ACTIVIDAD PRCTICA BCC5

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA
FACULTAD DE MEDICINA

ESTUDIO DE LAS MODIFICACIONES OXIDATIVAS

DE LA LIPOPROTEINA DE BAJA DENSIDAD (LDL):
ANALISIS DE LA OXIDACION DEL COMPONENTE
LIPIDICO Y PROTEICO.

Elaborado por:

Dr. Andrs Trostchansky

Lic. Luca Bonilla
Dra. Madia Trujillo
Dra. Laura Castro
Dr. Homero Rubbo

Marzo de 2012

Introduccin.
Las lipoprotenas de baja densidad (LDL) son partculas esfricas con un
dimetro de 19-23 nm, constituyendo la poblacin de lipoprotenas que poseen
una densidad entre 1,019 y 1,063 g/ml. La hiptesis oxidativa de la
aterosclerosis postula que las placas de ateroma se forman a partir de clulas
(principalmente macrfagos y musculares lisas) cargadas con lpidos (steres
de colesterol), como consecuencia de modificaciones oxidativas de la LDL (LDL
oxidada u ox-LDL). Las LDL son internalizadas en las clulas a travs del
receptor normal de LDL (receptor apoE/apoB) por endocitosis mediada por
receptor. Este es un proceso regulado a la baja que impide la entrada excesiva
de lipoprotenas a las clulas; adems su regulacin est coordinada con la del
metabolismo del coleterol impidiendo la acumulacin nociva de este lpido. A
diferencia de la LDL nativa, la ox-LDL es reconocida por receptores
barrenderos o scavenger a nivel de las clulas endoteliales y musculares
lisas, monocitos y macrfagos por un proceso no regulado. Mientras la LDL es
oxidada, la lipoprotena pierde su habilidad de ser reconocida por el receptor de
la LDL incrementndose a su vez la afinidad por el receptor scavenger. Durante
la oxidacin de la LDL a una forma reconocida por los receptores scavenger,
existe una disminucin de la cantidad de grupos - amino libres de los residuos
de lisina de las LDL lo cual explica el cambio en la especificidad del receptor.
La acumulacin intracelular de lpidos, combinada con la disminucin de la
degradacin de los lpidos oxidados, resulta en la conversin de los
macrfagos en clulas espumosas formndose la estra grasa que constituye
una acumulacin focal de lpidos en la ntima arterial y que representa la lesin
ms precoz del proceso.
Estructura de la LDL.
La LDL humana se define como la poblacin de lipoprotenas que pueden ser
aisladas por ultracentrifugacin en gradiente de densidad, con un rango de
densidad entre 1,019 a 1,063 g/ml.
Caractersticas de las principales lipoprotenas del plasma humano.
Densidad
(g/ml)
Movilidad
Electrofortica
Dimetro
(nm)
Peso molecular
(daltons)
Relacin
Lpido/ Protena
Lpidos ms
Abundantes
Principales
Apoprotenas

Quilomicrones
< 0,95

VLDL
0,95 -1,006

Origen

Pre- beta

> 70

25 - 70

0,4- 30
9
10
99 : 1
TG
Exgenos
A-I, B-48,
C-I,C-II, CIII

IDL
1,006 - 1,019

LDL
1,019 - 1,063

HDL
1,063 - 1,210

Beta

Alfa

22 - 24

19 23

4 - 10

5 - 10
6
10

4-5
6
10

1,8 - 2,8
6
10

1,8 - 3,6
5
10

90 : 10

85 : 15

80 : 20

50 : 50

Entre beta y pre

- beta

TG endge-nos TG endgenos
y Ce
B-100, C-I,
B- 100, E
C-II,C-III,E

CE y FC

Phl y CE

B-100

A-I, A-II

TG: triacilglicridos; CE: steres de colesterol; FC: colesterol libre; Phl: fosfolpidos

Como muestra la tabla, las molculas de LDL son grandes partculas esfricas
con un dimetro de 19 - 23 nm y un peso molecular entre 1,8 y 2,8 millones.
Tomando 2,5 millones como un valor promedio del peso molecular de la
lipoprotena cada partcula contiene alrededor de 1600 molculas de steres de
colesterol y 170 molculas de triglicridos que juntos forman un core central
lipoflico. Este core central se encuentra rodeado por una monocapa formada
principalmente por unas 700 molculas de fosfolpidos (particularmente
fosfatidilcolina) y 600 molculas de colesterol libre. Las cabezas polares de los
fosfolpidos se encuentran en la superficie de la partcula de LDL contribuyendo
a su solubilidad en la fase acuosa. El nmero total de molculas de cidos
grasos unidos a las diferentes clases de lpidos de la LDL es en promedio de
2700. De estos, alrededor del 50 % son cidos grasos poliinsaturados,
principalmente cido linoleico (18:2).
El contenido de cidos grasos y su patrn de distribucin vara
considerablemente de persona en persona probablemente por los distintos
hbitos dietticos. La variacin en el contenido de cidos grasos
poliinsaturados y la relacin saturados/poliinsaturados tiene un efecto
significativo sobre el comportamiento oxidativo de las distintas partculas de
LDL ya que estos cidos grasos son ms susceptibles de oxidacin por
mecanismos no enzimticos.
En la capa externa de la molcula se encuentra la nica protena que forma
parte de la LDL y que recibe el nombre de apolipoprotena B-100 (apo B-100).
La apo B-100 es una protena constituida por 4536 aminocidos y un peso de
512 kDa. De su secuencia aminoacdica se destacan la presencia de
triptofanos, tirosinas y metioninas (37,152 y 78 mol/mol respectivamente) as
como cuatro residuos de cistena libres.
Es importante resaltar la presencia de diversos antioxidantes como
componentes estructurales de la LDL. Entre ellos se destaca el -tocoferol con
una concentracin en nmol/mg de LDL que equivale a aproximadamente seis
molculas de -tocoferol por partcula de LDL. Los dems antioxidantes, como
ser el -tocoferol, -caroteno,- caroteno y ubiquinol-10 se encuentran en
cantidades menores.
Procesos de oxidacin lipdica.
La lipoperoxidacin es el proceso en el cual el oxgeno molecular es
incorporado a molculas de lpidos insaturados (LH) para formar
hidroperxidos lipdicos (LOOH). El proceso de ataque y dao oxidativo que
sufren los lpidos insaturados se debe a reacciones en cadena mediadas por
radicales libres, iniciadas por la abstraccin de un tomo de hidrgeno del
metileno bis- allico del lpido insaturado por un radical libre reactivo y seguido
por una secuencia de reacciones propagadoras.
La lipoperoxidacin procede a travs de tres fases: iniciacin,
propagacin y terminacin. La fase de iniciacin, el primer paso crtico, est
promovida por algn tipo de iniciador que sobrepasa la energa de

disociacin del enlace allico causando la abstraccin del hidrgeno y entonces

la formacin del radical alquilo (L.). La oxidabilidad de un lpido est dada por la
facilidad con la que el tomo de hidrgeno inicial puede ser abstrado. J.P.
Cosgrove et al propusieron una relacin entre la capacidad de los cidos
grasos insaturados (PUFAs) de oxidarse con respecto a la cantidad de dobles
enlaces allicos presentes en la molcula.
Una vez que se form el radical alquilo grupos adyacentes le proveen
estabilizacin por resonancia. Si est presente el oxgeno molecular
reaccionar rpidamente con el radical alquilo para formar en el caso del O2
radical peroxilo (LOO.). El radical peroxilo es un importante intermediario en la
cadena de propagacin porque una vez formado, continuar la cadena de
reacciones oxidativas abstrayendo un tomo de hidrgeno de otros grupos
alquilo cercanos. Este ciclo de reacciones propagadoras se repite a travs de la
abstraccin de hidrgenos y formacin de LOO., siempre que se encuentran
disponibles suficientes molculas de O2 y sustratos lipdicos insaturados. La
duracin del ciclo de reacciones de radicales peroxilo es gobernado por varias
reacciones competidoras de terminacin. En teora, estas incluyen la reaccin
bimolecular de dos radicales alquilo o de dos radicales peroxilo para formar
productos no radicalares. Tambin existen reacciones de tipo radical-radical
entre los radicales lipdicos generados durante la propagacin y otras especies
radicalares
LH

RH

INICIACION

HOO

O2

LOOH

PROPAGACION

OO

LOO

L + L
LOO + LOO
L + LOO
XH + L
XH + LOO

LH

LL
LOOL + O 2
LOOL
X + LH
X + LOOH

TERMINACION

Esquema para las transformaciones qumicas en las tres fases de lipoperoxidacin

generalizado para un lpido diinsaturado.
LH: lpido; L.: radical (centrado en el carbono) lipdico; LOOH: hidroperxido lipdico;
LOO.: radical lipoperoxilo; XH: compuesto antioxidante.

Protocolo experimental.
Objetivos.
Estudiar la oxidacin de la LDL por Cu(II) utilizando diferentes metodologas
experimentales, analizando las modificaciones sufridas por los tres principales
componentes de la lipoprotena: lpidos, apolipoprotena B-100 y antioxidantes.
Purificacin de LDL.
A partir de plasma humano fresco se purifica la fraccin de LDL por
ultracentrifugacin.
1) 24 ml de plasma se mezclan con KBr para llevar la solucin a una densidad
final de 1.3 g/ml. Para ello se agregan 0.28 g de KBr por ml de plasma. Se
obtiene una solucin de una fase agitando suavemente al plasma.
2) En cada tubo de ultracentrifugacin se agregan 1.4 ml de la solucin de
plasma y 2.2 ml de NaCl 0.15 M (isotnico).
Nota: el NaCl se agrega sobre las paredes del tubo para evitar que se mezclen ambas
soluciones y alcanzar eficientemente el gradiente de densidad.

3) Se centrifuga a 80000 rpm por 90 minutos a 4C.

4) Se separa la banda de color naranja que se observa en el tercio superior del
tubo evitando arrastrar fracciones superiores.
5) La LDL se guarda a 4C.
Dosificacin de la concentracin de la LDL.
La dosificacin del contenido proteico de la LDL ser realizado mediante la
reaccin de Biuret de manera espectrofotomtrica.
Materiales:
1) El reactivo de Biuret se prepara mezclando:
- 1.5 g de CuSO4
- 6.0 g de tartrato de Na-K
- 30.0 g de NaOH
- llevar a 1 L con agua destilada
2) Solucin estndar de protenas (por ej. BSA) de 10 mg/mL
3) Buffer fosfato 50 mM, pH 7,4
Metodologa:
A partir de la solucin de concentracin proteica conocida, se realiza una curva
de calibracin en el rango de 1 mg/mL a 10 mg/mL de la siguiente forma:

Vol. Solucin estndar (mL) Vol. Buffer fosfato (mL) Conc. de protenas (mg/mL)

1.0
0.6
0.5
0.4
0.2
0.1

0
0.4
0.5
0.6
0.8
0.9

10.0
6.0
5.0
4.0
2.0
1.0

Determinacin de la concentracin por espectrofotometra:

Preparar una gradilla con 23 tubos correspondientes a: 18 tubos (tres por cada
concentracin) para la curva de calibracin, 1 tubo para el blanco de reaccin
(con buffer fosfato), 4 tubos para la mezcla problema (dos diluciones diferentes
por duplicado).
Para el desarrollo de color del mtodo de Biuret, colocar en cada tubo:
Vol. Solucin proteica (mL) Vol. Reactivo de Biuret (mL)

0.2

0.8

Homogenizar y dejar reaccionar por 20 minutos a temperatura ambiente, para

permitir el desarrollo de color. Luego se mide absorbancia de cada mezcla de
reaccin a 540 nm.
En el caso de la muestra problema de LDL, se determina la concentracin de
las diluciones 1/2 y 1/3 de la solucin obtenida por ultracentrifugacin.
Oxidacin de la LDL.
La oxidacin de la LDL se llevar a cabo a 25C en presencia de Cu(II) de
acuerdo a Batthyny C. et al (Arch. Biochem. Biophys., 2000). Los procesos de
oxidacin lipdica en la LDL sern analizados por consumo de oxgeno y
espectrofotometra (consumo de antioxidantes) mientras que las modificaciones
en la apoliporotena B-100 sern analizadas por electroforesis.
Oxidacin lipdica-Consumo de oxgeno.
El consumo de oxgeno se realiza en una cmara de 4 ml de volumen final a
agitacin constante.
CALIBRACION: el aparato se calibra al 100% de oxgeno mediante el burbujeo
con pipeta pasteur durante algunos minutos para saturar con aire la cmara
que contiene agua solamente. Posteriormente esperar a que se estabilice la
medida y llevar a 100% con la perilla de CAL. El 100% depende de la
temperatura:

Temperatura (C)
5
10
15
20
25
28
30
35
37

O2 nmoles/ml
397
351
314
284
258
244
237
222
217

Una vez calibrado se puede empezar a trabajar.

OBSERVACIONES: no olvidar lavar despus de cada medida y cambiar la membrana
cuando se va a trabajar con material diferente al utilizado en la ltima corrida.
No olvidar dejar con agua la cmara una vez que se termina de trabajar.

Para la oxidacin de la LDL:

1) Se incuba, en un volumen final de 4 ml, la LDL (0.1 mg/ml, concentracin
final) en buffer fosfato 50 mM, pH 7.4 con CuSO4 en una relacin LDL/Cu(II) de
1:75.
2) Se registra el consumo de oxgeno por 100 minutos, detectando las fases de
latencia, propagacin y terminacin.
Consumo de antioxidantes endgenos de la LDL: oxidacin de carotenoides.
1) Determinacin de la longitud de onda de trabajo. Realizar el espectro de
absorcin de la LDL. Para ello incubar LDL (2 mg/ml, concentracin final) en
una cubeta de espectrofotmetro y realizar medidas de absorbancia cada 5
nm entre 380 nm y 550 nm. La longitud de onda de trabajo se corresponde
con aquella donde la solucin presenta mayor absorbancia.
2) Se incuba la LDL (2 mg/ml, concentracin final) en una cubeta de
espectrofotmetro (volumen 1 ml), con CuSO4 en una relacin LDL/Cu(II) de
1:75.
3) Se realizan medidas de absorbancia cada 3 minutos, durante 60 minutos, a
la longitud de onda seleccionada en 1.
Oxidacin de la LDL- Electroforesis en agarosa.
Materiales y mtodos.
a) Gel de agarosa al 0,5% en buffer de corrida (Tris-Glicina 1x pH=8,3),
aproximadamente 60 ml 0,4 gr de agarosa
b) Buffer de muestra 5x : 0,58 ml de glicerol + 0,42 ml de H2O + 1 ml de buffer
corrida 10x
c) Buffer corrida: Tris-Glicina 1x pH=8,3, aproximadamente 500 ml. Se prepara
por dilucin de un stock 10x: 114,2 gr glicina + 30,3 gr Tris, disolver en 800
ml de H2O, ajustar pH a 8,3 y llevar a 1 litro.

d) Solucin de fijacin: 250 ml de etanol:actico:agua (60:10:30) 150 ml de

EtOH + 25 ml actico + 75 ml de H2O
e) Solucin de tincin: Coomasie Brillant Blue R-250 0,15% en Destain.
Preparar aprox. 120 ml 0,18 gr coomasie
f) Solucin de Destain: MeOH:actico:H2O (35:25:40). Se prepara 1 litro
Procedimiento
La LDL se oxida con cobre como previamente. Se sacan muestras a los 0, 15,
50 y 90 minutos para analizar los cambios en la movilidad electrofortica de la
LDL. Adems se lo compara con una muestra de plasma.
a. Se siembran por pocillo hasta 20 l de solucin de muestra (4 l de buffer
de la muestra 5x + 16 l de muestra) con una cantidad final de protena
entre 10 a 20 g.
b. Corrida: 40 minutos a 65 voltios constante (aprox.30 mA) + 15 minutos a 90
voltios
c. Fijacin: 10-20 minutos en solucin de fijacin (antes de fijar poner en el
congelador la solucin de fijacin y el coomasie)
d. Deshidratar el gel por peso entre papel de filtro seco.
e. Coloracin: 10 minutos en solucin de tincin
f. Decoloracin: 1 hora (o hasta que exista buen contraste bandas/fondo) en
destain con cambios sucesivos de la solucin
g. Secado: 1) Con papel de filtro sin peso
2) Con papel de filtro con peso
3) Secador de geles entre papel celofn
Anlisis de los datos.
1) Dibuje la curva de calibracin, graficando Abs540nm vs Conc. de protenas
(mg/mL). Determine con ella la concentracin de la solucin stock de LDL.
2) En los casos de la oxidacin lipdica y de antioxidantes graficar las medidas
realizadas en funcin del tiempo identificando, donde amerite, las fases de
latencia, propagacin y terminacin.
3) Indicar para cada fase los principales intermediarios involucrados y que
funcin cumplen: reductor u oxidante.
4) Para el caso de la electroforesis, y de acuerdo a la literatura, identificar las
especies presentes en cada carril.
5) Hipotetizar la razn por la cual se observan cambios en la movilidad
electrofortica de la LDL incubada con Cu(II) y como se relaciona con la
formacin de las clulas espumosas. Cules seran los oxidantes
responsables de la oxidacin de LDL in vivo?

Referencias.
Herrera E. Metabolismo de las Lipoprotenas. In: Graw-Hill IM, ed. Elementos
de Bioqumica, 1993.
Esterbauer H, Gebicki J, Puhl H, Jurgens G. The role of lipid peroxidation and
antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radic Biol Med 1992;
13:341-90.
Westhuyzen J. The oxidation hypothesis of atherosclerosis: an update. Ann Clin
Lab Sci 1997; 27:1-10.
Cosgrove JP, Church DF, Pryor WA. The kinetics of the autoxidation of
polyunsaturated fatty acids. Lipids 1987; 22:299-304.
Trostchansky, A., Batthyany, C., Botti, H., Radi, R., Denicola, A., and Rubbo, H.
Formation of lipid-protein adducts in low-density lipoprotein by fluxes of
peroxynitrite and its inhibition by nitric oxide. Arch. Biochem. Biophys. 395:
225-232.; 2001
Trostchansky, A., Ferrer-Sueta, G., Batthyany, C., Botti, H., Batinic-Haberle, I.,
Radi, R., and Rubbo, H. Peroxynitrite-mediated LDL oxidation is inhibited by
manganese porphyris in the presence of uric acid. Free. Rad. Biol. Med. 35:
1293-1300; 2003