Meccanismi per riparare il DNA

In una cellula, quando esiste un maleappaiamento,

cio ad esempio G-T, la cellula deve avere un modo per
riconoscere qual il filamento di nuova sintesi rispetto
a quello parentale perch deve sapere qual la base
sbagliata delle due. Noi sappiamo che il DNA metilato,
e controlla lo stato di aggregazione della cromatina, e
ovviamente il pattern di metilazione del DNA anche
viene trasmesso al DNA di nuova sintesi. Soltanto che
questo meccanismo sfalsato rispetto alla duplicazione
del DNA, quindi prima avviene la duplicazione del DNA e
poi dopo vengono copiate nel nuovo filamento tutte le
modificazioni epigenetiche. Quindi c un istante in cui il
DNA semimetilato, cio, in cui metilato soltanto da
una parte. Chiaramente i gruppi metilici stanno ad
indicare che quello il filamento prentale, quindi e c
un errore viene corretto solo nel filamento di nuova sintesi, che quello senza gruppi
metilici.
Un meccanismo comune di correzione, se c una base male appaiata, interviene una
endonucleasi,che tagli a monte del maleappaiamento, creando cos unintaccatura, a
questo punto interviene la DNA polimerasi I, che fa sempre la stessa cosa. Quando
vede unintaccatura sul DNA, ci si siede sopra, prende come primer il DNA che sta
prima diggerendo quello che sta davanti sostituendo il DNA correggendo la base
maleappaiata. Le basi azotate possono subire una reazione di deamminazione
ossidativa. Esiste un apparato enzimatico apposta per rimuovere queste basi anomale.
Interviene una DNA glicosidasi, che taglia il legame glicosidico, che unisce cio il
ribosio alla base azotata, quindi esiste una DNA glicosidasi specifica per ogni base,
creando cos un sito dove manca la base. Ancora lo scheletro zuccherofosfato
intatto, dopo che si creato questo sito detto apurnico perch manca una purina
interviene una endonucleasi, che taglia in corrispondenza del sito apurinico lo
scheletro zucherofosfatoe cos facendo crea unintaccatura. A questo punto interviene
sempre la DNA polimerasi I, che fa sempre la stessa cosa, usa il DNA precedente come
primer e sostituisce il DNA che gli sta davanti. Questo il motivo per cui la DNA
plimerasi un enzima poco veloce e poco processivo, proprio perch non deve
copiare tutto il genoma, serve soltanto per sostituire 10, 20 nucleotidi che gli stanno
davanti, siano essi primer di RNA che devono essere sostituiti durante la duplicazione
oppure errori che devono essere corretti.
Il folato una vitamina che serve per trasportare gruppi monocarboniosi, gruppi CH3,
o al massimo bicarboniosi, CH3-CH2. Questi gruppi monocarboniosi servono per la
sintesi delle purine, oppure servono per la metilazione (da desossi UTP al desossi TTP)
e quindi si tratto di una vitamina molto importante per il metabolismo del DNA, tra
laltro questo il motivo per il quale, alle donne in gravidanza, si da sempre
unintegrazione di acido folico, perch nel bambino che si sta formando, si passa in
nove mesi da una cellula a una cosa che pesa pi o meno tre chili, quindi c una
sintesi del DNA molto veloce e quindi serve un sacco di acido folico per la sintesi della

timina, delle purine e per tutte le modificazioni epigenetiche, per la metilazione

corretta del DNA, che una cosa importante. Se c qualche gene che controlla il ciclo
cellulare che dovrebbe essere spento e invece acceso, allora ci possono essere dei
problemi come losviluppo di tumori. Se non ci sono abbastana gruppi metilici per la
formazione di Timina, allora viene incorporato luracile nel DNA, che viene riconosciuto
come estraneo da quel sistema di riparo di cui si parlava prima. Se non c la timina
normale, per sostituire quella base, rimane un sito a purinico, un sito senza nessun
nucleotide. E quindi nella divisione successiva in quel sito verr incorporato un
nucleotide a caso e quindi c lo sviluppo di tumore.
Un altro meccanismo che interviene per la rimozione dei dimeri di timina, che abbiamo
visto ieri, quando abbiamo parlato della chimica degli acidi nucleici, lirraggiamento
con luce UV pu portare alla formazione di un anello di ciclobutano che porta una
distorsione localizzata della doppiaelica. Un meccansimo per rimuovere questo tipo di
danno lintervento di una endonucleasi e successivamente di una elicasi, che svolge
il DNA contenente il dimero di timina. Poi ovviemnte c il solito intervento della DNA
polimerasi I.
Unaltra mutazione che pu avvenire, quella ad opera di agenti alchilanti che sono
delle sostanza chimiche che ossono introdurre i gruppi metilici ad esempio nella
guanina. Questo composto che si forma si appaia perfettamente con la timina, con la
stessa geometria di un appaiamento secondo la gemotria di Watson e Crick.
Chiaramente se questa cosa non viene corretta, va incontro a mutazione, perch nella
divisione successiva, verr introdotta una base che non era presente. Questo riparo
viene riparato da un enzima che una metil transferasi, cio un enzima che prende
questi gruppi metilici che stanno dove non dovrebbero stare, quindi se c una citosina
metilata in posizine 5, quella una metilazione corretta, e fa parte del bagaglio
epigenetico della cellula, mentre questo tipo di metilazione non deve essere presente
normalmente e quindi questa metil transferasi la riconosce e toglie il gruppo metilico.
Adesso che abbiamo parlazo della duplicazione del DNA, vediamo un metodo per
determinare la sequenza del DNA che si basa proprio sulle conoscenze acquisite da
questi studi sulla duplicazione del DNA. Il metodo si chiama metodo Sanger, ed stato
praticamente usato con qualche modifica che dopo vedremo per il completamento del
progetto genoma umano. Ovviamente, per queso metodo c bisogno di uno stampo a
singola elica, rappresentato dal DNA di cui si vuole determinare la sequenza, poi serve
un primer per le DNA polimerasi, serve un pezzettino di doppio filamento per poter
funzionare. La presenza dei 4 nucleotidi trifosfato dei quali uno marcato, cos ci
permette di poter vedere soltanto il DNA di nuova intesi. Oltre a questo c il
didesossinucleotide , la cui formula questa qua, che manca oltre allossidrile in 2
anche dellossidrile in 3. Chiaramente, quando questo nucleotide viene incorporato
nel DNA nascente, la reazione di sintesi del DNA si blocca, perch la DNA polimerasi
che cosa fa, utilizza praticamente il gruppo fosfato per attaccarlo allossidrile in 3 del
DNA nascente, qui siccome non c nessun ossidrile, ma c lidrogeno la sintesi si
blocca. Vediamo un esempio, un pezzetto di DNA lungo 6 nucleotidi, in realt si usano
pezzi di DNA lunghi qualche centinaio di nucleotidi. C uno stamp a singola elica, c
la sequenza che noi vogliamo determinare, e noi conosciamo un pezzo della sequenza
di quel DNA che sta attaccato alla sequenza che noi vogliamo determinare. La
conosciamo perch possiamo sintetizzare un oligonucleotide lungo una ventina di
nucleotidi da usare come primer e, a questo punto, una volta che si ha quella roba li, si
divide in 4 provette, che contengono tutte quante i quattro nucleotidi, una DNA

polmerasi, e in una provetta ci mettiamo la didesossiadenina, in unaltra la

didesossicitosina, e cos via per i quattro nucleotidi e facciamo avvenire la sintesi. Che
cosa succede, prendiamo ad esempio la reazione con la didesossiadenina, se io ci
metto tanta didesossiadenina, ogni frammento di nuova sintesi incorporer subito il
didesossinucleotide, e quindi la sintesi si blocca subito, se ce ne metto troppo poca, al
contrario, la sintesi viene completata perch la didesossi raro che ci vada a finire,
quindi se uso una quantit tale che in media viene incorporata una sola molecola di
desossiadenina per molecole di DNA di nuova sintesi, avr una miscela di fammenti a
tutte le adenine presenti nel DNA stampo. La stessa cosa vale per gli altri tre
nucleotidi, a questo
punto si prende la
reazione, si mette su
un gel e si sottopone a
un campo elettrico
(elettroforesi) in
quattro campioni
diversi (le quattro
lane), il che consente
di separare le
molecole cariche
secondo la loro
dimensione. Quelli pi
piccoli sono pi veloci,
saranno pi in basso.
A questo punto, una
volta avvenuta la separazione, si legge direttamente la sequenza partendo dal basso
andando verso lalto. Questo metodo viene chiamato sequenziamento di Sanger. Ora
questo metodo, era poco adatto per un progetto cos ambizioso come il progetto
genoma umano, visto che il nostro genoma lungo tre miliadi di nucleotidi. Per
determinare quali sono i polimorfismi degli individui bisogna ovviamente sequenziare
non uno, ma centinaia di individui diversi. Questo significa sequenziare centinaia di
miliardi di nucleotidi. Ovviamente
questo metodo non andava bene
perch, innanzi tutto, per ogni
singola sequenza c bisogno dello
spazio di quattro lane sul gel di
sequenza, inoltre, siccome un
metodo che si basa sulla
separazione delle varie bande che
differiscono in lunghezza di un solo
nucleotide, chiaramente la
differenza di mobilit di queste
due bande, se una lunga 100 e
laltra 101, sar una certa
distanza, ma se 600 e 601, la
distanza sar talmente piccola da
essere invisibile allocchio umano.
Ed per questo che i ricercatori

hanno sviluppato unaltro metodo, che non fa pi uso del radioattivo, per visualizzare il
DNA di nuova sintesi, ma fa uso di questi didesossinucleotidi ai
quali stata attaccata una sonda fluorescente, una cosa che
quando viene illuminata dalla luce ultravioletta emette luce di un
certo colore. Ovviamente si utilizzano colori diversi per i quattro
nucleotidi e questo ci permette di caricare le quattro lane che
abbiamo visto prima,
in una singola
miscelaperch le
quattro bande, a
questo punto,
siccome i nucleotidi
hanno 4 colori
diversi, si possono
facilmente
distinguere. Inoltre,
siccome tutto quanto avviene automatizzato, non pi lo
sperimentatore che con locchio deve guardare una lastra
fotografica, e quindi a un certo punto diventa difficile distinguere due bande quando
sono quasi sovrapposte, qui invece un computer che raccoglie le informazioni e di
coneguenza molto pi preciso. Questo quello che esce fuori chiaramente, il
computer interpreta se il segnale che gli arriva ha una certa lunghezza donda e lui sa
quale base .

Questo praticamente il
metodo che stato usato per
il progetto genoma umano,
che altrimenti sarebbe stato
impossibile realizzare. Si
formano tutti i frammenti
possibili, ognuno marcato
da un colore diverso, dipende
dal nucleotide. Poi con
lelettroforesi si separano tutti i frammenti in base alle loro dimensioni e a questo
punto si pu leggere la sequenza. C un illuminatore di luce ultravioletta, un detector
che capta la luce emessa, il tutto viene dato ad un computer che elabora il tutto.
Quando si andava ad analizzare quello che venuto fuori dal progetto genoma umano,
si scoperto che ben il 40% del nostro DNA fatto da sequenze ripetute, cio
sequenze pi o meno lunghe e che vengono ripetute decine o anche centinaia di volte.

Il numero di ripetizioni tale che se io analizzassi 5 di queste regioni ripetute, la

probabilit di trovare due individui con lo stesso numero di ripetizioni uno si 20
miliardi. Un DNA quando ha la stessa sequenza ripetuta tutte queste volte, quando c
il crossing over possibile che i due cromatidi facciano il crossing over mettendosi non
appaiati correttamente, quando
questo accado, ovviamente
viene cambiato il numero delle
ripetizioni, da una parte
dimiuisce e dallaltra aumenta.
Questo fatto, ripetuto per milioni
di generazioni, ha generato la
situazione in cui abbiamo questo
DNA ripetuto, ma il numero di
ripetizioni diverso da individuo
a individuo. Quindi lanalisi di
questo particolare DNA, che non si sa a che serve tra laltro, permette di individuare
una persona. Quando si dice che sulla scena del delitto di fa lanalisi del DNA, o per
lanalisi della paternit, significa che si va ad analizzare proprio queste regioni
ripetute, e siccome la probabilit che due persone hanno lo stesso numero di 5 regioni
ripetute di uno su 20 miliardi, chiaramente molto difficile, pressoch impossibile,
visto che siamo solo 7 miliardi, che si possa sbagliare persona.
PCR
Adesso vediamo unaltra tecnica che sfrutta la presenza di una DNA polimerasi,
Questa tecnica la PCR, reazione a catena della polimerasi (polimerase chain
reaction). Serve ad amplificare un tratto di DNA, quando si fa lanalisi del DNA sulla
scena del delitto, per analizzare quelle 5 regioni ripetute di cui di diceva prima,
ovviamente serve una quantit discreta di DNA, solo che sulla scena di un delitto,
spesso la polizia trova un capello al quale sono attaccate poche cellule del bulbo
pilifero. Questa tecnica serve ad amplificare queste regioni di DNA che si vogliono
amplificare, quindi bastano delle quantit minime di DNA per poter essere amplificate.
Questa tecnica stata ideata molto tempo fa, e si basa sul riscaldamento ciclico di
una soluzione che contiene DNA polimerasi e i quattri nucleotidi. La soluzione viene
ciclicamente riscaldata, per separare il DNA e poi viene abbassata la temperatura per
far avvenire la sintesi. Solo che la DNA polimerasi che si usava allora era la DNA
polimerasi estratta da E.coli, la quale come la maggior parte delle polimerasi degli
organismi che vivono a temperatura ambiente viene denaturata con il calore. Cera
questo grosso impedimento che ad ogni ciclo bisognava aggiungere una nuova
quantit di DNA polimerasi. Questo ha impedito lo sviluppo di questa tecnica finch a
qualcuno non venuto in mente che esistono sulla terra degli organismi che sono dei
procarioti che vivono anche a temperature superiori a 100 gradi, nelle pozze
solforiche. I loro enzimi devono resistere ad alte temperature al contrario di quella di
E.coli. DA quel punto in poi la tecnica si molto sviluppata e ora, in biologia
molecolare non ci sono esperimenti che non la richiedano. Ora, quello che bisogna
avere per poterla utilizzare, bisogna conoscere la squenza di DNA che fiancheggia la
sequenza che vogliamo amplificare. Questo poteva essere un problema qualche anno
fa, ma adesso non o pi visto che la sequenza del genoma umano stata
completamente determinata. C un sottosito sul sito del NIH dove c tutta la

sequenza del DNA e si pu vedere tutto il cromosoma, perci se si conosce la

sequenza da amplificare si va a vedere la sequenza di ci che fiancheggia la regione
che bisogna amplificare. Serve il DNA stampo che si vuole amplificare, due
oligonucleotidi che fiancheggiano la regione che si vuole amplificare, perch quasta
tecnica fa uso della DNA polimerasi che fa uso di un ossidrile in 3 da poter allungare.
Poi una DNA polimerasi termostabile e i quattro desossinucleotidi trifosfato. Il processo
prevede diversi cicli che si ripetono con questa modalit, prima c la denaturazione
del DNA stampo, quindi si porta la soluzione a 95C per separare le due eliche, poi la
temperatura si abbassa a circa 55C per permettere lappaiamento con i due primer.
Poi si rialza di nuovo, siccome la DNA polimerasi la polimerasi di un organismo che
vive ad alte temperature, funziona bene ad alte temperature, circa a 72 gradi, e quindi
si porta la temperatura a 72 gradi e inizia la sintesi. Dopo questo ciclo si ripete di
nuovo. Allinizio, quando ancora non avevano pensato alla DNA polimerasi
termostabile, la tecnica veniva poco usata perch, oltre al fatto di aggiungere lenzima
nuovamente nella miscela di reazione si dovevano avere tre termstati e lo doveva
passare a mano queste provette da un termostato allaltro, adesso ovviamente tutto
automatizzato, quindi lo stesso termostato che automaticamente cambia la
temperatura della provetta. Vediamo che cosa accade allinterno della provetta
quando si verificano questi cambiamenti di temperatura. Allinizio abbiamo il DNA che
vogliamo amplificare, c il segmento a 95 gradi, poi c lappaiamento. da notare
che la reazione termodinamicamente favorita rispetto al riappaiamento del DNA che
vogliamo amplificare, perch abbiamo messo allinizio nella provetta un eccesso di
oligonucleotidi primer, altrimenti il rischio quello che abbassando la temperatura il
DNA si riappaia e quindi non succede pi niente. Per mettendo un eccesso di primer,
il prodotto della reazione termodinamicamente favorito proprio questo, i primer si
appaiano ognuno su una singola elica di DNA.La freccia sta a simboleggiare lossidrile
in 3 quindi il punto che verr riconosciuto dalla DNA polimerasi e che verr
allungato. Da notare anche che i due ossidrili in 3 guardano ognuno verso il segmento
che si vuole amplificare.
Durante la reazione sintesi, la DNA polimerasi allunga il primer e questa la fine del
primo ciclo. Si ripete loperazione quindi abbiamo questa volta quattro eliche,
lolgonucleotide che ci abbiamo messo in eccesso, quindi ognuno si lega al proprio
posto, arriva la DNA polimerasi e si formano queste quattro molecole di DNA alla fine
del secondo ciclo. Alla fine del terzo ciclo cominciano a comparire delle molecole che
hanno la lunghezza esattamente uguale al tratto di DNA contenuto fra i due
oligonucleotidi. Alla fine del terzo ciclo compaiono le molecole che noi volevamo
amplificare. Da notare che la sequenza di DNA contenuta allinterno dei due
oligonucleotidi, ad ogni ciclo raddoppia, cresce in maniera esponenziale. Tutto ci che

sta allesterno, aumenta per soltanto in maniera aritmetica. Allinizio sono due poi
tre, poi quattro poi 5. Questo sta a significare che se faccio 30 cicli, teoricamente
ottengo 268 milioni di molecole contenute allinterno dei due oligonuceotidi, mentre ci
sono soltanto una trentina di molecole di DNA. Chiaramente ho amplificato solo quello
che stava allinterno dei due oligonucleotidi.
Basta anche una singola copia di DNA per poterla amplificare moltissime volte.
Vantaggi e Svantaggi (37:06)