciones
previas en la determinacin de contaminantes en muestras acuosas. En este
bloque se presentan en tres captulos los resultados obtenidos en las
investigaciones realizadas para evaluar la capacidad de los sistemas
supramoleculares para simplificar las operaciones previas en procesos
analticos.Enlosdosprimeroscaptulossedesarrollandosmetodologasparala
extraccin/preconcentracin y estabilizacin de tensioactivos de benzalconio y
plaguicidas.Conestefin,seempleanhemimicelasdedodecilsulfatoyadmicelas
mixtas de dodecilsulfato y tetrabutilamonio sobre almina como adsorbentes
paralaextraccin enfaseslidadeestoscontaminantesenmuestrasdeagua
naturales (fluviales y subterrneas) y residuales. En el tercer captulo se
proponen los disolventes supramoleculares de micelas acuosas de cido
dodecanosulfnicoparaextraer/preconcentraryestabilizarlostensioactivosde
benzalconioehidrocarburosaromticospolicclicos(PAHs)enaguasresidualesy
fluviales. Los estudios de estabilidad de los analitos en los diferentes
adsorbentesydisolventesinvestigadosserealizaronendistintascondicionesde
temperatura, iluminacin y acidez durante un periodo de tres meses. Las
metodologas desarrolladas permiten la determinacin de los contaminantes
prioritariosseleccionadosalnivelexigidoporlalegislacinvigente.
-9-
Acontinuacin,seincluyeenlaMemoriaunaseccindondesediscuten
de forma global los resultados de esta Tesis, destacando las aportaciones ms
relevanteseinnovadorasyporltimosepresentanlasconclusionesobtenidas
delostrabajosdeinvestigacinrealizados.
- 10 -
INTRODUCCIN
Introduccin
1.
ANLISISAMBIENTAL:MARCOLEGISLATIVO
Sinoscentramosenlaherramientalegislativavigenteparaelcontrolde
la contaminacin en materia de aguas, Europa se rige por la Directiva
2000/60/CE,tambindenominadaDirectivaMarcodelAgua(DMA)[2].Estase
caracteriza por presentar una visin global y un marco de accin local, y
especificarlasmedidasatomarparaconseguirlaproteccinintegradadelagua
ylacalidadqumicayecolgicadelamisma,mediantelareduccinprogresiva
de la contaminacin existente y, en el caso de las denominadas sustancias
peligrosasprioritarias,medianteelceseolaprogresivaeliminacindevertidos,
emisiones y fugas. Esta Directiva tambin resalt dos mbitos en que era
necesariaunanormativamsespecfica:lasaguassubterrneasylassustancias
prioritarias.
[1] The state of our river: EU-wide survey results. (Disponible en: http://ec.europa.eu/
environment/integration/research/newsalert/pdf/139na4.pdf).
[2] DO L 327 de 22.12.2000, p. 1 Directiva 2000/60/CE del Parlamento Europeo y del
Consejo, de 23 de octubre de 2000, por la que se establece un marco comunitario de
actuacin en el mbito de la poltica de aguas.
- 13 -
dinmica(Directiva2008/105/CE)queserevisacadacuatroaos[3].Estaslistas
contienen una variedad de compuestos orgnicos, inorgnicos y metales
consideradospeligrososparalasaludhumanay/odelmedioambiente.Muchos
de estos compuestos, como los hidrocarburos aromticos policclicos, los
plaguicidas y la mayor parte de los metales, han sido objeto de estudio y
regulacin durante dcadas. Otros, por el contrario, han sido incluidos en las
listasdesustanciasprioritariasrecientemente.Esteeselcaso,porejemplo,de
los alquilfenoles (productos de degradacin de detergentes de tipo alquilfenol
etoxilado), de los difenilteres bromados (utilizados fundamentalmente como
retardantes de llama) o los ftalatos, considerados hasta hace poco como
contaminantesemergentes.Loscontaminantesemergentessoncontaminantes
previamente desconocidos o no reconocidos como tales, cuya presencia en el
medio ambiente no es necesariamente nueva pero si la preocupacin por las
posibleconsecuenciasdelamisma[4,5].Porlotantosuelenestarpocoonada
investigados, hay escasez o ausencia de datos ambientales y faltan mtodos
analticos adecuados para su determinacin, lo cual dificulta su estudio en las
campaasdemonitorizacinambiental.Entreestoscontaminantesemergentes
actualmente destacan los frmacos, las hormonas, compuestos alteradores
endocrinos (EDCs) como el bisfenol A, el cido de perfluorooctano sulfonato
(PFOS) y otros compuestos perfluorados, nanomateriales, productos derivados
de la desinfeccin de aguas potables y piscinas, productos de degradacin de
pesticidas, el perclorato, ciertas toxinas de algas, filtros ultravioleta,
benzotriazoles,dioxano,arsnico,metiltertbutilterycidosnaftnicos.
- 14 -
Introduccin
contralacontaminacinyeldeterioro[6]ysehapropuestootrarelativaalas
normasdecalidadambientalenelmbitodelapolticadeaguas,porlaquese
modifica la Directiva 2000/60/CE, en la que se definen concentraciones
mximas admisibles y medias anuales para las sustancias consideradas como
prioritariasyotroscontaminantesenaguassuperficialesybiota[3].
Enaplicacindelartculo5delaDMA,losEstadosmiembrostenande
plazo hasta diciembre de 2004 para elaborar un anlisis de las caractersticas
particulares de cada distrito hidrogrfico, un estudio de la incidencia de la
actividadhumanasobrelasaguas,unanlisiseconmicodesuusoyunregistro
de las zonas que necesitan una proteccin especial, utilizando ante todo la
informacin existente. Por lo general, casi todos los Estados miembros
dedicaron considerables esfuerzos a este primer anlisis, creando una base de
informacin que nunca haba existido a escala comunitaria. Los resultados
mostraronqueporcentajeselevadosdemasasdeaguacorranelriesgodeno
alcanzar los objetivos previstos, los cuales estaban claramente vinculados a
zonasyregionesdensamentepobladasenlasquesehacaunusointensivoya
menudonosostenibledelagua.
[6] DO L 372 de 27.12.2006, p.19 Directiva 2006/118/CE del parlamento europeo y del
consejo de 12 de diciembre de 2006 relativa a la proteccin de las aguas subterrneas
contra la contaminacin y el deterioro.
- 15 -
En2007laComisinEuropeallevacabounestudioparadeterminarel
estadodelosrosyarroyosdelaUninEuropea[7].Serecogieronnumerosas
muestras de agua, concretamente en 122 puntos de muestreo de ms de 100
puntos hidrogrficos de toda Europa, y se enviaron a analizar a un centro de
investigacin asociado a la Comisin Europea. Gracias a estos anlisis se
identificaron un nmero importante de contaminantes y pudo realizarse una
estadstica sobre las mayores emisiones y frecuencia de aparicin en los
diferentes ros. Slo el 10 % de los ros estudiados pudieron clasificarse como
muy limpios en trminos de contaminacin qumica y se puso de relieve la
necesidad de incrementar las medidas para frenar el deterioro de los ros
europeos. El estudio tambin destac la necesidad de anticipar los problemas
ambientalesderivadosdelautilizacindeproductosqumicosenEuropa.
- 16 -
Introduccin
EnrelacinconelusodelassustanciasqumicasenEuropa,hastahace
poco,lalegislacineuropearelativaalosproductosqumicoseraunmosaicode
distintasnormativasyreglamentos,ynosedisponadesuficienteinformacin
para evaluar y controlar las sustancias qumicas de forma eficaz. La nueva
poltica europea REACH [8], cuyas siglas en ingls corresponden a registro,
evaluacinyautorizacin desustanciasqumicas,entrenvigorel1dejunio
de2007ycreunsistemanormativonicoparaeltratamientodelassustancias
qumicas. Este sistema pretende acabar con las carencias informativas que
existan hasta la fecha, y hace recaer sobre la industria una mayor
responsabilidad sobre la gestin del riesgo de los productos qumicos y la
informacin en materia de seguridad que se debe proporcionar a los usuarios
profesionales.Todaslosempresasquefabricanoimportanalmenos1tonelada
de sustancias qumicas al ao deben registrarlos en la Agencia Europea de
Sustancias y Preparados Qumicos (ECHA), y presentar informacin sobre sus
propiedades,usosylosmediosparamanipularlosdeformasegura.Adems,los
productores e importadores tienen que transmitir la informacin sobre
seguridadpertinenteatodoslosqueutilicenlassustanciaseneltranscursode
su actividad industrial o profesional. De este modo se garantiza que se sepa
cmo utilizarlas sin riesgo para los trabajadores, los consumidores y el medio
ambiente.LaECHA,consedeenHelsinki,seencargadegestionareldaadade
los procesos de registro, evaluacin, autorizacin y restriccin de sustancias
qumicas. Las empresas necesitarn autorizacin para poder utilizar sustancias
qumicas que provocan cncer, mutaciones o problemas en el sistema
reproductivo,oqueseacumulanennuestroorganismoyenelentornoyestas
noseconcedernsilaempresaencuestinnodemuestraunadecuadocontrol
de los riesgos. El objetivo final de esta poltica es fomentar la sustitucin
progresivaydefinitivadelassustanciasmspeligrosasporunaalternativams
[8] DO L 369 de 30.12.2006, p.1 Reglamento (EC) n 1907/2006 del Parlamento Europeo
y del Consejo de 18 de Diciembre de 2006 relativo al registro, la evaluacin, la
autorizacin y la restriccin de las sustancias y preparados qumicos (REACH), por el
que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Preparados Qumicos, se modifica la
Directiva 1999/45/CE y se deroga el Reglamento (CEE) n793/93 del Consejo y el
Reglamento (CE) n 1488/94 de la Comisin as como la Directiva 76/769/CEE del
Consejo y las Directivas 9/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE y 2000/21/CE de la
Comisin.
- 17 -
segura y cabe la posibilidad de que se impongan restricciones o prohibiciones
sobre la produccin, introduccin en el mercado o uso de determinadas
sustanciasqueplanteenriesgosinaceptablesparalasaludoelmedioambiente.
- 18 -
Introduccin
determinadas tcnicas de produccin o transformacin de alimentos [15].
Adems,sehanadoptadomedidasparalimitarlacontaminacinacausadela
polucin del agua o el aire [16] o por exposicin a la radiactividad [17] y se
controlan tambin los riesgos de contaminacin por organismos modificados
genticamente[18]yporenvasesalimentarios[19].
- 19 -
1881/2006 [21] fija para una serie de alimentos, los contenidos mximos
admisibles de nitratos, micotoxinas, metales, dioxinas e hidrocarburos
aromticos policclicos y reduce estos valores para lactantes y nios de corta
edad con el fin de proteger la salud de ese grupo vulnerable. El muestreo y
anlisis para el control oficial de los contenidos mximos especificados debe
efectuarsedeconformidadconlosreglamentos(CE)n1882/2006[22],(CE)n
401/2006[23],(CE)n1883/2006[24]y(CE)n333/2007[25]delacomisiny
los productos alimenticios enumerados en los anexos no se comercializarn
cuandocontenganunodeloscontaminantesenumeradosenelmismoenuna
cantidadquesupereelcontenidomximoestablecido.
- 20 -
Introduccin
sustancias de efecto hormonal es la Directiva 96/22/CE [27] la cual tiene por
objeto regular la utilizacin de determinadas sustancias de efecto hormonal y
tireostticoysustanciasbetaagonistasenlacradeganadoparaprotegeralos
consumidores y preservar la calidad de los alimentos de origen animal. Esta
Directiva se ha modificado mediante las Directivas 2003/74/CE y 2008/97/CE
por las que se prohbe utilizar determinadas sustancias de efecto hormonal y
tireostticoysustancias agonistasenlacra de ganado.Loslmitesmximos
de residuos para las sustancias farmacolgicamente activas en productos de
origenanimalestnestablecidosenelReglamentoCEn37/2010.
unaherramientaclaveempleadaparareaccionarconrapidezantelosincidentes
[27] DO L 125 de 23.5.1996, p. 3 Directiva 96/22/CE del Consejo, de 29 de abril de
1996, por la que se prohbe utilizar determinadas sustancias de efecto hormonal y
tireosttico y sustancias - agonistas en la cra de ganado y por la que se derogan las
Directivas 81/602/CEE, 88/146/CEE y 88/299/CEE.
[28] DO L 70 de 16.3.2005, p. 1 Reglamento (CE) n 396/2005 del Parlamento Europeo y
del Consejo, de 23 de febrero de 2005, relativo a los lmites mximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal y que modifica la Directiva
91/414/CEE del Consejo.
- 21 -
registradosenelmbitodelosalimentosylospiensosdenominadaRASFFel
sistemadealertarpidaparaalimentosypiensos.Los27Estadosmiembrosde
la UE forman parte del RASFF, junto con la Comisin Europea y la Autoridad
Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA). As, cuando un miembro del RASFF
dispone de informacin sobre un riesgo sanitario grave procedente de
alimentos o piensos, debe informar inmediatamente a la Comisin Europea
mediante el sistema RASFF que a su vez informa sin demora al resto de
miembros con la finalidad de adoptar las acciones apropiadas. Existen cuatro
tiposdiferentesdenotificacindependiendodelagravedad:lasnotificaciones
dealertasemandanenelcasodequeestnalaventaalimentosopiensosque
presentenungraveriesgoydebanemprenderseaccionesdeformarpida;las
notificaciones de informacin se usan en la misma situacin, pero cuando los
otrosmiembrosnodebenadoptarmedidasdeformarpidaporqueelproducto
noseencuentraenelmercadooelriesgonoseconsideragrave;elrechazoen
frontera afecta a las remesas de alimentos y piensos que se han examinado y
rechazadoenlasfronterasexterioresdelaUEaldetectarseunriesgosanitario,
y por ltimo cualquier informacin relacionada con la seguridad de los
alimentos y los piensos que no se haya comunicado como una notificacin de
alertaodeinformacin,peroquelasautoridadesdecontrolhayanconsiderado
interesante se transmite a los miembros bajo el epgrafe de noticias. A
continuacin,segneltipodenotificacinlosmiembrosdelRASFFemprenden
acciones e informan de inmediato a la Comisin de las medidas adoptadas,
entre las que puede incluirse la retirada de un producto del mercado para
proteger la salud de los consumidores. Durante 2010, un total de 3.358
notificacionesfuerontramitadasatravsdelaRASFF,delascuales1.806fueron
dentro del territorio de la UE y 1.552 fueron notificaciones en frontera de
alimentosprocedentesdepasesfueradelaUE.Lamayoradelasnotificaciones
fueron debidas a micotoxinas (principalmente aflatoxinas en frutos secos,
semillas y verduras), seguidas de microorganismos entre los que destaca
salmonellasp,residuosdepesticidasenfrutasyverduras,presenciadeanisakiy
- 22 -
Introduccin
mercurioenpescado,cerealesmodificadosgenticamente,migracindecromo
desdelosrecipientesadiferentesalimentos,biotoxinasmarinasydioxinas[29].
2.
RETOSYTENDENCIASENELANLISISAMBIENTAL
2.1.
Aspectosgenerales
[29] The Rapid Alert System for Food and Feed. Annual Report 2010. (Disponible en:
http://ec.europa.eu/food/food/rapidalert/docs/rasff_annual_report_2010_en.pdf).
[30] D. Prez-Bendito, S. Rubio en: Environmental analytical chemistry, Elsevier,
Amsterdam, 1999.
[31] E. Andreu Moliner, A. Camacho Gonzlez en: Recomendaciones para la toma de
muestras de agua, biota y sedimentos en humedales Ramsar, Direccin General de
Conservacin de la Naturaleza (DGCN), Secretaria General de Medio Ambiente,
Ministerio de Medio Ambiente, Madrid, 2002.
- 23 -
sensibilidad y selectividad para determinar con exactitud las bajas
concentracionesgeneralmentepresentes.
Disolventessupramoleculares
SPE
SDME
SPME
Aumentodela
frecuenciade
recogidade
muestras simples
Muestreo
pasivo
Obtencinde
muestras
representativas
Simplificacine
integracindelas
etapasde
extraccin/conserva
cin/transporte
Tomademuestra
Reduccindel
consumode
disolventesorgnicos
y/otiempode
extraccinen
muestrasslidas
Desarrollode
nuevas
metodologaspara
contaminantes
emergentes
Operacionesprevias
PROCESO
ANALTICO
Medicindelasealanaltica
Tratamientodedatos
Envirometra
Cuantificacindecantidades
trazaeidentificacinde
compuestosenmuestras
complejas
Cromatografalquidaespetrometrademasas:
UPLC
HILIC
Detectoresdenuevageneracinohbridos:
QqQ,QqTOF,QqLIT,LTQOrbitrap.
Cromatografadegasesespetrometra
demasas
GCcapilar
GCbidimensional
TcnicasLVI
SPE: Extraccin en fase slida; SDME: Microextraccin en una gota; SPME: Microextraccin en fase
slida,MSPD:Dispersindelamatrizenfaseslida;UPLC:Cromatografalquidadeultrapresin;HILIC:
Cromatografa lquida de interaccin hidroflica; QqQ: Triple cuadrupolo, QqTOF: Cuadrupolotiempo
de vuelo; QqLIT: Cuadrupolotrampas lineales; LTQOrbitrap: Trampa inica linealOrbitrap; Tcnicas
LVI:Tcnicasdegranvolumendeinyeccin.
- 24 -
Introduccin
El desarrollo de mtodos en anlisis ambiental se enfrenta a
importantes retos en cada una de las etapas que constituyen el proceso
analtico. En la Figura 1 se muestran estas etapas, algunos de los retos
implicados y las estrategias que se han desarrollado hasta la fecha para su
solucin.
2.2.
Muestreoambiental
- 25 -
muestras, adems de las muestras blanco, los duplicados, las submuestras y
muestrasconadicionesconocidasdecontaminantesnecesariasparaelcontroly
lagarantadelacalidad,lascualeshayqueconservar,transportaryalmacenar
adecuadamente para finalmente analizarlas. Al objeto de reducir el esfuerzo y
coste implicado en el transporte y almacenamiento de relativamente altos
volmenes de muestras acuosas ambientales durante campaas de
monitorizacin se han desarrollado estrategias que integran las etapas de
extraccin,conservacinytransportedeloscontaminantesdeinters.
Simplificacineintegracindeoperacionesprevias
Nocabedudadequehoyendalatcnicadeextraccinenfaseslida
(SPE) es la estrategia ms aceptada para la preparacin de muestras acuosas
[37]. Est tcnica permite la extraccin/preconcentracin y conservacin
simultneadeloscompuestosenunaslaetapa.Porlotanto,elempleodeSPE
en campo evita tener que transportar y almacenar grandes volmenes de
muestras acuosas con la ventaja aadida de que los compuestos permanecen
estabilizados en cartuchos de pequeo tamao. Adems, debido al poco
volumen que ocupan, los cartuchos pueden mantenerse fcilmente a bajas
temperaturas durante largos periodos de tiempos antes de su determinacin.
Suportabilidad,fcilusoypotencialparaestabilizarlosanalitoshacenqueSPE
seaunatcnicaatractivaparasimplificareintegrarlasoperacionespreviasdel
procesoanaltico.
Sehanpropuestodiferentesformatos(discosocartuchos)deSPEpara
laextraccin,preconcentracinyestabilizacindecontaminantesorgnicos.En
bibliografapueden encontrarsenumerosaspublicacionesdonde sedemuestra
lautilidaddeestatcnicaparaladeterminacindehidrocarburos[38],fenoles
[39],tensioactivos[40],colorantes[41,42]yantibiticos[43],perosindudalos
[37] C.J. Koester, Anal. Chem. 77 (2005) 3737.
[38] D.R. Green, D. Le Pape, Anal. Chem. 59 (1987) 699.
[39] M. Castillo, D. Puig, D. Barcel, J. Chromatogr. A 778 (1997) 301.
[40] M. Petrovi, D. Barcel, Fresenius J. Anal.Chem. 368 (2000) 676.
[41] M.C. Alonso, D. Barcel, J. Chromatogr. A 889 (2000) 2231.
- 26 -
Introduccin
analitos ms investigados han sido los plaguicidas [4456] ya que la
4546
4748
4950
5152
5556
- 27 -
Los sistemas supramoleculares tambin son tiles para la mejora e
integracin de las operaciones previas del proceso analtico. As, se ha
demostrado que los medios micelares constituidos por tensioactivos inicos
(cetilpiridinio cloruro, dodecilsulfato sdico y acido dodecilsulfnico) y no
inicos (Tritn X114 y Brij35) son tiles para evitar la degradacin de los
hidrocarburos aromticos policclicos en disoluciones acuosas y su adsorcin
sobre la superficie del contenedor [5759]. Tambin se ha demostrado que
5859
- 28 -
Introduccin
algunos procesos qumicos. Por ejemplo, los saborizantes son, por lo general,
sustancias voltiles que se deterioran rpidamente y que en presencia de
ciclodextrinas forman complejos estables que pueden permanecer en estado
secosindegradarsedurantelargosperiodosdetiempoatemperaturaambiente
[62,63].Otroscompuestos,comoporejemplolasvitaminas,sedestruyenporel
calor y gracias a su complejacin con ciclodextrinas se estabilizan sin sufrir
prdidas en los procesos de procesamiento trmico [64]. Tambin se han
utilizado para mejorar la conservacin de diversos alimentos [64,65] y las
industrias de cosmticos y aseo personal tambin las han usado ampliamente
para la estabilizacin de fragancias [66,67], tintes y bronceadores. El principal
usofarmacuticodelasciclodextrinasesaumentarlasolubilidad,estabilidady
biodisponibilidad de los principios activos en medicamentos [62]. Con este
mismo fin, tambin se han usado otros sistemas supramoleculares tales como
micelas acuosas [68], e inversas [69] y liposomas [68]. Diferentes sistemas
coloidales
lipdicos
[70,71]
(como
nanocpsulas,
nanoemulsiones,
Otraestrategiaqueestganandoconsiderableintersenlosprogramas
de monitorizacin ambiental es el uso del muestreo pasivo debido a su
potencialparaafrontarelenormeretodeobtenermuestrasrepresentativasen
los sistemasambientales, sujetos a elevada variabilidad espacial y/o temporal,
[63] S. Muoz-Botella, B. del Castillo, M.A. Martn, Ars Pharm. 36 (1995) 187.
[64] L. Szente, J. Szejtli, Trends Food Sci. Technol. 15 (2004) 137.
[65] K. Takeshita, T. Urata, Antimicrobial food preservatives containing cyclodextrin
inclusion complexes. Japanese Patent JP 29, 054 (2001).
[66] R.A. Hedges, Chem. Rev. 98 (1998) 2035.
[67] S. Tatsuya, Stabilization of fragance in bathing preparations, Japanese Patent 11,
209, 787 (1999).
[68] G. Bonacucina, M. Cespi, M. Misici-Falzi, G.F. Palmieri, J. Pharm. Sci. 98 (2009) 1.
[69] H. Sah, Biomed. Chromatogr. 20 (2006) 1142.
[70] M. Garca-Fuentes, D. Torres, M.J. Alonso, Int. J. Pharm. 296 (2005) 122.
[71] M. Rawat, D. Singh, S. Saraf, S. Saraf, Yakugaku Zasshi 182 (2008) 269.
[72] C.M.L. Carvalho, J.M.S. Cabral, Biochimie 82 (2000) 1063.
- 29 -
de una manera efectiva, robusta y de bajo coste [73]. Los muestreadores
pasivosfuerondiseadosinicialmenteparacompuestosgaseososenaire,rea
donde han ganado una importante aceptacin por parte de la industria y las
autoridadeslegislativas[74,75].Sinembargo,elusodemuestreadorespasivos
paramuestreoacuosoesttodavalimitadoalmbitodelainvestigacin.Sise
considera el potencial de esta tecnologa, el limitado uso que actualmente
presentapuedeatribuirseprobablementeasurelativamentetempranoestado
de desarrollo y a la falta de informacin sobre esta tcnica por parte de
fabricantes y cientficos [76]. En los ltimos aos, el muestreo pasivo en
matricesslidastalescomosuelosysedimentosseestconvirtiendoenunrea
deinvestigacinmuyactiva.
2.3.
Preparacindemuestrasambientales
2.3.1. Muestrasacuosas
2.3.1.1. Extraccinenfaseslida
- 30 -
Introduccin
Como se coment anteriormente, la extraccin en fase slida es la
tcnica ms popular y establecida para el tratamiento de muestras acuosas
ambientales.Recientesdesarrollosenestareasonlosrelacionadosconeluso
de nuevos materiales adsorbentes por ejemplo, polmeros de impresin
molecular (MIPs), nanotubos de carbono (CNTs), hemimicelas/admicelas, etc.
conpotencialparamejorarlaeficaciadeextraccinyextenderlaaplicabilidad
de SPE. Por otro lado, los materiales sorbentes que permiten la retencin de
compuestos en un amplio intervalo de polaridad continan utilizndose
ampliamente,porejemploloscopolmerosdedivilbenceno/Nvinilpirrodilonay
aquellosquepermitenestablecermecanismosmixtosdeinteraccin.
78,79,80
- 31 -
Isolute HCX, HCX3, HCX5, HCXQ y HAX), el segundo grupo lo forman
sorbentes polimricos modificados qumicamente a los que se le introducen
gruposfuncionalesdeintercambioinico(ej.OasisMCX,MAX,WCXyWAX)yel
tercer grupo est constituido por una mezcla de sorbentes sliceC8 o C18 y
polmeros altamente entrecruzados de poliestireno divinilbenceno (ej. Isolute
C8/Env+, C18/Env+). El doble mecanismo de retencin de estos adsorbentes
permite la elucin secuencial de las interferencias de la matriz y proporciona
extractosfcilmenteanalizablesporLC/MS[81].
- 32 -
Introduccin
ampliamenteenelreamedioambientalybiolgica[8486]. Variosejemplosde
85,86
- 33 -
metoxicloro) estuvieron en el intervalo 0,010,03 g L1. Los MWCNTs son
tambin vlidos para extraer metales pesados, por ejemplo, Cu (II), Cd (II), Pb
(II),Zn(II),Ni(II)yCo(II)antesdesudeterminacinporespectrometraatmica
[94]. Los lmites de deteccin para estos iones, extrados como quelatos con
pirrolidinaditiocarbamatoamnico,estuvieronenelintervalo0,300,60gL1.
Estos MWCNTs (300 mg) se usaron en 250 experimentos sin que se observara
ningunaprdidaensucapacidaddeadsorcin.
travsdeunprocesodeoxidacin.Sesabequeeltratamientoconacidontrico
incrementa el rea superficial y el dimetro de los CNTs modificando las
propiedades de adsorcin de los SWCNTs. ElSheikh et al. [95] estudiaron la
influenciadelaoxidacindelosMWCNTsenlaextraccindealgunospesticidas
modelo (atrazina, propoxur y metidatin) concluyendo que la oxidacin
afectabaalaeficaciadeextraccindelosmismosdependiendodelanaturaleza
del MWCNTs y del agente oxidante empleado. En los MWCNTs oxidados con
perxido de hidrgeno y persulfato amnico no se observaron mejoras en las
recuperaciones de los pesticidas, mientras que aquellos oxidados con cido
ntrico mostraron mejor eficiencia de enriquecimiento a pH 5 comparado con
los MWCNTs sin oxidar. Los lmites de deteccin para propoxur, atrazina y
metidatinfueron220,57,5y37,5ngL1,respectivamente.
- 34 -
Introduccin
completamente la superficie del xido. Las estructuras de estos agregados
molecularespuedenverseenlaFigura2.
Monmerode
tensioactivo
xidomineral
Hemimicelas
Admicelas
- 35 -
Logtensioactivoadsorbido(mgg1xido)
Mximacarga
CHC dehemimicelas
Reginde
Henry
I
Mximacarga
detensioactivo CMC
Regin
Regin
hemimicelar hemimicelar/admicelar
II
III
Reginadmicelar
IVa
IVb
Logconcentracindetensioactivo
- 36 -
Introduccin
disolucin.Algunosdelossistemasxidomineraltensioactivocuyasisotermas
son similares a la descrita [96] estn constituidos por agregados de dodecil
sulfonato sdico, alquilbenceno sulfonato, dodecil sulfato sdico o 4C11
paraxilenosulfonatosobrealmina;agregadosdeclorurodetetradecilpiridinio,
bromuro de tetradecil piridinio o bromuro de dodecil piridinio sobre gel de
slice;agregadosdeIgepalCo660sobreslicepirognica;yagregadosdecloruro
dedodecilpiridinioop3nonilbencenosulfonatosdicosobrerutilo.
Laformacindehemimicelasyadmicelassobrelasuperficiedeunxido
mineral est influenciada fundamentalmente por el pH y la longitud de la
cadena hidrocarbonada de la molcula de tensioactivo. El pH determina la
densidad de carga superficial del xido mineral y por tanto la cantidad de
tensioactivoquepuedeadsorberse.Losxidosmineralesmsusados,alminay
slice, tienen punto de carga cero (pcz) a valores de pH alrededor de 9 y 3,
respectivamente. Por tanto, la almina se usa a valores de pH cidos para la
adsorcin de tensioactivos aninicos y la slice a valores de pH neutros o
ligeramentebsicosparalaadsorcindetensioactivoscatinicos.Conrelacina
la cadena hidrocarbonada, cuanto mayor es su longitud, ms hidrfoba es la
molcula y mayor es su facilidad para formar agregados, con la consiguiente
disminucin de la CHC o CMC. Un incremento de un grupo CH2 en la cadena
hidrocarbonadadeltensioactivoproduceunadisminucindelaCMCyCHCde
tresveces(regladeTraube)[97].
Mecanismosdeadsolubilizacindelosanalitos
- 37 -
agregado seleccionado. En la figura 4 se muestra el tipo de interacciones que
puedendarsedependiendodelaregindelaisotermadondenosencontremos.
Delascuatroregionesenlasquesedivideunaisoterma,notodasson
adecuadas para su utilizacin en SPE. Las regiones que pueden utilizarse son
- 38 -
Introduccin
aquellasenlasquehemimicelasyadmicelasestnenequilibrioconmonmeros
en disolucin. As, la regin I (Figura 4), donde el mecanismo de adsorcin de
tensioactivo sobre el xido mineral se debe a interacciones meramente
electrostticas, no es apta para SPE puesto que no se forma ningn tipo de
agregado donde los analitos puedan solubilizarse. En la regin hemimicelar
(reginII,Figura4)losanalitospuedensolubilizarseeneladsorbentemediante
interacciones hidrfobas con la cadena hidrocarbonada del tensioactivo. Las
regionesIII(constituidaporhemimicelasyadmicelas)yIVa(admicelas)sonlas
que ofrecen mayores posibilidades en SPE puesto que la superficie exterior es
polaroinicayeltipodeinteraccinpuedemodificarsemedianteseleccindel
tensioactivo.Enestasregionespuedenadsolubilizarseanalitosdemuydiferente
polaridad, ya que pueden producirse enlaces por puente de hidrgeno,
interacciones inicas, de Van der Waals o catin y formacin de agregados
mixtos(cuandolosanalitospresentancarcteranfiflico).As,sepodralograrla
retencin simultnea de analitos con muy diferente polaridad, siendo esta
caracterstica muy importante en monitorizacin medioambiental. Cuando la
concentracindetensioactivoendisolucinalcanzalaCMC,reginIVb,(Figura
4), comienzan a formarse micelas y en este caso la retencin de los analitos
sobre el adsorbente no es cuantitativa ya que stos se distribuyen entre el
adsorbente y las micelas en disolucin. Por consiguiente, esta regin de la
isotermatampocoesaptaparaSPE.
Mododeoperacin
Unaspectoimportanteaconsiderarcuandosetrabajaconhemimicelas
y/o admicelas como adsorbente en SPE es que la adsorcin del tensioactivo
sobre el xido mineral es un proceso dinmico, por lo que estos agregados se
encuentranenequilibrioconmolculasdetensioactivoendisolucin.Portanto,
durantelapercolacindelamuestraatravsdeladsorbenteseproduciruna
prdida progresiva de tensioactivo, lo cual modificar la cantidad y/o
caractersticas de la fase adsorbente usada. Si se trabaja en la regin
hemimicelar,laconcentracinendisolucinesdelordendegL1ylaprdida
de tensioactivo durante la percolacin de la muestra es despreciable, no
- 39 -
necesitndose hacer un aporte adicional de tensioactivo a la muestra. Sin
embargo,laconcentracindetensioactivoendisolucinenlasregionesdonde
seproducenadmicelasesdelordendemgL1,yportantosiestosagregadosse
usanenSPEesfundamentalaadiralamuestralaconcentracinadecuadade
tensioactivo,paramantenerconstantelacantidaddetensioactivoadsorbido.
Elmododeoperacincuandosetrabajaenextraccinenfaseslidacon
hemimicelas/admicelas es similar a la extraccin en fase slida convencional
(Figura5):
a)Formacinde
hemimicelas/admicelas
Disolucin de tensioactivo
al pH de la extraccin
b)Adsolubilizacindelos
contaminantes
c)Elucindelos
contaminantes
Muestra ambiental
Me
1-2 mL de disolvente
orgnico o disolucin
acuosa
OH
H
H
H
xido mineral
H
H H
Me
OH
b) Acontinuacinseprocedealapercolacindelamuestrademaneraquese
producelaadsolubilizacindelosanalitos(retencin).Hayquetenerpresente
eltipodeagregadoconelquesetrabaja,puessegnseacabademencionar,si
se trabaja en la zona admicelar hay que aadir a la muestra la concentracin
- 40 -
Introduccin
adecuada de tensioactivo, para mantener constante la cantidad adsorbida del
mismo.
Aplicaciones
Inicialmentelosadsorbenteshemimicelares/admicelaresseaplicarona
la extraccin de metales pesados presentes en muestras acuosas mediante la
formacin de complejos con agentes quelatantes, previamente solubilizados
sobre el agregado [98101] o bien mediante formacin de un quelato en
99,100,101
disolucinacuosayposterioradsolubilizacin[98,99,101,102].
[98] J.L. Manzoori, M.H. Sorouraddin, A.M.H. Shabani, J. Anal. At. Spectrom. 13 (1998)
305.
[99] J.L. Manzoori, M.H. Sorouraddin, A.M H. Shabani, Microchem. J. 63 (1999) 295.
[100] J.L. Manzoori, M.H. Sorouranddin, F. Semirani, Talanta 42 (1995) 1151.
[101] M. Hirade, J. Iwasawa, H. Tawaguchi, Talanta 44 (1997) 231.
[102] M. Hirade, J. Hori, Anal. Sci. 15 (1999) 1055.
[103] T. Saitoh, Y. Nakayama, M.T. Hiraide, J. Chromatogr. A 972 (2002) 205.
[104] T. Saitoh, Y. Nakayama, M.T. Hiraide, J. Chromatogr. A 1040 (2004) 185.
[105] M. Cantero, S. Rubio, D. Prez-Bendito, J. Chromatogr. A 1120 (2006) 271.
[106] F.J. Lpez-Jimnez, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chim. Acta 551 (2005) 142.
- 41 -
hidrocarburospolicclicosaromticos(PAHs)[107]yestrgenos[108]presentes
en muestras acuosas ambientales. Tambin se ha propuesto la determinacin
declorofenolesenaguadero[109]yPAHsendistintasmuestrasacuosas[110]
usando admicelas de aerosol OT sobre almina y de bromuro de
dihexadecildimetilamoniosobreslice,respectivamente.Enlamayoradeestas
aplicaciones el mecanismo principal de solubilizacin de los analitos sobre el
agregado se debe al establecimiento de interacciones hidrfobas, aunque
tambin pueden darse otro tipo de interacciones (electrostticas, catin,
puentes de hidrgeno, etc.) dependiendo de la naturaleza del grupo polar del
tensioactivo,pudindoseseleccionarapriorieladsorbentemsadecuadopara
una aplicacin concreta. As, se ha llevado a cabo la extraccin de
benzimidazoles [111] y herbicidas de amonio cuaternario quats [112]
utilizando admicelas de SDS sobre almina donde los analitos se retienen
medianteinteraccionesdetipoelectrostticooporformacindeparesinicos,
respectivamente. En la aplicacin relativa a los quats, se propuso por vez
primeraelacoplamientoonlinedeunadsorbentedeSPEbasadoenagregados
supramolecularesdetensioactivoacromatografadelquidos.
- 42 -
Introduccin
Recientemente se han desarrollado mtodos en los que el mecanismo
deextraccinsebasaenlaformacindeagregadosmixtosanalitoextractante,
siendo requisito indispensable el carcter anfiflico del analito por lo que esta
metodologahasidomuyaplicadaparaelanlisisdetensioactivos.Hemimicelas
del tensioactivo aninico SDS adsorbidas sobre almina o resinas de
intercambio aninico se han empleado para extraer tensioactivos catinicos
[115,116] y no inicos [117], mientras que hemimicelas de tensioactivos
catinicos (cloruro de cetilpiridinio y bromuro de cetiltrimetilamonio)
adsorbidassobreslicesehanempleadoparaextraertensioactivosaninicosde
muestrasdeaguapotable,deroyresiduales[118,119].
Enlosltimosaoslainvestigacinsobrehemimicelas/admicelascomo
sorbentes para SPE ha estado relacionada principalmente con el desarrollo de
nuevas aplicaciones [114,119121] y formatos [122127] as como estudios
120,121
123124125
126127
Li
et
al
[120]
propusieron
el
adsorbente
bromuro
de
- 43 -
sulfonamidas
(suldiazina,
sulfatiazol,
sulfapiridina,
sulfametazina
fenilureas,
carbamatos,
azoles,
anilidas,
cloroacetanilidas,
organofosforados,fenoxicidos,cidosariloxicidosyfenoles)enaguasderoy
subterrneas. El adsorbente seleccionado (hemimicelas/admicelas mixtas de
dodecil sulfato sdico y tetrabutilamonio sobre almina) proporcion
interacciones hidrofbicas, inicas y catin que retuvieron fuertemente los
pesticidas con diferentes polaridades y acidez (bases, neutros y cidos). Se
obtuvieronlmitesdedeteccinmenoresde100ngL1paraladeterminacinde
los17pesticidasmedianteLCUV.
Conelfindeacelerarlaextraccinenfaseslidaconvencionalyevitar
la percolacin de la muestra, varios grupos de investigacin han utilizado
nanopartculas como soporte slido para las hemimicelas/admicelas. Niu et al
[122]prepararonnanotubosdetitaniatocubiertosdehemimicelasyadmicelas
- 44 -
Introduccin
debromurodecetiltrimetilamonioparapreconcentrarsteresdeftalato(din
propilftalato, dinbutilftalato, diciclohexilftalato y dinoctilftalato) en
muestrasacuosas.Elmtodoalcanzlmitesdedeteccinentre19y39ngL1.Li
etal[123]propusieronelusodenanopartculasdeFe3O4 comoxidomineral.
Deestemodo,laSPEsellevaacaboenmodobatchyacontinuacinseseparan
las nanopartculas utilizando un imn de NdFeB. El mtodo propuesto se ha
usado para la extraccin de clorofenoles (2clorofenol, 2,4diclorofenol, 2,4,6
diclorofenol y pentaclorofenol) en muestras acuosas ambientales usando
bromurodecetiltrimetilamonioadsorbidosobreFe3O4.Loselevadosfactoresde
preconcentracin(700)quesealcanzaronparalosanalitosresultaronenlmites
de deteccin entre 0,110,15 g L1 usando LCUV. Ballesteros et al. [127]
utilizaron una estrategia parecida empleando nanopartculas magnticas
recubiertas con hemimicelas de tetradecanoato para extraer hidrocarburos
aromticos policclicos (benzo(a)antraceno, criseno, benzo(b)fluoranteno,
benzo(k)fluoranteno,
benzo(a)pireno,
dibenzo(a,h)antraceno,
benzo(ghi)
perilenoeindeno(1,2,3cd)pireno).Laprincipalventajadeesteadsorbenteesel
fuerte enlace qumico entre las nanopartculas y las hemimicelas que evita la
elucindelasmismasyportanto,seproducenextractoslibresdetensioactivo.
Laeficienciadeextraccinnoseinfluenciaporlaconcentracindesaleshasta1
M y valores de pH comprendidos entre 2,59 y el factor de preconcentracin
alcanzado fue 116. Los lmites de cuantificacin obtenidos estuvieron
comprendidos entre 0,20,5 ng L1 utilizando cromatografa lquidadeteccin
porfluorescencia(LCFL).Elmtodopropuestoseaplicaladeterminacinde
estoscontaminantesenaguassuperficialesysubterrneasdevarioslugaresdel
surdeEspaa.
- 45 -
competan con las molculas de tensioactivo por los sitios de carga superficial
enlaprimerapartedelareginhemimicelar.Porotroladosecomprobquelos
agentes precipitantes producan sales insolubles con el tensioactivo en el
adsorbente admicelar y que la materia orgnica no tena ningn tipo de
influencia. A partir de estos resultados, se establecieron reglas simples para
prevenir y detectar modificaciones en la adsorcin del tensioactivo, inducidas
porlamatrizdelamuestra.Asimismo,conelconocimientoadquiridoapartirde
estos resultados, es posible conocer, a priori, la idoneidad de un adsorbente
paraunaaplicacinespecficalocualdeberapermitireldesarrollodemtodos
msrobustosysimples.
2.3.1.2. Disolventessupramoleculares
Labsquedadealternativasalosdisolventesorgnicostradicionalesen
las extracciones lquidolquido ha fomentado el uso de lquidos ms
respetuosos con el medio ambiente como es el caso de los disolventes
supramoleculares (SUPRASs). El inters por aplicar estos disolventes en
procesosdeextraccinyotrastcnicasdeseparacinsedebeasuversatilidad,
principalmente derivada de los diferentes tipos de interacciones que pueden
establecer con los analitos, lo que hace que tengan capacidad para solubilizar
compuestosenunampliointervalodepolaridad.
- 46 -
Introduccin
A continuacin se comentan los aspectos ms importantes de los
diferentes tipos de disolventes supramoleculares con especial nfasis en los
constituidos por micelas normales e inversas y vesculas de tensioactivos
aninicosquesernlossistemasutilizadosenlasinvestigacionesllevadasacabo
enestamemoria.
Losdisolventessupramolecularesconstituidospormicelasdetensioactivosno
inicos hansidolosmsutilizadosen lasextraccionesanalticasylosquems
atencinhanrecibidodesdequefuerondescritosporWatanabeetal.[130].Se
forman al elevarse la temperatura de las disoluciones acuosas que contienen
concentraciones de tensioactivos no inicos superiores a su concentracin
micelarcrtica(cmc).Latemperaturaapartirdelacualseproduceelfenmeno
decoacervacinsedenominapuntodenubecloudpointyvaraenfuncinde
la estructura molecular del tensioactivo y de su concentracin en disolucin.
Esta metodologa denominada cloud point extraction (CPE) se ha aplicado
usando fundamentalmente Triton X114 para la extraccin de sustancias
apolares en muestras acuosas ambientales [131135] y quelatos metlicos
132133
134135
[136,137]. CPE contina siendo una de las tcnicas lder para la extraccin de
metales en agua previa a su determinacin por espectrometra de absorcin
atmica. La aplicacin de CPE a la extraccin de contaminantes orgnicos ha
encontradomsproblemasdebidoalacoelucinoriginadaporlostensioactivos
no inicos en cromatografa lquida, ya que stos slo estn disponibles
comercialmentecomomezclasdehomlogoseismeros.
[130] H. Ishii, J. Miura, H. Watanabe, Bunseki Kagaku 26 (1997) 252
[131] S. Rubio, D. Prez-Bendito, Trend Anal. Chem 22 (2002) 470.
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[137] C.D. Stalikas, Trends Anal. Chem. 21 (2002) 343.
- 47 -
Disolventes supramoleculares constituidos por micelas de tensioactivos
anfteros. El uso de este tipo de disolventes en procesos de extraccin fue
propuestaporSaitohetal.enladcadadelos90[138].Alcontrarioqueocurre
conlostensioactivosnoinicos,laformacindeldisolventesupramolecularen
disoluciones de tensioactivos anfteros se produce cuando la temperatura
disminuyepordebajodeunvalorcrtico.
- 48 -
Introduccin
Disolventes supramoleculares constituidos por micelas mixtas. Estos
disolventesseobtienenapartirdedisolucionesacuosasquecontienenmezclas
de tensioactivos no inicos, mezclas de un tensioactivo no inico y un
tensioactivo inico o mezclas de un tensioactivo catinico y otro aninico. El
agenteinductordelacoacervacineslatemperaturayelvaloralquesealcanza
elcloudpointdelasdisolucionesdependedelamezcladetensioactivosdecada
sistema. Estos disolventes se han usado para extraer y preconcentrar
compuestosorgnicos[146151] y metales[152157].
147,148,149
150,151
153,154,155,156,157
- 49 -
contaminantesorgnicosenunampliointervalodepolaridadsehademostrado
mediantesuaplicacinaaguasnaturalesyresiduales[158,159].
en
proporciones
equimoleculares
[160].
El
catin
- 50 -
Introduccin
Micelaacuosa
Vescula
Micelainversa
a)
b)
c)
20x
20x
Existendiferenciasmorfolgicasyestructuralesentrelosdistintostipos
de agregados producidos en disolucin las cuales afectan al proceso de
extraccin. As, aunque las micelas acuosas e inversas son entidades esfricas
condimetrosmuysimilares(360y4080,respectivamente)lasprimerasse
forman en agua y la segundas en disolventes apolares y de baja constante
dielctrica y por tanto, los medios de extraccin utilizados son diferentes. El
tamao de las vesculas es considerablemente mayor (3005000 ) y como
consecuenciaelnmerodemolculasdesolutoquepuedensolubilizarseenlas
mismasessuperioralquesesolubilizanenlasmicelas.En2010sepublicuna
- 51 -
revisinsobreaspectostericoprcticosrelacionadosconelusodediferentes
SUPRASsenextraccionesanalticas[162].
Diagramadefases
- 52 -
Introduccin
una regin heterognea donde el cido decanoico permanece insoluble
mientrasqueenlareginLLcoexisteneldisolventesupramolecularylafaseen
equilibrio. A altos porcentajes de tetrahidrofurano se forma una nica fase
homognea donde el biotensioactivo forma micelas inversas (regin L).
Finalmente en la figura 7e puede observarse el comportamiento de fases de
mezclas de cido decanoico/decanoato en relacin 1:1 en presencia de
tetrabutilamonio bromuro a temperatura ambiente. En la regin L mezclas de
cidos carboxlicos protonados y desprotonados en relacin 1:1 producen
vesculas. La presencia de iones tetrabutilamonio hace que estas vesculas
coacervenformndoseeldisolventesupramolecularenlareginLL.Unexceso
de estos iones provocara mezclas del disolvente supramolecular con
precipitadosslidoscorrespondientesalareginSdelagrfica.
- 53 -
40
10
8
(a)
L-L
30
20
10
[HCl], M
TEMPERATURA, C
S
E
6
4
L-L
2
0
(b)
10 12
60
40
L-L
Agua (v/v)
TEMPERATURA, C
20
(d)
40
60
30
20
10
[C APSO ] (w/v)
9
4
80
L
60
L-L
80
40
20
100
10
S
0
Tetrahidrofurano (v/v)
20
(c)
80
[SDSA] (w/v)
100
3
1
2
4
[cido decanoico] (w/v)
Bu4NBr (M)
0,8
(e)
S
0,6
0,4
L-L
0,2
0
L
0 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2
[decanoico+decanoato] (M)
- 54 -
Introduccin
Mecanismosdesolubilizacinyconcentracindelosanalitos
D=[A]d/[A]aq
[163] S.D. Christian, J.F. Scamehorn (Eds.) en: Surfactant-Based Separation Processes,
Surfactant Science Series 33, Dekker, New York, 1989.
- 55 -
donde[A]dy[A]aq sonlasconcentraciones,eneldisolventesupramolecularyen
lafaseacuosa,respectivamente.
Mododeoperacin
a)Formacindeldisolvente
supramolecular
b)Extraccin/concentracindelosanalitos
Disolucindel Adicindel
tensioactivo
agente
enlamuestra coacervante
acuosa
Disolvente
supramolecular
conlosanalitos
extraidos
Agitacin
Centrifugacin
- 56 -
Introduccin
b)Extraccindelosanalitos.Lamezclaseagitaduranteundeterminadotiempo
con objeto de favorecer la transferencia del analito o analitos al disolvente
supramolecularyacontinuacinsecentrifugaparaacelerarlaseparacindelas
fases.Losanalitosextradosgeneralmentesedeterminanmediantelainyeccin
de una alcuota de disolvente supramolecular en un cromatgrafo de lquidos
(Figura8b).
Microjeringade50L
Gotadedisolvente
supramolecular
+analitos
Vasotermostatado
Gotadedisolvente
supramolecular
Vialconlamuestra
Recuperacin
delagotaenla
microjeringa
Agitacin
magntica
- 57 -
Aplicaciones
Lamayoradelasaplicacionesanalticasquesehandesarrolladohasta
la fecha han hecho uso de disolventes supramoleculares constituidos por
micelas de tensioactivos no inicos (ej. tritn X100; la serie PONPE, teres
polietileneglicolmono4nonilfenol, etc.). Entre las aplicaciones destacan la
extraccin de aminocidos [164], protenas [138,165]; vitaminas [166]; iones
metlicos previa formacin de complejos neutros [136,137,167170]; y
168,169,170
compuestosorgnicostalescomoPAHs[58,171],PCBs[172];cidoshmicosy
flvicos[173],plaguicidas[174,175],drogasteraputicas[176],etc.
Ladescripcindedisolventessupramolecularesconstituidospormicelas
acuosas de tensioactivos catinicos [139] y aninicos [141] elimin algunos de
los inconvenientes asociados al uso de tensioactivos no inicos como eran los
problemas de coelucin. Adems,, fue posible la extraccin de compuestos en
un mayor intervalo de polaridad mediante su solubilizacin en los grupos
polares de las micelas a travs de diferentes interacciones (electrostticas,
catin, formacin de agregados mixtos, etc.). Basada en la coacervacin de
tensioactivoscatinicossepropusolaextraccin/concentracindeclorofenoles
en agua de ro [140]. En este caso la eficacia de extraccin es muy elevada ya
[164] C. Mahugo, Z. Sosa, J.J. Santana, Analyst 127 (2002) 1031.
[165] J. Bouvier, R.J. Etges, C. Bordier, J. Biol. Chem. 260 (1985) 15504.
[166] S.R. Sirimanne, D.G. Patterson, L. Ma, J.B. Justice, J. Chromatogr. B 716 (1998)
129.
[167] J. Chen, K.C. Teo, Anal. Chim. Acta 434 (2001) 325.
[168] E.K. Paleologos, D.L. Giokas, M.I. Karayannis, Trends Anal. Chem. 24 (2005)
426.
[169] C. Bosh, F. Snchez, Anal. Bioanal. Chem. 394 (2009) 759.
[170] A.R. Rod, S. Borhani, F. Shemirani, Eur. Food Res. Technol. 223 (2006) 649.
[171] R. Ferrer, J.L. Beltrn, J. Guiteras, Anal. Chim. Acta 330 (1996) 199.
[172] A. Eiguren-Fernndez, Z. Sosa-Ferrera, J.J. Santana-Rodrguez, Quim. Anal. 16
(1997) 283.
[173] R.L. Revia, G.A. Makharadze, Talanta 48 (1999) 409.
[174] C. Garca-Pinto, J.L. Prez-Pavn, B. Moreno-Cordero, Anal. Chem. 67 (1995)
2606.
[175] J. Zhou, J. Chen, Y. Cheng, D. Li, F. Hu, H. Li, Talanta 79 (2009) 189.
[176] M.D. Rukhadze, S.K. Tsagareli, N.S. Sidamonidze, V.R. Meyer, Anal. Biochem.
287 (2009) 279.
- 58 -
Introduccin
que adems de interacciones hidrfobas entre los analitos y las micelas se
produceninteraccionescatinentreelanilloaromticodelosclorofenolesy
el grupo amonio del tensioactivo. El inconveniente de estos disolventes
supramoleculareseslaelevadaconcentracindeelectrolitonecesariaparaque
seproduzcalacoacervacin(400gL1deNaCl),loqueharestringidosuuso.
Lacoacervacindemicelasacuosasdetensioactivosaninicos,inducida
por cido, fue propuesta por nuestro grupo de investigacin con objeto de
evitar la coelucin de los analitos polares y los tensioactivos en el sistema
cromatogrfico[141].Laausenciadeanillosaromticosenlaestructuradelos
tensioactivosysucarcterpolarhapermitidolaaplicacindeestosdisolventes
supramolecularesalaextraccindeplaguicidas[144,145]yPAHs[59,143]ysu
posterior determinacin mediante cromatografa lquida combinada con
deteccinUV,fluorescenteyespectrometrademasas.
- 59 -
cidos alquilcarboxlicos que contienen (entre 0,7 y 1 mg L1) lo que permite
alcanzarelevadosrendimientosutilizandopequeosvolmenesdelosmismos.
Comoconsecuencia,sealcanzanfactoresdepreconcentracinentre100y400.
Porotrolado,losdisolventessupramolecularesdemicelasinversasseproducen
a pH inferiores a 4 y los de vesculas en el intervalo de pH entre 5 y 10,
abarcando un amplio intervalo en el que se puede seleccionar el valor ms
apropiadoparalaextraccin,dependiendodelascaractersticasdelosanalitos.
EnlaTabla1secomparanlasrecuperacionesobtenidasempleandodisolventes
supramoleculares de vesculas y micelas inversas para diferentes analitos,
clasificadosrespectoaltipodeinteraccinpredominantequeseproduceconel
tensioactivoqueformaeldisolventesupramolecular.
de
diferentes
compuestos
orgnicos
usando
disolventes
Enlacesde
hidrgeno
Inica
[Analito]
(M)
Analito
Naftaleno
Antraceno
Benzo(a)pireno
TritnX100
Alquilbencenosulfonatos
4clorofenol
2,4diclorofenol
2,4,6triclorofenol
Pentaclorofenol
BisfenolA
BisfenolF
Bencilbutilftalato
Dibutilftalato
Paratin
Atrazina
Hidroquinonasulfonada
Hidroquinonasulfonada
Azulbrillantedecumasn
Difenzoquat
- 60 -
3.9x105
2.8x105
2.0x105
8.3x106
2.9x105
3.9x105
3.2x105
2.6x105
1.9x105
3.8x105
3.6x105
5.1x105
4.8x105
4.1x105
5.2x105
5.2x105
7.3x107
6.9x106
Recuperaciones(%)
Vesculas M.inversas
993
952
1012
981
1003
971
991
983
1002
51
951
972
1001
991
982
1011
1002
1011
993
953
1002
971
803
991
854
1001
902
962
984
954
953
953
1004
502
Introduccin
Comopuedeobservarse,prcticamenteentodosloscasosseobtienen
recuperaciones cuantitativas a excepcin de la extraccin de alquilbenceno
sulfonatos y difenzoquat cuando se utilizan disolventes supramoleculares de
micelasinversasyvesculas,respectivamente.
Hastalafecha,losdisolventessupramolecularesdemicelasinversasse
hanaplicadoalaextraccindebisfenolesAyFyloscorrespondientesteresy
diglicidlicosenaguasresiduales[177],debisfenolAenmuestrasdeorina[178]
yalimentoslquidos[179],deOcratoxinaAenvino,vinagreycerveza[179,180],
dePAHsent,caf,aguasnaturalesyresiduales[179,181]ydecolorantesde
tipo Sudan en salsas para alimentos [182]. Por otro lado, los disolventes
supramoleculares de vesculas de cido decanoico inducidas por
tetrabutilamoniotambinsehanpropuestoparalaextraccindebisfenolAyF
y sus correspondientes teres diglicidlicos en aguas residuales y de ro [183].
Losfactoresdepreconcentracinestuvieroncomprendidosentre477y569,las
extracciones fueron independientes de la presencia de sales hasta 1M o
temperatura hasta 60C y las condiciones de equilibrio se alcanzaron en 5
minutos. La combinacin de coacervacin vesicular con CLfluorescencia
permitilacuantificacindelosanalitosconlmitesdedeteccinde910ngL1.
Los disolventes supramoleculares vesiculares combinados con fluorescencia
tambin se han empleado para la determinacin de fungicidas benzimidazoles
[184].Hastalafecha,sonlosnicostiposdedisolventessupramolecularesque
sehanutilizadoenelformatodemicroextraccinenunagota[161].
[177] A. Ballesteros-Gmez, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chim. Acta 603 (2007)
51.
[178] A. Garca-Prieto, L. Lunar, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chim. Acta 630
(2008) 19.
[179] A. Ballesteros-Gmez, S. Rubio, D. Prez-Bendito, J. Chromatogr. A 1216 (2009)
530.
[180] S. Garca-Fonseca, A. Ballesteros-Gmez, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chim.
Acta 617 (2008) 3.
[181] A. Ballesteros-Gmez, S. Rubio, D. Prez-Bendito, J. Chromatogr. A 1203 (2008)
168.
[182] F.J. Lpez-Jimnez, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Food Chem. 121 (2010) 763.
[183] F.J. Ruiz, S. Rubio, D. Prez-Bendito, J. Chromatogr. A 1163 (2007) 269.
[184] A. Moral, M.D. Sicilia, S. Rubio, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 3740.
- 61 -
2.3.2. Muestrasslidasambientalesybiolgicas
2.3.2.1. Tcnicasasistidasporenergasauxiliares
Laextraccinasistidapormicroondasserealizaenequiposquedifieren
eneltipodeenergaaplicadaalamuestra(multimodoofocalizada)yeneluso
o no de sobrepresin. Generalmente, los sistemas cerrados (los que operan a
alta presin) son multimodo, es decir la radiacin generada se dispersa de
formaaleatoriaenunacavidad.Lossistemasabiertos(enlosqueelprocesose
lleva a cabo a presin atmosfrica) son sistemas focalizados o monomodo, es
decir la radiacin microondas se confina en un espacio mucho ms reducido,
dondesesitalamuestra,yportantolaradiacinquellegaalamismaesms
intensaqueenlossistemasmultimodo.Existennumerosasrevisionesenlasque
- 62 -
Introduccin
sedescribenlosequiposutilizados,losprincipiosenlosquesebasalatcnicay
lasaplicacionesdesarrolladashastalafecha[185187].
186,187
Agency)haadoptadoestatcnicaparaelanlisisdeplaguicidasensuelos[193].
[185] L. Cheng, D Song, Y. Tian, L. Ding, A. Yu, H. Zhang, Trends Anal. Chem. 47
(2008) 151.
[186] J.L. Luque-Garca, M.D. Luque de Castro, Trends Anal. Chem. 22 (2003) 90.
[187] Q. Jin, F. Liang, H. Zhang, L. Zhao, Y. Huan, D. Song, Trends Anal. Chem. 18
(1999) 479.
[188] J.L. Luque-Garca, M.D. Luque de Castro, Trends Anal. Chem. 22 (2003) 41.
[189] R. Carabas-Martnez, E. Rodrguez-Gonzalo, P. Revilla-Ruiz, J. HernndezMndel, J. Chromatogr. A 1089 (2005) 1.
[190] L. Ramos, E.M. Kristenson, U.A.T. Brinkman, J. Chromatogr. A 975 (2002) 3.
[191] H. Runnqvist, S.A. Back, M. Hansen, B. Styrishave, B. Halling-Sorensen, E.
Bjrklund, J. Chromatogr. A 1217 (2010) 2447.
[192] A. Nieto, F. Borrull,E. Pocurull, R.M. Marc, Trends Anal. Chem. 29 (2010) 752.
[193] EPA Method 3545, US Environmental Protection Agency, Washington, DC, 1996.
- 63 -
Frecuentemente, PLE se combina con SPE o extraccin por adsorcin con
barritas agitadoras (SBSE una variedad de SPME, comercialmente conocidas
comoTwister)parapreconcentrarlosanalitos.
2.3.2.2. Dispersindelamatrizenfaseslida
- 64 -
Introduccin
multiresiduosdeplaguicidasenfrutasyverduras[199]ysuutilidadesevidente
alaluzdelgrannmerodeaplicacionesdesarrolladasyrevisadasenlosltimos
aos[198,200,201].Nuevastendenciasenestareasonlasrelacionadasconel
uso de nuevos adsorbentes y la combinacin de MSPD y PLE para conseguir
extraccionesMSPDmsrpidas,exhaustivasyautomticas.
- 65 -
masasconfuentedeplasmaacoplada(ICPMS)parasepararydetectartodaslas
especiesdearsnico.Otroejemplointeresanteconsisteenlaextraccinde27
PAHs en lodos de depuradoras de Madrid [205]. Los PAHs se extrajeron con
MSPDasistidaconultrasonidos.Lapurificacindelosextractossellevacabo
medianteSPEconC18ylosPAHssedeterminaronpordilucinisotpicaGC/MS.
Los lmites de deteccin estuvieron comprendidos entre 0,03 ng g1 para el
acenaftileno y 0,45 ng g1 para el benzo[b]nafto[2,1d]tiofeno. Se detectaron
PAHsentodaslasmuestrasconconcentracionesentre390y6.390ngg1(peso
seco) y en la mayora de los lodos examinados el compuesto principal fue el
fenantrenoconconcentracionesmediasde1.062ngg1.
2.3.2.3. Microextraccinenfaseslida
Lamicroextraccinenfaseslida(SPME)sebasaenlaextraccindelos
analitosdelamatrizdelamuestramedianteunafibradeslicefundidaqueest
recubiertadeunadsorbente,enlamayoradeloscasospolimrico,seguidade
la desorcin de los analitos mediante temperatura o un disolvente orgnico
[206]. El pequeo tamao de la fibra y su geometra cilndrica permiten
incorporarla en una jeringa. De esta forma, se facilita su manipulacin y al
mismotiemposeprotegelafibracuandonoseutiliza,yaquestapermanece
dentrodelaagujadelajeringa.
- 66 -
Introduccin
previamente diluidos en benceno con el fin de favorecer las interacciones
especficas cercanas a aquellas desarrolladas durante la sntesis del MIP en
tolueno. Turiel et al. [208] obtuvieron una fibra MIP sintetizando un monolito
dentro del capilar de slice que actuaba como molde, siendo la slice grabada
despus de la polimerizacin. Este MIP se sintetiz usando propazina como
moldeyseusparalaextraccindetriazinasydosmetabolitosenverdurasy
extractosdesuelo,previamentediluidoseneldisolventeporognicodesntesis
(tolueno).
2.3.2.4. Disolventessupramoleculares
Mododeoperacin
Enausenciadelamuestra,elSUPRASsesintetizapreviamenteenagua
destilada (Figura 11) y despus se aade a una pequea cantidad de muestra
slida. La mezcla se agita en vortex para favorecer la transferencia de los
analitosaldisolventesupramolecularyacontinuacinseultracentrifugapara
- 67 -
a)Formacindeldisolvente
supramolecular
b)Extraccin/concentracindelosanalitos
Adicindela Adicindel
disolucindel
agente
tensioactivoala coacervante
muestraslida
Disolvente
supramolecular
conlosanalitos
extrados
Agitacin
Disolucin Adicindel
acuosade
agente
tensioactivo coacervante
Agitacin
Disolvente
supramolecular
Centrifugacin
- 68 -
Introduccin
separar la muestra del SUPRAS con los analitos solubilizados. Alcuotas de
SUPRASseinyectanenCLparaladeterminacindeloscompuestosdeinters
(Figura12).
Disolventesupramolecular
conlos
analitosextrados
Adicindeldisolvente
supramolecularala
muestraslida
Centrifugacin
Agitacinenvortex
Aplicaciones
Aunque en menor medida si se compara con las aplicaciones en
muestras acuosas, en la bibliografa se han descrito diferentes aplicaciones de
disolventes supramoleculares de micelas no inicas y micelas mixtas en
procesosdeextraccindecontaminantesenmuestrasslidas.Ejemplosdetales
aplicaciones son la descontaminacin de suelos [147] y la determinacin de
plaguicidasenfrutas,cereales[209211] ysuelos[175]ydemetalesensuelos
210,211
[156].
- 69 -
las drsticas condiciones cidas en las que se producen, alrededor de 3 M, lo
que permite obtener eficientes extracciones de los contaminantes que estn
fuertementeretenidosenmatricescomosuelos,sedimentosylodos.Eseneste
campodondeestosdisolventessupramoleculareshantenidomayorrelevancia
yentrelasaplicacionesdesarrolladasdestacanlaextraccindePAHsensuelos,
lodos y sedimentos [212] y sobre todo la extraccin de sustancias anfiflicas
tales como tensioactivos aninicos (alquibencenosulfonatos) [213], catinicos
(alquilamonio) [214] y no inicos (alquilfenoles polietoxilados y alcoholes
etoxilados) [215] en lodos. La formacin de agregados mixtos entre los
tensioactivos analitos y el tensioactivo aninico que constituye el disolvente
supramolecularhapermitidolaextraccindelosmismosconelevadaeficiencia
yfactoresdepreconcentracinentre50y100.
Enlosltimosaosnuestrogrupodeinvestigacinsehacentradoenel
desarrollo de metodologas para el control y determinacin de contaminantes
orgnicos en alimentos mediante el uso de disolventes supramoleculares de
micelasinversasyvesculas.Hastalafecha,losdisolventessupramolecularesde
micelasinversassehanaplicadoalaextraccindebisfenolAenfrutas,verduras
y alimentos grasos enlatados [216,217], de ocratoxina A en trigo [218] y de
antibiticosenpescadosymariscos[219].Losdisolventesvesiculareshansido
solo aplicados para la determinacin de fungicidas bencimidazoles en frutas y
verduras[220].
- 70 -
Introduccin
2.3.3. Compuestosvoltilesysemivoltiles
Enestareahahabidouncrecimientoespectaculardeaplicacionesque
usantcnicasdemicroextraccinconespaciodecabeza(HS)paraelanlisisde
contaminantes en muestras ambientales [221], siendo las ms interesantes
microextraccin en fase slida (HSSPME) y microextraccin en una gota (HS
SDME).
- 71 -
Muchas aplicaciones han tratado sobre el desarrollo de nuevos
recubrimentos de fibra polimricos con el fin de mejorar la selectividad y
exactitud de los anlisis. As, Bagheri et al. [224] usaron la tecnologa de
recubrimientosolgelparasintetizarunnuevopolmeroaminofuncionalizadoa
partir de de 3(trimetoxisilil)propilamino como precursor. La novedosa fibra
aminofuncionalizada se emple para la HSSPME de algunos clorofenoles
importantes desde el punto de vista medioambiental, previamente
derivatizados con anhdrido actico. La comparacin de los resultados con los
datosobtenidosusandounafibracubiertadepoliacrilatodemostrquelafibra
propuesta mostraba una sensibilidad hasta 2,6 veces mayor para la extraccin
delosfenolesdemuestrasacuosas.
Porotrolado,latcnicadeHSSDMEparecemuyatractiva,aunquesus
mtodosestntodavaenunestadoincipientededesarrolloysehanpublicado
pocos trabajos. A diferencia de las fibras, las gotas se renuevan en cada
extraccin y es una estrategia para superar la limitada disponibilidad de
recubrimentosparalasfibrasdadolaampliavariedaddedisolventesyagentes
deatrapamientoquepuedenusarse.EnHSSDME,unamicrogotadedisolvente
con alto punto de ebullicin se suspende en la punta de la aguja de una
microjeringa y se coloca en el espacio de cabeza de una disolucin. Dado que
slo los compuestos que se volatilizan al espacio de cabeza pueden ser
atrapadosenlamicrogota,lasinterferenciasprocedentesdematricescomplejas
decrecensignificativamente.
Laderivatizacininsituespropuestafrecuentementeparaextenderla
aplicabilidaddeHSSDMEacompuestospolares.Porejemplo,Xiaoetal.[225]
propusieron un mtodo para la especiacin de compuestos butilestao en
muestras ambientales y biolgicas, el cual estuvo basado en HSSDME en
combinacin con GCICPMS, con derivatizacin previa de los compuestos con
tetraetilboratosdico.Loslmitesdedeteccinobtenidosfueron1,4ngL1para
MBT,1,8ngL1paraDBTy0,8ngL1paraTBT.LasconcentracionesdeMBT,DBT
[224] H. Bagheri, E. Babanezhad, F. Khalilian, Anal. Chim. Acta 616 (2008) 49.
[225] Q. Xiao, B. Hu, M. He, J. Chromatogr. A 1211 (2008) 135.
- 72 -
Introduccin
yTBTenaguadelmarfueron31,79y32ngL1,respectivamente,mientrasque
las concentraciones en diferentes mariscos estuvieron en el intervalo de 11,6
30,4;11,88,9y12,852,6ngg1,respectivamente.Tratamientostericosyuna
evaluacin experimental de derivatizacin en una gota fueron publicados por
Fiamengos y Stalikas [226]. En este estudio, dos aldehdos de bajo peso
molecular
fueron
derivatizados
en
una
gota
conteniendo
2,4,6
Loslquidosinicos(IL)tienenungranpotencialenHSSDMEdebidoa
sualtaviscosidady novolatilidad que permitelaformacin degotasestables.
Zhao et al. [227] propusieron el uso del lquido inico hexafluorofosfato de 1
octil3metilimidazolio en HSSDME para la extraccin de fenoles antes de GC
deteccinconionizacindellama(FID).Elvolumendelamicrogotadelquido
inico usada fue 1 L. Despus de la extraccin, se realiz la desercin de los
analitosenlavlvuladeinyeccinyelILnovoltilseretirconlamicrojeringa.
El mtodo se aplic a la determinacin de fenoles en agua de lago y aguas
residuales.
- 73 -
deteccin estuvieron comprendidos entre 0,102 y 0,203 g L1 y el mtodo se
validutilizandomuestrasfortificadasdeaguadegrifo,depozoyresiduales.
- 74 -
Introduccin
2.4.
Tcnicasdeseparacinydeteccin
La cromatografa lquida y gaseosa, en combinacin con la
espectrometrademasas(LCMS,GCMS)ysustandemenMS(LCMS/MS,GC
MS/MS) son las tcnicas predominantes para la identificacin y cuantificacin
decompuestosorgnicos,susmetabolitosyproductosdetransformacinenel
medio ambiente. Ambas se consideran necesarias para cubrir la necesidad del
anlisis de un amplio intervalo de contaminantes y matrices. GCMS y LC
MS/MS se han usado como tcnicas complementarias para cuantificar las 33
sustancias prioritarias de la lista europea del sistema de registro, evaluacin y
autorizacindecompuestosqumicos[229].
Asimismo,
los
recientes
avances
en
electroforesis
capilar
espectrometra de masas (CEMS) han hecho que esta tcnica combinada sea
ms competitiva en el anlisis de muestras ambientales aunque an necesita
proporcionar mayores prestaciones en su capacidad de deteccin debido a las
cantidades traza de contaminantes presentes en el medio ambiente y la alta
complejidaddelamatrizdelasmuestras.
2.4.1. Cromatografadegases/espectrometrademasas.
- 75 -
deGCcapilarconprogramasdetemperaturamuyrpidosparahacerfrenteal
procesadodegrancantidaddemuestras[231].
Respectoalosdetectoresdemasas,loscuadrupolares(Q)odetrampa
inica(IT)sonlosmsutilizadosenelanlisisambiental.Losespectrmetrosde
tiempo de vuelo (TOF) con resolucin de unidades de masa a altas tasas de
adquisicin de datos (hasta 500 espectros/s) se acoplan a GC rpida o GC
bidimensional mientras los de moderada tasa de adquisicin de datos (2025
espectros/s) pero con gran resolucin de masas son ms apropiados para la
resolucindelosanalitosconrelacinaloscomponentesdelamatriz.Durante
los ltimos aos ha habido una gran tendencia a usar GC/ITMS dado que su
capacidad de deteccin mediante MS/MS, basada en la seleccin de un in
precursor y el espectro de masas completo de sus iones producto, permite la
identificacin con gran fiabilidad de los analitos de inters a bajos lmites de
deteccinybajocostedeoperacin.
2.4.2. Cromatografadelquidos/espectrometrademasas.
LCMSyLCMS/MScontriplecuadrupolo(QqQ)ytrampainica(IT)son
ahora tcnicas ampliamente utilizadas para el anlisis de contaminantes
ambientales y de hecho incluso han reemplazado a GC/MS en muchas
aplicacionesdebidoasusensibilidadeidoneidadparadeterminarcompuestos
en amplios intervalos de masa y polaridad. La interfase de ionizacin
electrospray (ESI) seguida de ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI)
[231] M. Dmtrov, E. Matisov, J. Chromatogr. A 1207 (2008) 1.
[232] L. Mondello, P.Q. Tranchida, P. Dugo, G. Dugo, Mass Spectrom. Rev. 27 (2008)
101.
- 76 -
Introduccin
sonlasmsusadas.Lainterfasedefotoionizacinapresinatmosfrica(APPI)
es la mejor seleccin en el caso de analizar compuestos quirales (los cuales
suelen requerir el uso de LC en fase normal) ya que, a diferencia de otras
interfases, no est sujeta a explosiones peligrosas cuando se usan disolventes
inflamablesenlafasemvil.
RecientesavancesenMShanllevadoaldesarrollodeanalizadoresQqQ
denuevageneracineinstrumentoshbridoscomocuadrupolotiempodevuelo
(QTOF), cuadrupolotrampas lineales (QLITs) y trampa inica linealOrbitrap
(LTQOrbitrap). Las ventajas de estos nuevos analizadores en trminos de
velocidad de monitorizacin, exactitud de masa y sensibilidad en el anlisis
ambiental han sido discutidas por Barcel y Petrovic [235]. QLIT MS con
posibilidad de MS3, LITs con alta sensibilidad para experimentos MSn y QTOF
[233] A.B. Lambie, A. Agarwal, H. Fang, A. Hamsher, L. Hong, K. ONeal, X. XU, S.G.
Weber, Trends Anal. Chem. 26 (2007) 445.
[234] P. Jandera, J. Sep. Sci. 31 (2008) 1241.
[235] D. Barcel, M. Petrovic, Trends Anal. Chem. 26 (2007) 2.
- 77 -
MSparamedidasdemasaexactasdelosionesproductosonherramientasmuy
poderosasparaidentificarproductosdetransformacin.
Actualmente,lasinvestigacionesenelreadelaLCMSestnenfocadas
al desarrollo de anlisis multiresiduo de contaminantes [236239] y a la
237,238,239
- 78 -
Introduccin
2.4.3. Electroforesiscapilar.
Lastcnicasdeelectroforesiscapilar(CE),tantoenformatotradicional
como en formato chip, se estn haciendo un hueco dentro del anlisis
ambientalgraciasalosrecientesavancesenestembito.
- 79 -
PARTEI:SISTEMASSUPRAMOLECULARESPARALASIMPLIFICACINDEOPERACIONESPREVIASENLA
DETERMINACINDECONTAMINANTESENMUESTRASACUOSAS
PARTE I
SISTEMAS SUPRAMOLECULARES
PARA LA SIMPLIFICACIN DE
OPERACIONES PREVIAS EN
LA DETERMINACIN DE
CONTAMINANTES EN
MUESTRAS ACUOSAS
Objeto
OBJETO
Lasimplificacindelasoperacionespreviasdelprocesoanalticoesun
objetivo prioritario en el mbito del anlisis qumico. En este sentido, la
extraccinenfaseslida(SPE)eslatcnicamsrecomendadaparaelanlisisde
muestrasacuosasdebidoasusimplicidadycapacidaddeintegrarlaextracciny
preconcentracin de los compuestos con la limpieza y conservacin de la
muestra.
Porello,esinteresanteyobjetodepartedelasinvestigacionesquese
presentan en el bloque I de esta Tesis Doctoral el desarrollo de nuevas fases
adsorbentes para SPE basadas en sistemas supramoleculares que aporten
alternativas y mejoren las prestaciones de las ya existentes. Los agregados
supramoleculares propuestos para alcanzar este objetivo han sido; (1)
hemimicelas de dodecilsulfato formadas sobre almina como nueva fase
adsorbenteparalaextraccin,concentracinyestabilizacin en faseslidade
tensioactivos de benzalconio y (2) admicelas mixtas de dodecilsulfato y
tetrabutilamoniosobrealminacomonuevafaseadsorbenteparalaextraccin,
concentracinyestabilizacinenfaseslidadedistintasfamiliasdeplaguicidas.
- 83 -
ParteI
hidrogeno,agregadosmixtos,etc.)quepuedenestablecerseentrelossolutosy
el extractante. Adems tanto las hemimicelas/admicelas como los disolventes
supramolecularesproporcionanmicroambientesdondelosanalitosseadsorben
o solubilizan evitndose prdidas por degradacin o adsorcin sobre los
contenedoresalolargodeltiempo.
- 84 -
Capitulo1
CAPTULO1:Stabilityofbenzalkoniumsurfactantsonhemimicellesbasedsolidphaseextractioncartridges
CAPTULO1
Stabilityofbenzalkoniumsurfactantsonhemimicelles
basedsolidphaseextractioncartridges
JournalofChromatographyA1094(2005)1723.
NoeliaLuque,FranciscoMerino,SoledadRubio,DoloresPrezBendito
Abstract
Keywords:Benzalkonium;Cationicsurfactant;Admicelle;Hemimicelle;Stability;
- 85 -
ParteI
storage;SPE.
1.Introduction
13141516
[1] J. Parr, M. Bollinger, O. Callaway, K. Carlberg, in: L.H. Keith (Ed.), Principles of
Environmental Sampling, American Chemical Society, Washington, 1996. p.267
(Chapter 15).
[2] D.R. Green, D. Le Pape, Anal. Chem. 59 (1987) 699.
[3] S.A. Senseman, T.L. Lavy, J.D. Mattice, B.M. Myers, B.W. Skulman, Environ. Sci.
Technol. 27 (1993) 516.
[4] D. Barcel, S. Chiron, S. Lacorte, E. Martnez, J.S. Salau, M.C. Hennion, Trends
Anal. Chem. 13 (1994) 352.
[5] I. Ferrer, D. Barcel, J. Chromatogr. A 737 (1996) 93.
[6] I. Lika, K. Blikov, J. Chromatogr. A 795 (1998) 61.
[7] I. Ferrer, D. Barcel, J. Chromatogr. A 778 (1997) 161.
[8] M. Castillo, D. Puig, D. Barcel, J. Chromatogr. A 778 (1997) 301.
[9] M.C. Alonso, D. Barcel, J. Chromatogr. A 889 (2000) 231.
[10] M.C. Alonso, D. Barcel, Analyst 127 (2002) 472.
[11] M .Petrovi, D. Barcel, Fresenius J. Anal. Chem. 368 (2000) 676.
[12] T. Saitoh, Y. Nakayama, M. Hiraide, J. Chromatogr. A 972 (2002) 205.
[13] F. Merino, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chem. 75 (2003) 6799.
[14] F. Merino, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chem. 76 (2004) 3878.
- 86 -
Capitulo1
Hemimicellesconsistofmonolayersofsurfactantsadsorbingheaddown
on an oppositely charged mineral oxide surface (e.g. alumina, silica, titanium
dioxide, ferric oxyhydroxide). Admicelles are surfactant bilayers formed from
hemimicelles, under addition of more surfactant, by interaction of surfactant
hydrocarbon chains.Amaincharacteristicofthesesorbentsistheirversatility.
On the one hand, the outer surface of the hemimicelle and admicelle is
hydrophobic and ionic, respectively, providing different mechanisms for
retention of organics. On the other hand, the number of surfactants
commercially available is very high, so both the degree of hydrophobicity and
the charge of the sorbent can be easily modified according to the nature of
analytes. As a result, high extraction yields have been obtained for organic
compounds of different nature such as hydrophobics [12,15], ionics [14] and
amphiphilics [13,16].Becausethepotentialofhemimicellesandadmicellesfor
theSPEofpollutants,theirabilitytopreserveorganiccompoundsafteronsite
extractiondeservestoberesearched.
- 87 -
ParteI
Different sorbent materials have been proposed for SPE of BASs
[13,19,20]. The use of nonpolar silica sorbents (e.g C18) is not recommended
because the strong interaction of these cationic surfactants with the silanol
groups which results in very broad elution bands. This problem can be solved
usingneutralpolymericsorbents,butBASextractionrecoveriesareabout75%
[19]. The use of sodium dodecyl sulphate (SDS) hemimicelles on alumina has
provedtobeaveryconvenientsorbentforthesesurfactantsbecauseboth,the
high BAS retention, derived from the formation of analyte:extractant mixed
aggregates, and the easy BAS desorption, derived from the fast disruption of
hemimicellesinthepresenceoforganicsolventsandtheelectrostaticrepulsion
between BASs and the positively charged alumina surface [13]. A similar
approach,usingdodecylsulphateattachedtoananionexchangeresinhasbeen
recentlyproposedforextractionofBASs[20].
[20] J.K. Autry, E.G. Vaught, E.D. Conte, Microchem. J. 80 (2005) 25.
[21] M.T. Garca, I. Ribosa, T. Guindulain, J. Snchez-Leal, J. Vives-Rego, Environ.
Pollut. 111 (2001) 169.
- 88 -
Capitulo1
reducedbycomplexationwithananionicsurfactant[22],andthisbehaviouris
expectedtobeastabilizingfactorforBASsonSDShemimicellecartridges.
Inthiswork,thestoragestabilityofC12,C14andC16BAShomologueson
SDS hemimicellesalumina cartridges was investigated during a period of 3
months at three different temperatures (20 C, 4C and room temperature).
The influence of light and matrix composition on BAS stability was also
investigated.BecauseofthelackofdataonthestabilityofBASsolutionstreated
with traditional preservation procedures, we also investigated the stability of
BASs under acidification (pH 2)/refrigeration (4C), addition of 5%
formaldehyde/refrigeration (4C), and freezing (20C). The final goal of this
research was to contribute to the knowledge of the ability of supramolecular
sorbents to stabilize organic compounds and to establish preservation
conditionsforBASsinenvironmentalwatersamples.
2.Experimental
2.1.Chemicalsandmaterials
- 89 -
ParteI
2.2.Stabilitystudies
2.2.1.Samplepreparation
Stability studies were carried out using spiked distilled water. For this
purpose, stock standard solutions of BASs (60 mg L1) were prepared in
methanol.Samples(0.25L)indarkglasscontainerswerespikedtoobtainafinal
concentration of 48 g/l of each surfactant. Then, they were treated with
differentpreservationmethods[hemimicellebasedcartridges,acidification(pH
2)/refrigeration (4C), addition of 5% formaldehyde/refrigeration (4C), and
freezing(20C)],andstoredunderdifferentconditions.Duplicatesampleswere
analysed for each experimental condition studied. Recoveries of BASs a time
zero were established for each preservation method investigated and data on
stabilitywerenormalisedtotheseresults.The matrixeffecton thestability of
BASs preconcentrated on hemimicellebased cartridges was investigated using
riverandwastewatersamples.RiversamplesweretakenfromtheRabanalesin
Crdoba city. Treated sewage samples were collected from the wastewater
treatmentplant(WWTP)ofBailninthesouthofSpain.BailnWWTPreceives
4050%industrialeffluents(mainlyfrombrickworks,andceramicandoliveoil
industries)mixedwith5060%domesticwastewaters.Sampleswerecollected
indarkglasscontainers.Immediatelytheywerefilteredthrough0.45mfilters
(Whatman GF/F, Osmonics, France) in order to remove suspended solids, and
then they were spiked to obtain a final concentration of 48 g L1 of each
surfactant. Blank river and wastewater samples were analysed prior to spiking
BASs.
2.2.2.BASpreservationonhemimicellebasedSPEcartridges
- 90 -
Capitulo1
BASpreservationanddetermination
HemimicellebasedSPEcartridges
Conventionalprocedures
WatersampleatpH2(0.25L)
(distilled,river,wastewater)
BASPRESERVATION
Distilledwater(0.25 L)
SDS
Alumina
Acidificationat
pH2and
storageat4C
BASPRESERVATION
Sampleloading
+ +
BASs
Additionof
formaldehyde
(5%)andstorage
at4C
Freezingat
20C
SDS
Alumina
AdjusttopH2
withnitricacid
Drying
SDS
Alumina
Storageconditions
Sampleloading
4C
++
BASDETERMINATION
Elution
2mLofmethanol
1.
Scheme
SDS
Alumina
Elution
2mLofmethanol
LC/DADUVdetermination
Figure
BASs
BASDETERMINATION
Room
temperature
20C
LC/DADUVdetermination
of
the
different
stops
followed
for
the
- 91 -
ParteI
nitricacidtoavoidtheadsorptionofBASsonthewallofsamplecontainers[13].
Bond Elut Jr. cartridge columns were conditioned with 5 ml of distilled water
(pH = 2). The hemimicelles were formed on the alumina by passing a 10 mL
solutioncontaining12.5mgofSDSatpH2.Thesorbentwasnotallowedtodry
andthen,0.25Lofthespikedwatersampleswereloadedonthehemimicelles
usingavacuumpump(EyelaA35,RikakikaiCo.,Tokyo),ataflowrateof10mL
min1. Then, the percolated samples were subjected to the three kinds of
experimentsabovespecified:(a)Desiccationstudieswerecarriedoutusingthe
Eyelavacuumpump,fortimesrangingfrom3to5min(thetimenecessaryto
notobservewaterdropsleakingoutthecartridge)to1hour.Wetcartridges(i.e.
withoutdrying)werealsoanalysedatthesametimes.(b)Darkconditionswere
obtained by initially wrapping the cartridges up with aluminium foil. Drying of
thepercolatedsampleswasstoppedwhennotwaterdropswereleakedoutthe
cartridge.Ittookabout35min.Thecartridgescontainingthepreconcentrated
BASs were stored at room temperature for a period of 1 month and BAS
concentrations were determined weekly. Noncovered cartridges were also
analysedatthesametimes.(c)TheeffectofthetemperatureonBASstability
was studied by using noncovered cartridges. After drying the percolated
samplesfor35min,thepreconcentratedBASswerestoredat20C,4Cand
roomtemperatureforaperiodof3months.BASconcentrationswereanalysed
after0.25,0.5,0.75,1,2and3months.Thecartridgesat4Cand20Cwere
broughttoroomtemperaturefor15minand1hour,respectively,priortothe
determinationofBASs.
2.2.3.BASpreservationusingconventionalprocedures
Thestabilityofspikeddistilledwatersamples(0.25L),containedindark
glass bottles, was also studied according to the following conventional
procedures(seeFigure1):
TheywereadjustedtopH2bytheadditionofconcentratednitricacid
andstoredat4C.
- 92 -
Capitulo1
Formaldehydewasaddedtomakeafinalconcentrationof5%andthen,
thesampleswerestoredat4C.
Sampleswerefrozenat20C
Stability measurements were performed at time zero and at each week for a
month.
2.2.4.BASdetermination
ThesequencefollowedforBASdetermination,aftertheirstorageunder
different conditions, is depicted in Figure 1. BASs stored on hemimicelle
cartridges were eluted with 2 mL of methanol and aliquots of the eluate
(typically20L)wereinjectedintoaLC/DADUVsystem.Samplespreservedby
conventional procedures were adjusted at pH 2 and preconcentrated on SDS
hemimicellesbasedcartridgesaccordingtotheprocedurepreviouslydescribed
(section2.2.2).Then,elutionwith2mLofmethanolandinjectionofanaliquot
inthechromatographwasperformed.
- 93 -
ParteI
3.Resultsanddiscussion
3.1.Analyticalperformance
Combination
of
SDS
hemimicellebased
SPE
with
liquid
Asimplertechnique(i.e.liquidchromatography/UVdetection)wasused
in this work to control the stability of BASs in SDS hemimicelles since its
performance was enough for this purpose. BASs were monitored at 210 nm
becauseofthiswavelengthprovidedthebestsignaltonoiseratiointherange
210250 nm. Recoveries of BASs from distilled water, river water and
wastewater,spikedwith48gL1ofeachhomologue,wasnearly100%andno
interferencewasdetectedfromthecomponentsofthedifferentmatricesusing
this detection system. No cleanup steps were required to determine
benzalkoniumsurfactantsintheenvironmentalwatersamplesanalysed.
- 94 -
Capitulo1
independent spiked (48 g L1) distilled water samples. The relative standard
deviationwasalwaysbetween4and6%.
3.2.Stabilitystudies
3.2.1.StabilityofBASsinwatersamples
TheabilityoftraditionalstabilizationprocedurestopreserveBASsatthe
levelsfoundinenvironmentalwatersampleswasassessed.Inordertodecrease
microbiological degradation the strategies tested always included the use of
refrigeration or freezing (see Figure 1). Adjustment of the pH solution at 2, to
decreaseBASadsorptionontheglasscontainer,andadditionofformaldehyde,
a typical stabilizing agent for organic compounds, were used in combination
withrefrigeration.Allexperimentswerecarriedoutunderdarkconditions.
Figure2showstheresultsobtainedforthestudyofthestabilityofBASs
inspiked(48gL1)distilledwatersamples,foraperiodofamonth,usingthe
three conventional procedures specified in Figure 1. Combination of both
chemical addition (i.e. nitric acid or formaldehyde) and decrease of the
temperaturewastheonlyeffectivewaytopreserveBASsintheshortterm(i.e.
for a week). Then progressive losses of these cationic surfactants, which were
higher as the alkyl chain length increased, were found. Therefore, chemical
addition/refrigeration is not a useful strategy for preservation of BASs in the
mediumlong term. Freezing of samples did not improve the stability of BASs
suggestingthatadsorptiononcontainerswasanimportantissueforthelossof
thesecationicsurfactants.
- 95 -
ParteI
(a)
100
80
1stweek
60
2ndweek
40
3thweek
20
4thweek
0
(b)
100
Recovery(%)
Time0
80
60
40
20
0
100
(c)
80
60
40
20
0
Acidification/
refrigeration
Formaldehyde/
refrigeration
Freezing
- 96 -
Capitulo1
3.2.2.StabilityofBASsonhemimicellebasedSPEcartridges
3.2.2.1. Effect of water removal and dark conditions on BAS stability. Residual
water surrounding the sorbent after sample filtration has been described to
cause hydrolysis of susceptible compounds [23]. So, different desiccation
treatmentshavebeenproposedtoenhancethestabilityofanalytesstoredon
SPEcartridgesordisks[311].Theeffectofwaterremovalafterpercolationof
thesampleonthestabilityofBASswasassessedbydryingthecartridgeswitha
vacuum pump for times ranging between 3 min and 1 h. BAS recoveries
decreasedabout45%aftertheirstorageinwetcartridgesatroomtemperature
for 1 day. Partial drying of cartridges stabilized the target compounds and
recoveries were quantitative after their storage at room temperature for at
leastaweek.NoeffectsofthedryingtimeonBASstabilitywereobserved.So,
dryingofcartridgesfor35minafterpercolationofthesamplewasproposed.
Thestorageofcartridgesunderdarkconditions(i.e.usingaluminiumfoil
wrapped cartridges) was not necessary to achieve BAS stability. Recoveries
obtained for the target compounds from aluminium foil wrapped cartridges
(Table1)andnoncoveredones(topofTable2),storedatroomtemperaturefor
amonth,weresimilar.Therefore,naturalilluminationinthelab(i.e.thatfrom
sunlight) did not affect BAS stability and further experiences were carried out
usingnoncoveredcartridges.
Table1. Mean recoveries (%) of benzalkonium surfactants after storing the SDShemimicelles aluminium foil wrapped cartridges at room temperature.
Storagetime(week)
0
1st
2nd
3rd
4th
BDDA(%)
100
100
106
98
103
BDTA(%)
100
98
96
105
95
BDHA(%)
100
97
96
96
102
[23] S.A. Senseman, T.L. Lavy, J.D. Mattice, Anal. Chem. 67 (1995) 3064.
- 97 -
ParteI
AdjustmentofthepHofsamplesat2preventedtheadsorptionofBASs
onthewallofthematerialsusedintheanalyticalprocess,asitcanbederived
fromthequantitativerecoveriesobtainedforthetargetcompoundsunderthe
differentexperimentalconditionsinvestigated.
3.2.2.2. Effect of the cartridge storage temperature on BAS stability. For this
study, hemimicelllebased SPE cartridges loaded with spiked distilled water
wereanalysedduringa3monthperiod.Afterpreconcentration,thecartridges
were dried and then stored at 20 C, 4 C and at room temperature,
respectively. Before elution, cartridges at 20 C and 4 C were kept at room
temperatureforaperiodvaryingbetween5minand5hoursinordertodefrost
thesampleand/oravoidvariabilityproblems.Itwasfoundthatsorbentsshould
bekeptatroomtemperaturebeforeelutionforatleast15minand1hourwhen
they are brought from storage conditions involving 4 C and 20 C,
respectively,inordertoobtainquantitativeandhighprecisionresults.So,these
timeswereusedthroughthewholeexperiment.
Table 2 shows the recoveries obtained for the three BAS homologues
understudyatthethreetemperaturesexamined.SDShemimicelleshadahigh
stabilizing effect on BASs; the integrity of the target compounds was kept for
thewholeperiodoftimeinvestigated,independentlyonthetemperatureused
forstorageofcartridges.Nodifferencesofrecoverieswerefoundforthethree
homologues, despite C12 and C14 are known to be more easily biodegradable
than C16 [20]. The high stability afforded by BASs after formation of mixed
aggregates with SDS is in agreement with the biodegradation reduction
observed for cationicanionic surfactant complexes in natural environments
[22].ThefactthatBASsarestableatroomtemperatureforatleast3monthsis
an outstanding feature of the stabilizing strategy here proposed since it will
permitaneasytransportationofthesamplespreconcentratedonthecartridges
tolaboratoriesforanalysis.
- 98 -
Capitulo1
Table 2. Mean recoveries (%) of benzalkonium surfactants after storing the
SDS-hemimicelles cartridges at different temperatures values.
Storageconditions
Roomtemperature
Storagetime
(week)
0
1st
2nd
3rd
4th
8th
12th
BDDA
(%)
100
96
97
94
96
101
104
BDTA
(%)
100
97
101
97
101
97
99
BDHA
(%)
100
98
97
99
94
94
97
4C
0
1st
2nd
3rd
4th
8th
12th
100
102
105
114
97
103
99
100
98
104
103
103
98
97
100
100
105
98
103
96
98
20C
0
1st
2nd
3rd
4th
8th
12th
100
105
101
94
95
96
94
100
100
98
97
95
96
94
100
94
94
94
95
95
95
3.2.2.3. Effect of the water matrix on BAS stability. In order to validate the
preservationtechniquewehavetotakeintoaccountthecharacterofsamples
sincematrixcomponentscandegradethestabilityofthetargetcompounds.In
previous studies using SDS hemimicellebased SPE [13], no interference has
been found for BAS determination from alkylbenzenesulphonates and
nonylphenol/alcohol ethoxylates, at the concentration level found in sewage
(mg L1), or from other matrix components. The stability of sorbed BAS was
investigatedusingriverandwastewater(effluent)samples.Sincebothkindsof
- 99 -
ParteI
samples contain nonionic [16] and anionic [24] surfactants and other organic
components (e.g. humic material), they were considered appropriate to this
purpose. The concentration of BASs was undetectable because the practical
detection limit of LC/UV (about 10 g L1) was superior to the concentrations
usually found in these samples (e.g. between 0.1 and 6 g L1, [13,19]). So,
spiked samples were used. The loaded cartridges were kept at room
temperatureand4Cforamonth.Measurementswerecarriedoutweeklyfora
month.Theresultsobtained(Table3)indicatedthatmatrixcomponentshadnot
influence on the stability of BAS homologues, thus confirming the high
resistanceofSDS:BASaggregatestodegradation.
Time
Wastewater(effluent)
(week)
0
1st
2nd
3rd
4th
Riverwater
BDDA(%)
BTDA(%)
BHDA(%)
BDDA(%)
BTDA(%)
BHDA(%)
100
96
104
101
103
100
100
104
102
101
100
96
100
95
94
100
98
100
106
103
100
102
96
97
105
100
94
101
101
104
4.Conclusions
From the results reported in this study, it can be concluded that SDS
hemimicelles onto alumina is a valuable sorbent to stabilize BASs after
preconcentratingthemfromenvironmentalsamples.TherecoveryofBASswas
foundquantitativeandindependentofthealkylchainlengthundertherangeof
temperatures examined (from room temperature to 20 C) for a period of 3
months. No complete removal of water after percolation of the sample was
required for stabilization of BASs; drying the cartridges for 35 min with a
[24] F.J. Ruiz, S. Rubio, D. Prez-Bendito, J. Chromatogr. A 1030 (2004) 109.
- 100 -
Capitulo1
vacuum pump achieved the stabilization. Storage of cartridges under dark
conditionswasnotrequired;naturalilluminationinthelab(i.e.sunlight)didnot
affectBASstability.
The
results
obtained
open
the
possibility
of
using
Acknowledgements
- 101 -
ParteI
CAPTULO2:Extractionandstabilityofpesticidemultiresiduefromnaturalwateronamultifunctionaladmicellarsorbent
CAPTULO2
Extractionandstabilityofpesticidemultiresiduefrom
naturalwateronamixedmodeadmicellarsorbent
JournalofChromatographyA,DOI:10.1016/j.chroma.2012.06.006
NoeliaLuque,SoledadRubio.
Abstract
- 102 -
Captulo2
disadvantage of requiring large volumes of solvents for analyte elution. The
stabilizationofpesticidesontheadmicellarsorbentwaslongenoughtopermit
easyshippingandstorageofthecartridgesinmonitorizationcampaigns.
Keywords:Pesticidemultiresiduedetermination;pesticidepreservation,natural
waters,admicellarsolidphaseextraction;supramolecularsorbents
1.Introduction
Theextensiveuseofpesticidesinmodernagricultureraisesanumberof
environmentalandhealthconcerns.Pesticidesareacommoncauseofsoiland
water pollution [1] and many of them are considered as carcinogenic [2] or
endocrine disrupting chemicals [3]. Their analytical control is mandatory in
differentwaterbodieswithintheEUincludingdrinking[4],groundwater[5]and
surfacewaters[6].
Becauseofthespatialand/ortemporalvariabilityofpesticidesinwater
bodies, their analysis usually requires the processing of a large number of
samples. Field samples are not analysed immediately after collection, rather
theyarestoredforvariableperiodsoftime.Problemsofpesticidedegradation
- 103 -
ParteI
in water samples are wellknown, major transformations being due to
hydrolysis, biodegradation, photolysis and evaporation [713].8 Strategies9
such10 as11 chemical12 addition13 and/or temperature control have been
traditionallyusedtokeepsampleintegrityuntilanalysis.Inthisrespect,addition
of HgCl2 or monochloroacetic buffer at 4C has been proved to inhibit both
chemical and biological degradation [14]. However, the nature of the agent
requiredtostabilizesomecompoundsmayaffectthestabilityofothers[11,15]
ortheperformanceoftheanalyticalprocedure[16,17]andstabilizationisonly
guaranteed for no more than 12 weeks. Stabilization of pesticides in water
samplesisalsoaneedforthedevelopmentofmatrixreferencematerials[13].
- 104 -
Captulo2
highly crosslinked polymeric resins (e.g. styrenedivinylbenzene polymers) are
the best choice for multiclass pesticide SPE because of their potential to
simultaneously extract a wide polarity range compounds. Alkyl (C8 and C18)
bonded silica provides high retention of nonpolar and moderately polar
compounds but it is not appropriate for polar analytes [22]. Preservation of
pesticidesonSPEmaterialsishighlydependentonthestructureofbothanalyte
andsorbent.Asageneralrule,thestabilityofpesticidesincreasesinpolymeric
resinscomparedtoalkylbondedsilicaandcarbonmaterialsbutusuallyitisnot
longerthan12weeksatroomtemperature.Somedrawbacksassociatedtothe
use of these multiclass sorbents are the high solvent volume required to
quantitatively desorb pesticides from polymeric resins (e.g. 515 mL) and the
irreversible adsorptions occurring on carbon materials [23,24]. Frequently,
organic extracts have to be evaporated to increase concentration factors, that
resulting in long analysis times and losses of volatile and thermally unstable
pesticides. So, the search for mixedmode materials with highly preserving
propertiesandeasyelutionforpesticidesisdesirable.
- 105 -
ParteI
from the adsorption of surfactant molecules to these monolayers through
interactionsamongthehydrocarbonchainsandtheycloselyresembleaqueous
micelles. Their ability to extract analytes in a wide polarity range derives from
thevarietyofinteractionstheyoffer.Thus,hydrophobicsolutesaresolubilised
into the hydrocarbon region of the surfactant aggregates while polar/charged
analytesmaybesolubilisedinthesurfactantheadgroupsthroughelectrostatic,
cation,dipoledipoleinteractions,hydrogenbonds,etc.Elutionofanalytesis
facilitated by disruption of hemimicelles/admicelles in the presence of organic
solvents or by desorption of the surfactant by pH modification. On the other
hand, the ability of micelles and other surfactant aggregates to stabilize
reactants,intermediates,transitionstatesandproductsiswellknownandithas
beenwidelyexploitedinkinetic[28]andequilibrium[29]analyticalmethods.
- 106 -
Captulo2
adsorbed solutes, thus reducing effort and cost in environmental campaigns,
hasbeenhardlyexplored[40].
Compound
Bases/neutrals
Structure
Log
Ko/wa
pKaa
2.6
2.3
2.3
2.7
1.7
12.3;1.5
3.6
13.1;0.6
2.4
14.4;0.1
2.9
15.1;0.8
3.4
13.6;0.9
3.0
1.4
Cl
Atrazine
Triazines
N
CH3 CH2 NH
CH3
NH CH
CH3
Cl
Simazine
N
CH3 CH2 NH
NH CH2 CH3
N
O
Carbofuran
CH3 NH C O
Carbamates
CH3
CH3
Cl
Chlortoluron
CH3
O
CH3 N C NH
CH3
Phenylureas
Isoproturon
CH3
H N C O CH
Cl
CH3
Chlorpropham
CH
O
CH3 N C NH
CH3
CH3
CH3
O
Anilides
NH C CH2 CH3
Propanil
Cl
Cl
Chloroacetanilides
Metolachlor
CH3
- 107 -
ParteI
O
Alachlor
Cl CH2 C N C CH2 Cl
CH2 CH3
CH3 CH2
3.1
1.2
4.5
2.4
3.0
Cl
Organophosphorus
Chlorfenvinphos
Acids
CH
O
O CH2 CH3
CH2 CH3
Cl
Cl
H O
O CH C OH
2,4D
Cl
Cl
Phenoxyacids
CH3 O
O CH C OH
Mecoprop
2.6
3.2
a
Octanolwater partition constants and ionization constant were obtained from
ScifinderScholar.
CH3
Cl
2.Experimental
2.1.Chemicalsandmaterials
carbofuran,
chlorfenvinphos,
chlorpropham,
chlortoluron,
- 108 -
Captulo2
2.2.Samplecollectionandpreparation
Extractionandstabilitystudieswerecarriedoutusingdifferenttypesof
waters (distilled, river and underground). River samples were taken from the
Rabanales stream in Crdoba (South of Spain) and underground waters were
drawnfromtwowellsalsolocatedinCrdoba.Allthesampleswerecollectedin
amber glass containers and filtered through 0.45 m acetylcellulose filters in
order to remove suspended solids. Calcium in the samples was removed by
precipitationwithSDS[Ca(DS)2,Ksp=2.14x10 10].Forthispurpose,increasing
volumes (at increments of 0.1 mL) of a 0.1 M SDS solution was added to the
sampleuntilthestartofturbidity.Then,thecalciumcontentinthesamplewas
calculated from the minimum SDS concentration needed for precipitation and
thecorrespondingvolumeof0.1MSDSsolutionrequiredtoreacha[SDS]/[Ca+2]
molar ratio of 2 was added. The precipitate formed was separated from the
samplebycentrifugationat3000rpmfor10min.SampleswereacidifiedatpH2
withhydrochloricacidandstoredat4Cindarkuntiltheiruse.
2.3.ExtractionandpreservationofpesticidesonTBASDSadmicellebasedSPE
cartridges
- 109 -
ParteI
NaOH:methanol (90:10 v/v) solution. Aliquots of each eluate (20 L) were
analyzedbyliquidchromatographyphotodiodearraydetection(PAD).
2.4.Pesticidesdetermination
3.1.Sorbentdescriptionandselectionofoptimalextractionconditions
- 110 -
Captulo2
aggregates formed according to the amount of SDS adsorbed is depicted in
Figure1A.
(B)
mixedSDSTBAadmicelles
TBA
SDShemimicelles
mgSDSadsorbed/galumina
(A)
CHC
1000
CMC
Hemimicellarregion Hemimicellar/
Admicellar
region
Admicellar
region
100
10
0.1
10
100
1000
10000
[SDS]aqueous(mg/L)
Figure1. (A) Adsorption isotherm of SDS onto alumina and structure of the
different sorbents produced as a function of the amount of surfactant. (B)
Schematic of the formation of SDS-TBA mixed admicelles from SDS
hemimicelles at the hemimicellar critical concentration (CHC).
- 111 -
ParteI
All these sorbents offer mixedmode mechanisms for solubilisation of
solutes, namely dispersion interactions in the hydrocarbon chain and ionic
interactions in the polar group or the uncovered alumina. Hemimicelles,
althoughpredominantlyhydrophobic,alwayscontainpatchesofadmicelles.
Mostofthepesticidesunderstudy(Table1)wereneutralsatpH2,so
the major interactions expected to drive adsolubilization into the pure SDS
surfactant aggregates were hydrophobic. Having into account that all of them
havearomaticringsintheirstructure,mixedadmicellescontainingammonium
groups were expected to increase extraction yields because of their ability to
establish cation interactions with pesticides. Based on these considerations,
thecapabilitytoextractpesticidesofsorbentsmadeupof80mgSDS/galumina
(i.e.hemimicellesatthecriticalhemimicellarconcentration,CHC,Figure1A)and
different amounts of tetrabutylammonium, was assessed. A likely structure of
these sorbents is depicted in Figure 1B; first, all the alumina surface was
covered by SDS and then mixed SDSTBA admicelles were formed under
addition of the ammonium quaternary salt. This figure, although some
hypothetical,expressesthemaininteractionsexpectedtoberesponsibleofthe
retentionofpesticidesonthesorbent.
Experimentstoassessadsolubilizationwerecarriedoutbypassinga25
mLaqueoussolutioncontaining10gL1ofeachpesticideatpH2throughthe
different sorbents. Table 2 shows the results obtained. Quantitative retention
was achieved for most of the pesticides on pure SDS hemimicelles, however,
phenylureas required the presence of TBA to be quantitatively extracted.
Carbofuran was only partially retained in all the sorbents investigated.
According to these results, the sorbent selected for preservation studies was
madeof80mgofSDSand6x102mgofTBA/galumina.
Breakthroughvolumesweredeterminedbypassingincreasingvolumes
(25500mL)ofhydrochloricacidaqueoussolutions(102M),containing100ng
ofeachofthepesticides,throughthemixedSDSTBAsorbent,anddetermining
the concentration of each analyte in the eluates. The flow rate for sample
- 112 -
Captulo2
percolationwasbelow1mLmin1.Breakthroughwasconsideredtooccurwhen
the recovery decreased about 5%. Quantitative retention on the sorbent was
observed for triazines, anilides, chloroacetanilides, organophosphorus,
phenoxyacidsandchlorprophamatthemaximalpercolatedsamplevolume(500
mL).Breakthroughproblemswereonlydetectedforcarbofuran(e.g.recoveryof
221%using250mLofsample)andphenylureas(e.g.recoveriesof341%for
chlortoluronand513%forisoproturonusing100mLofsample).
mgTBA/galumina
Bases/Neutral
6x103
Triazines
Atrazine
972
991
Simazine
1001
983
Carbamates
Carbofuran
302
452
Chlorpropham
981
971
Phenylureas
Chlortoluron
601
801
Isoproturon
703
861
Anilides
Propanil
931
992
Chloroacetanilides
Metolachlor
982
971
Alachlor
1001
1002
Organophosphorus
Chlorfenvinphos
992
1001
Acids
Phenoxyacids
2,4D
991
1002
Mecoprop
981
1011
a
n=3
b
25mLofdistilledwater(10gL1eachpesticide)
c
SDS(80mg/galumina)
- 113 -
0.06
981
1042
503
992
861
982
971
1002
1034
983
1012
1031
0.6
991
1001
401
1002
781
871
993
971
1002
994
991
1011
ParteI
Several organic solvents (methanol, isopropanol and tetrahydrofuran)
weretestedaseluentsfordesorptionofpesticides.Basicandneutralpesticides
werequantitativelyelutedin1mLofTHFand2mLofmethanolorisopropanol
while the elution of acid pesticides was negligible in all these solvents. The
stronger solvent (THF, 1 mL) was chosen as eluent of basic and neutral
pesticides.Quantitativeelutionofmecopropand2,4Dwasachievedusing2mL
of0.3MNaOHmethanol(90:10v/v).Undertheseexperimentalconditions,the
chargeofthealuminasurfacechangedfrompositivetonegativewhichcaused
disruption of the TBASDS aggregates. The presence of methanol in the eluent
solution was mandatory to effectively desorb acidic pesticides. Methanol
extracts contained high concentrations of TBA and SDS monomers but their
prompt elution from the chromatographic column prevented them from
interfering in the chromatographic determination of pesticides; both retention
time or peak areas were identical to those obtained from standards in the
absence of TBA and SDS.The flow rate required for quantitative desorption of
pesticidesundertheoptimalestablishedconditionsshouldbebelow2mLmin1,
otherwisetherecoveriesdecreased.
)distilled,riverandgroundwater(Table3).
[41] A. Zapf, R. Beck, G. Platz, H. Hoffmann, Adv. Colloid Interface Sci. 100 102
(2003) 349.
- 114 -
Captulo2
Table 3. aMean recoveries (%) and standard deviation of pesticides from 250
mL spiked (0.2 g L-1) distilled and natural waters using mixed TBA-SDS
admicellar-based SPE.
Compound
Atrazine
Simazine
Carbofuran
Chlorpropham
Chlortoluron
Isoproturon
Propanil
Metolachlor
Alachlor
Chlorfenvinphos
2,4D
Mecoprop
a
n=3.
Distilled
991
1022
221
1062
242
383
1035
1041
981
985
993
981
WaterSample
River
Underground
974
1034
983
1014
243
201
984
1013
211
262
392
404
964
993
986
962
1023
991
1007
1003
1044
971
1024
973
It was checked from previous analysis that natural waters were free
from target compounds. Recoveries for fortified river and groundwater were
similar to those found for distilled water, that indicating that no adsorption of
the pesticides on the Ca(DS)2 precipitate occurred and matrix components did
notaffecttheextractioncapabilityofTBASDSadmicelles.
3.2.Analyticalperformance
- 116 -
153000
203000
103000
22000
22000
Metolachlor
Alachlor
Chlorfenvinphos
2,4D
Mecoprop
0.030.13
0.20.2
0.030.1
0.20.1
0.070.10
0.30.2
0.30.3
0.0080.058
0.20.2
0.040.2
0.060.59
1.90.2
5.560.09
4.90.1
3.10.07
5.090.05
6.40.1
11.70.2
12.30.3
1.810.05
10.20.2
11.80.2
27.30.2
30.20.1
Slopesa
(x104)
0.9999
0.9992
0.9997
0.9999
0.9998
0.9998
0.9994
0.9991
0.9995
0.9995
0.9995
0.9999
13
26
19
60
6
13
10
40
80
60
20
30
180
18
40
10
Method
Method
detection quantitation
limitsb(ngL1) limitsb(ngL1)
c
100
300
300
600
1000
AAEQS
(ngL1)
Standarddeviation.
Calculatedfrominstrumentaldetectionandquantitationlimits,recoveriesandconcentrationfactorsusing250mLofwater
samples.
c
Annualaverageenvironmentalqualitystandards[6].
52000
Propanil
103000
52000
2.52000
Carbofuran
Chlorpropham
Chlortoluron
22000
22000
Atrazine
Isoproturon
2.52000
Simazine
Analytes
Linearrangefor
Interceptsa
instrumental
(x104)
calibration(gL1)
ParteI
Captulo2
245nm
0.0012
0.0008
AU
3
1
0.0004
5
2
0.0000
7
6
10
89
-0.0004
225nm
0.0003
AU
0.0002
0.0001
23 5
0.0000
89
10
-0.0001
5.00
25.00 30.00
Minutes
35.00
40.00 45.00
50.00
55.00
225mn
0.00020
AU
0.00015
0.00010
11
12
0.00005
0.0000
2.00
4.00
6.00
- 117 -
ParteI
respective instrumental limits taking into account the recoveries and
concentrationfactorsfromtheextractionof250mLofsampleandelutionwith
1 mL (neutral/basic pesticides) or 2 mL (acid pesticides) of solvent. Method
LOQsforpesticidesregulatedintheDirective2008/105/EC[6]werelowerthan
theenvironmentalqualitystandardsestablished.
Figure2depictsthechromatogramsobtainedfromaspiked(0.2gL1)
river water sample. No interferences were detected for any of the target
pesticidesundertherecommendedoperationconditions(seesection2.4).
Figure3showsthegeneralprocedurefollowedtostudythecapabilityof
SDSTBA cartridges to stabilize pesticides under a variety of experimental
conditions.Cartridgeswerestoredforthreemonthsatthreetemperatures(i.e.
room,4Cand20C)andtheinfluenceofdarknessandnaturalilluminationwas
evaluated. The effect of matrix components, wellknown to affect pesticide
stability,wasinvestigatedusingriverandundergroundwater.Inordertoavoid
hydrolysis of the pesticides in the residual water remaining in the cartridges
after sample percolation, they were subjected to desiccation using a vacuum
pumpfor35minutes.
- 118 -
Captulo2
admicellarcartridgesarestoredmorethan1weekbeforeanalysistoavoidthe
degradationofthelightsensitivepesticides.Thestrongstabilisingcapabilityof
surfactantaggregatesallowedthepesticidestokeepunalteredfor1(triazines,
phenylureas,
organophosphorus),
(carbamates,
anilides)
or
84Cartridgesx25mLofdistilledwaterspikedat1g/L
42cartridgesat
roomtemperature
21cartridges
indarkness
21cartridgesat4C
21cartridgesat20C
21cartridgesin
naturalillumination
30Cartridgesx250mLofnaturalwaterspikedat0.2g/L
15riverwatersamples
15undergroundwatersamples
15cartridgesat4C
15cartridgesat4C
- 119 -
2nd
3rd
4th
8th
Storagetime(weeks)
12th
- 120 -
1007 1075 977 1076 1021 8411 784 1054 994 1037 1082 888 793
Isoproturon
1005 971 1073 1125 1123 1048 1005 1003 1055 1081 1064 1081 984
Chloro Metolachlor
acetanilidesAlachlor
1007 882
1008 803
n=3;bNormalizedextractionrates.
Phenoxy 2,4D
acids Mecoprop
Organophos
Chlorfenvinphos 1003 931
phorus
954 886 1043 914 993 965 923 914 1024 972 922
903 974 951 1013 923 976 911 1003 972 984 923
1005 1061 965 1097 1065 1105 951 1013 995 1112 1022 1127 982
1004 1033 956 1092 1061 988 872 1014 954 1025 1032 964 902
Anilides Propanil
Phenylureas
1008 1087 926 1007 971 8310 702 1068 944 979 1014 878 733
1002 1001 994 1074 955 1094 928 1014 1014 1102 1161 1096 967
Chlortoluron
Carbamates Chlorpropham
31
12
st
10010 112111061010210 1064 964 808 1066 1044 7810 882 804 844
th
Carbofuran
th
th
rd
Atrazine
nd
Storagetime(weeks)
Naturallight
1003 993
st
Darkness
Storageconditions
Simazine
Pesticide
Triazines
Structural
group
Table 5. Meana recoveriesb (%) and standard deviation of pesticides from 25 mL spiked (1 g L-1) distilled water after storage
on mixed TBA-SDS admicellar-based SPE cartridges at room temperature under natural light and darkness conditions for 3
months.
ParteI
Captulo2
Table6showstheresults obtained. Refrigerationcompletelystabilized
mostofthetargetcompoundsandgreatlyincreasedthestabilityofatrazineand
clorfenvinphoscomparedtoroomtemperature.Completestabilizationofthese
pesticidesforthreemonthswasachievedbystoringthecartridgesat20C.
Table6. Meana recoveriesb (%) and standard deviation for pesticides from 25 mL
spiked (1 g L-1) distilled water after storage on mixed TBA-SDS admicellarbased SPE cartridges at different temperatures.
Structural
4C
20C
group
Pesticide
Storagetime(weeks)
Storagetime(weeks)
th
th
12
th
th
12
Simazine
1003
1023
975
973
1091
1024
1003
Atrazine
1004
1043
743
674
1042
1073
1054
Carbamates
Carbofuran
10010
1028
1022
1106
986
1006
1044
Chlorpropham
1002
1075
1057
984
1111
1084
948
Phenylureas
Chlortoluron
1008
1031
1011
1056
1008
1085
975
Isoproturon
1007
1154
1001
1031
1082
1014
1077
Propanil
1004
1061
1091
1031
1031
1004
994
Chlorfenvinphos
1003
1024
832
805
1052
1041
1004
Triazines
Anilides
Organophosphorus
a
Storageconditions
th
th
n=3.
Normalizedextractionrates.
Comparisonofthestabilityofthetargetpesticidesindifferentsorbent
materialsisshowninTable8.Dataforchlorpyrifoswerealsoincludedbecause
few studies have been previously reported for the structurally analogous
chlorfenvinphos,theselectedpesticideinthisstudy.Comparisonfromthedata
- 121 -
ParteI
in Table 8 becomes a bit difficult because different periods of time were
investigatedinthedifferentreportedstudies.However,onthewhole,SDSTBA
admicelles were clearly superior to C18 or black carbon sorbents in terms of
stabilization at any temperature while they were similar to that in polymeric
materials, the last one with the disadvantage of the need of higher solvent
volume for their elution [23,24]. The ability of micelles and other surfactant
aggregates to stabilize compounds has been widely used in kinetic and
equilibrium analytical methods, as it was stated in the Introduction. Although
there is not a general mechanism to account for this stabilization, the
microenvironments in the aggregates are expected to protect analytes from
externalconditionswhichcausetheirdegradation.
Table 7. Meana recoveriesb (%) of pesticides from 250 mL of spiked (0.2 g L-1)
natural water after storage on mixed TBA-SDS admicelles-based SPE cartridges at
4C for 3 months.
Riverwater
Structural
Group
Pesticide
Undergroundwater
Storagetime(months)
1
st
nd
Simazine
Atrazine
Carbofuran
Chlorpropham
Chlortoluron
Isoproturon
1004
1003
1005
1002
1003
1004
1051
994
1071
994
1005
982
982
776
963
1013
905
1024
936
634
1005
976
973
1016
Anilides
Propanil
1008
999
1017
9810
1007
9310
935
1057
Chloro
acetanilides
Organo
phosphorus
Metolachlor
Alachlor
Chlorfenvin
phos
2,4D
Mecoprop
1007
1004
982
995
968
1023
1058
977
1008
1003
10410
984
10410
1019
1005
962
1008
1038
851
782
1003
994
868
806
1004
1005
986
1036
915
1002
1059
984
1009
1006
959
987
1024
994
1059
1015
Triazines
Carbamates
Phenylureas
Phenoxyacid
a
n=3.
b
Normalizedextractionrates.
- 122 -
rd
st
nd
rd
1004
1006
1006
1002
1005
1006
916
1025
932
984
1003
976
971
804
1016
994
1008
1015
1019
605
1044
996
1103
986
- 123 -
Alachlor
Propanil
Metolachlor
Isoproturon
Chlortoluron
Chlorpropham
Carbofuran
Atrazine
Simazine
<1w[9]
*7w[12]
<1w[18] *3m[9]
*10d[10]
*10d[10]
*2w[43] <1m[13]
*1w[7] *1w[7]
<1m[42]
*1w[7] *1w[7]
*1w[7] *10d[10]
<1m[42]
<1w[18] *7w[12]
*3m[9]
*7w[12]
*1m[18] *1y[13]
*3m[8]
1w[18] *3m[9]
1m[42]
<3d[44]
*3m[9]
2m[42] 1w[18] *1y[13]
*7w[12]
*3m
*3m
1m
*3m
*3m
*3m
1m
*3m
*3m
*3m[9]
*2m[18]
[42]
*7w[12]
C18
4C
*Maximumtimeinvestigated Datanotshowninthemanuscripty:year;m:months;w:weeks;d:days
Mecoprop
*3m
1m
2m
*3m
1m
2m
1m
*3m[9]
*3m[42] 1m[18] *10d[10]
*7w[12]
C18
Roomtemperature
Chlorfenvinphos 2w[8]
<1w[7]
*1w[7] *10d[10]
Chlorpyrifos
2w[8]
*1w[7] *1w[7] 1w[19]
2,4D
C18
*2m
[18]
*1y[13]
*3w[7]
3m[44] *3w[7]
*8m[8] *3w[7]
2m[42]
*3m[9]
*1y[13]
*3m[9]
*3m
*3m
*3m
*3m
*3m
*3m
*3m
20C
*3m[42] 1m[18]
*3m[42]
Table8. Comparison of the stability of the target pesticides in different sorbent materials.
Captulo2
ParteI
4.Conclusions
Acknowledgements
- 124 -
Captulo3
CAPTULO3:Useofcoacervatesfortheonsiteextraction/preservationofpolycyclicaromatichydrocarbonsandbenzalkoniumsurfactants
CAPTULO3
Useofcoacervatesfortheonsite
extraction/preservationofpolycyclicaromatic
hydrocarbonsandbenzalkoniumsurfactants
AnalyticaChimicaActa,584(2007)181188.
NoeliaLuque,SoledadRubio,DoloresPrezBendito
Abstract
- 125 -
ParteI
Keywords: Polycyclic aromatic hydrocarbons; Benzalkonium surfactants;
Preservation;Micellebasedcoacervates;Monitoringprograms.
1.Introduction
- 126 -
Captulo3
immiscible liquid phases produced in colloidal solutions by the action of a
dehydrating agent (e.g. changes in the temperature or pH of the solution,
addition of an electrolyte or addition of a water miscible solvent in which the
macromolecule has low solubility) [10]. The coacervates are very rich in the
colloid component and have the capacity to solubilize solutes, so they are
suitabletodeveloporganicsolventfreeextractionprocedures.
Applicationofthecoacervationphenomenontoanalyticalprocesseshas
invariablyinvolvedtheuseofaqueousmicellebasedcoacervates(i.e.nonionic
[1113], zwitterionic [14], cationic [15] and anionic [16]). The most used
1213
coacervateshavebeenmadeofnonionicmicelles,whichundergocoacervation
by changes in the temperature of the aqueous solution. The corresponding
methodology has been named cloud point extraction (CPE) and it has been
extensively used for the extraction/concentration of nonpolar and moderately
nonpolar compounds [12,13]. Recently, anionic micelles made up of
dodecanesulfonic acid (SDSA), which undergo coacervation under the addition
ofhydrochloricacidintheconcentrationrangeof2.55M,havebeenprovento
efficiently extract hydrophobic [1618] and amphiphilic [1921], pollutants
17
18
2021
fromenvironmentalwaterandsolidsamples.
Oneofthemostdistinctivefeaturesofsupramolecularassemblybased
[10] IUPAC Compendium of Chemical Terminology 31 (1972) 611.
[11] W.L. Hinze, E. Pramauro, Crit. Rev. Anal. Chem. 24 (1993) 133.
[12] E. Pramauro, E. Pelizzetti, in: S.G. Weber (Ed.), Surfactants in Analytical
Chemistry. Applications of Organized Amphiphilic Media, Elsevier, New York, 1996.
[13] R. Carabias-Martnez, E. Rodrguez-Gonzalo, B. Moreno- Cordero, J.L. PrezPavn, C. Garca- Pinto, E. Ferndez-Laespada, J. Chromatogr. A 902 (2000) 251.
[14] T. Saitoh, W.L. Hinze, Anal. Chem. 63 (1991) 2520.
[15] X. Jin, M. Zhu, E.D. Conte, Anal. Chem. 71 (1999) 514.
[16] I. Casero, D. Sicilia, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chem. 71 (1999) 4519.
[17] D. Sicilia, S. Rubio, D. Prez-Bendito, N. Maniasso, E.A.G. Zagatto, Anal. Chim.
Acta 392 (1999) 29.
[18] F. Merino, S. Rubio, D. Prez-Bendito, J. Chromatogr. A 962 (2002) 1.
[19] F. Merino, S. Rubio, D. Prez-Bendito, J. Chromatogr. A 998 (2003) 143.
[20] F.J. Ruiz, S. Rubio, D. Prez-Bendito, J. Chromatogr. A 1030 (2004) 109.
[21] M. Cantero, S. Rubio, D. Prez-Bendito, J. Chromatogr. A 1046 (2004) 147.
- 127 -
ParteI
coacervates is the special structure of the macromolecules making up them.
Micelles have regions of different polarity where analytes of very different
physicalchemical characteristics can be solubilized. A number of interactions
canbeestablishedwithanalytesdependingofthenatureofthepolargroupof
the coacervate (mainly hydrophobic or ionic interactions, formation of mixed
aggregates, hydrogen bonds, etc.). So, they are very versatile extraction
systems. On the other hand, the low volume of the coacervates permits both
theextractionandpreconcentrationofanalytestobesimultaneousperformed.
This research deals, for the first time, with the study of the ability of
coacervates for the preservation of organic compounds. The aim was to
determine
their
applicability
for
the
onsite
intothecoacervateswasinvestigatedforaperiodof3monthsunderdifferent
experimental conditions. The effect of matrix components on PAHs and BASs
stabilitywasassessedbyusingriverandwastewater.
- 128 -
Captulo3
glass [17]. Addition of acetonitrile at concentrations between 25% and 40%
(v/v)hasbeenusedasastrategytopreservebothBASs[25]andPAHs[26,27].
However, this strategy was only successful in preventing losses of the target
compoundsforsomedays.ItalsoproducedadecreaseintherecoveryofBASs
fromSPEcartridges[25].
30
31
extraction and to recover them from humic acids [17,28]. On the other hand,
ourresearchgrouphasrecentlydescribedthepreservationofBASsondodecyl
sulfate hemimicelles adsorbed on alumina [8]. The BASs were stable on these
supramolecularassemblybasedSPEsorbentsatroomtemperatureforatleast
threemonths.So,theknownstabilizingcapacityofsupramolecularassemblies
for BASs and PAHs is exploited here for their simultaneous extraction,
preconcentration and preservation using coacervatebased liquidliquid
extraction.
2.Experimental
2.1.Chemicals
were
supplied
by
Aldrich
(Milwaukee,
WI,
USA):
benzyldimethyldodecylammoniumbromide(BDDA),benzyldimethyltetradecyl
ammonium bromide (BDTA), benzyldimethylhexadecyl ammonium chloride
[25] I. Ferrer, E.T. Furlong, Environ. Sci. Technol. 35 (2001) 2583.
[26] A. Lpez, E. Blanco, J.I. Garca, A. Sanz-Medel, Anal. Chim. Acta 264 (1992) 241.
[27] R. El Harrak, M. Calull, R.M. Marce, F. Borrull, Int. J. Environ. Anal. Chem. 64
(1996) 47.
[28] C. Garca, J.L. Prez, B. Moreno, Anal. Chem 66 (1994) 874.
[29] V. Pino, J.H. Ayala, A.M. Afonso, V. Gonzlez, J. Chromatogr. A 949 (2002) 291.
[30] W.L. Hinze, H.N. Singh, Z.S. Fu, R.W. Williams, D.J. Kippenber, M.D. Morris, F.S.
Sadek, in: T. Vo-Dinh (Ed.), Chemical Analysis of Polycyclic Aromatic Compounds,
John Wiley & Sons, New York, 1989, p. 151 (Chapter 5).
[31] E.R. Brouwer, A.N.J. Herms, H. Lingeman, U.A.Th. Brinkman, J. Chromatogr. A
669 (1994) 45.
- 129 -
ParteI
(BDHA),
benzo(a)pyrene
(BaP),
benzo(b)fluoranthene
(BbF),
2.2.Apparatus
2.3.Stabilitystudies
2.3.1.Samplecollectionandpreparation
- 130 -
Captulo3
south of Spain: Bailn, Linares and Mengibar. Bailn WWTP receives 60%
industrial effluents (mainly from brickwork, ceramic and olive oil industries)
mixedwith40%domesticwastewater.LinaresWWTPreceivesaboutthesame
levels of domestic and industrial wastewater, and Mengibar WWTP receives
mainlydomesticwastewater.Treatedwastewatersamplesweretakenfromthe
WWTPofBailn.Riverandwastewatersampleswerefilteredthrough0.45m
filters(Millipore,Billerica,MA,USA)toremovesuspendedsolids,acidifiedatpH
2withhydrochloricacidandkeptinamberglasscontainersat4Cuntilspiking.
Distilled water was used to check the stability of BASs and PAHs on
coacervatesfor3monthsatdifferentstorageconditions.Riverandwastewater
(influentsandeffluents)wereusedtoinvestigatematrixeffectsonthestability.
The different influent samples were mixed in order to have a representative
compositionofthewastewater.Oncethesampleswerespikedtoobtainafinal
concentration of 0.19 g L1 of each BASs or PAHs, they were immediately
extracted with the coacervate and stored under a variety of experimental
conditionswhicharedetailinSection2.3.2.
2.3.2.BASandPAHpreservationoncoacervates
- 131 -
ParteI
concentrationofhydrochloricacidusedtoinducecoacervation(3.75Mand4.2
M),(b)thetemperatureofstorage(35C,roomtemperature,4Cand20C),
(c) the exposition of vials to natural light (noncovered and aluminium foil
wrappedvials)and(d)matrixeffects(usingriverandwastewater).
2.3.3.BASandPAHdetermination
- 132 -
Captulo3
Figure
1.
Scheme
of
the
different
stops
followed
for
the
- 133 -
ParteI
3.Resultsanddiscussion
3.1.Analyticalperformance
- 134 -
Captulo3
3.2.StabilityofBASsandPAHsintoSDSAcoacervates
ThefollowingcompoundswereselectedasrepresentativeofBASsand
PAHstoassestheinfluenceofdifferentstorageconditionsontheirstability:C12,
C14andC16BAS,thataretheBAShomologuesusedatthehighestproportionin
commercial formulations, and BaA, BaP and IP, which were considered as
models for PAHs of four, five and six aromatic rings, respectively. All the
experimentsweremadeintriplicate.
Theacidmediumrequiredforcoacervationofthesurfactantdodecane
sulfonic acid was obtained by using hydrochloric acid [16,32]. The use of
oxidizing acids, such as nitric or perchloric was avoided because of the likely
gradualoxidationofthesurfactantinthesemedia.Also,theuseofsulfuricacid
was avoided because its handling usually requires special precautions. The
stabilitystudiesweremadeattwohydrochloricacidconcentrations(3.75Mand
4.2 M). They were selected on the basis that extraction efficiencies for the
targetcompoundsareindependentofHClintheconcentrationrangeinwhich
coacervation is produced (2.54.5 M), and that preconcentration factors
increase as the HCl concentration does. So, we restrict our stability studies at
acid concentrations at which maximum preconcentration was achieved.
Preconcentrationfactorsaround50and60wereobtainedbyusing3.75Mand
4.2MHCl,respectively.TherecoveriesofPAHsandBASswerequantitativeat
thetwoacidconcentrationsinvestigated.
The effect of the natural illumination in the laboratory (i.e. that from
sunlight) on the stability was studied by storage of the coacervates containing
BASsorPAHsintononcoveredandaluminiumfoilwrappedvialskeptatroom
temperature. The coacervates were analysed daily for a period of a week.
Recoveries obtained for the target compounds were similar for both types of
vials.So,wrappingofthesamplesduringstoragewasnotnecessarytoachieve
BASsorPAHsstability.
[32] D. Sicilia, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chim. Acta 460 (2002) 13.
- 135 -
ParteI
To determine the effect of the temperature on BAS and PAH stability,
thecoacervatesproducedattwohydrochloricacidconcentrationswerestored
at room temperature, 4 C and 20 C and analysed weekly during a 3month
period. Table 1 shows some of the recoveries obtained for the target
compoundsandTable2showstheconcentrationsfoundandthecorresponding
standard deviations. Recoveries ranged from 90% to 109%. The integrity of
analytes was kept for the whole period of time investigated, independently of
thetemperatureusedforstorageofthecoacervatesortheacidconcentration
added toinduce coacervation.AlthoughthehydrocarbonchainlengthofBASs
can influence their biodegradability [33], no differences of recoveries were
foundforthethreehomologues.
3.3.EffectofthewatermatrixonBASandPAHstability
SincematrixcomponentscanaffectthestabilityofBASsandPAHs,we
triedthesuitabilityofanionicmicellebasedcoacervatestokeeptheintegrityof
these pollutants after their extraction from wastewater and riverwater. Since
the stability of PAHs wasfound to be independent of the number of aromatic
rings (Table 1), the PAHs selected for this study were those for which the
EuropeanCommunityDirective98/83/CEaboutthequalityofwatersupply[34]
has established threshold values (BaP, BbF, BkF, IP and BghiP). No effort was
made to separate IP and BghiP, which coeluted under the chromatographic
conditionsproposed,sothePAHsanalysedwereBaP,BbF,BkFandBghiP.
[33] J.K. Autry, E.G. Vaught, E.D. Conte, Microchem. J. 80 (2005) 25.
[34] Off. J. Eur. Commu. L 330 of 5th December 1998, p. 32. European Community
Directive 98/93/EC.
- 136 -
Captulo3
Table 1. Meana recoveriesb (%) of benzalkonium surfactants and polynuclear
aromatic hydrocarbons from spiked distilled water (0.19 g L-1 of each analyte)
after storage of the acid-induced SDSA coacervates at different hydrochloric
acid concentrations and temperature values.
Compound
Storage
time
(week)
Storageconditions
4.2M
Room
tempe
rature
4C
20C
BenzalkoniumSurfactants
0
100
100
100
1st
97
99
100
BDDA
8th
92
94
94
108
107
108
12th
0
100
100
100
st
97
100
102
1
BDTA
th
8
92
94
93
th
12
94
101
104
0
100
100
100
st
100
101
103
1
BDHA
8th
94
94
96
12th
101
105
104
PolynuclearAromaticHydrocarbons
BaA
0
100
100
100
1st
103
103
101
8th
103
103
101
102
102
100
12th
0
100
100
100
BaP
95
100
103
1st
8th
98
101
101
96
97
99
12th
IP
0
100
100
100
102
99
102
1st
8th
99
103
100
90
95
94
12th
Rangeforrelativestandarddeviationofrecoveries:24%.
a
n=3.
b
Normalizedextractionrates.
3.75M
Room
tempe
rature
4C
20C
100
93
92
98
100
94
92
95
100
99
95
95
100
96
94
101
100
94
93
95
100
99
99
96
100
94
95
101
100
96
94
95
100
101
96
95
100
100
105
99
100
100
101
97
100
100
104
94
100
108
104
102
100
105
99
99
100
105
102
96
100
108
109
101
100
108
105
100
100
105
107
98
- 137 -
ParteI
Table 2. Meana concentration (g L-1) of benzalkonium surfactants and
polynuclear aromatic hydrocarbons from spiked distilled water (0.19 g L-1 of
each analyte) after storage of the acid-induced SDSA coacervates at different
hydrochloric acid concentrations and temperature values.
Storageconditions
Storage
Compound
4.2M
time
(week)
Room
temperature
3.75M
4C
20C
Room
temperature
4C
20C
BenzalkoniumSurfactants
0.19190.005
1st
0.1850.001
0.1880.003 0.19150.0005
0.1930.006
0.17990.0008
0.1860.003
0.1830.002
BDDA
8th
0.1760.002
0.1810.003
0.1810.002
0.1780.002
0.1830.006
0.1850.002
12th
0.2090.006
0.2060.009 0.20720.0007
0.2090.006
0.2060.009
0.20720.0007
0.1920.007
BDTA
BDHA
0
1st
8th
12th
0.1900.004
0.1780.002
0.1800.004
0.1920.009 0.1980.009
0.18010.0008
0.1750.006
0.1830.005
0.1810.007
0.1840.002
0.1790.002
0.1840.004
0.1800.005
0.1820.002
0.1880.006
0.190.01
1st
0.1870.002
0.1890.001
0.1940.004
0.1840.002
0.1840.005
0.1880.003
8th
0.1760.002
0.1770.004
0.1810.004
0.1780.006
0.1840.002
0.1810.005
12th
0.190.02
0.200.01
0.1950.006
0.1790.009
0.1790.004
0.1790.008
PolynuclearAromaticHydrocarbons
0.18710.0008
0.1830.004
1st
0.1920.003
0.1920.002
0.1880.001
0.1870.002
0.1990.002
0.2000.002
BaA
8th
0.1920.004
12th
0.190.01
0.1910.004 0.18850.0001
0.1940.006
0.1910.007
0.2020.002
0.1890.007
0.1830.004
0.1870.001
0.1830.001
0.1860.005
0.1860.004
0.1820.005
1st
0.1760.002
0.1860.002
0.1880.006
0.1830.008
0.19210.0001
0.19810.0004
BaP
8th
0.1830.006
0.1880.001
0.1850.001
0.1840.005
0.1810.004
0.1920.004
12th
0.1790.005
0.1810.004
0.1850.009
0.1780.004
0.1810.003
0.1820.005
0.1920.008
0.1870.004
1st
0.190.01
0.1900.006
0.1950.002
0.1870.005
0.19620.0004
0.1970.001
0.1900.004
0.1970.004
0.1920.002
0.1940.006
0.1890.004
0.2000.004
0.17120.0003 0.1810.007
0.1810.003
0.1750.003
0.1800.001
0.1830.007
IP
8th
12th
n=3.
show some of the recoveries and concentrations found for the target
compounds in the analyses of environmental waters. No influence of matrix
componentsonthestabilitywasdetectedthusconfirmingthehighstabilization
capacity of coacervates for the target pollutants. Fig. 2 depicts two typical
chromatograms obtained in the analysis of BASs and PAHs in influent
wastewater samples. The chromatographic peaks corresponding to BDDA and
BDTAshowedshoulderswhichprobablycorrespondedtobranchedBAS
- 138 -
Captulo3
Table 3. Meana recoveriesb (%) of benzalkonium surfactants and polynuclear
aromatic hydrocarbons from spiked environmental water samples (0.19 g L-1
of each analyte) after storing the acid-induced SDSA coacervates at 4C for a
month.
Time
Wastewater(influent) Wastewater(effluent)
Riverwater
(weeks)
BenzalkoniumSurfactants
BbF
BkF
BaP B(ghi)P BbF
BkF
BaP B(ghi)P BbF
0
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
95
84
88
105
93
89
100
93
1st
2nd
93
93
85
104
95
90
89
94
103
96
99
97
102
107
97
89
97
113
3rd
4th
108
102
101
101
100
97
95
105
98
a
n=2.
Normalizedextractionrates.
Rangeforrelativestandarddeviationofrecoveries:BASs(24%);PAHs(610%).
3.4.Practicalconsiderations
- 139 -
ParteI
Table 4. Meana concentration (g L1) of benzalkonium surfactants and polynuclear
aromatichydrocarbonsfromspikedenvironmentalwatersamples(0.19gL1ofeach
analyte)afterstoringtheacidinducedSDSAcoacervatesat4Cforamonth.
Compound
Storagetime
(week)
Wastewater
(influent)
Wastewater
(effluent)
Riverwater
BenzalkoniumSurfactants
0
0.1980.008
0.2080.009
4th
0.1810.002
0.1860.006
0
0.1820.005
0.1880.005
BDTA
4th
0.17020.0004
0.1750.002
0
0.2000.004
0.2000.004
BDHA
4th
0.17910.0009
0.1760.002
PolynuclearAromaticHydrocarbons
0
0.170.02
0.180.02
1st
0.180.01
0.1900.003
2nd
0.1630.004
0.1700.005
BbF
3rd
0.170.02
0.190.02
4th
0.1890.006
0.1800.006
0
0.180.01
0.190.01
1st
0.1690.008
0.1770.006
2nd
0.1650.004
0.1720.005
BkF
3rd
0.1770.003
0.1850.006
4th
0.1830.006 0.18510.0003
0
0.180.01
0.190.01
st
1
0.1500.007
0.1690.003
BaP
2nd
0.1520.004
0.1680.006
3rd
0.17290.0003
0.1690.002
4th
0.1810.003
0.1810.003
0
0.170.02
0.190.02
st
1
0.1500.01
0.1860.003
2nd
B(ghi)P
0.180.01
0.180.02
3rd
0.1750.005
0.1790.005
4th
0.170.02
0.195510.0008
a
n=3.
BDDA
- 140 -
0.2030.007
0.1910.005
0.1860.005
0.170.02
0.1840.004
0.170.002
0.170.02
0.1640.002
0.1810.007
0.19810.0007
0.17160.0005
0.180.01
0.160.01
0.1820.003
0.1880.006
0.180.01
0.180.01
0.160.02
0.1780.002
0.1750.002
0.190.02
0.180.02
0.1740.009
0.1910.003
0.1810.006
0.180.02
Captulo3
X10
BDDA
(A)
BDTA
1.25
Intens
1.00
BDHA
0.75
0.50
0.25
0.00
10
15
min
20
0.25
25
BkF
(B)
mV
0.20
0.15
BaP
0.10
B(ghi)P
BbF
0.05
0.0
5
10
15
20
25
30
min
Figure2. (A) LC-MS extracted ion chromatogram of BASs (BDDA at m/z 304,
BDTA at m/z 322 and BDHA at m/z 360) and (B) LC-fluorescence
chromatogram of PAHs (300 nm/430 nm at 0 min for BbF, BkF and BaP, and
290 nm/410 nm at 28 min for BghiP) obtained from spiked (0.19 g L-1)
influent water sample.
- 141 -
ParteI
sample handling will be considerably simplified if low sample volumes can be
treated.
4.Conclusions
- 142 -
Captulo3
additionalfeaturesthatmaketheiruseinterestingformonitoringprograms:(1)
thepreconcentrationfactordoesnotdependonthesamplevolumebutonthe
surfactant concentration, so we can treat low sample volumes which makes
sample handling easy; (2) the extraction is simple and rapid and only low cost
equipmentisrequired;and(3)thelowvolumeofcoacervatespermitstostore
theminvialswhichfacilitatetransportandstorage.
Acknowledgements
TheauthorsgratefullyacknowledgefinancialsupportfromMEC(Project
CTQ200500643). They also thank the Linares, Mengibar and Bailn WWTPs
personnel for kindly collecting the sewage water samples. We specially thank
thepersonnelfromAguasJanCompanyfortheirtechnicalassistance.
- 143 -
PARTEII:NUEVASMETODOLOGASPARAELANLISISDESUSTANCIASPERFLUOROALQUILADASEN
MUESTRASBIOLGICAS
PARTE II
NUEVAS METODOLOGAS PARA
EL ANLISIS DE SUSTANCIAS
PERFLUOROALQUILADAS EN
MUESTRAS BIOLGICAS
Objeto
OBJETO
Ladeterminacindelassustanciasperfluoroalquiladas(PFASs)esobjeto
de estudio por parte de la comunidad cientfica desde que se descubriera su
ubicuidadenelmedioambienteybioacumulacinalolargodelacadenatrfica
hace ya ms de una dcada. El estudio de sus fuentes, rutas y destinos en el
medioambienteylaevaluacindelaexposicinhumanaaestoscontaminantes
son lneas de investigacin sobre las que se est discutiendo mucho en los
ltimosaos.Parallevaracaboestastareassonnecesariasmetodologaspara
el anlisis de las PFASs en los distintos compartimentos ambientales, en los
alimentoscomofuenteprincipaldeexposicinhumanayenmuestrashumanas
comodescriptorintegradodelasdistintasvasdeexposicinalasqueestamos
expuestos. Actualmente no existen niveles mximos permitidos en alimentos
para estas sustancias aunque la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria
(EFSA) ha establecido lmites de tolerancia diaria de 1500 y 150 ng kg1 peso
corporalda1paraelcidoperfluorooctanoicoyelperfluorooctanosulfonatoy
harecomendadosuvigilanciaenalimentoscomofuentedeexposicinadichos
contaminantes[1].Porotrolado,lasPFASssehanincluidoenlassustanciasde
relevancia que deben monitorizarse para evaluar el buen estado de las aguas
marinas dentro del descriptor 9 de laDirectiva Marco sobre Estrategia Marina
Contaminantesenpecesymariscoparaelconsumohumano[2].Losmtodos
analticosexistentesparaanalizarmuestrasbiolgicasodealimentosrequieren
un elevado consumo de disolvente orgnico y en muchos casos extracciones
repetitivasyetapasdelimpieza.AdemsproporcionanrecuperacionesdePFASs
muy dependientes del tipo de matriz y analito debido al amplio intervalo de
polaridad de los mismos ya que incluyen sustancias desde 4 a 14 tomos de
carbono.
[1] Opinion of the Scientific Panel on Contaminants in the Food chain on Perfluorooctane
sulfonate (PFOS), Perfluorooctanoic acid (PFOA) and their salts, The EFSA Journal 653
(2008) 1.
[2] Marine strategy framework directive. Task group 9 Contaminants in fish and other
seafood, available at: http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/bitstream/111111111/
13669/1/tg9%20report%20final_vii.pdf
- 147 -
ParteII
As,lasinvestigacionesquesepresentanenestesegundobloquedela
Tesis Doctoral tienen como objetivo el desarrollo de metodologas para la
extraccin y determinacin de PFASs en distintas muestras biolgicas;
concretamente aves marinas, pescados y suero sanguneo que resuelvan los
problemas existentes y ofrezcan una alternativa adecuada a las metodologas
existentesencuantoasimplicidad,rendimientosdeextraccinindependientes
delalongituddelacadenafluorocarbonada,exactitud,precisinysensibilidad.
Lasmetodologaspropuestasparaalcanzaresteobjetivosehanbasadoen;
(1)elempleodemezclastetrahidrofurano(THF):aguaqueposeenunaexcelente
capacidaddesolubilizacinparaloscompuestosanfiflicos,comoeselcasode
estos analitos. Estos disolventes presentan una gran diferencia en los valores
respectivosdelasconstantesdielctricas(agua=80;THF=7,5)yparmetros
de solubilidad de Hildebrand ( agua=23,3 cal1/2 cm3/2; THF=9,5 cal1/2 cm3/2).
Gracias a estas diferencias la mezcla hidroorgnica proporciona un balance de
interacciones (dispersivas, puentes de hidrgeno y polares) adecuadas tanto
para la solubilizacin del grupo polar como de la cadena hidrfoba del
tensioactivo.
(3)lamejoradelacuantificacindelasPFASstrabajandoenmodoaislamiento
de iones cuando se emplea espectrometra de masas con trampa inica. Este
modo de trabajo evita los problemas de selectividad provocados por el efecto
espaciocarga a la vez que que mantiene la sensibilidad obtenida en modo
barrido.
- 148 -
Objeto
A continuacin se presentan los resultados obtenidos de las
investigacionesrealizadasenestesegundobloquedelaTesisDoctoral.
- 149 -
ParteII
CAPTULO4:Analysisofperfluorinatedcompoundsinbiotabymicroextractionwithtetrahydrofuranandliquidchromatography/ionisolationbasediontrapmassspectrometry
CAPTULO4
Analysisofperfluorinatedcompoundsbymicroextraction
withtetrahydrofuranandliquidchromatography/ion
isolationbasediontrapmassspectrometry
JournalofChromatographyA,1217(2010)37743782.
NoeliaLuque,AnaBallesterosGmez,StefanvanLeeuwen,SoledadRubio
Abstract
- 150 -
Captulo4
Only PFSAs were found in samples at quantifiable levels (2.9 and 13.1 ng g1)
whilePFCAswerebelowtherespectivequantitationlimits.Thismethodallows
quick and simple microextraction of PFASs with minimal solvent consumption,
whiledeliveringaccurateandprecisedata.
1.Introduction
[1] E. Kissa, Fluorinated Surfactants and Repellents, CRC Press, Surfactant Science
Series, Vol. 97, 2nd Ed., 2001.
[2] K. Kannan, J. Koistinen, K. Beckmen, T. Evans, J.F. Gorzelany, K.J. Hansen, P.D.
Jones, E. Helle, M. Nyman, J.P. Giesy, Environ. Sci. Technol. 35 (2001) 1593.
[3] M. Houde, J.W. Martin, R.J. Letcher, K.R. Solomon, D.C.G. Muir, Environ. Sci.
Technol. 40 (2006) 3463.
[4] N. Yamashita, K. Kannan, S. Taniyasu, Y. Hori, G. Petrick, T. Gamo, Mar. Pollut.
Bull. 51 (2005) 658.
[5] A. Jahnke, L. Ahrens, R. Ebinghaus, C. Temme, Environ. Sci. Technol. 41 (2007)
745.
[6] C.M. Butt, S.A. Mabury, D.C.G. Muir, B.M. Braune, Environ. Sci. Technol. 41
(2007) 3521.
[7] K. Kannan, S. Corsolini, J. Falandysz, G. Oehme, S. Focardi, J.P. Giesy, Environ. Sci.
Technol. 36 (2002) 3210.
[8] J.W. Martin, M.M. Smithwick, B.M. Birgit, P.F. Hoekstra, D.C.G. Muir, S.A.
Mabury, Environ. Sci. Technol. 38 (2004) 373.
[9] R. Bosi, F.F. Riget, R. Dietz, C. Sonne, P. Fauser, M. Dam, K. Vorkamp, Environ.
Pollut. 136 (2005) 323.
- 151 -
ParteII
10
a11majorroleassinkformanypersistentorganicpollutants(POPs),PFASsare
usually present in many fishes, sea birds and marine mammals, e.g. levels of
perfluorooctanesulfonate(PFOS)intherange0.3173ngg1,11780ngg1and
0.44000 ng g1 respectively, have been reported [11,12]. High levels of PFASs
have been also found in human blood (ngg mL1) [13], being food a possible
primary route for human exposure [14]. These emerging contaminants have
beenrecentlyincludedaspriorityhazardoussubstancesintheEuropeanwater
legislation[15].Althoughnoregulationshavebeensetyetconcerningbiotaand
foodstuff, the development of suitable analytical methods for the routine
control of PFCs in these samples is highly desirable due to their ubiquity and
toxicproperties[16].
Atpresent,liquidchromatography(LC)/negativeelectrosprayionization
(ESI)/triplequadrupole MS/MS is by far the preferred technique for
quantitation of PFASs in environmental and human matrices due to its
sensitivityintheselectivemultiplereactionmonitoring(MRM)mode(limitsof
detection 1100 pg [17]). Monitored product ions for perfluoroalkyl sulfonates
(PFSAs) and perfluoroalkyl carboxylates (PFCAs) are [SO3], m/z 80, and [M
COOH],respectively.AcheaperalternativetotriplequadrupoleMSisiontrap
[10] C.J. Young, V.I. Furdui, J. Franklin, R.M. Koerner, D.C.G. Muir, S.A. Mabury,
Environ. Sci. Technol. 41 (2007) 3455.
[11] C.R. Powley, S.W. George, M.H. Russell, R.A. Hoke, R.C. Buck, Chemosphere 70
(2008) 664.
[12] Appendice 2 in Ecological Screening Assessment Report on Perfluorooctane
Sulfonate, Its Salts and Its Precursors that contain the C8F17SO2, C8F17SO3 or C8F17SO2N
Moiety, available at: htpp://www.ec.gc.ca.ceparegistry/documents/subs_list/PFOS_SAR/
PFOS_A2.cfm
[13] A. Karrman, B. van Bavel, U. Jarnberg, L. Hardell, G. Lindstrom, Chemosphere 64
(2006)1582.
[14] EFSA Perfluorooctane sulfonate (PFOS), perfluorooctanoic acid (PFOA) and their
salts - Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food chain. The EFSA
journal 653 (2008) 653 1.
[15] Commission Notice No 2008/C 102 E/02 of 22 May 2007, amendment of annex to
Directive 2000/60/EC, Official J. Eur. Union, C51 (2008) 105.
[16] C. Lau, K. Anitole,C. Hodes, D. Lai, A. Pfahles-Hutchens, J. Seed, Toxicol. Sci. 99
(2007) 366.
[17] U. Berger, I. Langlois, M. Oehme, R. Kallenborn, Eur. J. Mass Spectrom. 10 (2004)
10.
- 152 -
Captulo4
MS[1719].18Iontrap 19analyzerscanalsoperformtandemanalysis,including
MSn experiments,andarebestsuitedforstructureelucidationofPFASsisomers
because their spectra contain very specific product ions [17]. Quantitation of
PFCAs by iontrap MS in the MRM mode is straightforward by measuring the
product ion [MCOOH]. Unfortunately, the fragmentation of PFSAs yields a
numberofspecifichighm/zratioionswithlowintensity,whicharenotsuitable
for sensitive MRM. On the other hand, low m/z ratio ions (e.g. 80) cannot be
monitoredbecauseoftheinherentlowmasscutoffderivedfromthecollision
induced dissociation [17]. As a result, applications involving iontrap
quantitationofPFASsusethesingleMSmodeafterathoroughsamplecleanup
to remove interferences [18,19]. Coeluting interferences often cause space
charge effects, which degrade severely the performance of the ion trap. So,
thereistheneedforsensitiveenough,moreselectiveiontrapbasedmethods
foranalysisofPFASsinordertodevelopalternativestothestraightforward(but
expensive)triplequadrupoleanalyzer.
- 153 -
ParteII
methodsinthiscontexthavebeenthemethodofHansenetal.[23](extraction
with
methyltertbutylether
(MTBE)
after
ionpairing
with
- 154 -
Captulo4
moleculeswithhydrogenbonddonorand/oracceptorgroupsandhydrophobic
perfluorinated alkyl moieties, was determined. The final aim was to provide
guidelinesforPFASextractionbasedontheknowledgeofthedifferenttypesof
intermolecular forces between analytes and solvents in order to avoid that
methoddevelopmentcanbecomealargelyempirical,laborintensiveandtime
consumingtrialanderrorprocess.SelectivityandsensitivityiniontrapMSwas
investigatedbyisolationofthetargetionsbeforedetection.Theobjectivewas
to avoid the possible spacecharge effects caused by coeluting matrix
components while keeping the sensitivity of full scan MS operation. The
complete analysis cycle included the accumulation of the ions in the trap, the
isolationofaspecificordifferentm/zionsandtheproductionofaspectrumby
resonantlyejectingtheionsfromthetraptodetector.Bothextractionandion
trap MS were optimized and the method was applied to the determination of
PFASsinfishandbirdtissues.Methodvalidationwasperformedbyanalysisofa
flounderfilletsample,whichwasusedinthe2ndinternationalinterlaboratory
study on PFASs [22]. The extracts were analyzed by both iontrap and triple
quadrupoleMS.Mainresultsobtainedinthisresearcharedescribedbelow.
2.Experimental
2.1.Chemicals
- 155 -
ParteII
purification system (Millipore, Madrid, Spain). Standard solutions (1 g L1) of
individual PFASs were prepared in methanol and stored under dark conditions
at4C.
2.2.Apparatus
The LCMS system used was an Agilent 1100 series Ion TrapSL mass
spectrometer coupled to an 1100 liquid chromatograph with an electrospray
interfaceoperatinginthenegativeionmode.Thestationaryphaseusedwasan
Ascentis C18 column (5 cm x 2.1 mm i.d, 3 m) from Supelco. A Water
SymmetryC18guardcolumn(3.9cmx2.0mmi.d.,5m)wasinsertedbefore
the LC column. A homogenizer UltraTurrax T25 Basic from Ika (Werke,
Germany), a Reax Heidolph vortex (Schwabach, Germany) with an attachment
for 10 test tubes and a High Speed Brushless centrifuge MPW350R (Warsaw,
Poland)wereusedforsamplepreparationandextraction.
2.3. DeterminationofPFASsinbiota
2.3.1.Samplecollectionandpreservation
Different species of fish [i.e. bullet tuna (Auxis rochei rochei) atlantic
pomfret (Brama brama) and mackerel (Scomber scombrus)] and marine birds
[herring gull (Larus michahellis) and northern gannet (Morus bassanus)] were
analyzed. Fish samples were bought in local markets in Crdoba (Spain) while
bothbirdswerekindlyprovidedbytheMigresFoundation.ThisOrganization
was founded at the end of 2003, promoted by the Regional Government of
Andalusia,formonitoringthemigrationofbirdsthroughtheStraitofGibraltar.
Birds had just dead as they were picked up in Tarifa coast (Cdiz, Spain). The
northerngannetwasatwothreemonthsagednativeofNorthernEurope,while
the herring gull was a local individual around one year old, as their feathers
indicated. Birds and fishes were frozen (20 C) until extraction to perform
muscle and/or liver analyses. A sample of flounder fillet, previously used as a
- 156 -
Captulo4
fish material in the 2nd international interlaboratory study on PFASs [22], was
alsoanalyzedforvalidationpurposes.
2.3.2.Samplepreparationandmicroextraction
Liver and muscle samples were obtained after dissection and were
homogenized using an UltraTurrax homogenizer T25 equipped with S25N8g
and S25N25g dispersing elements. Extraction of PFASs was performed by
mixing a sample aliquot [0.2 g, wet weight (ww)], 600 L of THF and 60 L of
water into a 1.5 mL polypropylene centrifuge microtubes. Taking into account
thewatercontentofsamples(70%)[28],thefinalcompositionofthesolvent
mixture was around 25:75 (v/v) water:THF. Four glass balls (3 mm diameter)
were added to the microtubes to accelerate and enhance sample extraction.
The samples were vortexshaken for 7 minutes and then centrifuged (15,000
rpm,10C,13minutes)toclarifythesupernatant.Aliquotsofthissupernatant
(150 L) were transferred to autosampler glass vials with inserts and capped
with aluminum/silicone septum barriers (Supelco, Bellefonte, USA) and they
weresubjectedtoLC/MSanalysis.
2.3.3.QuantitationofPFASsbyLC(ESI)ITMS
- 157 -
ParteII
nebulizergas30psi,octopole1.7VexceptforPFTeDA2.1V,ICC(ioncharge
control)30.000andmaximalaccumulationtime100ms.Valuesfortheskimmer
conevoltage,trapdriveandcapillaryexitvoltageforeachofthePFASsanalyzed
areshowninTable1.Quantitationofthetargetcompoundswasperformedby
usingtheionisolationmode,whichisapreviousstagetofragmentationinion
traps, and measuring the peak areas (smoothing with the Gauss function:
width=1points and cycles=1) of [MK] ions for PFSAs and the sum of [MH]
plus [MCOOH] ions for PFCAs (see Table 1 for the corresponding ion m/z).
Solvent based calibration curves were constructed in the PFAS concentration
range0.5150gL1usingstandardsinwaterTHF(25:75,v/v).
Table1. Quantitation ions and MS parameters used in the analysis of the target
PFASs in biota.
PFBS
PFHxA PFHxS
PFOA
PFOS
PFDA
PFUnDA
PFTeDA
[MH]
[MH]
[MK] [MH] [MK] [MH] [MK] [MH]
[MCOOH]
[MCOOH] [MCOOH] [MCOOH]
Quantitation [MCOOH]
m/z
m/z
m/z
m/z
m/z
m/z
m/z
m/z
ions
299 313+269 399 413+369 499 513+469 563+519 713+669
Skimmer
conevoltage 40
(V)
Capillaryexit
150
voltage(V)
40
41.5
40
41.5
41.5
41.5
41.5
150
75
150
100
200
150
150
Trapdrive
49
45
44
45
52
54
54
64
3.Resultsanddiscussion
3.1. Sourcesandcontrolofbackgroundcontamination
- 158 -
Captulo4
THF:water 75:25, v/v) in the LC/ESI/ion trap mass spectrometer. Background
signalswerealwaysobservedforPFHxSandPFOAatconcentrationsneartheir
quantification limits (0.5 and 4 g L1, respectively). After replacing the PTFE
septa, which were identified as the instrumental contamination source, by
aluminum/silicone septa, the background signals disappeared. Procedural
contamination was investigated by adding 800 L of a waterTHF (25:75, v/v)
mixture into polypropylene centrifuge microtubes and subjecting them to
extraction (i.e. vortexshaken and centrifugation at variable times). No
contamination was observed for the target PFASs above their detection limits.
Anyway,proceduralblankswereroutinelyinjectedduringsamplesequencesto
checkpossiblecontaminationfromtheLCsystemandsampletreatment.
3.2.Solventextractionmethoddevelopment
3.2.1.Criteriaforsolventselection
AgoodknowledgeoftheinteractionsbetweenthesolventandPFASsis
important for setting up an efficient extraction scheme. PFCAs and PFSAs are
amphiphilic molecules with highly hydrophobic hydrocarbon chains (lengths
betweenC3andC14)duetothepresenceoffluorine.ThepolargroupsofPFCAs
arebothdonorandacceptorhydrogenbondingwhilethoseofPFSAsareanionic
andacceptorhydrogenbonding.ThesepropertiesmakePFASextractiondifficult
becauseofthehighpolarityandnonpolarityofthetworegionspresentintheir
structure. Our initial hypothesis was that a good solvent for PFASs should
provide both polar and nonpolar interactions in a correct balance. For this
purpose, we selected THF and water because of their differences in dielectric
constants(water=80;THF=7.5),whichareameasurementofsolventpolarity,
andHildebrandsolubilityparameters(water=23.3cal1/2 cm3/2;THF=9.5cal1/2
cm3/2),whicharenumericalvaluesthatindicatetherelativesolvencybehaviour
of a specific solvent. They are derived from the cohesive energy density of
solvents,whichinturnarederivedfromvaporizationheats[27].
- 159 -
ParteII
Solubility behaviour can be adequately described using Hildebrand
values, but predictions become more consistent using Hansen parameters,
which are the dispersion (d), hydrogen bonding (h) and dipoledipole (p)
componentsofHildebrandparameters(Total)andrelatetoitthrough[27]:
2Total=2d+2p+2h
Hansen parameters for water and THF are shown in Table 2 and their
values indicate that hydrogen bonding and dispersive forces are the major
components in water and THF, respectively. So, solvents with very different
solvency behaviour can be obtained by simply varying the composition of the
THF:water mixture (the Hildebrand parameter for a solvent mixture can be
easilycalculatedbyaveragingtheircomponents).Inthisway,themostsuitable
solvent for PFAS extraction and guidelines to determine the major forces
involved in PFAS solubility can be found. On the other hand, water is a polar
protic solvent able to provide adequate interactions with the polar groups of
PFASs(i.e.iondipoleinteractionswithPFSAsandhydrogenbondingwithboth
PFCAsandPFSAs).
Water
Tetrahydrofuran
Methanol
Acetonitrile
Hildebrand
parameters
(cal1/2cm3/2)
t
Hansen
parameters
(cal1/2cm3/2)
d p
h
Fractionalparameters
100fd
100fp 100fh
23.3
9.5
14.5
12
7.6
8.2
7.4
7.5
7.8
2.8
6.0
8.8
20.6
3.9
10.9
3.0
21
55
30
39
22
19
25
46
57
26
45
15
Aconvenientmethodforwhichsolubilityinformationcanbeillustrated
istheTeastriangulargraph.Thissimpleplanarthreecomponentdatagraphis
based on the hypothetical assumption that all solvents have the same
Hildebrandvalueandsolubilitybehaviourisdeterminedbytherelativeamounts
- 160 -
Captulo4
thatthethreecomponentforcescontributetotheHildebrandparameter.This
allows us the convenience of related percentages rather than unrelated sums.
Tea parameters, also called fractional parameters, are mathematically derived
from Hansen values by calculating the relative amount that each Hansen
parametercontributestothewhole[27].Table2showstheTeaparametersfor
water and THF. These values express that an appropriate combination of both
dispersive and hydrogen bonding forces can be obtained, while keeping
constant the dipoledipole one, by mixing water and THF at different
proportions.BecauseHildebrandvaluesarenotthesameforallliquids,theTeas
graph is an empirical system with little theoretical justification. This lack of
theoretical foundation, however, does not prevent the Teas graph from being
an accurate and useful tool, perhaps the most convenient method by which
solubilityinformationcanbeillustrated[27].
3.2.2.Optimization
Asampleconsistingof12homogenizedbullettunaliverswasusedfor
optimization of solvent extraction efficiency. Sample aliquots (0.10.35 g ww)
werespikedwithanappropriatevolumeofa1mgL1solutionofPFASsinTHF
(spikingrange2040ngg1)twohoursbeforeextraction.Equilibrationbetween
PFASsandlivermatrixforalongerperiodoftime(i.e.overnight)didnotchange
theextractionefficiency.Matrixmatchedcalibrationwasusedforoptimization
until method development was complete in order to ensure accurate
quantitation.
- 161 -
ParteII
mixture.Tohelpdiscussion,theTeasparametersforwater,THFandthemixed
solventattheproportionswiththehighestrecoveries(Table3)aredepictedin
Figure1a.
Table3. Hildebrand parameters (, cal1/2 cm-3/2) and recoveries for PFASs (%)
along with their respective standard deviations (n=3) as a function of solvent
composition.
RecoveriesSD(%)
Solvent
composition
THF:water,
v/v
100:0
85:15
75:25
70:30
55:45
40:60
15:85
0:100
PFBS
9.5
0
11.6 1007
13.0 1051
13.6 1031
15.7 941
17.8 794
21.2 371
23.3 332
PFHxA
PFHxS
0
135
726 1033
942 1031
928
983
1012 984
811
805
361
131
303
131
PFOA
206
897
971
959
976
932
121
101
PFOS
PFDA
256 287
1007 855
1041 1041
1064 927
716 779
718 543
101 101
71
151
PFUnDA PFTeDA
283
816
1051
1041
688
403
61
21
291
706
1061
1055
6811
328
22
21
Sample:0.2g(wetweight)offortified(40ngg1ww)frozendriedbullettuna
Solventvolume:600L
Accordingtotheseresults,solventshavingHildebrandparametervalues
around1214(Table3)andTeasparameterswithpolar(fh+fp)/nonpolar(fd)
forceratiosabout1.2(e.g.amixture25:75ofwater:THF,seeFigure1a)should
- 162 -
Captulo4
(a)
(b)
(c)
Figure 1. Teas graphs for pure solvents and their mixtures at the specified
compositions: (a) THF and water; (b) methanol and water and (c) acetonitrile
and water.
provideefficientextractionsforPFASs.BecauseofthenatureofthePFASpolar
groups, these solvents should be able to provide both donor and acceptor
hydrogenbondingand,probably,extractionisenhancedaspolarforcesmainly
consist of hydrogen bonding (e.g. under optimal conditions, the Teas
parameters with hydrogen boding/dipoledipole ratio was around 1.7, Figure
- 163 -
ParteII
1a). Solvents or solvent mixtures meeting these characteristics can be easily
found from the knowledge of their structure, and their Hildebrand and Teas
parameters,alwaystakingintoaccountthewatercontentinsamples.
For comparison, the Teas graph for two solvents widely used in the
extractionofPFASsfrombiologicalsamples,namely50:50methanol:water[24]
and acetonitrile [11], were constructed. According to the reported procedures
[11,24], calculations were based on 1 g of sample and 3 mL of 50:50
methanol:wateror10mLofacetonitrile,respectively.Thewatercontentofthe
sample(around0.7mL)wasalsoconsidered.Figure1depictsthepercentages
ofthethreeforcescontributingtotheHildebrandparameterforpuresolvents
(waterandmethanolinFigure1bandwaterandacetonitrileinFigure1c)and
the corresponding solvent mixtures (including sample water) proposed for
extraction.SolubilityparametersforwaterandmethanolareshowninTable2.
Hildebrandparametersforthemethanol:waterandacetonitrile:watermixtures
were19.8and12.7cal1/2cm3/2,respectively.
3.2.2.2.Solventvolume.Oncethecompositionofthesolventwasoptimized,we
evaluated the volume needed for the extraction of PFASs from 0.2 g (ww) of
fortified (40ng g1) sample aliquots previously freezedried. Solvent volumes of
- 164 -
Captulo4
25:75 v/v water:THF mixtures between 250 and 1000 L were tested and
recoveries higher than 90% were obtained for the target compounds in the
whole range. Recoveries kept constant with the amount of sample used for
extraction(rangedtested0.10.35gww)providedthatsolventvolume/sample
amountratioswerewithintheintervalpreviouslytested.
3.2.2.3. Extraction time. The time required to reach equilibrium conditions for
extraction was investigated. For this purpose, samples were vortexshaken in
the interval comprised between 5 and 45 min. Equilibrium conditions were
rapidly achieved, just 5 min, owing to the high solubilising capability of the
solvent mixture used. An extraction time of 7 min was selected because the
precision was slightly improved. Experiments were carried out using both
fortifiedbullettunaliversamplesandaflounderfilletsample,previouslyusedin
the2ndinternationalinterlaboratorystudyonPFASs[22],inordertocheckthat
the method used for sample fortification did not affect the time required for
extraction.
3.3.AnalyticalperformanceofionisolationbasediontrapMSquantitation
- 165 -
ParteII
nonrigorouslycleanedupsampleextractsinSIMandFullscanmodesandthe
absence of suitable product ions from PFSAs in MRM, we investigated the
sensitivity,selectivityandprecisionoftheionisolationmodeforquantitationof
PFASs.
3.3.1.Sensitivity
Both ESI source and iontrap parameters were optimized to get the
highest sensitivity for PFASs in each of the selected monitoring modes. As
previously reported [1719], PFCAs underwent an inevitable insource
decarboxylation, its extent mainly depending on the voltages applied to the
capillary and capillary exit. Voltages and other instrumental parameters were
selected to give the highest possible amount of the following ions: [MK] for
PFSAs, the sum of [MH]and [MCOOH] for PFCAs in both full scan and ion
isolation modes and [MH] for PFCAs in MRM mode. Optimization of
parameterswascarriedoutbyinjectingstandardsolutionsofanalytes(1mgL1
preparedinthesamesolventcompositionofmobilephasetheyareelutedfrom
theanalyticalcolumn)intheLCiontrapMSsystemusingaKDScientific,model
100,syringepump(NewHope,MN)at300Lh1.ForMS/MSexperiments,[M
H] ions were isolated with the isolation width set at 4 m/z units, and then
[29] N.A. Yates, M.M. Booth, J.L. Stephenson, R. A. Yost in: R.E. March, J.F.J Todd
(Eds), Practical Aspects of Ion Trap Mass Spectrometry. Volume III. CRC Press,
London. 1995, p. 121.
- 166 -
Captulo4
fragmented with the resonance excitation set at the previously optimized
values.
Table 4 shows the figures of merit obtained for calibration curves run
using standard solutions (0.5250 g L1) of PFASs in THF/water (75:25 v/v)
undertheexperimentalconditionsoptimizedforeachofthemonitoringmodes.
Similar sensitivity was achieved by fullscan and ion isolation modes, which
indicated that the latter can be used for sensitive monitoring of PFASs. In
contrast, quantitation of PFCAs by MRM was between 4 and 45fold less
sensitive. This decrease mainly resulted from the insource fragmentation of
parentionsandthelowyieldoftherespectiveionproductsintothetrap.
AtypicalchromatogramobtainedforstandardsolutionsofPFASsunder
the ion isolation monitoring mode is shown in Figure 2a. Chromatograms for
PFCAs show the two monitored ions (i.e. [MH]and [MCOOH]). Correlation
between peak areas and PFAS concentrations (0.0051.5 ng, absolute amount
injected)wasdeterminedbylinearregression.Thecoefficientsofdetermination
were in the range 0.99810.9999, indicating good fits. Instrumental detection
limits(LOD)werecalculatedfromthelowerconcentrationsofstandardsgivinga
signaltonoiseratioof3andtheywerefoundtobe1pgforPFBSandPFOS,3
pgforPFHxAandPFHxS,5pgforPFTeDA,10pgforPFOAandPFUnDAand15
pg for PFDA. So, they were low enough for monitoring PFASs in biological
samples.
3.3.2.Selectivity
Coelutingmatrixcomponentscausetwomajortypesofinterferencesin
ESI/iontrap MS, namely ionization suppression or enhancement in the ESI
source and spacecharge effects in the iontrap. On the other hand, matrix
componentswithinterferingmassesarefrequentlydetectedintheMSanalysis
ofsomePFSAs.Knowninterferencesoriginatedfromthepresenceofbilesalts
inbiota(e.g.birdlivers)interferewithPFOSandendogenoushumanhormones
interferewithPFHxSinhuman(e.g.serum)samples.Thiskindofinterferences
- 167 -
ParteII
Table 4. Figures of merit for quantitation of PFASs under different operation
modes in ion-trap MS.
Analytes Operationmode
Fullscana
Ionisolationb
PFBS
PFHxA
Fullscana
Ionisolationb
MRM
PFHxS
Fullscana
Ionisolationb
PFOA
Fullscana
Ionisolationb
MRM
PFOS
Fullscana
Ionisolationb
PFDA
Fullscana
Ionisolationb
MRM
PFUnDA
Fullscana
Ionisolationb
MRM
Quantitationions
(Slopesc)x103
1053
102.00.7
0.9980
0.9990
[MK]m/z299
[MK]m/z299
[MH]m/z313+
[MCOOH]m/z269
[MH]m/z313+
[MCOOH]m/z269
m/z313>m/z269
[MK]m/z399
[MK]m/z399
[MH]m/z413+
[MCOOH]m/z369
[MH]m/z413+
[MCOOH]m/z369
m/z413>m/z369
[MK]m/z499
[MK]m/z499
[MH]m/z513+
[MCOOH]m/z469
[MH]m/z513+
[MCOOH]m/z469
m/z513>m/z469
[MH]m/z563+
[MCOOH]m/z519
[MH]m/z563+
[MCOOH]m/z519
m/z563>m/z519
r2
37.10.6
392
1.00.3
0.9992
0.9983
0.9974
892
893
0.9982
0.9990
28.00.6
26.80.2
0.620.05
0.9994
0.9999
0.9921
782
752
0.9983
0.9981
14.80.4
14.50.3
1.860.06
0.9984
0.9993
0.9982
21.30.7
18.10.5
0.790.04
0.9983
0.9982
0.9951
Fullscana
[MH]m/z713+
18.60.4
0.9981
[MCOOH]m/z669
Ionisolationb
[MH]m/z713+
0.9993
18.50.4
[MCOOH]m/z669
MRM
0.9903
m/z713>m/z669
1.240.07
a
m/zrange,100750.bselectedm/zvalues4ineverysegment.cStandarddeviation.
PFTeDA
- 168 -
Captulo4
Intens
x10
a)Standardsolution
PFBS
PFHxS
0.8
PFOS
0.6
0.4
PFHxA
0.0
4
x10
Intens
PFDA PFUnDA
PFTeDA
PFOA
0.2
b)Referencematerial
PFOS
0.8
0.6
0.4
0.2
PFOA
0.0
Intens 4
x10
c)Spikedsampleofbullettunaliver
PFDA
PFUnDA
PFHxS
PFOS
PFBS
0.8
0.6
PFHxA
0.4
PFDA
PFUnDA PFTeDA
PFOA
0.2
0.0
4
x10
Intens
d)Sampleofherringgullmuscle
0.8
0.6
PFHxS
PFBS
0.4
PFOS
PFTeDA
0.2
0.0
10
15
20
25
Time(min)
- 169 -
ParteII
can be solved by using less sensitive interferencefree transitions in MS/MS
(option not available for iontraps because of the low mass cutoff) or using
perfluorinated stationary phases for interference separation [3032].3132Since
mass interferences can be easily solved by using the appropriate
chromatographic column, we only focused in this research on interferences
influencing ionization or producing spacecharge effects. Samples for which
taurodeoxycholicacid(themajormassinterferenceforPFOS)wasdetected(the
m/z and the retention time for PFOS underwent a detectable shift) were
discarded(e.g.liversfromherringgullandnortherngannet).
- 170 -
Captulo4
Formorecomplexsamples(suchasfoodstuffs,e.g.dairies)theinclusionofan
additionalcleanupstepmaybenecessary.
Theexpectedhigherperformanceoftheionisolationmonitoringmode
over full scan mode to prevent spacecharge effects was assessed. In the
simplestsense,spacechargeeffectsareaconsequenceofthemutualrepulsion
between particles of like charge and are produced when too many ions are
stored in the trap overfilling it. High ion density causes that the ions in the
centerofthetrapareshieldedbyouterionsanddonotrespondideallytothe
RF field leading to lower mass resolution, mass misassignments and a loss of
sensitivity [29,34]. Space charge effects are more marked on ions with lower
m/zwhicharethefirstonesinleavingthetrap.
Spacechargeeffectswereevaluated,forbothionisolationandfullscan
modes,throughtheanalysisoffortified(80ngg1)bullettunasamplesaccording
to the procedure specified in section 2.3 but varying the maximum
accumulationtimeofionsinthetrapandtheionchargecontrol(ICC)between
100200msand5,00050,000,respectively.Theejectionofmatrixionsfromthe
iontrapduringtheisolationstepoftargetionspreventedsomehowthespace
chargeeffectsonthedetectorandnospacechargeeffectswereobservedatall
usingtheionisolationmonitoringmode.Onthecontrary,spacechargerelated
interferencesweredetectedforalltheanalytesunderfullscanconditions,the
effects being more significant for the lower m/z ions. As an example, Figure 3
compares the mass spectra obtained for the analysis of PFOS in a standard
[34] K.A. Cox, C.D. Cleven, R.G. Cooks, Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 144
(1995) 47.
- 171 -
ParteII
solution(a)andanextractofspikedbullettunaliver(b,c).Spectraobtainedfor
the sample using the ion isolation mode (c) were interferencefree (compare
with the spectrum of the standard in a) while spacecharge effects were
observed for sample extracts analyzed under fullscan conditions (b). The
resonance for ions of each specific m/z value was spread over a range of
frequenciesgivenrisetobroadpeakscenteredatahighermass.
(a)Fullscanmode(standard)
PFOS
(b)Fullscanmode(sampleextract)
PFOS
(c)Ionisolationmode(sampleextract)
PFOS
Figure 3. Ion trap-MS mass spectra obtained for PFOS from a standard
solution of 20 g L-1 when working in full-scan mode (a) and from a spiked
(80 ng g-1) extract of bullet tuna liver when working in full-scan (b) and
isolation MRM (c) modes.
3.3.3.Precision
Captulo4
mackerel and northern gannet) samples. The values, expressed as relative
standarddeviation(RSD),werebetween5%and9%forallthePFASs.
3.4.Methodvalidation
Table5showsthesummarystatisticsobtainedinthisstudyandFigure
2b shows the corresponding extracted ion chromatogram obtained by ion
isolationiontrapMS.Datareportedforthissamplefromthe2ndinternational
interlaboratorystudyarealsoincludedinTable5[22].Asavailable,theresults
obtainedforPFASsbyionisolationiontrapMSwerealwayswithinthemeanS
values reported for the reference material and they were in good agreement
withthoseobtainedbythemostselectivetandemMS.Theresultsobtainedby
triplequadrupolemeasurementsindicatethattheproposedsolventextraction
methodisalsoarapidandconvenientalternativetoexistingextractionmethods
forthistechnique.
3.5.Analysisofbiotasamples
- 173 -
ParteII
Table5. Summary statistics of results obtained in the analysis of a flounder fillet
sample by using ion-trap and triple quadrupole MS and those provided by the
laboratories (n=15) in the 2nd international interlaboratory study (2nd ILS) on
perfluorinated compounds.
Analyte
PFBS
PFHxA
PFHxS
PFOA
PFOS
PFNA
PFDA
PFUnDA
PFDoDA
PFTeDA
PFOSA
a
Spike IonisolationIontrap
1
(ngg )
MS
a
Mean S
RSD
1
(ngg )
(%)
n.d.
n.d.
n.d.
9
22.6
212
145
8
1948
17.2
n.a.
21.9 25.30.1
1
7
17.8
201
20.1
n.a.
n.d.
3.2
n.a.
MRMTriplequadrupole
MS
a
Mean S RSD
1
(ngg )
(%)
n.d.
n.d.
n.d.
18.00.8
5
7
17712
17.71.5
8
21.30.9
5
17.51.3
7
23.00.8
4
n.a.
9
3.10.4
nd
2 Internationalinterlaboratory
b
study
Mean
S
RSD Min
Max
1
1
1
1
(ngg ) (ngg ) (%) (ngg ) (ngg )
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
18.0
4.1
23
9.2
23.6
150
44.0
29 49.9
230
17.5
4.6
26
8.9
27.3
21.1
4.6
22 12.9
26.7
15.9
4.1
26
9.0
21.0
17.3
5.2
30
8.5
23.6
n.a.
n.a.
n.a.
3.6
1.7
47
1.5
7.5
n=3;n.d.nondetected;n.a.nonanalyzed.
Datatakenfrom[22]
limits of the method for PFASs were determined by analysing sample blanks
(n=11)andconsideringasignaltonoiseof3and10,respectively.MethodLODs
andLOQsforthetargetPFASswerebetween0.4and6ngg1and2and16ngg1
ww,respectively.
Table6liststheconcentrationsfoundforthetargetcompoundsandthe
recoveriesobtainedafterspikingthesamplesatdifferentconcentrationlevels.
Recoveries of PFASs ranged from 87% to 111% (n=9) with relative standard
deviations(RSD)rangingfrom1to11%.
- 174 -
Captulo4
Table 6. Mean concentrations and recoveries and the respective standard
deviations obtained for the target compounds in the analysis of biota samples
using the proposed method.
Samples
ConcentrationsSa(ngg1)andrecoveriesSa(%)
PFBS PFHxA PFHxS PFOA PFOS
PFDA PFUnDA PFTeDA
Bullettunamuscle
Spikedsample
Atlanticpomfretmuscle
Spikedsample
n.d.
957
Herringgullmuscle
Spikedsample
Bullettunaliver
Spikedsample
Atlanticpomfretliver
Spikedsample
a
<LOQ
1059
n.d.
901
n.d.
n.d.
n.d.
1093 10011 946
n.d.
1051
n.d.
942
8.90.3 n.d.
901 853
n.d.
985
n.d.
1005
n.d.
1031
<LOQ
1029
n.d.
971
n.d.
1013
n.d.
974
n.d.
1041
n.d.
1056
<LOQ
1051
<LOQ
1001
n.d.
9810
n.d.
971
n.d.
8811
n.d.
n.d. 13.10.2 n.d.
1031 9010 1041 1041
n.d.
n.d.
1071 11111
n.d.
<LOQ
1097 10611
Northerngannetmuscle
Spikedsample
n.d.
n.d. 2.90.6 n.d.
1056 1001 1057 934
Mackerelmuscle
Spikedsample
n.d.
n.d. 9.50.5
1073 1031 991
n.d.
1051
n.d.
1061
n.d.
1073
n.d.
991
n.d.
1081
n=3;n.d.nondetected;spikedconcentration:20ngg1ww
4.Conclusions
AsimplemethodhasbeendevelopedfortheanalysisofPFASsinbiota
by combining an efficient microextraction procedure and an ion isolation
monitoring mode in iontrap MS. The mixture 75:25 (v/v) of THF and water
constitutesavaluablealternativetothecurrentsolventsusedfortheextraction
of PFASs. Major benefits of this mixture are the adequate balance between
polarandnonpolarforcesandthepossibilityofestablishingdifferenttypesof
interactions with the polar groups of PFASs (i.e. iondipole and hydrogen
bonding).ThesepropertiesmakeitpossibletoextractionicandnonionicPFASs
with carbon chain lengths between C4 and C14 from biota samples (i.e. muscle
and/orliverofseafishandbirds)usinglowsolventvolumes,whichavoidsthe
commonly required subsequent evaporation. Recoveries in spiked samples
rangedbetween85and111%.Itwasprovedthatthemethodnotonlyworked
- 175 -
ParteII
withiontrapMS,ashereproposed,butalsowithotherMStechniquesastriple
quadrupole. From this study, it can be inferred that Hildebrand solubility
parameters and their components, illustrated by Teas diagrams, may offer a
simplewaytoestablishguidelinesforsolventselectioninextractions.
TheionisolationmonitoringmodeiniontrapMSofferssensitivityand
selectivityenoughtodeterminePFASsintheTHF:waterextractofbiotasamples
withouttheneedofcleanupsteps.Sensitivityofionisolationmonitoringmode
issimilartothefullscanmode,thuspermittingdetectionlimitsforPFASsinthe
range 0.46 ng g1. The selectivity achieved is a consequence of the
reduction/removal of the spacecharge effects caused by matrix components.
Themethod,however,doesnotsolvemassinterferencescausedbybilesaltsin
theanalysisofPFSAsinsomebiotasamplessuchasbirdlivers.So,itisstrongly
recommendedtheuseofperfluorinatedstationaryphasesformassinterference
separation[3032]inordertoextendtheapplicationofiontrapMStoawider
typeofsamples.
Acknowledgments
AuthorsgratefullyacknowledgefinancialsupportfromSpanishMICINN
(Project No CTQ200801068). They specially thank to the staff of Migres
Foundation for kindly providing the sea birds. The two firsts authors
acknowledgetheSpanishMECforthepostgradfellowshipsaward(AP20043644
andAP20054275).
- 176 -
Captulo5
CAPTULO5:Asimpleandrapidextractionmethodforsensitivedeterminationofperfluoroalkylsubstancesinbloodserumsuitableforexposureevaluation
CAPTULO5
Asimpleandrapidextractionmethodforsensitive
determinationofperfluoroalkylsubstancesinblood
serumsuitableforexposureevaluation
JournalofChromatographyA1235(2012)8491
NoeliaLuque,AnaBallesterosGmez,StefanvanLeeuwen,SoledadRubio
Abstract
- 177 -
ParteII
and between 84 and 5168 pg mL1 in samples of human origin. Both the
analytical and operational features of this method make it suitable for the
evaluationofexposuretoPFASs.
Keywords:Perfluoroalkylsubstances;Bloodserum;supramolecularsolvent
basedmicroextraction,Liquidchromatographytandemmassspectrometry.
1.Introduction
Perandpolyfluoroalkylsubstances(PFASs)areemergingcontaminants
that comprise a large group of chemicals [1]. Attention has been focused on
these chemicals due to the discovery of their global biospheric distribution
explained by their persistence and bioaccumulation in biota [23]. The
marketing and use of perfluorooctane sulfonate (PFOS) were restricted by the
Europeandirective2006/122/EC[4].PFOShasbeenincludedintheannexIIIof
theDirective2008/105/ECaspartofthelistofsubstancessubjecttoreviewfor
identification as priority hazardous compounds in the framework of the
European water policies [5]. PFASs have been also listed as contaminants of
relevancetobemonitoredinfishandotherseafoodforhumanconsumptionfor
determininggoodenvironmentalstatusofmarinewatersintheMarineStrategy
Framework Directive [6]. In addition, PFOS, its salts and perfluorooctane
sulfonyl fluoride (PFOSF) have been included in Annex B to the Stockholm
[1] R.C. Buck, J. Franklin, U. Berger, J.M. Conder, I.T. Counsins, P. de Voogt, A.A.
Jensen, K. Kannan, S.A. Mabury, S.P.J. van Leeuwen. Integr. Environ. Assess. Manage 7
(2011) 513.
[2] J.P. Giesy, K. Kannan, Environ. Sci. Technol. 35 (2001)1339.
[3]C.R. Powley, S.W. George, M.H. Russell, R.A. Hoke, R.C. Buck, Chemosphere 70
(2008) 664.
[4] Directive 2006/122/EC of the European Parliament and of the Council, Official J.
Eur. Union, L 372 (2006) 32.
[5] Directive 2008/105/EC of the European Parliament and of the Council, Official J.
Eur. Union, L 348 (2008) 84.
[6] Marine strategy framework directive. Task group 9 Contaminants in fish and other
seafood, available at: http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/bitstream/111111111/
13669/1/tg9%20report%20final_vii.pdf
- 178 -
Captulo5
Conventiononpersistentorganicpollutants(POPs)[7].
[7] The 9 new POPs under the Stockholm Convention, available at:
http://chm.pops.int/Programmes/New%20POPs/The%209%20new%20POPs/tabid/672/la
nguage/en-US/Default.aspx.
[8] D.R. Taves, Nature 217 (1968) 1050.
[9] F.D. Gilliland, J.S. Mandel, Am. J. Ind. Med. 29 (1996) 560.
[10] K.J. Hansen, L.A. Clemen, M.E. Ellefson, H.O. Johnson, Environ. Sci. Technol. 35
(2001) 766.
[11] Y. Pico, M. Farre, M. Llorca, D. Barcelo, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 51 (2011) 605.
[12] K. Kannan, Environ. Chem.8 (2011) 333.
[13] K. Kannan, S. Corsolini, J. Falandysz, G. Fillmann, K.S. Kumar, B.G. Loganathan,
M.A. Mohd, J. Olivero, N. van Wouwe, J.H. Yang, K.M. Aldous, Environ. Sci. Technol.
38 (2004) 4489.
[14] A.M. Calafat, L.L. Needham, Z. Kuklenyik, J.A. Reidy, J.S. Tully, M. AguilarVillalobos, L.P. Naeher, Chemosphere 63 (2006) 490.
[15] D.J. Ehresman, J.W. Froehlich, G.W. Olsen, S. Chang, J.L. Butenhoff, Environ. Res.
103 (2007) 176.
[16] L.S. Haug, C. Thomsen, G. Becher, J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 385.
[17] A. Jahnke, U. Berger, J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 410.
- 179 -
ParteII
plasma, serum and whole blood has been reported [18]. Current sample
treatmentsforPFASsanalysisaremostlybasedonionpairextractionemploying
methyltertbutylether after reaction with tetrabutylammonium [10], solvent
extraction with acetonitrile [3,19] or solid phase extraction (SPE), both offline
[15,20,21]orcolumnswitching[16,22,23].Organicsolventvolumesaround10
15 mL [3,13,18] and times between 15 min and 16 h are spent by extraction
[13,18,20,21].Acidification[20,22],alkalinedigestion[21]oradditionoforganic
solvent to samples [3,16,18,23] are usually carried out prior SPE in order to
prevent the clogging of pre/columns caused by the precipitation of blood
proteins. Cleanup strategies include column washing [15,20,22], filtration
[10,20],centrifugation[22],dispersivegraphitizedcarbonwithglacialaceticacid
[3], and Wax SPE of extracts [19], being common the use of multiplesteps
methods. Main drawbacks of these strategies are much handson time due to
theneedforrepetitivewashes[10],lowrecoveriesforlongchainPFASsdueto
coprecipitation with serum protein [16,19], thorough washings of SPE
cartridges after sample percolation [15,19], problems of contamination in the
different procedural steps, lack of enrichment or even dilution of the samples
(only online SPE techniques permit to concentrate them) or the need for
additional column switching equipment investments [16,22,23]. In addition
most of the developed methodologies require matrixmatched calibration for
accurate quantitation of PFASs. Usual detection limits (LODs) are in the range
0.13 ng mL1 [17] although a method allowing PFAS quantification at
concentrations as low as 0.05 ng PFAS mL1 serum has been reported [16].
Accordingtotheabovestatements,thedevelopmentofnewmethodsforexact
[18] W.K. Reagen, M.E. Ellefson, K. Kannan, J.P. Giesy, Anal. Chim. Acta 628 (2008)
214
[19] L.W.Y. Yeung, S. Taniyasu, K. Kannan, D.Z.Y. Xu, K.S. Guruge, P.K.S. Lam, N.
Yamashita, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 4950.
[20] A. Krrman, B. van Bavel, U. Jrnberg, L. Hardell, G. Lindsrm, Anal. Chem. 77
(2005) 864.
[21] S. Taniyasu, K. Kannan, M.K. So, A. Gulkowska, E. Sinclair, T. Okazawa, N.
Yamashita, J. Chromatogr. A 1093 (2005) 89.
[22] Z. Kuklenyik, L.L. Needham, A.M. Calafat, Anal Chem. 77 (2005) 6085.
[23] A. Holm, S.R. Wilson, P. Molander, E. Lundanes, T. Greibrokk, J. Sep. Sci. 27
(2004) 1071.
- 180 -
Captulo5
quantitation of PFASs, which feature straightforward and reduced sample
handling(thusreducingriskofcontaminationandlossofanalytes)isnecessary
forlargescalehumanbiomonitoring.Withthisaim,thisarticleinvestigatesthe
potentialofamphiphilebasedsupramolecularsolvents.
[24] R. Carabias-Martnez, E. Rodrguez-Gonzalo, B. Moreno-Cordero, J.L. PrezPavn, C. Garca-Pinto, E. Frnandez_laespada, J. Chromatogr. A 902 (2000) 251.
[25] T. Saitoh, W. L. Hinze, Anal. Chem. 63 (1991) 2520.
[26] X. Jin, M. Zhu, E. D. Conte, Anal. Chem. 71 (1999) 514.
[27] I. Casero, D. Sicilia, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chem. 71 (1999) 4519.
[28] F. J. Ruiz, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chem. 79 (2007) 7473
[29] F. J. Ruiz, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chem. 78 (2006) 7229.
[30] A. Ballesteros-Gmez, M.D. Sicilia, S. Rubio, Anal. Chim. Acta 677 (2010) 108.
[31] A. Garca-Prieto, M.L. Lunar, S. Rubio, D. Prez-Bendito, Anal. Chim. Acta 630
(2008) 19.
- 181 -
ParteII
solid samples [3537].36 Supramolecular37 solvents are compatible with LC but
they have to be removed before injection in gas chromatography or capillary
electrophoresis.
Againstconventionalorganicsolvents,SUPRASsarespeciallysuitedfor
the extraction of amphiphilic contaminants such as PFASs since analyte
extractant mixed aggregates are formed through both interactions between
fluorocarbonchainsandpolargroups.TheuseofSUPRASsfortheextractionof
theseemergingcontaminantsisherepresentedforthefirsttime.Withthisaim,
aSUPRASmadeupofhexanoicacidreversemicelleswasheresynthesizedfor
the first time through a selfassembly process, and then characterized and
assessedfortheextraction/concentrationofPFASsfromserumsamplespriorto
LC/Triple quadrupole (QQQ) MSMS determination. The selection of hexanoic
acid(HA)wasbasedonboththedispersionandhydrogenbondinginteractions
theycanestablishwithPFASsanditsshorthydrocarbonchainlengththatallows
an early elution from the chromatographic column thus preventing coelution
with the PFASs usually found in blood (i.e. PFHxS, PFOS, PFOA and C9C14
perfluoroalkyl carboxylates). Carboxylic acids with chain lengths shorter than
hexanoic acid were not employed because of their high water solubility and
accordingly low yield of SUPRAS production under the proper selfassembly
conditions.Parametersaffectingextractionefficiencyandconcentrationfactors
were optimised and the applicability of the proposed method to the
determinationofPFASsindifferentserawasassessed.
- 182 -
Captulo5
2.Experimental
2.1.Chemicals
acid
(PFNA);
perfluorodecanoic
acid
(PFDA),
18
O2PFHxS (MPFHxS),
13
C2PFDA (MPFDA),
13
C4PFOA (MPFOA),
13
C4PFOS (MPFOS),
13
13
C5PFNA (MPFNA),
13
C2
2.2.Apparatusandmaterials
- 183 -
ParteII
i.d. 2.1mm, length 50 mm) from Waters (Milford, MA, USA). A
SymmetryShieldTM RP8guardcolumn(particlesize3.5m,i.d.3.9mm,length
20 mm) was inserted before the analytical column. Coloumetric Karl Fischer
titrator from Metrohm (Herisau, Suize) was used for determination of water
content in the SUPRAS. Two mlmicrotubes SafeLock from Eppendorf Iberica
(Madrid,Spain),glassballs(3mmdiameter)fromAlbus(Crdoba,Spain),aReax
Heidolphvortex(Schwabach,Germany),withanattachmentfor10testtubes,a
High Speed Brushless centrifuge MPW350R (Warsaw, Poland), and a 50L
microsyringe 750 NR from Hamilton (Bonaduz, Switzerland) were used for
sample preparation and extraction. The volume obtained of SUPRASs under
different experimental conditions was measured with a digital calliper from
MedidPrecision,S.A.(Barcelona,Spain).
2.3.SUPRAScharacterization
- 184 -
Captulo5
2.4.DeterminationofPFASsinserumsamples
2.4.1.Samplecollectionandpreservation
2.4.2.SamplepreparationandSUPRASbasedmicroextraction
Thefrozenserumsampleswereallowedtothawatroomtemperature
andshakenuntilhomogenization.ExtractionofPFASswasperformedbymixing
asamplealiquotof765Lofserum,38LofHCl(12M),97Lofhexanoicacid,
600 L of THF and 18 L of ISs (100 ng mL1 in methanol) into a 2 ml
polypropylenecentrifugemicrotubewith34glassballs(3mmdiameter)atthe
bottom. Glass balls were added to accelerate and enhance sample mixing and
extraction. The mixtures were vortexshaken for 7 min and then centrifuged
(15,000 rpm, 15C, 13 minutes) to achieve the complete separation and
clarificationoftheSUPRAS(i.e.thesupernatant)formedintothebulksolution.
ThevolumeofSUPRAS(360L)wascalculatedbymeasuringitsheightwitha
digitalcalliper.MoreinformationregardingsynthesisofSUPRASsisdetailedin
3.2.1. Finally, an aliquot of SUPRAS was withdrawn with a microsyringe and
transferred to autosampler glass vials with inserts. Samples were capped with
aluminum/siliconeseptumbarriers(Supelco,Bellefonte,USA)andsubjectedto
LC/MS/MSanalysis.
2.4.3.QuantitationofPFASsbyLC(ESI)QQQMS2
- 185 -
ParteII
ScheduledMRMmoderecordingthetransitionsbetweentheprecursorionand
thetwomostabundantproductsions.Table1showsthequantifierandqualifier
ionsusedforeachnativePFASandthequantifierionfortheISs.Thequantifier
andqualifierionsforTDCA(acommoninterferenceforPFOS)arealsogiven.
MethodISs
Quantifier
Qualifier
transition transition
18
PFHxS
399>119
399>119
O2PFHxS 403>119
13
PFOA
413>369
413>169
C4PFOA 417>372
13
PFOS
499>99
499>99
C4PFOS
503>99
PFNA
463>419
463>219 13C5PFNA 468>423
PFDA
513>469
513>219 13C2PFDA 515>470
PFUnDA 563>519
563>269 13C2PFUdDA 565>520
PFTeDA
713>669
713>369 13C2PFDoDA 615>570
TDCA
498.3>80
(PFOS
498.3>107
interfe
498.3>124
rence)
PFCAsprecursorion[MH],quantifierproduction[MCOOH]
PFHxSprecursorion[MK],quantifierproduction[CF3CF2]
PFOSprecursorion[MK],quantifierproduction[FSO3]
DP;Declusteringpotential
CE;Collisionenergy
CXP;Collisioncellexitpotencial
MSparameters
DP
CE CXP
(V)
(V) (V)
95
48
1
45
16
9
100 72 15
40
16 21
40
16 21
50
22 37
75
16 11
100
72
15
Theinjectionvolumeusedwas10L.Themobilephaseconsistedof2
mMaqueousammoniumacetate(A)andmethanol(B)ataflowrateof0.3ml
min1. The temperature for the analytical column was set at 30 C and the
gradientelutionwasprogrammedasfollows:lineargradientfrom0to100%of
methanolfor50min,andthenrevertingtoinitialconditionsallowing10minfor
stabilization.Theeluatesfromtheanalyticalcolumnweredivertedbyswitching
valvetowastefrom0to 30.5minutesinorder toavoidtheentryofhexanoic
acidandthemostpolarmatrixcompoundsinthemassspectrometer.TheTurbo
spraysettingswereasfollows:curtaingas(N2)30psi;ionsprayvoltage4500V;
- 186 -
Captulo5
temperature450C;nebulizerandturbogas70psi.Declusteringpotential(DP),
collision energy (CE) and collision cell exit potential (CXP) parameters were
optimizedforeachanalyte(Table1).UnitresolutionwasusedforbothQ1 and
Q3quadrupoles.CalibrationcurveswereconstructedatconcentrationsofPFASs
overtherangesstatedinTable2withaconcentrationofthemethodISsof5ng
mL1.
PFHxS
PFOA
Solvent
Calibration
range
(ngmL1)
0.130
0.0130
PFOS
0.0530
0.9995
36.3
29
10
PFNA
0.0130
0.9996
35.4
PFDA
0.0530
0.9997
37.7
29
10
PFUnDA
0.0530
0.9991
39.1
29
10
PFASs
Correlation
coefficient
(r)
Retention
time
(min)
Method
LOQ
(pgmL1)
Method
LOD
(pgmL1)
0.9997
0.9998
31.6
33.8
59
6
20
2
PFTeDA 0.0530
0.9994
42.7
29
10
n=8;
b
Calculatedonthebasisof80%recoveriesforPFCs(meanrecoveriesfromall
analyzedserumsamples).
a
3.Resultsanddiscussion
3.1.Sourcesandcontrolofbackgroundcontamination
- 187 -
ParteII
in the components of LC equipment or labware [38]. As a precautionary
measure, an additional column (Water Symmetry 3.5 m, 4.6 mm 75 mm)
wasinsertedbetweenthepumpandinjectorinordertotrapPFASspotentially
released from the instrument. Contamination arising from labware was
preventedbyusingdisposablepolypropylenetubes,aluminum/siliconesepta,a
glassmicrosyringe,nylonsyringefiltersandglasscoatedroundmagneticstirring
bars. Procedural contamination was investigated by adding distilled water at
different hydrochloric acid concentrations (1501500 mM) into polypropylene
centrifuge microtubes, instead of serum samples, and subjecting them to
different supramolecular microextraction conditions (i.e. several hexanoic acid
and tetrahydrofuran concentrations and vortexshaken and centrifugation at
variable times). No contamination of PFASs was observed above the method
detectionlimits.Appropriatecontrolreagentblankswereroutinelyinjectedinto
the instrument during sample processing sequences in order to check for
potentialproceduralorinstrumentalcontamination.
3.2.DescriptionandcharacterizationofhexanoicacidbasedSUPRASs
3.2.1.Synthesis
- 188 -
Captulo5
separation usually occurs upward, but the term may still be applied if the
relative densities of the dispersed and continuous phases are such that the
concentrated emulsion settles downward [39]. The process occurred from the
protonated hexanoic acid form (pKa 4.80.1), so pH values below 4 were
requiredfortheformationoftheSUPRAS.
Figure1showstherelativeconcentrationsofTHFandhexanoicacidat
whichcoacervationoccurredleadingtotheformationoftheSUPRAS.
%THF(v/v)
100
90
80
70
Hexanoicacidisotropicsolution
60
50
40
Coacervation
30
20
10
1
0
6
8
%Hexanoicacid(v/v)
10
12
- 189 -
ParteII
between 100 and the sum of the percentages of HA and THF. Above the
coacervationregion,theSUPRASsolubilisedintheTHF:waterbulksolution,the
boundarybeingdependentontheamphiphile(i.e.hexanoicacid)concentration.
Ontheotherhand,theSUPRASwasonlypartiallyformedatpercentagesofTHF
below1%whereamisciblemixtureofhexanoicacidandSUPRASwasobtained.
Itisworthmentioningthebehaviorfoundforthehexanoicacidinmixturesat
relativeconcentrationsof0.5%forHAand0.54.5%forTHF.Inthesesolutions
HA was completely solubilized; however, the SUPRAS started to form at a
concentrationof5%ofTHF,despitethefactofthehighersolubilityofHAinthis
medium.
3.2.2.Composition
The composition of the SUPRAS was THF dependent; the higher the
contentofTHFinthebulksolutionthehigherthepercentagesofTHFandwater
intheSUPRAS,thisleadingtothesynthesisofsolventsprogressivelycontaining
decreased concentrations of HA. On the other hand, the amount of hexanoic
acidremaininginthebulksolutionafterSUPRASseparationwasbothTHFand
HA dependent. Thus, at HA concentrations above approximately 3%, the self
assembly of the amphiphile was favored as the THF in the bulk solution, and
consequently in the SUPRAS, increased. Incorporation of HA tothe coacervate
phasewaspracticallyquantitativeasthepercentageofTHFinthebulksolution
ranged from 30 to 50%. The opposite was found for SUPRAS concentrations
nearly and below 2%; solubilization of the amphiphile in the equilibrium
solutionwasfavoredwithincreasingconcentrationsofTHFanditsincorporation
into the SUPRAS did not exceed the 60% over the range investigated. This
behavior, as it was expected, negatively influenced the extraction processes
since solutes partitioned between the amphiphile in the SUPRAS and the
- 190 -
Captulo5
equilibrium solution. As an example, recoveries for PFASs ranged from 39 to
67%withSUPRASssynthesizedfrom2%ofHAand40%ofTHFandfrom80to
94% with SUPRAS synthesized from 5% of HA and 50% of THF despite the
SUPRAS composition was practically the same (see Table 3). So, only SUPRASs
synthesized at hexanoic acid concentrations above 3% were considered in this
study.
94
88
83
79
70
58
37
27
16
11
78
76
81
85
82
81
98
91
95
%ofHAincorporated
inSUPRAS
6
6
7
8
9
9
10
12
15
19
SUPRAS
composition
(w/w,%)
HA
6
10
13
21
33
53
61
69
70
SUPRAS
composition
(w/w,%)
10
water
48
50
53
56
67
56
39
25
%ofHAincorporated
inSUPRAS
95
85
79
67
65
55
33
19
10
HA
5
6
7
8
8
9
10
14
20
water
%ofHAincorporated
inSUPRAS
9
14
25
27
36
57
67
70
SUPRAS
composition
(w/w,%)
THF
HA
0
1
2
3
5
10
20
30
40
50
water
%
THF
(v/v)
THF
%HA(v/v)
5
THF
5
9
10
20
31
48
58
64
67
5
6
6
7
8
9
10
11
12
14
95
89 72
85 75
83 84
72 86
60 83
42 91
31 98
24 104
19 110
3.2.3.Volumeprediction
ThevolumeofSUPRASobtainedthroughtheselfassemblyofhexanoic
acidwasbothTHFandamphiphiledependent.So,aseriesofexperimentswere
- 191 -
ParteII
carriedouttodevelopanequationforthepredictionofthevolumeofSUPRAS
as a function of these components. The aim was to be able to predict the
maximum concentration factor that could be obtained under given
experimentalconditions.Forthispurpose,asetofSUPRASswaspreparedusing
a variety of amphiphile (310%) and THF (150%) concentrations within the
range of analytical interest according to the results obtained in the above
section.
y=0.69HA+0.0761HATHF+e0,1047THF[1]
[40] N.R. Draper, H. Smith, Applied Regression Analysis, third ed., Willey-Interscience,
New York, 1998, 505
- 192 -
Captulo5
3.2.4.Handlingofsupramolecularsolvents
3.3.Optimization
- 193 -
ParteII
namely the highest possible ACF and recoveries above 75%. The variables
investigated were THF and HA concentrations, pH , analyte concentration and
stirringtime.
Table5showstherecoveriesobtainedforPFASsinserumasafunction
of both THF and hexanoic acid concentrations. The volume of SUPRAS, and so
concentrationfactors,alsovariedwiththesereagentsaccordingtotheequation
1.Recoveriesabove75%andfluorocarbonchainlengthindependentwere
- 194 -
Captulo5
Table 4. Mean PFAS recoveries and standard deviation (R S, %) from spiked
serum samples as a function of the concentration of hydrochloric acid.
PFTeDA
PFUnDA
PFDA
PFNA
PFOS
PFOA
molof
HCl/ml
ofserum
PFHxS
Analytes(RSa)
69
513 452 643 481 542 543 701
100
502 441 554 472 521 551 674
140
521 474 652 505 553 603 683
164
524 525 654 573 612 663 742
267
703 824 794 812 832 811 842
398
815 863 783 841 842 822 842
792
734 861 831 831 863 831 801
1500
775 822 844 822 811 801 802
1800
735 813 781 801 832 822 831
a
Hexanoicacid=6.5%andTHF=40%;n=3;spikedPFASconcentration=5gL1.
obtained with SUPRASs made from 35% (v/v) of THF and 5.4% (v/v) of HA.
Recoveries increased with the concentration of THF because this solvent
facilitated the rupture of PFASprotein interactions, however SUPRAS volume
alsoincreasedandconsequentlyconcentrationfactorsdiminished.So,valuesof
40% of THF and 6.5% (v/v) of HA were selected as optimal, which provided
recoveries
of
7983%
and
ACFs
of
1.681.76.
Simultaneous
Recoverieswereintheintervals7390%foralltheanalytesinthewholerange
ofconcentrationassessed(i.e.between0.1and15ngmL1).
Thetimeforextraction(vortexshaking,2.300rpm)wasinvestigatedin
theinterval 040min.Equilibrium conditionswere achievedafter5minowing
tothehighsolubilisingcapabilityoftheSUPRAS.Atimeof7minwasfixedfor
furtherexperimentsinordertogetmaximalreproducibility.
- 195 -
ParteII
Table 5. Mean recoveries and standard deviation (R S, %) of PFASs from
spiked serum samples at 600 moles of HCl/ml of serum as function of the
concentration of hexanoic acid and THF.
THFa
Analytes(RSc)
%(v/v)
PFHxS
PFOA PFOS PFNA
PFDA
25 517
677 551 642
645
30
612
782 734 742
752
35
681
831 811 781
801
40
836
833 794 811
832
45
791
884 822 842
832
50
801
975 925 924
862
HAb
%(v/v)
4.3 611
751 781 781
806
5.4
753
892 861 824
843
6.5
836
833 794 811
832
7.5
773
861 861 861
883
a
Hexanoicacid=6.5%(v/v).
b
THF=40%(v/v).
c
n=3;spikedPFASconcentration=5gL1.
PFUnDA
667
753
811
821
872
922
PFTeDA
712
772
811
832
854
945
816
822
821
883
876
821
832
864
- 196 -
Captulo5
3.4.Analyticalperformance
3.4.1.Sensitivity
Table2showstheanalyticalfiguresofmeritfortheproposedmethod.
The instrumental limits of quantitation (LOQs) and detection (LODs) were
determinedfromstandardspreparedin75:25THF:water(v/v),containinga5ng
mL1ofthemethodIS,andusingasignaltonoiseratioof10and3,respectively.
Eachcurvepointwasquantifiedusingtheoverallcalibrationcurveandreviewed
foraccuracy.Methodcalibrationaccuracyrequirementsof10025%weremet
forallanalytes.TheLOQsandLODsthusobtainedwere0.1and0.03ngmL1 for
PFHxS;0.05and0.02ngmL1forPFOS,PFDA,PFUnDAandPFTeDA;and0.01and
0.003ngmL1 forPFOAandPFNA;respectively.Correlationbetweenpeakareas
andPFASconcentrationswasdeterminedbylinearregressionand1/xweighted
calibration.Thecorrelationcoefficientswereintherange0.99910.9998forall
analytesindicatinggoodfits.
Duetothelackofblankserumsamples,methodLOQsandLODswere
estimated from the respective instrumental quantitation and detection limits
and the mean actual concentration factor obtained (1.7) considering 80% as
mean recovery for all PFASs (see Table 2). No significant differences in
background noise were observed for serum samples and standards. A typical
chromatogram obtained for a standard solution containing 5 ng mL1 of each
PFASisshowninFigure2a.
3.4.2.Selectivity
AnalysisofPFASsinserumiscommonlyconfrontedwiththepresenceof
coeluting matrix components which can cause ionization suppression or
enhancement in the ESI source and even perfluoroalkyl sulfonic acids (PFSAs)
peak misidentification. Thus, PFSAs have been overreported in serum due to
- 197 -
ParteII
coelutingwithTDCAandsteriodsulfateswhenusingC18columns[19,41].The
masses of these compounds are too close to those of PFHxS and PFOS for
accurate analysis by the oneunit resolution QQQMS and can lead to
overestimationatthe499>80,399>80and399>99transitions.Thisproblemhas
been addressed in various ways including the use of other columns providing
more selective retention mechanisms (e.g. perfluorooctyl, Synergi hydroRP or
ionexchangephasecolumns[19,41,42])ortheuseofmoreselectivebutalso
lesssensitivetransitions(mainly49999and399119[41,42]).Inthisworkwe
quantifiedPFASsinserumusingaC18columnandthemoreselectivetransitions
399>119and499>99topreventPFASmisidentification.Thepresenceofsteroid
sulfates in the human sera analyzed was confirmed by the transition 399>99
whileTDCAisomersweredetectedinallthehumanandanimalserumsamples
at the transitions 498.3>107 and 498.3>80. These interferences coeluted,
therefore using the 399>119 and 499>99 transitions was fundamental to
quantify PFHxS and PFOS properly. Although the use of these transitions
resultedinasomewhatdecreasedsensitivity,theoverallmethodsensitivitywas
sufficient for analysis of human samples. Signal enhancement or suppression
wasestimatedbycomparingtheresponseforISsaddedtotheSUPRASextracts
obtainedafterserumtreatment,justpriorinjection(5ngmL1),totheaverage
response of ISs in the calibration solutions. The serum samples analysed
exhibitedlowsignalsuppression(12%)orenhancement(6%)forallPFASs,
includingPFHxSandPFOS.Therefore,matrixeffectsontheionizationofPFASs
werenegligibleinthismethodandfurthercleanupstepswerenotnecessary.
3.4.3.Precision
- 198 -
Captulo5
recoveries ranged between 95 and 111%. The values, expressed as relative
standarddeviation(RSD),werebetween1and6%forallthePFASs.
3.5.Analysisofserumsamples.
Table 6. Mean concentrations (pg mL-1) (n=2) obtained for the target
Simples
PFHxS
PFOA
PFOS
PFNA
PFDA
PFUnDA
PFTeDA
<LOD
14.30.7
197.30.6
233
<LOQ
693
7010
<LOD
171
1562
521
374
724
10813
<LOD
352
<LOQ
452
<LOQ
715
<LOQ
746116
173535
516863
90833
37632
67866
124247
4597171
56533
2615
54823
865
79441
121920
467010
56717
2585
5606
844
Calf
serum
Bovine
serum
Horse
serum
Human
serum1
Human
serum2
Human
serum3
6243
993
- 199 -
ParteII
(a)Standardsolutioncontaining5ngmL1 ofeachPFAS
Intensity,cps
4.1e4_
3.0e4_
PFOA
1700
2.0e4_
1.0e4_
4000.0
0
0
PFNA
PFOS
PFDA
PFHxS
800
0
30
PFUnDA
50
40
10
15
20
Intensity,cps
3.0e4_ (b)Human1serumsample
2.5e4_ 320
2.0e4_
4_
PFHxS
1.0e
30
35
40
45
50
PFOA
160
0
30
PFNA
40
5000.0
0
0
25
PFTeDA
1.5e
4_
PFTeDA
PFHxS PFOS
Waste
10
50
PFDA
PFHxS PFOS PFUnDA
Waste
PFTeDA
35 40
20
25 30
45 50
15
Time,min
quantitation.BilesaltsinterferingwithPFOSweredetectedinbovine,horseand
humansera atthe transition499>80andsothe daughterion99wasusedfor
quantitation.TheconcentrationsofPFASsinanimalsamplesrangedbetween17
and197.3pgmL1 andbetween84and5168pgmL1 inhumansera.RSDswere
between1and15%.ThehighestconcentrationswerefoundforPFOSandPFOA
and both branched and linear PFOS were clearly observed in the
- 200 -
Captulo5
chromatograms for human samples. The presence of longchain PFCAs (PFDA,
PFUnDA and PFTeDA) in human sera highlights the need for their routine
determinationalongwiththemostcommonlyfoundPFOAandPFOS.
4.Conclusions
Asupramolecularsolventconsistingofreverseaggregatesofhexanoic
acid in THF:water mixtures was here described and characterized for the first
time and its suitability as a solvent for the microextraction of PFASs in serum
was proved. The formation of the supramolecular solvent is spontaneous and
requiresminutevolumesofTHF(600Lpersample)thatadditionallyprovokes
the breaking of PFASprotein interactions. The method offers a valuable
alternative to current approaches for the evaluation of human and animal
exposuretothesecontaminants.Themajorbenefitsofthismethodcompared
tootherpreviouslyreportedare:(a)lowervolumeoforganicsolventpersample
extraction(e.g.600LofTHF);(b)shorterextractiontimes(e.g.7minutes);(c)
nocleanuporevaporationofextractsrequired;(d)noneedforadditionalsteps
orreagentsdifferentfromthoseusedfortheextractionsystemitselfforprotein
precipitationandnocontaminationoranalytelossesproducedduringthisstep;
(e) accurate quantitation obtained using IS solventbased calibration; (f) high
sensitivity (e.g.LODs220pg mL1and LOQs659pgmL1).The methodmeets
the analytical and operational requirements to be used in largescale
epidemiologicalstudies.
Acknowledgment
- 201 -
RESUMEN Y DISCUSIN
DE LOS RESULTADOS
Resumenydiscusindelosresultados
1.
INTRODUCCIN
han
sido
adsorbentes
supramoleculares,
disolventes
supramolecularesymezclashidroorgnicas.
EnlaTabla1seresumenlosproblemasanalticosabordadosconcada
- 205 -
- 206 -
Tipodeinteracciones
posibles
(Pka)
Polaridad
LogKow
6.ANALITOS
5.SISTEMA
EXTRACTANTE
Interaccionescatin,
inicas,dedispersiny
puentesdehidrogeno
(1,5)15,1
1,74,5
Plaguicidas
Interacciones
inicasyde
dispersin
2,94,9
Interacciones
dedispersin
5,76,6
Hidrocarburos
aromticos
policclicos
Micelasacuosas
Microextraccin
lquidolquido
Tensioactivos
de
benzalconio
Hemimicelas/Admicelas
Extraccinenfaseslida
Extraccin,preconcentracin,estabilizacin
3.ETAPASDEL
PROCESOANALTICO
INVESTIGADAS
4.FORMATO
Aguassuperficiales,subterrneasyresiduales
Micelasinversas
Microextraccin
lquidolquido
Extracciny
preconcentracin
Interaccionesdipolo
dipolo,fuerzasde
dispersinypuentes
dehidrgeno
Interaccionesde
dispersiny
puentesde
hidrgeno
(3,6)0,52
1,710,8
Sustanciasperfluoroalquiladas
Tetrahidrofurano:agua
(75:25,v/v)
Microextraccinslido
lquido
Extraccinydeteccin
Tejidosdepescadoyavesysuerosanguneo
2.MUESTRAS
1.PROBLEMAS
ABORDADOS
Tabla1. Resumen de los objetivos, sistemas extractantes empleados, muestras y analitos analizados.
Resumenydiscusindelosresultados
2.
- 207 -
tetrabutilamonio.Laseparacinanalticaserealizmediantecromatografade
lquidosylacuantificacinsellevoacaboconundetectordediodosenfila.Por
ltimo, en el tercer mtodo desarrollado se emplea un disolvente
supramolecularconstituidopormicelasnormalesdedodecilsulfonatodesodio
para la extraccin, preconcentracin y estabilizacin de los tensioactivos de
benzalconio e hidrocarburos aromticos policclicos en muestras de aguas
fluviales y residuales. La cuantificacin de los compuestos de benzalconio se
realiz con un espectrmetro de masas con trampa inica e interfase
electrospray y los hidrocarburos se cuantificaron mediante deteccin
fluorescente.
LaFigura1resumelosprocedimientosoperacionalesllevadosacaboen
las distintas metodologas y las condiciones de almacenamiento ensayadas en
los estudios de estabilidad de los analitos. A continuacin se presentan los
principales resultados obtenidos en cada etapa del proceso analtico y se
discutenlosaspectosmsrelevantesdelosmismos.
2.1.
Muestrasyanalitos
- 208 -
Resumenydiscusindelosresultados
Plaguicidas
PAHs
BASs
1)Formacinde
hemimicelas/admicelas
25mLpH2
1
1,6gL SDS
1)Formacindeldisolventesupramolecular
yextraccindeloscontaminantes
0,1gdeSDSo
12.514mLdeHCl(12M)
25mLdemuestraacuosafortificada
(destiladaoreal)
10mLpH2
1
1,25gL SDS
2)Extraccindelos
contaminantes
25mLdeagua
destilada
fortificadao250
mLdeagua
natural
fortificadaque
contengan
0,03mgdeTBA
250mldeagua
destilada
fortificadao
muestraacuosa
realfortificada
500mgde
alumina
3)Secado
2)Separacindefasesporcentrifugacin
4)Almacenamiento
3)Coleccindeldisolventeformado
Diferentestemperaturas(Tambiente,4Cy
20C)
Diferentescondicionesdeiluminacin(luz
solaryoscuridad)
5)Elucin
Plaguicidas
bsicosyneutros:
1mLde
tetrahidrofurano
Plaguicidas
cidos:2mLde
mezcla0,3M
sosametanol
(90:10v/v)
2mLde
metanol
4)Almacenamiento
Diferentescondicionesdeacidez(3,75y4,2MHCl)
Diferentestemperaturas(35C,Tambiente,4Cy
20C)
Diferentescondicionesdeiluminacin(luzsolary
oscuridad)
6)Determinacin
Cromatografalquidayfotometra
5)Determinacin
Cromatografalquiday
espectrometrademasas
(interfaseelectrospray/
trampainica)
Cromatografa
lquiday
fluorescencia
SDS:dodecilsulfatosdico;TBA:tetrabutilamonio;SDSo:dodecilsulfonatosdico;HCl:cidoclorhdrico
- 209 -
construccin,delaceiteydelautomvil.Enlasaguasnaturales,losfactoresque
condicionanlacomposicindelaguasonmltiples,destacandodenuevoeltipo
deactividad humanaque serealiceenlazonademuestreoylanaturalezade
losmaterialesdelterrenoconlosqueelaguaentraencontacto.Lacuencadel
Guadalquivir est formada por sedimentos terciarios calizos (margas, calizas
margosas,calizasyareniscascalizas)quealsersurcadosporelroGuadalquivir
y sus afluentes, quedaron cubiertos en parte por sedimentos fluviales cuyos
restosformanlasterrazasactuales.Estossuelosestndedicadosprincipalmente
acultivossiendoportantolaagriculturalaactividadquemayorinfluenciatiene
en la calidad de las aguas subterrneas y fluviales a su paso por la ciudad de
Crdoba.
- 210 -
Resumenydiscusindelosresultados
Los contaminantes orgnicos objeto de nuestro estudio se
seleccionaron en base a los problemas de estabilizacin que presentan en las
muestras acuosas ambientales y fueron; compuestos de benzalconio (BASs),
hidrocarburosaromticospolicclicos(PAHs)yplaguicidas.
CH3
CH3
N+ (CH2)nCH3
CH2
n=11homlogoBASC12(BDDA)
n=13homlogoBASC14(BDTA)
n=15homlogoBASC16(BDHA)
- 211 -
principalmenteasugrancapacidaddeadsorcin(alrededordel90%)sobrelos
recipientes, independientemente del tipo de material (vidrio, polipropileno o
tefln) [3], siendo necesario la acidificacin del agua a pH 2 o la adicin de
acetonitriloaunaconcentracindel25%(v/v)paraevitardichasperdidas[4,5].
Estudios de biodegradacin aerbica tambin han demostrado que la
estabilidad de los BASs est afectada por la accin microbiolgica. As, los
homlogos BAS C12 y BAS C14 se degradan completamente en una semana
mientras que la degradacin del homlogo BAS C16 es del 30% en el mismo
periododetiempo[6].PuestoquelabiodegradacindelosBASsenlossistemas
acuticossereduceconsiderablementedebidoalaformacindecomplejoscon
tensioactivos aninicos [7], se espera que estos analitos se estabilicen en
cartuchos de extraccin en fase slida (SPE) al adsolubilizarse sobre las
hemimicelasoadmicelasdedodecilsulfatousadascomoadsorbentes.
LosPAHssonungruponumerosodesustanciasderivadasdelbenceno
- 212 -
Resumenydiscusindelosresultados
juntoconelBenzo(b)fluoranteno,elBenzo(ghi)perileno,elBenzo(k)fluoranteno
yelIndeno(1,2,3cd)pireno,hasidoincluidosenlalistadesustanciasprioritarias
enelmbitodelapolticadeaguas.LaFigura3muestralasestructurasdelos
PAHsestudiadosenlasinvestigacionesqueconstituyenestaMemoria.
Benzo(a)
antraceno
Benzo(a)
pireno
Benzo(b)
fluoranteno
BaA
BaP
BbF
B(ghi)P
IP
AligualqueocurreconlosBASs,losPAHspresentanbajaestabilidaden
- 213 -
Triazinas
Compuestos
Cl
Cl
N
N
CH3 CH2 NH
NH CH
CH3
Atrazina
Carbamatos
CH3
CH3
CH3
H N C O CH
Cl
CH3
H
CH3
N C NH
N C NH
CH3
Clortoluron
CH
Anilidas
CH3
CH3
CH3
Isoproturon
O
NH C CH2 CH3
Cl
Cl
Propanil
CH3
Cl CH2 C N CH CH2 O
CH3
CH2 CH3
Cl CH2 C N C CH2 Cl
CH2 CH3
CH3 CH2
CH3
Metolaclor
Alaclor
Organofosforados
Cl
C
Cl
O
CH
O
Cl
O CH2 CH3
CH2 CH3
Clorfenvinfos
Fenoxiacidos
Clorprofam
Cl
O
CH3
NH CH2 CH3
Simazina
O
CH3
Cloroacetanilidas
CH3 CH2 NH
O
CH3 NH C O
Carbofuran
Fenilureas
CH3
H
O CH
O
C
CH3 O
OH
O CH C OH
Cl
CH3
Cl
2,4D
- 214 -
Cl
Mecoprop
Resumenydiscusindelosresultados
Ladegradacinqueexperimentanlosplaguicidasenlasaguasnaturales
debido a hidrlisis, biodegradacin, fotlisis o evaporacin, es un problema
ampliamente conocido [9] siendo las triazinas, los organofosforados y los
carbamatos los grupos ms afectados. Se han utilizado diferentes estrategias
parasuestabilizacinbasadasenlaadicindecompuestosqumicosyelcontrol
de la temperatura. Sin embargo, el uso de determinadas sustancias qumicas
paraestabilizarunafamiliadeplaguicidaspuedeafectarlaestabilidaddeotros
grupos [10,11] y adems, la estabilizacin slo es efectiva durante 1 2
semanas.
2.2.
Extraccinyconcentracindelosanalitos
- 215 -
Lascondicionespropuestasparalaextraccindenuestrosanalitosson:
25mgdeSDSabsorbidosporgramodealminaquedanlugaralaformacinde
- 216 -
Resumenydiscusindelosresultados
hemimicelasdeSDSenelcasodeextraccindelosBASs,y80mgdeSDSy0,06
mg de TBA por gramo de almina que originan admicelas mixtas para la
extraccindelosplaguicidas(Figura4).EnamboscasoslaconcentracindeSDS
queseeluirdurantelafiltracindelamuestraserdespreciableyportantose
mantieneconstantelacomposicindeladsorbente.
(B)
HemimicelasdeSDS
mgSDSadsorbed/galumina
(A)
AdmicelasmixtasdeSDSTBA
CHC
1000
CMC
Hemimicellarregion Hemimicellar/
Admicellar
region
Admicellar
region
100
10
0.1
10
100
1000
10000
[SDS]aqueous(mg/L)
- 217 -
b)Disolventesupramolecularconstituidopormicelasdecidododecilsulfnico
LascondicionespropuestasparalaextraccindelosBASsyPAHsson25
mLdemuestraacuosaconunaconcentracinfinalde3,75Mo4,2Mdecido
clorhdricoy0,25%(w/v)dedodecilsulfonatosdico.
- 218 -
Resumenydiscusindelosresultados
10
8
E
[HCl],M
LL
0
0
[SDSA](w/v)
2.2.2. Extraccinypreconcentracin
a)Plaguicidas.
- 219 -
Loseluyentestradicionalmenteusadosparaladesorcindelosanalitos
de los adsorbentes supramoleculares son disolventes orgnicos o disoluciones
acuosasaunpHadecuadoquetienenlacapacidaddedestruirlosagregadosde
tensioactivosobreeloxidomineral.Enlaaplicacindesarrolladaseensayaron
losdisolventesorgnicosmetanol,isopropanol,tetrahidrofuranoylamezcla0,3
Mhidrxido sdicometanol(90:10v/v)adiferentesvolmenes,obtenindose
las mejores recuperaciones de plaguicidas bsicos y neutros (carbamatos,
fenilureas,triazinas,anilidas,organofosforadosycloroacetanilidas)con1mLde
tetrahidrofurano. La desorcin de los pesticidas cidos se llev a cabo
empleando una segunda etapa de elucin con 2 mL de la mezcla 0,3 M
hidrxido sdicometanol (90:10 v/v), la cual al percolarse por los cartuchos
cambialacargadelaalminadepositivaanegativacausandolarupturadelos
agregados TBASDS. La pequea proporcin de metanol en la mezcla es
necesariaparaobtenerladesorcindelospesticidascidos.Lasrecuperaciones
de los plaguicidas ensayados fueron cuantitativas a excepcin del carbofuran
(503%).
Losresultadosdelestudiodevolumenderuptura(volumendemuestra
para el cual la recuperacin de analitos disminuye en un 5%) para el mtodo
propuesto mostraron recuperaciones cuantitativas para la mayora de los
plaguicidas con el mximo volumen de muestra ensayado (500 mL). Sin
embargo, las recuperaciones para carbofuran y fenilureas disminuyeron
alrededor de un 50% al percolar 250 mL y 100 mL de muestra acuosa
respectivamente.As,elvolumendemuestrapropuestoparaestemtodofue
de 250 mL como solucin de compromiso. Los factores de preconcentracin
fueron de 250 (250 mL de muestra y 1mL de eluyente) para los plaguicidas
bsicos y neutros y 125 (250 mL de muestra y 2mL de eluyente) para los
- 220 -
Resumenydiscusindelosresultados
plaguicidascidos.Enbaseaestosresultadospodemosdecirqueeladsorbente
admicelar mixto propuesto es una herramienta vlida para la extraccin y
preconcentracin de multiresiduos de pesticidas en base a las diferentes
interacciones que puede establecer con los analitos. Otra caracterstica
destacable del mtodo es el bajo volumen de disolvente orgnico necesario
para la desorcin de los analitos lo cual evita la etapa de evaporacin y
reconstitucindelosextractosquegeneralmenteesnecesariacuandoseusan
adsorbentespolimricosconunelevadogradodeentrecruzamientoodenegro
decarbn.
b)Compuestosdebenzalconio.
fuertes interacciones entre los BASs y los grupos silanoles lo que implica la
utilizacindegrandesvolmenesdedisolventeorgnicoparasuelucin[4,13].
Por ello el uso del adsorbente admicelar propuesto en esta memoria supone
unagranventajadebidoasueficaciadeextraccinyfcilelucin.
[13] J.K. Autry, E.G. Vaught, E.D. Conte, Microchem. J. 80 (2005) 25.
- 222 -
Resumenydiscusindelosresultados
c)Hidrocarburosaromticospolicclicos.
2.3.
Estabilizacindeloscontaminantesenmuestrasacuosas
Dado el gran potencial que presentan las hemimicelas, admicelas y
- 223 -
Compuestosymuestras
BASsenaguadestilada
BASenmuestrasambientales
Plaguicidasenaguadestilada
Plaguicidasenmuestras
ambientales
Condicionesdealmacenamientodelosadsorbentes
hemimicelares/admicelares
Tambiente
4C
20C
Oscuridad Luzsolar
1mes
3meses
3meses
3meses
1mes
3meses
3meses
3meses
3meses
3meses
Compuestosy
muestras
BASsenagua
destilada
BASenmuestras
ambientales
PAHsenagua
destilada
PAHsenmuestras
ambientales
Condicionesdealmacenamientodelosdisolventes
supramoleculares
35C
Tambiente
4C
20C
Oscuridad Oscuridad Luzsolar
1mes
1semana
3meses
3meses
3meses
1mes
1mes
1semana
3meses
3meses
3meses
1mes
2.3.1. Estabilizacinenadsorbenteshemimicelares/admicelares
a)Efectodesecadodeladsorbente
- 224 -
Resumenydiscusindelosresultados
minutosy1hora.Paralelamente,tambinsealmacenaroncartuchosquenose
haban sometido al proceso de secado del adsorbente. Las recuperaciones de
losBASsenestosltimosdisminuyeronun5%entanslo1da,mientrasque
las recuperaciones de los cartuchos sometidos a secado fueron cuantitativas
despus de una semana para todos los tiempos de secado ensayados. Se
propone por consiguiente, secar siempre los cartuchos durante 35 minutos
paraeliminarelaguaresidualdespusdelapercolacindelamuestra.
b)Efectodelaexposicinalaluzsolar.
Lainfluenciadelaluzsolarsobrelaestabilidaddeloscompuestosenlas
fasesadsorbentesestudiadasseinvestigcomparandolosresultadosobtenidos
con cartuchos expuestos a la luz (iluminacin natural del laboratorio) y
cartuchos almacenados en condiciones de oscuridad (bien envolvindolos en
papeldealuminioobienguardndolosencajasdecartnopacas)duranteuno
o3mesesatemperaturaambiente.EnelcasodelosBASsylamayoradelas
familias de plaguicidas estudiadas (carbamatos, fenilureas, anilidas,
cloroacetanilidas y fenoxicidos) las recuperaciones obtenidas fueron
cuantitativas independientemente de las condiciones de iluminacin; sin
embargo,comosepuedeverenlaTabla3,losplaguicidasorganofosforadosy
las triazinas se degradaron muy rpidamente a partir de la primera semana
cuandosealmacenaronsinproteccindelaluzsolar.
- 225 -
BDDA
Condicionesdealmacenamiento
Temperaturaambientey
Temperaturaambientey
Oscuridad
luznatural
Tiempo(semanas)
Tiempo(semanas)
2
3
4
1
2
3
4
0
1
1005 1001 1065 985 1035 961 973 942 965
BDTA
1004
981
962
1056
BDHA
1006
972
961
961 1025
981
Simazina
1003
993
974
954
896
984
Atrazina
1004
1002
885
944
946
936
Compuestos
956
Carbofuran 10010 11211 10610 10210 1064 1066 1044 7810 882
Clorprofam
1002
1001
994
1074
955
Clortoluron
1008
1087
926
1007
971
Isoproturon 1007
1075
977
Propanil
1004
1033
956
Metolaclor
1005
971
Alaclor
1005
1061
965
Clorfenvinfos 1003
931
933
1015
2,4D
1007
882
954
886 1043
965
Mecoprop
1008
803
903
974
976
Tasasdeextraccinnormalizadas.
923
951
c)Efectodelatemperatura.
- 226 -
Resumenydiscusindelosresultados
almacenaronadistintastemperaturas(ambiente,4Cy20C)durante3meses.
Antesdelaelucin,loscartuchosconservadosa4Cy20Cdebenmantenerse
a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos y una hora
respectivamenteparaevitarvariabilidadenlacuantificacin.
la
gran
capacidad
estabilizadora
de
los
agregados
- 227 -
- 228 -
1002
1008
1007
1004
1005
1005
1003
1007
1008
Clorprofam
Clortoluron
Isoproturon
Propanil
Metolaclor
Alaclor
Clorfenvinfos
2,4D
MCPP
911
995
995
883
921
1051
935
1098
1052
1064
996
1085
1106
1062
1072
1122
1094
1042
1066
1091
1126
1082
1061
1053
1043
1052
1112
1001
981
1021
952
853
1032
1056
1092
981
992
9711
1004
904
1051
994
985
1031
1147
931
1014
1024
1064
983
1061
1154
1031
1075
1028
1043
1023
1034
1031
976
964
891
832
1106
967
1091
1001
1011
1057
1022
743
975
966
985
1035
4C
Tiempodealmacenamiento(semanas)
884
913
805
972
945
1031
1031
1056
984
1106
674
973
981
971
993
12
861
985
1022
1042
1021
1075
1078
1077
1052
1142
1152
1112
945
1001
1054
883
941
994
916
1083
976
1056
956
1004
948
983
983
941
982
1013
941
891
1041
1026
1011
1027
1037
949
1001
922
1122
1041
941
971
945
931
1003
1052
1064
1042
1031
1082
1008
1111
986
1042
1091
951
952
951
944
893
1041
1116
1046
1004
1014
1085
1084
1006
1073
1024
951
961
961
951
942
942
12
923
962
1004
993
913
994
1077
975
948
1044
1054
1003
20C
Tiempodealmacenamiento(semanas)
1004
1003
Simazina
10010
1006
BDHA
Carbofuran
1004
BDTA
Atrazina
1005
BDDA
Compuestos
Condicionesdealmacenamiento
Tabla 4. Recuperacionesa medias (n=3, %) de los analitos de muestras de agua destiladas fortificadasb despus de ser
almacenados en los adsorbentes supramoleculares investigados a 4C y -20C durante 3 meses.
Resumenydiscusindelosresultados
Enelcasodelosplaguicidas,latemperaturaafectsuestabilidadenlos
agregadosadmicelares(verTabla3y4).Ningnplaguicidainvestigadomostr
degradacin en 3 meses cuando los cartuchos se almacenaron a 20C. Sin
embargo,atrazinayclorfenvinfoscomenzaronadegradarsea4Capartirdeun
mes mientras que la estabilidad de los analitos a temperatura ambiente
dependidelgrupoestructural.As,laestabilidadfuedeunmesparatriazinas,
fenilureasyorganofosforados,dosmesesparacarbamatosyanilidasy3meses
para cloroacetanilidas y fenoxicidos. De nuevo las triazinas y el clorfenvinfos
fueronlosmsafectadosporlatemperaturaaligualqueocurriconlaluzsolar.
d)Efectodeloscomponentesdelamatriz
Las aguas de los sistemas acuticos naturales y sobre todo las aguas
residualestienenunacomposicinmuyvariableypresentancomponentesenla
matriz que pueden afectar a la estabilidad de los analitos. Por este motivo se
comprob la estabilidad de los analitos en los adsorbentes supramoleculares
almacenados durante 1 mes a 4C empleando diferentes tipos de muestras
acuosas(fluviales,subterrneasyresiduales)conelfindevalidarlaaplicabilidad
de esta metodologa a muestras reales. Los resultados mostraron que los
- 229 -
2.3.2. Estabilizacinendisolventessupramoleculares
a)Efectodelaconcentracindecidoclorhdrico
En primer lugar se comprob si la acidez de los disolventes formados
[inducidos con dos concentraciones de cido clorhdrico (3,75 M y 4,2 M)]
tenaninfluenciaenlaestabilidaddelosBASsyPAHs.Losresultadosmostraron
quenoexistandiferenciasentrelosdostiposdeSUPRASsylasrecuperaciones
fueronsiemprecuantitativasparatodoslosanalitos(verTabla5).
b)Efectodelaexposicinaluzsolar.
Elefectodelaluznaturalenlaestabilidaddelosanalitossolubilizados
enlosdisolventesseestudiexponiendounosvialesalaluzsolaryenvolviendo
otros con papel aluminio durante una semana a temperatura ambiente.
Ninguno de los compuestos analizados mostr degradacin en las condiciones
de almacenamiento ensayadas por lo que no es necesario mantener en
oscuridadlosvialesatemperaturaambiente.
- 230 -
Resumenydiscusindelosresultados
Tabla 5. Recuperacionesa medias (n = 3, %) de los analitos despus de su
extraccin de muestras de agua destilada fortificadas (0,19 g L-1) y
almacenamiento en los disolventes supramoleculares en diferentes de
condiciones de acidez y temperatura durante 3 meses.
Compuestos
BDDA
BDTA
Tiempo
(semanas)
CompuestosdeBenzalconio
Condicionesdealmacenamiento
4,2M
3,75M
T
ambiente
4C
20C
T
ambiente
4C
0
1
8
12
0
1
8
12
0
1
8
12
1003
1004
971
992 1001
931 962
921
942 941
921 943
1083
1074 1081
983 1014
1002
1004
971
1002 1021
941 944
922
941 932
923 931
945
1015 1045
953 952
1001
1004
1001
1011 1032
991 993
BDHA
941
942 962
953 991
1014
1055 1043
955 962
HidrocarburosAromticosPolicclicos
Condicionesdealmacenamiento
Tiempo
4,2M
3,75M
Compuestos
(semanas)
T
T
4C
20C
4C
ambiente
ambiente
0
1001
1002
BaA
1
1032
1031 1011
1001 1081
8
1032
1032 1011
1053 1044
12
1024
1024 1003
992 1021
0
1002
1003
BaP
1
951
1001 1033
1004 1051
8
983
1011 1011
1013 992
12
963
972 995
972 992
0
1004
1002
1
1024
993 1021
1003 1051
IP
8
992
1032 1001
1043 1022
12
a
901
954 942
Tasasdeextraccinnormalizadas.
- 231 -
942 961
20C
941
951
1011
961
943
952
1012
963
954
20C
1081
1091
1011
1081
1052
1003
1051
1072
984
c)Efectodelatemperatura.
La influencia de la temperatura en la conservacin de las muestras
tambinsecomprobguardandolosvialesa35C,temperaturaambiente,4C
y 20C durante 3 meses. La tabla 5 muestra un resumen de los resultados
obtenidos.Lasrecuperacionesdelosanalitosestuvieroncomprendidasentre90
y 109% demostrando que una vez solubilizados en los SUPRASs no
experimentan degradacin, independientemente del nmero de anillos
aromticos presentes en su estructura o la longitud de la cadena
hidrocarbonada. El hecho de que tambin sean estables, independientemente
de las condiciones de acidez e iluminacin, facilita el transporte y
almacenamiento de las muestras durante el trabajo de campo, sobre todo en
zonascalurosasysoleadas.
d)Efectodeloscomponentesdelamatriz
Aguafluvial(Guadalquivir)
(das)
BbF
BkF
BaP B(ghi)P
BbF
BkF
BaP
B(ghi)P
0
10010 1006 1006 10010 1008 1006 1006 10011
30
1083 1023 1012 1019 981 1026 1055
1009
a
Tasas de extraccin normalizadas.
Tiempo
- 232 -
Resumenydiscusindelosresultados
Comoconclusindeesteapartado,sepuedeafirmarquelosagregados
supramoleculares, tanto disolventes como adsorbentes, presentan gran
capacidad de estabilizacin para los contaminantes orgnicos en muestras
acuosasambientales.
2.4.
Cuantificacin
Los extractos supramoleculares son compatibles con cromatografa
lquidaacopladaadistintosdetectores.Enlasinvestigacionesllevadasacaboen
esta Tesis Doctoral, se han empleado absorbancia, fluorescencia y
espectrometrademasas.LosagregadosmicelaresqueconstituyenlosSUPRASs
deSDSAsedestruyencuandoelextractosediluyeconmetanoljustoantesdela
inyeccin cromatogrfica, con objeto de disminuir su viscosidad y acidez,
mientras que los agregados de hemimicelas/admicelas se destruyen por el
disolvente orgnico utilizado para la elucin en SPE. En ambos casos los
extractos adems de contener los analitos poseen una elevada cantidad de
monmerosdetensioactivo.Yaquetantododecilsulfonatocomododecilsulfato
son inicos, eluyen rpidamente en los procesos cromatogrficos y
generalmenteseenvanadesechocuandoCLestacopladaaespectrometrade
masas para evitar que la fuente de ionizacin se ensucie. La gran ventaja de
estostensioactivosconrespectoalosnoinicosdesdeelpuntodevistadela
deteccin, es que los primeros se comercializan como monmeros puros de
estructura definida, mientras los tensioactivos noinicos slo se comercializan
comounamezcladehomlogoseismeros.Estehecho,unidoaquelamayora
de los tensioactivos no inicos presentan estructuras aromticas, y mayores
tiempos de retencin, hace que se obtengan picos cromatogrficos de banda
ancha lo que dificulta o impide la adecuada resolucin cromatogrfica de los
analitospolaresymedianamentepolares(ejemploFigura7).
- 233 -
(a)
TritonX100
0.5UA
BaA
BbF
BkF
ABSORBANCIA
BeP
Py
SDSA
BbF
BaA
0.05UA
(b)
BkF
BeP
Py
10
12
Tiempo (min)
benzo[k] fluoranteno
Lacuantificacindelosplaguicidasunavezextradosdelasmuestrasde
aguas naturales mediante SPE con admicelas mixtas se realiz empleando un
cromatgrafo de lquidos acoplado a un detector ultravioletavisible de diodos
enfila,mientrasquelosPAHssolubilizadoseneldisolventesupramolecularse
analizaronenuncromatgrafodelquidosacopladoaundetectorfluorimtrico.
Los BASs se cuantificaron utilizando cromatografa lquida acoplada a dos
detectores distintos dependiendo de la tcnica de extraccin empleada; en el
caso de SPE hemimicelar fue un detector de diodos en fila y en el caso de su
extraccin coacervativa se emple un espectrmetro de masas con trampa
inica. La cuantificacin de los BASs mediante espectrometra de masas es la
- 234 -
Resumenydiscusindelosresultados
opcin ms recomendable siempre que sea posible, en base a los lmites de
cuantificacin instrumentales que presenta (g L1) en comparacin con su
deteccinfotomtrica(mgL1),ysucapacidaddeconfirmacin.
- 235 -
Analitos
BDDA
BDTA
BDHA
Simazina
Atrazina
Carbofuran
Clorprofam
Clortoluron
Isoproturon
Propanil
Metolaclor
Alaclor
Clorfenvinfos
2,4D
Mecoprop
Intervalodelinealidad
(gL1)
240(x103)
240(x103)
240(x103)
2.52000
22000
103000
52000
2.52000
22000
52000
153000
203000
103000
22000
22000
r
0.9994
0.9992
0.9980
0.9999
0.9995
0.9991
0.9995
0.9995
0.9994
0.9998
0.9998
0.9999
0.9997
0.9992
0.9999
LDMa
(ngL1)
6400
6400
9600
3
2
60
6
13
7
6
19
26
13
3
3
Lmitededeteccindelmtodocalculadoaplicandoelprocesoanalticocompletoa
muestrasreales.
queseaconsejasucuantificacinempleandoSPEhemimicelaryespectrometra
de masas cuyos lmites de cuantificacin del mtodo bajan hasta 2 ng L1. La
determinacindeestoscompuestosusandoespectrometrademasastambin
sellevacaboconlametodologadeextraccincoacervativa.Enestecasolos
lmites de cuantificacin alcanzados para los BASs son de 40 ng L1 debido al
menor factor de preconcentracin del mtodo. La combinacin de estas dos
metodologas,SPEhemimicelaryextraccincondisolventessupramoleculares,
con espectrometra de masas (interfase electrospray/trampa inica) para la
determinacin de estos tensioactivos catinicos haba sido previamente
estudiada por nuestro grupo de investigacin [3,6] comprobndose que los
componentes de la matriz no causaban supresin de la ionizacin ni efectos
espaciocarga.
- 236 -
Resumenydiscusindelosresultados
Las caractersticas analticas de los mtodos desarrollados empleando
disolventessupramolecularessemuestranenlaTabla8.
Intervalodelinealidad
Analitos
(gL1)
(ngL1)
BDDA
11000
0,998
BDTA
11000
0,9996
BDHA
11000
0,9997
BaA
0,0520
0,9996
0,5
BbF
0,220
0,9993
2,5
BkF
0,0520
0,9994
0,5
BaP
0,120
0,9995
IP
0,220
0,9991
2.5
B(ghi)P
0,120
0,9998
Lmitededeteccindelmtodocalculadoaplicandoelprocesoanalticocompletoa
muestrasreales.
ElmtododesarrolladoparalosPAHspermitesudeteccinanivelesde
entre0,5y2,5ngL1,siendosusconcentracionesmximasadmisiblesenaguas
superficiales continentales 0,05 g L1 para el BaP, 0,03 g L1 para la suma de
BbFyBkF,y0,002gL1paralasumadeIPyB(ghi)P.
- 237 -
3.
DESARROLLO
DE
NUEVAS
METODOLOGAS
PARA
LA
EnlaFigura8seresumenlosprocedimientosllevadosacaboenlasdos
metodologas desarrolladas y a continuacin se discuten los resultados y
aspectosmsrelevantesdecadaetapadelprocesoanaltico.
- 238 -
Resumenydiscusindelosresultados
1)Homogenizacin
delamuestra
1)Homogenizacin
delamuestra
2)Adicindelos
disolventesyextraccinde
lasPFASs
2)Formacindel
disolventesupramolecular
yextraccindelasPFASs
600LdeTHF
60Ldeagua
200mgdemuestra(pesohmedo)
Teniendoencuentaelcontenidoenaguadela
muestra(70%),lacomposicindeladisolucin
finalesTHF:agua75:25(v/v)
765Ldesuero
38LdeHCl(12M)
600LdeTHF
97Ldecidohexanoico
1
18LdeISs(100ngmL )
3)Separacindefasespor
ultracentrifugacin
3)Ultracentrifugacin
4)Coleccindeunaalcuotade
extracto
4)Medidaycoleccindel
disolventesupramolecular
formado
Volumendel
disolvente360 L
conunacomposicin
del20%decido
hexanoico,14%de
aguay66%deTHF
Volumenfinaldel
extracto800L
5)Determinacin
5)Determinacin
Cromatografalquidayespectrometrade
masas(interfaseelectrospray/trampa
inicaenmodoaislamientodeiones)
Cromatografalquidayespectrometrademasas
(interfaseelectrospray/triplecuadrupolo)
3.1.
Muestrasyanalitos
Enlaactualidadexisteunagranpreocupacinporlaexposicinhumana
alasPFASs.Losniveleshalladosdeestoscompuestosensuerosanguneoenla
[15] OECD Hazard assessment of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and its salts. Report
RNV/JM/RD (2002) 17/FINAL, 2002.
[16] K. Prevedouros, I.T.Cousins, R.C. Buck, S.H. Korzeniowski, Environ. Sci. Technol.
40 (2006) 32.
[17] C.R. Powley, S.W. George, M.H.Russell, R.A. Hoke, R.C.Buck, Chemosphere 70
(2008) 664.
[18] Appendice 2 in Ecological Screening Assessment Report on Perfluorooctane
Sulfonate, Its Salts and Its Precursors that Contain the C8F17SO2, C8F17SO3 or C8F17SO2N
Moiety, disponible en: http://www.ec.gc.ca.ceparegistry/documents/subslist/PFOSSAR/
PFOS A2.cfm.
- 240 -
Resumenydiscusindelosresultados
poblacin general son del orden de ng mL1 [19] y aumenta hasta
concentraciones de g mL1 en personas con exposicin ocupacional [20]. En
2008, la Comisin Tcnica constituida por la Autoridad Europea de Seguridad
Alimentaria (EFSA) para el estudio de contaminantes que afectan a la cadena
alimentaria prepar un informe cientfico en el que se conclua que era poco
probable que el PFOS y PFOA estn teniendo efectos nocivos en la poblacin
general, pero manifestaba ciertas dudas respecto a las repercusiones en el
desarrollodeorganismosvivos.Larecomendacinfinaldeesteestudiofueque
serecogiesenmsdatossobrelosnivelesdesustanciasperfluoroalquiladasen
alimentosypersonas,conelfindedeterminarlastendenciasenlaexposicina
dichassustancias[21].
- 241 -
PorotroladoelConveniodeEstocolmosobrecontaminantesorgnicos
Lasmuestrasbiolgicasanalizadasenestasegundapartedelamemoria
- 242 -
Resumenydiscusindelosresultados
temperaturaambienteyoscuridadhastasuanlisis.Porotrolado,lasmuestras
sanguneas fueron almacenadas en botes de polipropileno a 20C hasta el
momentodelanlisis.
Nombre
cidosperfluoroalquilcarboxlicos
Abreviatura
PFCAs
cidoperfluorobutanoico
cidoperfluorohexanoico
cidoperfluoroheptanoico
cidoperflurooctanoico
cidoperfluorononanoico
cidoperfluorodecanoico
cidoperfluoroundecanoico
cidoperfluorododecanoico
cidoperfluorotridecanoico
cidoperfluorotetradecanoico
cidoperfluoropentadecanoico
Formulaqumica
PFBA
PFHxA
PFHpA
PFOA
PFNA
PFDA
PFUnDA
PFDoDA
PFTrDA
PFTeDA
PFPeDA
cidosperfluoroalcanosulfnicos
PFSAs
Perfluorobutanosulfonato
Perfluorohexanosulfonato
Perfluorooctanosulfonato
Perfluorodecanosulfonato
PFBS
PFHxS
PFOS
PFDS
CF3(CF2)2COOH
CF3(CF2)4COOH
CF3(CF2)5COOH
CF3(CF2)6COOH
CF3(CF2)7COOH
CF3(CF2)8COOH
CF3(CF2)9COOH
CF3(CF2)10COOH
CF3(CF2)11COOH
CF3(CF2)12COOH
CF3(CF2)13COOH
CF3(CF2)3SO3
CF3(CF2)5SO3
CF3(CF2)7SO3
CF3(CF2)9SO3
3.2.
Extraccindelosanalitos
- 243 -
solublesenagua(C45)ascomoparalosnopolaresdecadenalarga(C1314).Con
el propsito de mejorar las recuperaciones de estos compuestos en las
muestras biolgicas, se desarroll un primer mtodo basado en el uso de
mezclas hidroorgnicas de tetrahidrofurano (THF) y agua, disolventes que
presentan constantes dielctricas (agua = 80; THF = 7,5) y parmetros de
solubilidaddeHildebrand(agua=23,3cal1/2 cm3/2;THF=9,5cal1/2 cm3/2)muy
diferentes.As,alirvariandolacomposicindelamezclaTHF:aguaseobtienen
disolventes con muy diferente poder de solvatacin. El segundo mtodo
desarrollado consisti en una microextraccin lquidolquido de los PFASs en
muestrasdesuerosanguneomedianteelusodeundisolventesupramolecular
constituido por micelas inversas de cido hexanoico dispersas en una fase
continuaagua:THF.Eltratamientodemuestrasesimplificconsiderablemente
en comparacin con la mayora de los mtodos empleados para la
determinacin de PFASs en muestras de suero que usualmente requieren de
varias etapas de extraccin y limpieza de los extractos o procedimientos ms
complicadosdeSPEonline.
3.2.1. Sntesisycaractersticasdelossistemasextractantesempleados
a) Mezclahidroorgnicatetrahidrofurano:agua
- 244 -
Resumenydiscusindelosresultados
LaFigura9ilustraeldiagramadefasesdelcidohexanoico(HA)donde
semuestralaregindecoacervacinquepuedeutilizarseconfinesanalticos.
Por encima de la regin de coacervacin, los SUPRASs se solubilizan en la
disolucin THF:agua, mientras que por debajo encontramos mezclas de
SUPRASsycidohexanoico.Merecelapenacomentarelcasoparticulardelas
disoluciones de cido hexanoico a concentracin 0,5 % (v/v) en mezclas
agua:THF (concentraciones de THF entre 0,54,5% v/v) donde el anfifilo se
solubilizacompletamente,sinembargoalaumentarlaconcentracindeTHFal
5% comienza a formarse el SUPRAS a pesar de la mayor solubilidad del HA en
estemedio.
- 245 -
100
80
%THF(v/v)
Disolucinisotrpica
decidohexanoico
60
40
Disolvente
supramolecular
20
0
0
10
12
%cidohexanoico(v/v)
- 246 -
Resumenydiscusindelosresultados
aumentael%deTHFhastallegaraincorporacincuantitativaapartirdel30%
(v/v)deTHF.
y=0,69HA+0,0761HATHF+e0,1047THF
ElvalordeyvieneexpresadoenLylosvaloresdeHAyTHFenmgy%
(v/v) respectivamente. Porcentajes de HA por debajo del 3% no cumplen esta
ecuacin, ya que la incorporacin del HA en el SUPRAS en funcin del THF
presenta un comportamiento opuesto al observado en las disoluciones con
concentracionesapartirdel3%.LosporcentajesdeTHFquepuedeaplicarseen
esta ecuacin van desde 1% hasta valores cercanos al lmite superior del
diagramadefases.Elcoeficientededeterminacinfue99,126%locualindica
unabuenacapacidaddeprediccindeestaecuacin.
3.2.2. Extraccinypreconcentracin
a)Muestrasbiolgicasslidas
LaextraccindePFASsenlasmuestrasbiolgicasslidassellevacabo
mediantelaadicindirectade600LdeTHFy60Ldeaguaa0,2gdemuestra
en un tubo de microcentrifuga que se coloca en un agitador tipo vortex
durante 7 minutos a mxima potencia (aproximadamente 2.500 rpm). Para
favorecerelcontactoyladisgregacindeloscomponentes,seaaden4esferas
de vidrio de 3 mm de dimetro. Tras agitar la muestra y extraer las PFASs, el
microtuboseultracentrifugaa15.000rpmdurante13minutosparasepararel
- 247 -
- 248 -
Resumenydiscusindelosresultados
2
Total
= d2 + p2 + h2
Disolvente
Parmetros
deHildebrand
(cal1/2cm3/2)
t
Parmetrosde
Hansen
(cal1/2cm3/2)
d
p
h
Parmetros
fraccionales
Agua
THF
Metanol
Acetonitrilo
23,3
9,5
14,5
12
7,6
8,2
7,4
7,5
7,8
2,8
6,0
8,8
20,6
3,9
10,9
3,0
21
55
30
39
22
19
25
46
57
26
45
15
100fd
100fp
100fh
SegnlosvaloresdelosparmetrosdeHansen,enelaguapredominan
lasinteraccionesdepuentesdehidrgenomientrasqueenelTHFpredominan
las fuerzas de dispersin, por lo tanto pueden obtenerse disolventes con
diferentescapacidadesdesolvatacinsimplementevariandolacomposicinde
la mezcla THF:agua. Esta informacin puede representarse de modo grfico
mediante el tringulo de Teas. Para ello es necesario convertir los parmetros
de Hansen en parmetros de Teas (tambin conocidos como parmetros
fraccionales) calculando la cantidad relativa que aporta cada parmetro de
Hansenaltotal(Tabla10).EnlaFigura10semuestraunagrficadeTeasenla
que se ilustran los parmetros de Hildebrand (T) y los fraccionales (fh, fd, fp)
paralosdisolventespurosaguayTHFyunamezcladeambos.
- 249 -
T=23.3
T=13
T =9.5
100:0
85:15
75:25
70:30
55:45
40:60
15:85
0:100
PFBS
PFHxA
PFHxS
9.5
0
0
135
11.6 1007 726 1033
13.0 1051 942 1031
13.6 1031 928
983
15.7 941 1012 984
17.8 794
811
805
21.2 371
361
131
23.3 332
303
131
PFOA
206
897
971
959
976
932
121
101
PFOS
PFDA
256 287
1007 855
1041 1041
1064 927
716 779
718 543
101 101
71
151
PFUnDA PFTeDA
283
816
1051
1041
688
403
61
21
291
706
1061
1055
6811
328
22
21
Muestra:Melvaliofilizada0,2g(pesohmedo)yfortificada(40ngg1pesohmedo)
Volumendedisolvente:600L.
- 250 -
Resumenydiscusindelosresultados
LaextraccindePFASsenaguaoTHFesmuybajadebidoalinadecuado
equilibrioenestosdisolventesentrefuerzaspolaresynopolares.Laeficiencia
de extraccin aument considerablemente al emplear mezclas de agua:THF,
siendocuantitativaaporcentajesdeaguaentre1530%paralosPFSAsyentre
2030% para los PFCAs. Al ser el agua un disolvente prtico es capaz de
proporcionar interacciones indipolo con los grupos polares de los PFSAs y
puentesdehidrgenoconlosgrupospolaresdelosPFCAsylosPFSAs.Segnlos
datos de las recuperaciones, disoluciones con valores de Hildebrand
comprendidos entre 1214 y valores de Teas con una relacin entre fuerzas
polares(fh+fp)/nopolares(fd)dealrededorde1,2sernlasidneasparauna
adecuadasolubilizacindelasPFCAs,independientementedesuestructura.La
mezcla 75:25 (v/v) THF:agua se escogi como ptima para la extraccin de las
PFASssiendosurelacinfh/fp =1,7,delocualsededucelaimportanciadelos
puentes de hidrgeno en este disolvente. Este mtodo cumple la
recomendacindelaComisinEuropearelativaalavigilanciadelassustancias
perfluoroalquiladasenlosalimentos(2010/161/UE)dondeseestablecequelos
porcentajesderecuperacindebenestarcomprendidosentreel70%yel120%
[22].
Seseleccioncomoptimounvalorde800Lyaqueseobservsupresinde
la ionizacin de las PFASs en extractos inferiores a 700 L. Tambin se
comprobquelaeficienciadeextraccinenmuestrashmedaseraequivalente
a la obtenida con muestras liofilizadas, por lo que se propone trabajar con
muestrassinliofilizarperoteniendoencuentasucontenidoenagua(7075%)en
larelacinagua:THF(25:75v/v)yenelvolumenfinaldedisolvente.
(3) Influencia de los parmetros operacionales. Los parmetros
operacionalesseoptimizaronconelfindeminimizareltiemporequeridopara
alcanzar el equilibrio de extraccin y asegurar una completa separacin del
extractoobtenidodelamatrizdelamuestra.Elequilibriodedistribucindelas
PFASsentrelasmuestrasyeldisolventeseestablecirpidamente(7min)yel
tiempodecentrifugacinsefijen13minutosa15.000rpm.
b)Muestrasdesuerosanguneo
Durante la extraccin de las PFASs en las muestras de suero sanguneo el
disolvente supramolecular acta como extractante mientras que la disolucin
de equilibrio (THF:agua) incorpora una etapa de limpieza simultnea al
proporcionar un medio donde los compuestos hidroflicos de la matriz son
solubilizados. El mtodo de extraccin propuesto consiste en la adicin en un
microtubo de centrfuga de 18 L de una disolucin de patrones internos
marcadosisotpicamente(ISs)enmetanoldeconcentracin100ngmL1,765L
de suero, 38 L de cido clorhdrico (12 M), 600 L de THF y 97 L de cido
hexanoico para dar lugar a una concentracin final de 6,5 % (v/v) de cido
hexanoico y un 40% (v/v) de THF, condiciones bajo las cuales se forma
espontneamentealrededorde360LdeSUPRAS.LaadicindelosISsdesdeel
principioesfundamentalparacorregircualquierprdidaduranteelprocesode
extraccinyelposibleefectomatriz.Laextraccinrequiereagitacinconvortex
durante 7 minutos a mxima potencia (aproximadamente 2.500 rpm) y
ultracentrifugacin a 15.000 rpm durante 13 minutos. Se aaden 3 bolitas de
vidrio de 3 mm de dimetro para facilitar la homogenizacin de la mezcla
durante la agitacin ya que las protenas del suero sanguneo precipitan
- 252 -
Resumenydiscusindelosresultados
despus de la adicin del cido clorhdrico y el disolvente orgnico. La
extraccin de los PFASs se basa en la formacin de agregados mixtos
analito:cidohexanoicomediantefuerzasdedispersinypuentesdehidrgeno.
La Figura 11 representa esquemticamente las interacciones que se producen
en la formacin de agregados mixtos. Alcuotas del disolvente supramolecular
formadoserecogenysetransfierenavialesdevidrioparaserinyectadasenel
sistemacromatogrfico.LasPFASsanalizadasfueronloscidosperfluorados(C8
C14)ylossulfonatosperfluorados(C6C8).
Agregadosmixtosentre
PFASsycidohexanoico
Puentesdehidrogeno
~360L
Interaccioneshidrofbicas
PFASs
cidohexanoico
observqueelrendimientodeextraccindelasPFASsenlasmuestrasdesuero
dependan de la acidez del medio. La ruptura del enlace de las PFASs con las
- 253 -
(2)
- 254 -
Resumenydiscusindelosresultados
Tabla12.Recuperaciones de las PFASs con sus desviaciones estndar (n=3) en
funcin de la concentracin de tetrahidrofurano y cido hexanoico.
Analitos
%
RDE(%)
(v/v)
a
THF PFHxS
PFOA
PFOS
PFNA PFDA PFUnDA
25 517
677
551
642 645 667
30 612
782
734
742 752 753
35 681
831
811
781 801 811
40 836
833
794
811 832 821
45 791
884
822
842 832 872
50 801
975
925
924 862 922
b
HA
4.3 611
751
781
781 806 816
5.4 753
892
861
824 843 822
6.5 836
833
794
811 832 821
7.5 773
861
861
861 883 883
Muestrasfortificadasa5ngmL1y600molesdeHCl/mldesuero.
a
6.5%(v/v)decidohexanoico.
b
40%(v/v)deTHF.
PFTeDA
712
772
811
832
854
945
876
821
832
864
3.3.
Cuantificacin
La cuantificacin de las PFASs se realiz empleando cromatografa
- 255 -
Debidoalosproblemascausadosporefectoespaciocargaenelanlisis
de extractos de muestras que no se han sometido a una severa etapa de
limpieza cuando se trabaja en modo single ion monitoring o barrido y a la
imposibilidad de determinar las PFSAs en MRM por la ausencia de iones
producto adecuados, se investig la posibilidad de cuantificar las PFASs
trabajando en modo aislamiento de iones. El modo aislamiento de iones
[24] U. Berger, I. Langlois, M. Oehme, R. Kallenborn, Eur. J. Mass Spectrom. 10 (2004)
10.
[25] A. Holm, S.R. Wilson, P. Molander, E. Lundanes, T. Greibrokk, J. Sep. Sci. 27
(2004) 1071.
[26] C. Tseng, L. Liu, C. Chen, W. Ding, J. Chromatogr. A 1105 (2006) 119.
- 256 -
Resumenydiscusindelosresultados
consiste en trabajar en MRM sin llegar a fragmentar los iones precursores
despus de su aislamiento en la trampa. A continuacin se comentan las
caractersticas analticas de los dos mtodos desarrollados; en el primero las
PFASssedeterminaroncontrampainicaenmodoaislamientoyenelsegundo
contriplecuadrupolo.
3.3.1. Sensibilidad
considerablementemejorgraciasasufuentedeionesTurboVqueconsigue
unaexcelentedesolvatacindelflujoprovenientedelcromatgrafoeintroduce
un mayor nmero de iones en el analizador. Adems, presenta la ventaja de
trabajar en modo Scheduled MRM que programa al instrumento para
monitorizarcadainsloduranteunapequeaventanadetiempoalolargodel
cromatogramaenfuncindeltiempoderetencinesperadoparacadaanalito.
El dwell time se ajusta automticamente para cada transicin y mejora la
sensibilidad.Loslmitesdedeteccininstrumentalesenpatronesbajarona0,2
0,3pgparalosPFSAsy0,030,2pgparalosPFCAs.
Adicionalmentesefortificaronmuestrasconelpatrninterno13C8PFOA
y se calcul su recuperacin mediante calibracin externa. Las recuperaciones
estuvieron comprendidas entre el 9699% demostrando la ausencia de efecto
- 258 -
Resumenydiscusindelosresultados
matriz y la exactitud conseguida con el mtodo mediante calibracin con
patronesendisolventehidroorgnico(25:75agua:THF).Puededecirseportanto
queloscomponentesdelamatrizdeestetipodemuestrasnointerfierenenla
determinacin de las PFASs en las condiciones de trabajo propuestas en esta
metodologa.
x105 (a)Patrnde20gL1
1.0
0.8
PFHxS
PFOS
PFBS
0.6
0.4
PFHxA
Intens.
0.2
PFOA
PFDA
PFUnDA
0.0
x105 (b)Muestradefiletedemelvafortificada(80ngg1)
1.0
PFOS
PFHxS
0.8
PFBS
PFTeDA
0.6
0.4
PFHxA
0.2
0.0
0.0
5.0
10.0
15.0
Tiempo(min)
PFOA
20.0
PFDA
PFUnDA
PFTeDA
25.0
Elestudiodelasupresinoincrementodelaionizacinenelsegundo
mtodo desarrollado se llev a cabo comparando la seal de los patrones
internos marcados isotpicamente (ISs) aadidos justo antes de la inyeccin a
losSUPRASobtenidosdemuestrasdesueroconlasealdelosISsobtenidaen
patrones preparados en THF:agua de la misma concentracin (5 ng mL1). Los
- 259 -
componentesdelamatriznointerfirieronsignificativamenteenlasealdelos
ISs,siendolasupresindelaionizacindel12%yelincrementodelamismadel
6% en el peor de los casos, por lo que los lmites de deteccin en muestras
realesnosevieronafectados.Adems,estametodologaempleaISsparacada
analito que corrigen las pequeas variaciones en la seal asegurando una
correcta cuantificacin. Los lmites de cuantificacin del mtodo estuvieron
comprendidos entre 6 y 59 pg mL1. La tabla 13 muestra un resumen de las
caractersticas analticas de los dos mtodos desarrollados para el anlisis de
PFASsenmuestrasbiolgicas.
Analitos
Intervalodelinealidad
(ngmL1)
Coeficientedecorrelacin
(r)
LOQdelmtodo
IT
(ngg1)
2
QqQ
(pgmL1)
0,9983
0,9990
0,9997
59
0,0130
0,9999
0,9998
12
0,5250
0,0530
0,9981
0,9995
29
PFNA
0,0130
0,9996
PFDA
4250
0,0530
0,9993
0,9997
16
29
PFUnDA
3250
0,0530
0,9982
0,9991
12
29
PFTeDA
1,5250
0,0530
0,9993
0,9994
29
IT
QqQ
IT
QqQ
0,5250
0,9990
PFHxA
1250
PFHxS
1250
0,130
PFOA
3250
PFOS
PFBS
3.3.2. Selectividad
- 260 -
Resumenydiscusindelosresultados
biliares (ismeros del cido taurodeoxiclico) que coeluyen con el PFHxS y el
PFOSrespectivamentecuandoseusanfasesestacionariasC18.Poseenm/zmuy
parecidas a las de los analitos e incluso comparten los iones producto ms
intensoscomnmenteempleadosparacuantificarlossulfonatosentandemMS
(i.e. 499>99 para PFOS y 399>99, 399>80 para PFHxS), lo cual ha llevado en
numerosas ocasiones a una sobreestimacin de las concentraciones de los
PFSAs en muestras biolgicas. Actualmente este problema puede resolverse
usando columnas analticas con mecanismos de retencin ms especficos que
separan estas interferencias de los analitos de inters (por ejemplo, columnas
perfluoradas, de intercambio inico o tipo Synergi hydroRP) o empleando las
transicionesmsselectivasaunquemenossensibles499>99y399>119cuando
sedeterminanportandemMS/MSconQqQ[2729].28La29estrategiaempleada
paraevitarunaidentificacinincorrectadelPFHxSyPFOSdurantelosanlisisde
PFASsenlasmuestrasdesuerosanguneofueemplearlastransiciones399>119
y 499>99 ya que la columna analtica empleada fue una C18. Las muestras de
sueroanimalanalizadasnopresentaroninterferenciasprocedentesdesulfatos
esteroides aunque s se detectaron sales biliares en el suero de oveja y de
caballoalmonitorizarlatransicin499>80.Lastresmuestrasdesuerohumano
analizadaspresentaroninterferenciascoeluyendoconelPFHxSyelPFOSenlos
cromatogramas obtenidos en las transiciones 399>80, 399>99 y 499>80,
demostrandolaimportanciadecuantificarempleandolastransiciones399>119
y499>99paraobtenerselectividad.
- 261 -
[30] K.A. Cox, C.D. Cleven, R.G. Cooks, Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 144
(1995) 47.
[31] N.A. Yates, M.M. Booth, J.L. Stephenson, R.A. Yost, en: Practical Aspects of Ion
Trap Mass Spectrometry, vol. III, p. 121, CRC Press, London, 1995.
- 262 -
Resumenydiscusindelosresultados
(a)Modobarrido
(patrn)
(b)Modobarrido
(extractodemuestra)
PFOS
PFOS
(c)Modoaislamientodeiones
(extractodemuestra)
PFOS
Figura 13. Espectros de masa obtenidos con trampa de iones de (a) una
disolucin de PFOS de 20 g L-1 trabajando en modo barrido, (b) un extracto
de muestra de hgado de melva fortificada a 80 ng g-1 trabajando en modo
barrido y (c) un extracto de muestra de hgado de melva fortificada a 80 ng g-1
trabajando en modo aislamiento de iones.
3.3.3. Controldelacontaminacin
Elproblemadelacontaminacindefondoprovenientedelmaterialde
laboratorioydeloscomponentesdelLCMSfabricadosconfluoropolmeros[29]
se monitoriz constantemente durante el desarrollo de las metodologas, ya
que puede conducir a cuantificacin inexacta de las PFASs. Una de las fuentes
decontaminacinidentificadasfueronlosseptadeTeflon/gomadelostapones
delosviales,porloquestossesustituyeronporseptadealuminio/siliconatras
lo cual la seal de fondo observada para el PFHxS y el PFOA en inyecciones
- 263 -
3.3.4. Veracidad
LaveracidaddelmtododesarrolladoparaanlisisdePFASsenbiota,se
evalumedianteelanlisisdelmaterialdereferencia(MR)empleadoenel2
estudiointerlaboratoriointernacionalcuyocontenidoenPFASsseespecificaen
laTabla14.LosextractosseanalizaronconITenmodoaislamientodeionesy
conQqQenmodoMRMempleandolassiguientestransiciones;PFBS,299>80;
PFHxA, 313>269; PFHxS, 399>80; PFOA, 413>369; PFOS, 499>80; PFNA,
463>419; PFDA, 513>469; PFUnDA, 563>519; PFDoDA, 613>569 y PFOSA,
498>78.LaseparacincromatogrficadelosanlisisrealizadosenQqQsellev
a cabo con una columna FluoroSep para evitar problemas de interferencias ya
que como se coment en el apartado 3.3.2. las transiciones escogidas en este
casoparacuantificarlosPFSAssonlasmsintensasperonolasmsselectivas.
Losresultadosobtenidos,expresadoscomovalormedio(n=3),semuestranen
la Tabla 14. La veracidad expresada como porcentaje [(concentracin
detectada/concentracinaseguradaporelMR)x100)estuvoenelintervalo80
130%paratodoslasPFASsdemostrandolabuenaconcordanciaconlosvalores
delMRindependientementedeltipodeMSempleadoparasucuantificacin.
AlnodisponersedeMRparalasPFASsensuerosanguneo,laveracidad
delsegundomtododesarrolladoseevalumedianteelanlisisdemuestrasde
- 264 -
Resumenydiscusindelosresultados
Tabla 14. Resultados obtenidos del anlisis del MR del 2 estudio
interlaboratorio internacional sobre PFASs mediante el mtodo desarrollado
empleando IT y QqQ para su cuantificacin.
Analitos
Concentracinenel
MR(ngg1)
PFBS
PFHxA
PFHxS
PFOA
PFOS
PFNA
PFDA
PFUnDA
PFDoDA
PFTeDA
PFOSA
n.d.,nodetectado
n.a.,noanalizado
22.6
145
17.2
21.9
17.8
20.1
3.2
ConcentracinDE
(ngg1)
Trampainicaen
Triplecuadrupolo
modoaislamiento
enMRM
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
212
18.00.8
1948
17712
n.a.
17.71.5
25.30.1
21.30.9
201
17.51.3
n.a.
23.00.8
n.d.
n.a.
n.a.
3.10.4
suerodeternerafortificadasconlosanalitos(5ngmL1).Debidoalaausenciade
muestrasblancoparatodoslosanalitoselporcentajederecuperacinsecalcul
como100*(x2 x1)/xfortificado;siendox1 elvalormedido enblancoyx2 elvalor
medidoenlaporcinenriquecida.Lasrecuperacionesobtenidasvariaronentre
el 79 y el 83%, considerndose valores aceptables. Estas pequeas prdidas
ocurridasduranteelprocesodeextraccinsecorrigierongraciasalempleode
patrones internos (ISs) en las muestras, obtenindose valores de recuperacin
entre95107%yasegurndoseportantounacuantificacinexactayprecisa.
3.3.5. Precisin
3.3.6. Anlisisdemuestras
- 266 -
n.d
Hgadodemelva
- 267 -
n.d.
2,90,6
n.d.
<LOQ
n.d.
n.d.
<LOQ
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
Suerobovino
Sueroequino
Suerohumano1
Suerohumano2
Suerohumano3
n.a.;noanalizado
n.d.;nodetectado
n.a.
n.a.
n.d.
n.d.
79441
67866
746116
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
<LOQ
<LOQ
<LOQ
n.d.
PFHxS
PFHxA
Suerovacuno
Msculodealcatraz
Msculodegaviota
Filetedecaballa
Hgadodepalometa
n.d.
8,90,3
n.d.
3,20,6
n.d.
n.d.
Filetedemelva
Filetedepalometa
PFBS
Muestras
1.21920
1.24247
1.73535
352
171
14,30,7
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
PFOA
4.67010
4.597171
5.16863
<LOQ
1562
197,30,6
<LOQ
<LOQ
<LOQ
9,50,5
13,10,2
<LOQ
<LOQ
PFOS
56717
56533
90833
452
521
233
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
PFNA
2585
2615
37632
<LOQ
5606
54823
6243
715
724
693
<LOQ
374
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
PFUnDA
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
PFDA
844
865
993
<LOQ
10813
7010
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
<LOQ
n.d.
n.d.
PFTeDA
Tabla 15. Concentraciones medias de PFASs encontradas en las muestras biolgicas analizadas
Resumenydiscusindelosresultados
PFOA
4_
Intensidad
2.5e
320
4_
2.0e
1.5e4_
1.0e4_
5000.0
0
0
PFHxS
PFTeDA
160
PFNA
0
50
40
30
Envioadesecho
5
10
15
20
PFHxS
30
25
Tiempo(min)
PFDA
PFOS PFUnDA
PFTeDA
35
40
45 50
- 268 -
CONCLUSIONES
Conclusiones
LasinvestigacionesqueserecogenenlaMemoriadeestaTesisDoctoral
handemostradolacapacidadquepresentanlossistemassupramolecularespara
integrarysimplificarlasetapasdelprocesoanalticoenelanlisisdemuestras
acuosas y biolgicas. Esto ha permitido desarrollar mtodos que extraen,
preconcentranyestabilizancontaminantesorgnicosenunasolaetapagracias
alempleodediferentesagregadossupramoleculares.Adems,sehanpuestoa
punto dos nuevas metodologas para la determinacin de sustancias
perfluoroalquiladas y se ha mejorado su cuantificacin cuando se emplea
espectrometra de masas con trampa inica. A continuacin se resumen las
principalesconclusionesobtenidasencadaunadelasPartesdeestaMemoria.
OPERACIONES
PREVIAS
EN
LA
DETERMINACIN
DE
CONTAMINANTESENMUESTRASACUOSAS.
1)
2)
Graneficaciadeextraccingraciasalaaltacapacidaddesolubilizacinya
los diferentes tipos de interacciones que proporcionan los sistemas
supramoleculares; fuerzas dispersivas, interacciones inicas, puentes de
- 271 -
hidrgenoeinteracciones catinparalaextraccindelos compuestos
orgnicos.
3)
4)
Enelcasodelasextraccionescondisolventessupramoleculares,lafaseen
equilibrio obtenida despus de la formacin del SUPRAS constituye un
medio donde se retienen las interferencias ms polares actuando como
etapadelimpiezasimultneaalaextraccin.
5)
Grancapacidaddeestabilizacindeloscontaminantes.Unavezretenidos
los analitos, el microambiente proporcionado por los agregados
supramoleculareslesconfiereestabilidadyevitasudegradacin.Adems,
el pequeo volumen de los formatos empleados; cartuchos de SPE y
pequeosvialesparalosSUPRASs,facilitasutransporte,almacenamiento
yrefrigeracinsifueranecesaria.
- 272 -
Conclusiones
de autoasociacin. Es la primera vez que se propone un disolvente con una
cadenahidrocarbonadatancortayelestudiorealizadohademostradoquesu
comportamiento es diferente en algunos aspectos a los disolventes
supramoleculares sintetizados a partir de cadenas hidrocarbonadas de mayor
longitud. As, debido a la gran solubilidad en agua de cido hexanoico, se
requieren porcentajes de ste y THF de al menos 4% y 30% (v/v),
respectivamente,paralacompletaincorporacindeltensioactivoenelSUPRAS,
lo cual es clave para conseguir rendimientos cuantitativos de extraccin. El
mecanismo de extraccin se basa en la formacin de agregados mixtos
HA:PFASsdadaslassimilitudesestructuralesentrelosanalitosyelextractante.
Porotrolado,laconcentracindeHAenelSUPRASeselevada(0,25mg/L),lo
cual posibilita llevar a cabo microextracciones lquidolquido con pequeos
volmenesdeSUPRASdebidoalelevadonmerodecentrosactivospresentes.
ElvolumendeSUPRAS generadopuedepredecirseyesfuncin delacantidad
deHAyporcentajedeTHFpresentesenlamezcladeproduccindeldisolvente.
- 273 -
1)
2)
Lasimplicidaddetratamientodelamuestra.Lasextraccionessellevana
cabo en una nica etapa. No se requiere precipitacin adicional de las
protenas ni etapas de limpieza y la presencia de efecto matriz es
despreciable.
3)
Laelevadafrecuenciademuestreo.Laextraccindelosanalitosserealiza
en 20 minutos y dada la simplicidad de los procedimientos analticos
utilizadosesposibletratarvariasmuestrassimultneamente.
4)
Elbajovolumendedisolventeorgnicoempleadoenlasextracciones(0,6
mL de THF por muestra) en comparacin con otras metodologas
comnmenteutilizadas.
5)
- 274 -
APNDICES
Apndices
1.
Stabilityofbenzalkoniumsurfactantsonhemimicellebasedsolidphase
extractioncartridges.
Noelia Luque, Francisco Merino, Soledad Rubio, Dolores PrezBendito.
JournalofChromatographyA,1094(2005)1723.
(Factor de Impacto 2011: 4.531; Posicin: Primer decil)
2.
3.
4.
5.
Extractionandstabilityofpesticidemultiresiduesfromnaturalwateron
amixedmodeadmicellarsorbent
NoeliaLuque,SoledadRubio.
- 277 -
JournalofChromatographyA,DOI:10.1016/j.chroma.2012.06.006
(Factor de Impacto 2011: 4.531; Posicin: Primer decil)
- 278 -
Apndices
APNDICESB.COMUNICACIONESACONGRESOS
1.
2.
3.
Extraccinyestabilizacindeplaguicidasmediantesorbentesadmicelares
mixtos.
Pster
NoeliaLuque,SoledadRubio,DoloresPrezBendito.
GRASEQA 2008; XI Reunin del Grupo Regional Andaluz de la Sociedad
EspaoladeQumicaAnaltica,Huelva,Espaa(2008).
4.
5.
Analysisofperfluoroalkylcompoundsinbiotabysolventmicroextraction
and liquid chromatography/ion isolationbased ion trap mass
spectrometry.
- 279 -
Pster
Noelia Luque, Ana BallesterosGmez, Stefan van Leeuwen y Soledad
Rubio.
4thInternationalSymposiumonRECENTADVANCESINFOODANALYSIS,
Praga,RepblicaCheca(2009).
6.
7.
8.
9.
- 280 -
Apndices
MaribelCasas,NoeliaLuque,AnaBallesterosGmez,MarietaFernndez,
MonicaGuxens,HolgerKoch,MichelleMndez,SoledadRubioyMartine
Vrijheid.
Child Health and Environment. INMA projectEnvironment and
Childhood.ConfernciesCientfiques.Barcelona,Espaa(2011).
- 281 -