La espectrometra ultravioleta-visible o espectrofotometra UV-Vis implica la espectroscopia de fotones en la

regin de radiacin ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV)
cercano
y
el
infrarrojo
(IR)
cercano.
En esta regin del espectro electromagntico, las molculas se someten a transiciones electrnicas. Esta
tcnica es complementaria de la espectrometra de fluorescencia, que trata con transiciones desde el estado
excitado al estado basal, mientras que la espectrometra de absorcin mide transiciones desde el estado basal
al estado excitado. La espectroscopa UV-Vis est basada en el proceso de absorcin de la radiacin
ultravioleta-visible (radiacin con longitud de onda comprendida entre los 160 y 780 nm) por una molcula. La
absorcin de esta radiacin causa la promocin de
un electrn
a un estado excitado. Los electrones que se excitan
al absorber
radiacin de esta frecuencia son los electrones de
enlace de
las molculas, por lo que los picos de absorcin se pueden correlacionar con los distintos tipos de enlace
presentes en el compuesto. Debido a ello, la espectroscopa UV-Vis se utiliza para la identificacin de los
grupos funcionales presentes en una molcula. Las bandas que aparecen en un espectro UV-Vis son anchas
debido a la superposicin de transiciones vibracionales y electrnicas. La espectroscopa NIR esta basada en
la absorcin de la radiacin a longitudes de onda entre 800 y 2700nm. En esta zona del espectro
electromagntico el proceso de absorcin es debido a presencia de sobretonos y bandas de combinacin
originados por transiciones vibracionales intensas que se producen a longitudes de onda mayores. Los
espectros NIR estn dominados por la presencia de bandas anchas de baja intensidad lo que restringe su uso
a muestras slidas y lquidas. Se usa principalmente en anlisis medioambiental, farmacutico y de alimentos,
as como en la industria de polmeros y plsticos.
Aplicaciones

Determinacin de grupos funcionales en molculas orgnicas

Anlisis de muestras bioqumicas

Determinacin de metales en compuestos de coordinacin

Anlisis de semiconductores

Medidas de color

Determinacin cuantitativa

Seguimiento de la cintica de procesos qumicos y bioqumicos

Equipamiento

Espectrmetro UV-Vis/NIR Jasco V-670, de doble haz, que cubre el rango de longitudes de onda de
190 a 2700 nm. El equipo dispone de un monocromador nico con doble red, una para la regin UV-Vis (1200 surcos/mm) y
otra para la regin NIR (300 surcos/mm). Los detectores son un tubo fotomultiplicador para la regin UV-Vis y un detector de
PbS para la regin NIR. El cambio, tanto de los detectores como de las redes, se efecta de forma automtica a una
longitud de onda fijada por el usuario entre 750 y 900 nm. Las fuentes utilizadas son una lmpara de deuterio (190 a 350
nm) y una lmpara halgena (330 a 2700 nm).
Requisitos de las muestras

Las muestras deben entregarse adecuadamente etiquetadas, envasadas y acondicionadas para

asegurar su identificacin, integridad y conservacin durante el transporte y garantizar la seguridad del personal que lo
realiza.

El equipo dispone de una esfera integradora, por lo que se pueden analizar muestras tanto lquidas
como slidas o en suspensin.

El volumen mnimo de lquido a analizar es de 3 ml. Las muestras slidas deben ser placas con
dimensiones comprendidas entre 20 (altura) x 20 (anchura) x 0.5 (grosor) mm y 65 (altura) x 50 (anchura) x 25 (grosor) mm.
Las muestras slidas en polvo deben estar molidas y no ser abrasivas.

Para el anlisis en el rango NIR de muestras en disolucin evitar usar agua y alcohol como disolventes.

La muestra deber presentarse en disolucin siendo la concentracin la adecuada para el anlisis. Si

no se cumple este requisito, la unidad podr actuar sobre la muestra (preparando la disolucin y/o obteniendo la
concentracin adecuada de analito) en cuyo caso, previa aceptacin del usuario, se proceder a facturar un importe en
concepto de preparacin de la muestra.

La disolucin del analito debe ser estable en las condiciones de almacenamiento y anlisis.
Los disolventes y los tampones utilizados no deben interferir en la zona de medida del analito (ver
documentacin de la unidad)

APLICACIONES
La espectrometra UV/Vis se utiliza habitualmente en la determinacin cuantitativa de soluciones de iones metlicos de
transicin
y
compuestos
orgnicos
muy
conjugados.
Soluciones

de

iones

metlicos

de

transicin

Las soluciones de iones metlicos de transicin pueden ser coloreadas (es decir, absorben la luz visible) debido a que los
electrones en los tomos de metal se pueden excitar desde un estado electrnico a otro. El color de las soluciones de iones
metlicos se ve muy afectado por la presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Por ejemplo, el color de
una solucin diluida de sulfato de cobre es muy azul; agregando amonaco se intensifica el color y cambia la longitud de
onda
de
absorcin
mxima.
Compuestos

orgnicos

Los compuestos orgnicos, especialmente aquellos con un alto grado de conjugacin, tambin absorben luz en las regiones
del espectro electromagntico visible o ultravioleta. Los disolventes para estas determinaciones son a menudo el agua para
los compuestos solubles en agua, o el etanol para compuestos orgnicos solubles. Los disolventes orgnicos pueden tener
una significativa absorcin de UV, por lo que no todos los disolventes son adecuados para su uso en espectrometra UV. El
etanol absorbe muy dbilmente en la mayora de longitudes de onda. La polaridad y el pH del disolvente pueden afectar la
absorcin del espectro de un compuesto orgnico. La tirosina, por ejemplo, aumenta su mximo de absorcin y su
coeficiente de extincin molar cuando aumenta el pH de 6 a 13, o cuando disminuye la polaridad de los disolventes.
Aunque los complejos de transferencia de carga tambin dan lugar a colores, stos son a menudo demasiado intensos para
ser
usados
en
mediciones
cuantitativas.
La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una solucin es directamente proporcional a la concentracin de la
solucin. Por tanto, la espectrometra UV/VIS puede usarse para determinar la concentracin de una solucin. Es necesario
saber con qu rapidez cambia la absorbancia con la concentracin. Esto puede ser obtenido a partir de referencias (las
tablas de coeficientes de extincin molar) o, con ms exactitud, determinndolo a partir de una curva de calibracin.
El espectrofotmetro UV/Vis puede utilizarse como detector para la Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR). La

presencia de un analito da una respuesta que puede ser proporcional a la concentracin. Para resultados precisos, la
respuesta del instrumento al analito debe compararse con la respuesta a un estndar, lo que es muy similar al uso de
curvas de calibracin. La respuesta (por ejemplo, el pico de altura) para un concentracin particular se conoce como factor
de
respuesta.
LEY DE BEER-LAMBERT
La espectrometra UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para determinar las concentraciones de
especies
absorbentes
en
solucin,
usando
la
Ley
de
Beer-Lambert:
donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz incidente a una determinada longitud de onda, I es la
intensidad de transmisin, L la longitud de ruta a travs de la muestra, y c la concentracin de las especies absorbentes.
Para cada especie y longitud de onda, es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extincin. Esta
constante es una propiedad fundamental molecular en un solvente dado, a una temperatura y presin particular, y tiene
como
unidades 1/M
*
cm o,
a
menudo, U/M
*
cm.
La absorbancia y extincin a veces son definidas en trminos de logaritmo natural en lugar de logaritmo de base 10.
La ley de Beer-Lambert es til para la caracterizacin de muchos compuestos, pero no sirve como relacin universal para la
concentracin y absorcin de todas las sustancias. En molculas complejas de gran tamao, como los tintes orgnicos
(Xylenol Naranja o Rojo Neutro, por ejemplo), a veces se encuentra una relacin polinmica de segundo orden entre la
absorcin
y
la
concentracin.
ESPECTROFOTMETRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE
El instrumento utilizado en la espectrometra ultravioleta-visible se llama espectrofotmetro UV-Vis. Mide la intensidad de luz
que pasa a travs de una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a travs de la muestra (Io). La
relacin I / Io se llama transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T). La absorbancia (A) se basa en
la
transmisin:
A

log

(%T)

Las partes bsicas de un espectrofotmetro son una fuente de luz (a menudo una bombilla incandescente para las
longitudes de onda visibles, o una lmpara de arco de deuterio en el ultravioleta), un soporte para la muestra, una rejilla de
difraccin o monocromador para separar las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. El detector suele ser un
fotodiodo o un CCD. Los fotodiodos se usan con monochomadores, que filtran la luz de modo que una sola longitud de onda
alcanza el detector. Las rejillas de difraccin se utilizan con CCDs, que recogen la luz de diferentes longitudes de onda en
pxeles.
Un espectrofotmetro puede ser nico o de doble haz. En un instrumento de un solo haz (como el Spectronic 20), toda la luz
pasa a travs de la clula muestra. La Io debe medirse retirando la muestra. Este fue el primer diseo, y todava est en uso
en
la
enseanza
y
laboratorios
industriales.
En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un haz se utiliza como
referencia, y el otro haz de luz pasa a travs de la muestra. Algunos instrumentos de doble haz tienen dos detectores
(fotodiodos), y el haz de referencia y el de la muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces
pasan a travs de un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la
del
haz
de
referencia.
Las muestras para espectrofotometra UV-Vis suelen ser lquidas, aunque la absorbancia de los gases e incluso de los
slidos tambin puede medirse. Las muestras suelen ser colocadas en una clula transparente, conocida como cubeta. Las
cubetas suelen ser rectangulares, con una anchura interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud de ruta, L, en
la Ley de Beer-Lambert. Tambin se pueden usar tubos de ensayo como cubetas en algunos instrumentos. Las mejores
cubetas estn hechas con cuarzo de alta calidad, aunque son comunes las de vidrio o plstico. El cristal y la mayora de los
plsticos
absorben
en
el
UV, lo
que
limita
su
utilidad
para
longitudes
de
onda
visibles.
ESPECTRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE

Un espectro ultravioleta-visible es esencialmente un grfico de absorbancia de luz frente a una longitud de onda en el rango
del ultravioleta o la luz visible. Este espectro puede ser producido directamente con los espectrofotmetros ms
sofisticados, o bien pueden registrarse los datos de una sola longitud de onda con los instrumentos ms simples. La longitud
de onda se representa con el smbolo . Del mismo modo, para una determinada sustancia, puede hacerse un grfico
estndar del coeficiente de extincin () frente a la longitud de onda (). Este grfico estndar sera efectivamente "la
concentracin corregida" y, por tanto, independiente de la concentracin. Para una sustancia determinada, la longitud de
onda en la cual se produce el mximo de absorbancia en el espectro se llama max, y se pronuncia "lambda-max".
Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones empricas que pueden utilizarse para predecir max, la
longitud de onda de la absorcin UV-Vis, para compuestos orgnicos conjugados como dienos y cetonas.
Las longitudes de onda de los picos de absorcin pueden correlacionarse con los tipos de enlace en una determinada
molcula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la molcula. La absorcin UV-Vis no es, sin
embargo, una prueba especfica para ningn compuesto determinado. La naturaleza del disolvente, el pH de la solucin, la
temperatura, la concentracin de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden influir en los espectros de
absorcin de los compuestos, as como las variaciones en la anchura de la hendidura (ancho de banda efectivo) en el
espectrofotmetro.