COMPARACIN DE METODOLOGAS DE ISTOPOS PARA EVALUAR FIJACIN

DE N ATMOSFRICO Y SU DESTINO EN SUELOS Y PLANTAS

COMPARISON OF ISOTOPE METHODOLOGIES TO ASSESS N2 FIXATION AND ITS
FATE IN PLANTS AND SOILS
Braulio Valles-de la Mora1, Georg Cadisch2 y Andrs Aluja-Schunemann3
1

Centro de Enseanza, Investigacin y Extensin en Ganadera Tropical (CEIEGT). FMVZ-UNAM,

Martnez de la Torre, Veracruz, 93600 Mxico. (braulio_36@hotmail.com). 2Imperial College at
Wye, University of London., Wye, Ashford, Kent, England. (g.cadisch@ic.ac.uk). 3ANUIES, Regin Sur-sureste, Mrida, Yucatn (anuiesur@tunku.uady.mx)

RESUMEN

ABSTRACT

El uso del istopo estable 15N es considerado una herramienta

indispensable para investigar la fijacin de N2 atmosfrico por
leguminosas y para trazar el destino de fertilizantes nitrogenados
en sistemas suelo y planta. En este trabajo se describen los mtodos ms comnmente usados para determinar el proceso de fijacin de nitrgeno por leguminosas forrajeras y se destacan las
diferencias ms importantes entre ellos. A fin de entender las
tcnicas isotpicas disponibles, la revisin describe detalladamente los mtodos de abundancia natural de 15N, la dilucin
isotpica de 15N, la tcnica de diferencia de N, la determinacin
de reduccin de acetileno y el mtodo de ureidos. Aunque se acepta que no existe un mtodo perfecto para evaluar la fijacin de
N2, se considera til una descripcin detallada de las tcnicas
disponibles, que facilite la seleccin del mtodo ms conveniente
segn las condiciones especficas del experimento. Se mencionan las ventajas y desventajas y se discute la aplicacin de los
mtodos. Se destaca que una cuidadosa eleccin del mtodo dar
resultados ms precisos y confiables, lo que a su vez disminuir
la probabilidad de errores.

The use of the stable isotope

15

N is considered an indispensable

tool to study N2 fixation by plant legumes and trace the path of

nitrogen fertilizer in soil and plant systems. This paper describes
the most common methods used to assess the N2 fixation process
by forage legumes and highlights the most important differences
among them. A revision of the natural 15N abundance, 15N isotope
dilution, N-difference technique, the acetylene reduction assay
(ARA) and ureides methods is reviewed here in order to understand
the different available techniques. Although there is no absolute
method by which the N2 fixation can be tested, a detailed
description of the available methods is necessary in order to select
the most convenient according to specific experimental conditions.
Advantages and drawbacks of the different methods are discussed,
as well as their applicability. A careful choice of the method will
give more reliable and accurate results, and guidelines are given
for each one of the mentioned methods in order to diminish
potential errors.
Key words: N2 fixation, stable isotopes, plant/soil systems.

Palabras clave: Fijacin de N2, istopos estables, sistemas suelo/

planta.

INTRODUCTION

itrogen is the most abundant component of a

great number of essential compounds that take
part in the functioning of multiple biological
organisms, and the deficiency of this element in the plants
limits its primary productivity. Nevertheless, the inert
molecule of N2 (atmospheric nitrogen) is not usable by
most of the biological systems, since these only can use
the combined nitrogen, that is already associate with other
elements to form ions such as the ammonium (NH4+) or
nitrate (NO
3 ). Therefore, the plants depend on the present
N in more reactive combinations. This biologically usable
N includes only a small fraction of the total N present in
the earth. Here the N2 fixation process acquires
importance, because it is involved in the transformation
of the greatest volume of atmospheric N2 to forms
usable by the plants. It has been calculated that around

INTRODUCCIN

l nitrgeno es el constituyente ms abundante de

un gran nmero de compuestos esenciales que
intervienen en el funcionamiento de mltiples organismos biolgicos, y la deficiencia de este elemento
en las plantas limita su productividad primaria. Sin embargo, la molcula inerte de N2 (nitrgeno atmosfrico)
no es utilizable por la mayor parte de los sistemas biolgicos, ya que stos slo pueden usar el nitrgeno combinado, es decir aqul que est ya asociado con otros
elementos para formar iones tales como el amonio (NH+4 )
o nitrato (NO3). As pues, las plantas dependen del N
Recibido: Julio, 2002. Aprobado: Diciembre, 2002.
Publicado como ENSAYO en Agrociencia 37: 117-128. 2003.
117

118

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NMERO 2, MARZO-ABRIL 2003

presente en combinaciones ms reactivas. Este N biolgicamente utilizable comprende slo una pequea fraccin del N total presente en la tierra. Aqu el proceso de
fijacin de N2 adquiere su importancia al ser responsable
de la transformacin del mayor volumen de N2 atmosfrico a formas utilizables por las plantas. Se ha calculado
que alrededor de 100 millones t de N combinado estn
disponibles para la biosfera cada ao por este proceso
(Lewis, 1986).
Mtodos para determinar la fijacin
de N2 atmosfrico
Istopos estables de nitrgeno
El istopo ms comn del N tiene un peso atmico
de 14, aunque existe un istopo ms pesado (15N), que
contiene un neutrn ms que el ncleo de la forma abundante (14N). Aunque las caractersticas qumicas de los
tomos en 15N y 14N son idnticas, existen pequeas diferencias cuantitativas debido a sus diferentes masas y
diferentes energas de activacin. La concentracin de
15
N en el aire es muy estable y constituye 0.3663%
(Mariotti, 1983); ese valor tiene una variacin de
0.0004% (Axmann y Zapata, 1990). A esta concentracin se le denomina abundancia natural.
Aunque la existencia del 15N fue demostrada en 1929
(Middelboe y Johansen, 1990), su aplicacin ha sido ms
intensa en las ltimas tres dcadas mediante
metodologas que utilizan la espectrometra de masas
de flujo de istopos. Ya que los fertilizantes nitrogenados
han contribuido al incremento de la produccin agrcola, el empleo del istopo estable de 15N ayuda a detectar, medir y rastrear el destino del fertilizante y el N de
los residuos en plantas y suelo. La rpida expansin del
uso de istopos estables ha originado un mejoramiento
en los equipos de deteccin y en las tcnicas analticas.
Los istopos estables tienen la ventaja de estar presentes en forma natural, y los cambios en su distribucin y
abundancia natural en plantas y suelos ofrecen informacin relevante relacionada con el funcionamiento de los
ecosistemas.
La evaluacin precisa del N simbiticamente fijado
por leguminosas es esencial para determinar la funcin
de estas especies en el mejoramiento de agroecosistemas
o en el mantenimiento de los niveles de N en el suelo. El
problema central en la cuantificacin del N simbiticamente fijado es la seleccin del mtodo apropiado. Ningn mtodo puede determinar la cantidad de N sin introducir algn error inherente al mtodo (Hauser, 1992).
Chalk y Ladha (1999) mencionan que la principal dificultad es la eleccin de la planta de referencia no fijadora
de N que debe emplearse en este proceso. Bergersen
(1980) resumi las dificultades para evaluar el contenido

100 million t of combined N is available for the biosphere

every year by this process. (Lewis, 1986).
Methods to assess atmospheric N2 fixation
Stable nitrogen isotopes
The most common isotope of the N has an atomic
weight of 14, although a heavier isotope exists (15N),
which contains a neutron more than the nucleus of the
abundant form (14N). Although the chemical
characteristics of atoms in 15N and 14N are identical, there
are small quantitative differences due to its different
masses and different activation energies. The
concentration of 15N in the air is very stable (Mariotti,
1983) and constitutes the 0.3663%; this value has a
variation of 0.0004% (Axmand and Zapata, 1990). This
concentration is named natural abundance.
Although the existence of 15N was proven in 1929
(Middelboe and Johansen, 1990), its application has been
more intense in the last three decades with the
development of new methodologies that use the flowisotope mass spectrometry. Since the nitrogen fertilizers
have contributed to the increase of the agricultural
production, the use of the stable isotope of 15N aid to
detect, to measure and to track the fate of the N fertilizer
and the residual N in plants and soil. The rapid expansion
in the stable isotope use has originated an improvement
in the detection instruments and analytical techniques.
The stable isotopes have the advantage of being present
in natural form, and changes in their distribution and
natural abundance in plants and soils offer excellent
information related to the functioning of the ecosystems.
The precise determination of the N symbiotically
fixed by legumes is essential to determine the role of
these species in the improvement of agroecosystems or
the maintenance of the N levels in the soil. The central
problem in the quantification of the N symbiotically fixed
is the selection of the appropriate method. No method
can determine the amount of N without introducing some
inherent error to the method (Hauser, 1992). Chalk and
Ladha (1999) mention that the main difficulty is the
election of the non-fixing N reference plant that must be
used in this process. Bergersen (1980) summarized the
difficulties to determine the N fixed and emphasized that
considerable losses occurs by denitrification or leaching;
also, the variability in the content of the biological
material increases the analytical errors.
The use of the isotope 15N in the nitrogen fixation
Methods with 15N have been used to know the
biochemistry of the N2 fixation, to study the factors which
affect the N2 fixation, to evaluate the capacity of

VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGAS DE ISTOPOS PARA EVALUAR FIJACIN DE N ATMOSFRICO

de N fijado y destac que prdidas considerables ocurren por desnitrificacin o por lixiviacin; adems, la
variabilidad en el contenido del material biolgico
incrementa los errores analticos.
El uso del istopo 15N en la fijacin de nitrgeno
Los mtodos con 15N se han utilizado para investigar la bioqumica de la fijacin del N2, para estudiar los
factores que afectan la fijacin del N2, evaluar la capacidad de microorganismos para fijar N2, medir el desplazamiento de N2 simbiticamente fijado, en estudios
del balance de N, y la calibracin de la tcnica para la
reduccin de acetileno.
La abundancia de 15N en cualquier medio es medida
mediante el anlisis de una planta de referencia (nofijadora de N2), la cual es totalmente dependiente del N
del suelo para su crecimiento. La fijacin de N2 puede
ser determinada por los cambios en el enriquecimiento
de 15N en una planta-fijadora debido a la asimilacin de
N2 atmosfrico de bajo enriquecimiento. Tambin puede usarse N sin 15N (N privado de 15N), pero el empleo
de este material es ms delicado debido a riesgos de contaminacin, aunque su costo es menor que el 15N enriquecido. El uso de 15N para medir la proporcin de N2
tiene la ventaja de no ser dependiente del rendimiento
cosechado. Existen limitaciones inherentes en la utilizacin del 15N: (1) baja disponibilidad de espectrmetros
de masas en pases en desarrollo; (2) restricciones para
utilizar 15N en fase gaseosa en experimentos de campo
y en experimentos de largo plazo debido a la dificultad
para mantener constantes las condiciones de fase gaseosa
en un sistema cerrado; (3) es necesario determinar el
nivel de enriquecimiento de 15N a utilizar; (4) debe conocerse la sensibilidad y la reproducibilidad de las mediciones de 15N antes de disear el experimento; (5) debe
conocerse el contenido de nitrgeno del material experimental; (6) altos costos de equipo para medir 15N, as
como del fertilizante enriquecido y, (7) se requiere un
alto nivel de entrenamiento del personal para evitar contaminaciones cruzadas.

119

microorganisms to fix N2, to measure the displacement

of N2 symbiotically fixed, to determine N balance, and
for calibration of the technique for the acetylene
reduction.
The abundance of 15N in any environment is
determined by analysis of a reference plant (non-fixing
N2 plant), which is totally dependent upon the soil N for
its growth. The N2 fixation can be determined by the
changes in the enrichment of 15N in the fixing plant due
to the assimilation of atmospheric N2 of low enrichment.
Also 15N-depleted material (N deprived of 15N) can be
used, but its use is more difficult due to contamination
risks, although its cost is lower than the 15N enriched.
Using 15N to measure the proportion of N2 has the
advantage of not being dependent upon the harvested
yield. There are inherent limitations in the use of 15N: (1)
low availability of mass spectrometers in developing
countries; (2) restrictions to use 15N in gaseous phase in
field experiments, as well as in long-term experiments
because it is difficult to maintain constant conditions for
the gaseous phase in a closed system; (3) it is necessary
to determine the level of enrichment of 15N to use; (4)
sensitivity and reproducibility of the measurements of
15
N must be known before designing the experiment; (5)
the nitrogen content of the experimental material must
be known; (6) high costs of equipment to measure 15N,
as well as of the enriched fertilizer and, (7) a high level
of training of the personnel is required to avoid crosscontaminations.
The method of the 15N-dilution
The method of 15N-dilution allows to evaluate each
one of the different N-sources in the plant, and it is the
most used to determine fixation of N2. The method
requires the application to the soil of a small dose of
fertilizer enriched with 15N before sowing: 1-10 kg N
ha-1 with 1 to 10 atom % 15N in excess, in order to reduce
any interference with the fixation of N2 of the legume.
The enrichment of the samples of plants is expressed as
percentage of atoms 15N in excess, and it is determined
as follows:

El mtodo de la dilucin del 15N

15

El mtodo de dilucin de N permite evaluar cada

una de las diferentes fuentes de N en la planta, y es el
ms usado para medir fijacin de N2. El mtodo requiere la aplicacin al suelo de una pequea dosis de fertilizante enriquecido con 15N previo a la siembra: 1-10 kg
N ha-1 con 1 a 10 % de exceso de tomos 15N, a fin de
reducir cualquier interferencia con la fijacin de N2 de
la leguminosa. El enriquecimiento de las muestras de
plantas se expresa como porcentaje de tomos 15N en
exceso, y se estima de la siguiente forma:

% atom 15N excess = (% atom 15N sample % atom 15N

in N2 air)
(1)
where % of atoms of 15N in air N2 is 0.3663.
The proportion of the N of the plant that is derived
from the atmospheric N2 and the N of the soil, can be
calculated if the isotopic abundance between these two
sources is different. This is obtained comparing the
enrichment in 15N of nodulated legume with non-fixing
N2 reference plants.

120

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NMERO 2, MARZO-ABRIL 2003

% tomos 15N en exceso = (% tomos 15N muestra %

tomos 15N en N2 del aire)
(1)

The following equation, taken from McAuliffe et al.

(1958), may be used to determine the atmospheric
percentage of fixed N of the legume (P):

donde el % de tomos de 15N en el N2 del aire es

0.3663.
P = 1
La proporcin del N de la planta que es derivada del
N2 atmosfrico y del N del suelo puede ser calculada si
la abundancia isotpica entre estas dos fuentes es diferente. Esto se logra comparando el enriquecimiento en
15
N de leguminosas noduladas con plantas de referencia
no fijadoras de N2.
La siguiente ecuacin, tomada de McAuliffe et al.
(1958), se puede utilizar para evaluar el porcentaje de N
atmosfrico fijado de la leguminosa (P):

P = 1

% tomos 15N en exceso en leg

% tomos 15N en exceso en ref

100

(2)

El porcentaje de tomos de 15N en el N derivado del

suelo en la leguminosa se mide a partir del porcentaje
de tomos de 15N de una planta de referencia no fijadora
de nitrgeno que crece en el mismo suelo y en el mismo
periodo que la leguminosa.
En el mtodo se supone que: (1) la relacin 14N/15N
de la planta no fijadora es la misma que la del N del
suelo; (2) la leguminosa y la planta de referencia exploran el mismo volumen de suelo de idntica relacin 14N/
15
N; (3) ambas plantas deben absorber la misma cantidad relativa del 15N aadido y de N del suelo y, (4) que
la dinmica de absorcin es la misma.
Salgado et al. (2001) compararon esta tcnica y la
de diferencia total de N para evaluar la eficiencia de recuperacin de nitrgeno en caa de azcar (Saccharum
officinarum L.) utilizando varias fuentes de N marcadas
con 15N, en una zona caera de Tabasco, Mxico. Ellos
encontraron que la eficiencia en la recuperacin del N
aplicado, determinada por el mtodo de la diferencia
total, fue mayor que la determinada por el mtodo
isotpico. En el mismo Estado, pero en la regin Plan
Chontalpa, Espinoza-Flores et al. (2002) evaluaron la
eficiencia de la fertilizacin nitrogenada en sorgo
(Sorghum bicolor) por medio de la tcnica isotpica de
15
N para medir la abundancia de este istopo en tallos,
hojas y grano a diferentes etapas fenolgicas; los resultados para eficiencia de la fertilizacin nitrogenada fueron confiables.
Ledgard y Peoples (1988) y Peoples et al. (1989)
mencionaron que los errores ms frecuentes para medir
la fijacin de N2 ocurren cuando la leguminosa y la planta
de referencia difieren en la relacin del N absorbido proveniente del 15N con aqul tomado del suelo. Esto fue
observado por Gil et al. (1997), cuando utilizaron

% atom 15N in excess in leg

% atom 15N in excess in ref

100

(2)

The percentage of atoms of 15N in the N derived from

the soil in the legume is determined from the percentage
of atoms of 15N of a non-fixing reference plant that grows
in the same soil and in the same period that the legume.
In the method it is supposed that: (1) relation 14N/15N
of the non-fixing plant is the same as in the N of the soil;
(2) the legume and the reference plant explore the same
volume of soil with identical relation 14N/15N; (3) both
plants must absorb the same relative amount of 15N added
and N of the soil, (4) that the absorption dynamics is the
same.
Salgado et al. (2001) compared this technique and
the one of the total N-difference to evaluate the efficiency
of sugarcane (Saccharum officinarum L.) nitrogen
recovery using several labeled 15N sources, in a sugarcane
zone of Tabasco, Mxico. They found that the efficiency
in the recovery of the applied N, determined by the total
N-difference method, was greater than that of the isotopic
method. In the same State, but in the Plan Chontalpa
region, Espinoza-Flores et al. (2002) evaluated the
efficiency of the nitrogen fertilization in sorghum
(Sorghum bicolor) using the isotopic technique of 15N to
measure the abundance of this isotope in stems, leaves
and grain at different phenologic stages; the results were
reliable for efficiency of the nitrogen fertilization.
Ledgard and Peoples (1988) and Peoples et al. (1989)
mentioned that the most frequent errors to measure the
N2-fixation occurs when the legume and the reference
plant differ in the relation of the absorbed N originated
from 15N with that taken from the soil. This was observed
by Gil et al. (1997), when they used Brachiaria
humidicola as a non-fixing grass in pastures associated
with the forage legumes Centrosema pubescens, Pueraria
phaseoloides or Stylosanthes hamata. They observed an
unequal pattern of N uptake from the soil between species
and, therefore, measurements of the N2-fixed were
erroneous.
Previously, Wagner and Zapata (1982) approached
the problem of the suitable reference crop for studies of
nitrogen fixation using the isotopic technique of double
labeling (labeling of the soil with 15N and 35S). These
researchers used faba bean (Vicia faba) and soybean
(Glycine max) as N2-fixing species; they determined the
symbiotic fixation of N using Sudan grass (Sorghum
sudanense) radish (Raphanus sativus) and barley
(Hordeum vulgare) as reference plants. The interval of

VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGAS DE ISTOPOS PARA EVALUAR FIJACIN DE N ATMOSFRICO

Brachiaria humidicola como gramnea no fijadora en

praderas asociadas con las leguminosas forrajeras
Centrosema pubescens, Stylosanthes hamata o Pueraria
phaseoloides. Ellos observaron un patrn desigual de
toma de N del suelo entre especies y, por lo tanto, fueron errneas las mediciones del N2 fijado.
Wagner y Zapata (1982) abordaron el problema del
cultivo de referencia idneo para estudios de fijacin de
nitrgeno usando la tcnica isotpica de doble marcaje
(marcaje del suelo con 15N y 35S). Estos investigadores
emplearon haba (Vicia faba) y soya (Glycine max) como
especies fijadoras de nitrgeno y determinaron su fijacin simbitica usando como plantas de referencia zacate
sudn (Sorghum sudanense) rbano (Raphanus sativus)
y cebada (Hordeum vulgare). El intervalo de fijacin de
N fue de 74 a 83% y concluyeron que los tres cultivos
de referencia fueron satisfactorios para los propsitos
indicados.
En vista de la importancia de la seleccin apropiada
de una planta no fijadora de N2, Thomas et al. (1997)
realizaron un experimento usando Brachiaria
dictyoneura como gramnea acompaante. Ellos calificaron como satisfactoria a esta planta no fijadora de N2
al cotejarla con las leguminosas Stylosanthes capitata,
Centrosema acutifolium y Arachis pintoi. La tcnica de
la dilucin del istopo 15N tambin fue utilizada por
Cadisch et al. (1989) para evaluar el efecto del aporte
de P:K en la fijacin de N2 en ocho leguminosas
forrajeras tropicales. Encontraron que suelo pobre en P
y K la fijacin de N2 se redujo, y reportaron considerables diferencias entre especies en el N derivado de la
atmsfera. Algunas desventajas del mtodo de dilucin
de 15N son el alto costo del fertilizante enriquecido, la
reduccin (en el tiempo) del enriquecimiento de 15N del
N del suelo disponible para la planta, la distribucin nouniforme de 15N (Witty y Ritz, 1984), y la contaminacin cruzada. Estos efectos conducen a errores importantes si la toma de N, en tiempo y espacio, por las plantas de referencia no fijadoras difiere de aqul que toma
la leguminosa (Ledgard et al., 1985).
El mtodo de la abundancia natural del 15N
Este mtodo es una variacin de la tcnica de dilucin de istopos, basada en pequeas diferencias en la
abundancia natural de 15N entre el N2 atmosfrico
(0.3663% tomos 15N) y el N del suelo. Estas diferencias
se expresan como delta ()15N o partes por mil () relativo a la composicin de 15N en el N2 atmosfrico (Shearer
y Kohl, 1986) y se calcula de la siguiente forma:

15N() =

% tomos 15N (muestra) % tomos 15N (std)

% tomos 15N (std)

1000 (3)

121

N fixation was 74 to 83% and they concluded that the

three reference plants were satisfactory for their
objectives.
Since the appropriate selection of a non-fixing N2
plant is important, Thomas et al. (1997) carried out an
experiment using Brachiaria dictyoneura as
accompanying grass. They found that this non-fixing N2
plant was satisfactory when matched with the legumes
Stylosanthes capitata, Centrosema acutifolium and
Arachis pintoi. The technique of the 15N isotope dilution
also was used by Cadisch et al. (1989) to determine the
effect of the contribution of P:K in the fixation of N2 in
eight tropical forage legumes. They found that in soil
low in P and K the N2-fixation was reduced, and reported
large differences among species in the N derived from
the atmosphere. Some disadvantages of the dilution of
15
N method are the high cost of the enriched fertilizer,
the reduction (in the time) of the enrichment of 15N of
the N of the soil available for the plant, the non-uniform
distribution of 15N (Witty and Ritz, 1984), and the crosscontamination. These effects lead to mistakes if the N
uptake, in time and space, by the reference non-fixing
plants differs from the legume uptake (Ledgard et al.,
1985).
Natural 15N abundance method
This method is a variation of the isotope dilution
technique, based on small differences in the natural
abundance of 15N between atmospheric N2 (0.3663%
atoms 15N) and the soil N. These differences are expressed
as delta ()15N or parts by thousand () relative to the
composition of 15N in the atmospheric N2 (Shearer and
Kohl, 1986) and it is calculated as follows:

15N() =

% atom 15N (sample) % atom 15N (std)

1000 (3)
% atom 15N (std)

where (std) is the standard atmospheric abundance of 15N,

that is, 0.3663% atoms of 15N. Therefore, by definition,
the value of d15N of the N2 of the air is equal to zero.
Shearer and Kohl (1986) mentioned that soils are
more enriched in 15N (range of 15N=6 to +16%) in
comparison to the atmospheric N2 (15N=0%); this
enrichment is due to the isotopic discrimination in the
processes of volatilization of ammonium, nitrification,
denitrification and other N transformations in the soil.
Since 15N is heavier than 14N, the compounds with 15N
tend to react more slowly. The net effect is that through
time, the soil becomes slightly more enriched with 15N,
and these differences, in fixing and no-fixing plants, are
used to calculate the fixed N2.

122

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NMERO 2, MARZO-ABRIL 2003

donde el (std) estndar es la abundancia de 15N atmosfrico, es decir 0.3663% tomos de 15N. Por consiguiente,
por definicin el valor de 15N del N2 del aire es igual a
cero.
Shearer y Kohl (1986) mencionan que los suelos estn ms enriquecidos en 15N (intervalo de 15N= 6 a
+16) en comparacin con el N2 de la atmsfera
(15N=0) y este enriquecimiento se debe a la discriminacin isotpica en los procesos de volatilizacin de
amonio, nitrificacion, denitrificacin y otras transformaciones del N en el suelo. Ya que el 15N es ms pesado
que el 14N, los compuestos con el primero tienden a reaccionar ms lentamente. El efecto neto es que a travs
del tiempo el suelo se vuelve ligeramente ms enriquecido con 15N, y estas diferencias, en plantas fijadoras y
de referencia, son usadas para calcular el N2 fijado.
El porcentaje (P) de N2 atmosfrico que es fijado
por la leguminosa se calcula mediante la siguiente ecuacin (4) propuesta por Bergersen y Turner (1983) y
Ledgard et al. (1985):

P=

15N ref 15N leg

15N ref B

100

(4)

donde B es el 15N de la leguminosa que crece con N2

atmosfrico como la nica fuente de nitrgeno, 15N
ref y 15N leg son las unidades de d 15N (%) para las
plantas no fijadoras (referencia) y leguminosa.
Considerando que el N del suelo es generalmente
ms abundante en 15N que el N2 atmosfrico, se esperara que las plantas no fijadoras, en las que la fuente primaria de N es el derivado del suelo, tuvieron ms 15N
que las plantas fijadoras que toman el N2 de la atmsfera as como del suelo.
La separacin de los istopos 15N y 14N se puede
hacer mediante espectrometra de emisin o de masas.
La ventaja de los espectrmetros de alta precisin es su
capacidad de medir diferencias extremadamente pequeas en abundancia isotpica entre el material experimental y un estndar del nitrgeno (Robinson y Smith, 1991).
Ledgard y Peoples (1988) mostraron resultados similares entre la tcnica de la abundancia natural de 15N
y aqullas que usan enriquecimiento artificial con 15N.
Algunas ventajas y limitaciones del mtodo de la abundancia natural de 15N son mencionadas por Peoples et
al. (1989).
Ventajas: (1) no requiere la adicin de 15N; (2) el 15N
del N del suelo disponible para las plantas puede ser
relativamente constante con la profundidad y tiempo y,
(3) la seleccin de las plantas de referencia puede ser de

The percentage (P) of atmospheric N2 that is fixed

by the legume is calculated following the equation (4)
proposed by Bergersen and Turner (1983) and Ledgard
et al. (1985):

P=

15N ref 15N leg

15N ref B

100

(4)

where B is the d15N of the legume that grows with

atmospheric N2 as the only nitrogen source, d15N ref and
d15N leg are the units of d15N () for the non-fixing
reference plant and legume.
Considering that soil is N generally more abundant
in 15N than the atmospheric N2, it would be expected that
the non-fixing plants in which the primary N source is
that derived from the soil, would have more 15N than the
fixing plants which take N2 from the atmosphere and the
soil.
The separation of isotopes 15N and 14N can be done
by mass spectrometry or spectrometry of emission. The
advantage of high precision spectrometers is its capacity
to measure extremely small differences in isotopic
abundance between the experimental material and a N
standard (Robinson and Smith, 1991). Ledgard and
Peoples (1988) showed similar results between the natural
15
N abundance technique and those using artificial
enrichment with 15N. Some advantages and limitations
of the method of the natural 15N abundance are mentioned
by Peoples et al. (1989).
Advantages: (1) it does not require the addition of 15N;
(2) the 15N of the N of the soil available for the plants
can be relatively constant with depth and time and, (3)
the selection of the reference plants can be of minor
importance than in studies with 15N enriched, although
in some cases it is necessary to take precautions when
matching reference plants with N2-fixing plants (Cadisch
et al., 2000).
Limitations: (1) requirement of a precise mass
spectrometer and meticulous analytical procedures; (2)
it is needed to measure the factor of discrimination (B
value) in the legumes during the N2-fixation; (3) the
technique is insensible if the 15N of the soil is near the
15N of the air, and it is suggested that the 15N of the
soil be >5 and, (4) the field variability can be considerable
in some cases.
In order to reduce the effect of field variability,
Unkovich et al. (1994) suggested a method of paired
sampling in systems of associated pastures, v.gr., by each
sample of legume, a grass sample from a bordering zone
is taken.

VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGAS DE ISTOPOS PARA EVALUAR FIJACIN DE N ATMOSFRICO

menor importancia que en estudios con 15N enriquecido, aunque en algunos casos es necesario tomar precauciones al cotejar plantas de referencia con las plantas
fijadoras (Cadisch et al., 2000).
Limitaciones: (1) se requiere un espectrmetro de masas preciso y procedimientos analticos meticulosos; (2)
se necesita medir el factor de discriminacin (B value)
en las leguminosas durante la fijacin de N2; (3) la tcnica es insensible si el 15N del suelo es cercano al 15N
del aire y se sugiere que el 15N del suelo sea >5 y, (4) la
variabilidad en el campo puede ser considerable en algunos casos.
Para reducir el efecto de variabilidad en el campo,
Unkovich et al. (1994) sugirieron un mtodo de muestreo
apareado en sistemas de pasturas asociadas, v.gr., por
cada muestra de leguminosa se toma una muestra de una
gramnea aledaa.
Una deficiencia del mtodo de abundancia natural
de 15N es que una pequea variacin en el 15N corresponde comparativamente a una enorme diferencia en la
fijacin de N2 (Vose et al., 1981). Sin embargo se ha
usado este mtodo de manera exitosa para determinar la
fijacin de N2 en leguminosas forrajeras y de grano
(Cadisch et al., 2000; Cadisch et al., 1993; Hossain et
al., 1995; Sanford et al., 1995; Bolger et al., 1995).
El mtodo de la diferencia total de N
El mtodo est basado en el rendimiento total del N
de la leguminosa, as como de la planta de referencia
que crece en el mismo suelo (Giller y Wilson, 1991). La
substraccin del N en la planta de referencia de aqul en
la planta fijadora dar un estimado del N2 fijado.
Peoples y Herridge (1990) mencionaron dos requerimientos bsicos del mtodo: (1) el N en la planta de
referencia proviene slo del suelo y, (2) la leguminosa y
la planta de referencia absorben la misma cantidad de N
del suelo. Ellos sugirieron que las dos plantas deben
explorar idealmente el mismo volumen en la zona de las
races, tener la misma capacidad de extraer y utilizar el
N mineral del suelo, y acumular el N del suelo en el
mismo periodo. Las comparaciones de este mtodo con
los de abundancia natural de 15N o de dilucin de 15N
han producido resultados contrastantes. Kohl et al.
(1980) encontraron una buena relacin entre el mtodo
de diferencia total de N y abundancia natural de 15N en
tres experimentos con soya (Glycine max) usando como
referencia una lnea no nodulante de esta especie. Por el
contrario, Carranc et al. (1999) con Trifolium
subterraneum como leguminosa fijadora, y una mezcla
de Lolium perenne con Dactylis glomerata como plantas de referencia, observaron que el mtodo de la diferencia de N mostr valores ms bajos en varios perodos
de muestreo, comparado con los mtodos de dilucin y

123

A deficiency of the natural 15N abundance method is

that a small variation in 15N corresponds comparatively
to a large difference in the N2-fixation (Vose et al., 1981).
Nevertheless, this method has been successfully used to
estimate N2-fixation in forage legumes and grain legumes
(Cadisch et al., 2000; Cadisch et al., 1993; Hossain et
al., 1995; Sanford et al., 1995; Bolger et al., 1995).
The total N-difference method
The method is based on the total N yield of the
legume, as well as of the reference plant that grows in
the same soil (Giller and Wilson, 1991). The subtraction
of the N in the reference plant of that one in the fixing
plant gives an estimator of the N2 fixed.
Peoples and Herridge (1990) mentioned two basic
requirements of the method: (1) the N in the reference
plant comes only from the soil and, (2) the legume and
the reference plant absorb the same amount of N of the
soil. They suggested that the two plants must ideally
explore the same volume in the root-zone, to have the
same capacity to extract and use the mineral soil-N, and
to accumulate the N of the soil in the same period. The
comparisons of this method with those of natural
abundance of 15N or dilution of 15N have produced
contrasting results. Kohl et al. (1980) found a good
relationship between the total N-difference method and
natural 15N abundance in three experiments with soybean
(Glycine max) using as reference a non-nodulating line
of this species. On the contrary, Carranc et al. (1999)
used Trifolium subterraneum as fixing-N2 legume, and a
mixture of Lolium perenne with Dactylis glomerata as
reference plants, and observed that the total-N difference
method showed lower values in several periods of
sampling, compared with the 15N-dilution and natural 15N
abundance methods. Nevertheless, since the method is
dependent of the crop yield, it is considered not so
reliable.
The acetylene reduction method
Since the nitrogenase (the N2-fixation enzyme) can
reduce other substrates with triple bond such as acetylene
(C2H2) to ethylene (C2H4), this latter reaction is the basis
of the acetylene reduction technique. The reduction can
be quantified by gas chromatography (Giller and Wilson,
1991) reading the concentration (peaks) of both gases.
According to Turner and Gibson (1980) the technique is
simple, rapid, of low equipment and resources costs.
However, these authors added that the apparent simplicity
of the method can be deceptive because of several
operational problems, and interpretation of the results
requires great care. One disadvantage is that it is
complicated to measure N2 fixation in soils due to the

124

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NMERO 2, MARZO-ABRIL 2003

de abundancia natural de 15N. Sin embargo, dado que el

mtodo depende del rendimiento, se le considera poco
confiable.
El mtodo por reduccin de acetileno
Puesto que la nitrogenasa (enzima responsable de la
fijacin de N2) puede reducir otros substratos con triple
enlace tales como acetileno (C2H2) a etileno (C2H4), esta
ltima reaccin es la base del mtodo por reduccin de
acetileno. La reduccin se puede cuantificar por
cromatografa de gases (Giller y Wilson, 1991) a travs
de la lectura de los picos de concentracin de ambos
gases. Segn Turner y Gibson (1980) la tcnica es simple, rpida, de bajo costo de equipo y recursos. Sin embargo, estos autores mencionaron que la simplicidad
evidente del mtodo puede ser engaosa debido a problemas operativos y a que los resultados requieren una
interpretacin cuidadosa. Otra desventaja es que es complicado medir la fijacin del N2 en suelos debido a los
efectos del acetileno en los procesos microbianos. Otros
problemas resultan de la diferencia en solubilidad e ndices de difusin del acetileno y del etileno en suelos,
asi como a alteraciones de la funcin nodular (Giller y
Wilson, 1991). Este mtodo no es lo suficientemente
exacto, ni siquiera para estudios comparativos entre leguminosas (Peoples et al., 1989).
En el trpico hmedo de Veracruz, MelchorMarroquin et al. (1999) aplicaron esta tcnica y encontraron que la aplicacin de podas al follaje afect la actividad de la enzima nitrogenasa en cocuite (Gliricidia
sepium). As, los investigadores hicieron propuestas acerca del manejo de la especie como componente
agroforestal.
El mtodo de ureidos
Debido a que existen importantes diferencias en las
formas principales de N transportadas en el xylema de
leguminosas noduladas y no noduladas, es posible utilizar la abundancia de ureidos en la savia del xylema como
medida indirecta de la proporcin de N de la planta derivado de la fijacin de N2. Muchas leguminosas tropicales, principalmente Phaseoleae y Desmodieae, transportan los productos de la fijacin de N2 desde los
ndulos a otras partes de la planta en forma de ureidos,
alantoina y cido alantoico (Giller y Wilson, 1991;
Peoples y Herridge, 1990). Este mtodo es aplicable a
las leguminosas de grano ms importantes, pero no a
muchas leguminosas forrajeras.
El muestreo del xylema es rpido, sencillo, y no es
totalmente destructivo. Tambin se pueden extraer ureidos
de muestras secas de plantas, como los peciolos, lo que
simplifica la aplicacin de la tcnica. Los componentes

effects of acetylene on microbial processes. Other

problems result from the differences in solubility and rates
of diffusion of acetylene and ethylene in soils, as well as
alterations on the nodulating function (Giller and Wilson,
1991). This method is not accurate enough, even for
comparative studies between legumes (Peoples et al.,
1989).
In the humid tropic of Veracruz, Melchor-Marroquin
et al. (1999) applied this technique and found that the
foliage prunings affected the activity of the enzyme
nitrogenase in cocuite trees (Gliricidia sepium). The
authors made proposals about the management of this
species as agroforestal component.
The ureides method
Because there are important differences in the
principal forms of N transported in the xylem of nodulated
and non-nodulated legumes, it is possible to use the
abundance of ureides in the xylem sap as an indirect
measure of the proportion of plant N derived from N2
fixation.
In many tropical legumes, mainly Phaseoleae and
Desmodieae, the product of N2 fixation is transported
from the nodules to other plant parts in form of the
ureides, allantoin and allantoic acid (Giller and Wilson,
1991; Peoples and Herridge, 1990). This method is
applicable to the more important grain legumes, but not
for many forage legumes.
The sampling of xylem is rapid, simple, and not
completely destructive. Also, it is possible to extract
ureides from dry samples of plants, as petioles, which
simplifies the application of the technique. N solute
components can be analyzed by colorimetric analyses.
Not expensive equipment is necessary, and many samples
can be collected and analysed on a single day. Some
limitations are: (1) the method is valid only for legumes
that export ureides; (2) it requires calibration for different
plant age to cover all stages of growth; (3) diurnal
variations for solute concentration and volume, (4) sap
composition is stable for only 4 h at 25 to 30 oC (Peoples
and Herridge, 1990). However, the major disadvantage
of the method is that it provides only a short-term measure
of symbiotic dependence. Thus, to determine seasonal
N2 fixation are required, it would be necessary to repeat
measurements of xylem combined with sequential
sampling for dry matter and N.
Limitations to the biological nitrogen fixation
The environmental conditions determine to a large
extent the symbiotic efficiency of the N2-fixing legumes.
Physical and chemical factors affect the fixation process:
the first case includes the effects by high temperatures
and hydric stress; the second is related to problems by
toxic effects of the soil, such as acidity and aluminum

VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGAS DE ISTOPOS PARA EVALUAR FIJACIN DE N ATMOSFRICO

de N se pueden analizar por mtodos colorimtricos. No

es necesario equipo costoso, y se puede recolectar y
analizar un gran nmero de muestras en un da. Algunas
limitaciones son: (1) el mtodo es vlido slo para leguminosas que exportan ureidos; (2) requiere calibracin
para diferentes edades de la planta a fin de cubrir todas
las etapas de crecimiento; (3) se presentan variaciones
diurnas para la concentracin del soluto y volumen y,
(4) la composicin de la savia es estable slo por 4 h a
25 a 30 oC (Peoples y Herridge, 1990). Sin embargo, la
desventaja principal del mtodo es que proporciona solamente una medida a corto plazo de la dependencia
simbitica. As, para evaluar la fijacin estacional de N2,
es necesario repetir las mediciones del xylema combinadas con muestreos secuenciales para materia seca y N.
Limitaciones a la fijacin biolgica de nitrgeno
Las condiciones ambientales determinan en gran
parte la eficiencia simbitica de las leguminosas fijadoras
de N2. Factores fsicos y qumicos afectan el proceso de
fijacin: el primer caso incluye los efectos por altas temperaturas y estrs hdrico; el segundo se relaciona con
problemas por efectos txicos del suelo, como acidez y
presencia de aluminio, as como deficiencias
nutricionales (Giller y Cadisch, 1995; Giller y Wilson,
1991).
Las altas temperaturas inhiben la fijacin de N2, y la
nodulacin puede fallar si las temperaturas del suelo alcanzan 40 C o ms en los primeros 5 cm de profundidad, temperatura que mata a muchas bacterias reduciendo su poblacin en el suelo. Los lmites mximos para
el crecimiento de rizobios estn entre 32 a 47 C, aunque la tolerancia vara entre especie y cepas (Hungria y
Vargas, 2000). Las altas temperaturas tambin inhiben
la formacin de pelos radicales, lo cual disminuye el
nmero de sitios posibles para nodulacin; es necesario
inocular repetidamente cuando las temperaturas son ms
altas a fin de mantener el proceso de fijacin de N2
(Hungria y Vargas, 2000). Giller y Wilson (1991) indicaron que en periodos cortos las cepas de
Bradyrhizobium son ms tolerantes a la sequa que las
cepas de Rhizobium. La tolerancia a la sequa es
influenciada por la capacidad de las plantas para captar
el agua del suelo; las leguminosas de races profundas
lo extraen de mayores profundidades para mantener su
potencial hdrico y evitar una reduccin en el ndice de
fijacin de N2 y en el desplazamiento de los productos
de la fijacin del N2 a los tallos.
Las limitaciones a la fijacin de N2 por acidez del
suelo son importantes, y una proporcin significativa
de las reas tropicales posee esta condicin. Dos
implicaciones son (Giller y Wilson, 1991): (1) supervivencia en un medio de pH bajo y, (2) cambios qumicos

125

presence, as well as nutritional deficiencies (Giller and

Cadisch, 1995; Giller and Wilson, 1991).
The high temperatures inhibit the N2-fixation, and the
nodulation can fail if the soil temperatures reach 40 C
or more in the first 5 cm of depth, temperature which kill
many bacteria reducing their population in the soil. The
maximum limits for the growth of rizobia are between
32 and 47 C, although the tolerance varies between
species and strains (Hungria y Vargas, 2000). The high
temperatures also inhibit the formation of root-hairs,
which diminish the number of possible sites for
nodulation; it is necessary to inoculate repeatedly when
the temperatures are higher in order to maintain the
N2 fixation process (Hungria y Vargas, 2000). Giller and
Wilson (1991) indicated that in short periods the strains
of Bradyrhizobium are more tolerant to the drought that
the strains of Rhizobium. The tolerance to the drought is
influenced by the capacity of the plants to absorb the
water of the soil; deep-root legumes extract it from greater
soil depths to maintain their hydric potential and avoid a
reduction in the N2-fixation rate and in the displacement
of the N2 fixation products to the stems.
The limitations to the N2-fixation by acidity of the
soil are important, and a significant proportion of the
tropical areas has this condition. Two implications are
(Giller and Wilson, 1991): (1) survival in a low pH
environment and, (2) chemical changes in the soil caused
by high soil acidity, such as a high proportion of
aluminum and iron-manganese. In acid soils, the
availability of P and Mo diminish and there are Ca
deficiencies. The common peanut (Arachis hypogaea) is
susceptible to Ca deficiency which affects the
development of the pods. The optimum pH for rizobia
growth is between 6.0 and 7.0 and little rizobia grows
well with pH below 5.0, in tropical soils. Hungria and
Vargas (2000) indicated that acidity affects the first stages
of the infection process for the nodulation. According to
Thomas (1995), most of the collected forage legumes by
CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali,
Colombia) have been selected from acid soils of Latin
America and they are extremely tolerant to acidity. This
author mentions that Calopogonium mucunoides, Arachis
pintoi and Centrosema spp are good options for poor soil
of the tropic pastures. In fact, Arachis species are more
tolerant to acidity that grain legumes, such as soybean or
common bean. Table 1 shows information about the
potential for N2-fixation of several legumes forage. The
range of N2-fixed is between 52 and 88%, according to
the species, region and method used for determining it.
The amount also depend upon type of legume and forage
yield, in addition to their percentage of fixation.

CONCLUSIONS
The use of the stable isotope 15N has an extensive
application in understanding the chemical or biological

126

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NMERO 2, MARZO-ABRIL 2003

Cuadro 1. Algunas estimaciones de la fijacin de N2 por leguminosas forrajeras tropicales en nivel de campo (adaptado de Giller, 2001).
Table 1. Some estimations of N2 fixation by tropical forage legumes on field (adapted from Giller, 2001).
Especies
Calopogonium
mucunoides

N2 fijado
(kg N ha-1)

Periodo
(Aos)

Pas

Mtodo

Ref

W. Samoa,
Brasil

Dif-N

1, 2

64-182

Centrosema
acutifolium

43

82

0.33

Colombia

DI

Centrosema
macrocarpum

41

83

0.33

Colombia

DI

25-110

70-89

0.25-1

Colombia,
W. Samoa, Brasil

Dif-N

31-54

81-93

0.27

Brasil

DI

Pueraria
phaseoloides

115

88

0.33

Colombia

DI

Stylosanthes
capitata

3-179

73-88

0.3-1

Colombia,
Brasil

DI, AN

3, 5, 6

Stylosanthes
guianensis

7-102

68-79

0.3-1.3

Colombia, Brasil
Dif-N, AN

DI,

3, 5, 6

4-89

74-88

1-1.4

Colombia,
Brasil

DI,
Dif-N, AN

3, 5, 6

22-40

52-70

0.31

Brasil

AN

61

88

0.33

Colombia

DI

Desmodium
ascendens
Galactia
striata

Stylosanthes
macrocephala
Stylosanthes
scabra
Zornia
glabra

1,3,4

Dif-N = Diferencia de N; DI = Dilucin de istopos 15N; AN= abundancia natural 15N.

Referencias: (1) Reynolds (1982); (2) Seiffert et al. (1985); (3) Cadisch et al. (1989); (4) Viera-Vargas et al. (1995); (5) Thomas y de Andrade
(1984); (6) Vallis et al. (1977).

en el suelo causados por acidez alta, como una alta proporcin de aluminio y hierro-manganeso. En suelos cidos disminuye la disponibilidad de P y Mo y hay deficiencia de Ca. El cacahuate comn (Arachis hypogaea)
es susceptible a la carencia de Ca que afecta el desarrollo de las vainas. El pH ptimo para el crecimiento de
rizobio est entre 6.0 y 7.0 y poco rizobio crece bien
con pH menor a 5.0, en suelos tropicales. Hungria y
Vargas (2000) asientan que la acidez afecta las primeras
etapas del proceso de infeccin para la nodulacin. De
acuerdo con Thomas (1995), la mayora de las leguminosas forrajeras recolectadas en el CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia) han
sido seleccionadas de suelos cidos de Amrica Latina
y son extremadamente tolerantes a la acidez. Este autor
menciona que Calopogonium mucunoides, Arachis pintoi
y Centrosema spp son buenas opciones para pasturas en
suelos pobres de los trpicos. Las especies de Arachis
son ms tolerantes a la acidez que las leguminosas de

processes that affect the nitrogen cycle and the nitrogen

compounds, movement in the plant/soil system. The
evidences presented show that no method is precise and
totally reliable to measure the biological fixation of the
atmospheric N2, due to multiple factors that affect their
quantification. Nevertheless, the methods that involve the
use of 15N, as 15N-dilution and natural 15N abundance,
would be most recommendable. The method to select
dependes on the availability of laboratory equipment. In
many developing countries, access to the spectrometry
of masses is a serious limitation; therefore, a method that
does not require a sophisticated equipment, such as that
of total N-difference, could be more recommendable.
End of the English version


grano como soya o frijol. El Cuadro 1 presenta informacin acerca del potencial de fijacin de N2 por varias

VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGAS DE ISTOPOS PARA EVALUAR FIJACIN DE N ATMOSFRICO

leguminosas forrajeras. El intervalo de N2 fijado est

entre 52 y 88% segn la especie, localidad y mtodo
empleado para medirlo. La cantidad depende tambin
del tipo de leguminosa y los rendimientos de forraje,
adems de su porcentaje de fijacin.

CONCLUSIONES
El empleo del istopo estable 15N tiene una amplia
aplicacin en la comprensin de los procesos qumicos
o biolgicos que afectan el ciclo del nitrgeno y el movimiento de compuestos nitrogenados en el sistema suelo/planta. Las evidencias presentadas muestran que ningn mtodo es preciso y totalmente confiable para medir la fijacin biolgica del N2 atmosfrico, debido a
mltiples factores que afectan su cuantificacin. Sin
embargo, los mtodos que involucran el uso de 15N, como
la dilucin de 15N y la abundancia natural de 15N, son
los ms recomendables. La eleccin del mtodo depende de la disponibilidad de equipo de laboratorio. En muchos pases en desarrollo el acceso a la espectrometra
de masas es una limitacin seria; por tanto, un mtodo
que no requiera equipo muy elaborado, como el de diferencia total de N, podra ser ms recomendable.

LITERATURA CITADA
Axmann, H., and F. Zapata. 1990. Stable and radioactive isotopes. In:
Use of Nuclear Techniques in Studies of Soil-Plant Relationships
(G. Hardarson, ed.). Training Course Series No. 2. International
Atomic Energy Agency. Vienna, Austria. pp: 9-25.
Bergersen, F. J. 1980. Measurement of nitrogen fixation by direct
means. In: Methods for Evaluating Biological Nitrogen Fixation
(F. J. Bergersen, ed.). J. Wiley and Sons, Ltd. UK. pp: 65-110.
Bergersen F., J., and G. L. Turner. 1983. An evaluation of 15N methods
for estimating nitrogen fixation in a subterranean clover
perennial ryegrass sward. Australian J. Agric. Res. 34: 391-401.
Bolger T., P., J.S. Pate, M. J. Unkovich, and N. C. Turner. 1995.
Estimates of seasonal nitrogen-fixation of annual subterranean
clover-based pastures using the N-15 natural-abundance
technique. Plant and Soil 175: 57-66
Cadisch G., R. S. Bradley, and J. Nosberger. 1989. 15N-Based
estimation of nitrogen fixation by eight tropical forage legumes
at two levels of P:K supply. Field Crops Res. 22: 181-194.
Cadisch G., S. F. Ledgard, J. Nsberger, and R. Sylvester-Bradley.
1993. Use of natural 15N abundance in estimating N2 fixation
by Centrosema spp.: Influence of phosphorus and strain of
Bradyrhizobium. In: XVII International Grassland Congress.
Palmerston North, New Zealand and Rockhampton, Australia.
Vol. 3, pp: 1916-1918.
Cadisch G., K. Hairiah, and K. E. Giller. 2000. Applicability of the
natural 15N abundance technique to measure N2 fixation in
Arachis hypogaea grown on an Ultisol. Netherlands J. Agric.
Sci. 48: 31-45.
Carranc C., A. de Varennes, and D. E. Rolston. 1999. Biological
nitrogen fixation estimated by 15N dilution, natural 15N
abundance, and N difference techniques in a subterranean clovergrass sward under Mediterranean conditions. European J. Agron.
10: 81-89.
Chalk, P.M. and J.K. Ladha. 1999. Estimation of legume symbiotic
dependence: an evaluation of techniques based on 15N dilution.
A review. Soil Biol. Biochem. 31: 1901-1917.

127

Espinoza-Flores J., E. Carrillo-Avila, D.J. Palma-Lpez, J.J. PeaCabriales, y S. Salgado-Garca. 2002. Eficiencia de la fertilizacin nitrogenada en sorgo con la tcnica isotpica 15N, en un
Vertisol con drenaje superficial. Terra 20: 129-139.
Gil, J., L., O. Guenni, and Y. Espinoza. 1997. Biological N2 fixation
by three tropical forage legumes and its transfer to Brachiaria
humidicola in mixed swards. Soil Biol. Biochem. 29. 999-1004.
Giller, K. E., and K. F. Wilson. 1991. Nitrogen Fixation in Tropical
Cropping Systems. CAB International, Wallingford, UK. 313
p.
Giller, K., and G. Cadisch. 1995. Future benefits from biological
nitrogen fixation: An ecological approach to agriculture. Plant
and Soil 174: 255-277.
Giller, K. 2001. Nitrogen Fixation in Tropical Cropping Systems,
Second edition/Ed. CAB International, Wallingford, UK. 405
p.
Hauser, S. 1992. Estimation of symbiotically fixed nitrogen using
extended N difference methods. In: Biological Nitrogen Fixation
and Sustainability of Tropical Agriculture (K. Mulongoy, M.
Gueye and D. S. C. Spencer, eds.). John Wiley and Sons. UK,
Ibadan, Nigeria. pp: 309-322.
Hossain S., A., S. A. Waring, W. M. Strong, R. C. Dalal, and E. J.
Weston. 1995. Estimates of nitrogen fixations by legumes in
alternate cropping systems at warra, queensland, using enriched15
N dilution and natural 15N abundance techniques. Australian
J.Agric. Res. 46: 493-505.
Hungria M., and M. A. T. Vargas. 2000. Environmental factors
affecting N2 fixation in grain legumes in the tropics, with an
emphasis on Brazil. Field Crops Res. 65: 151-164.
Kohl H., D., G. Shearer, and J. E. Harper. 1980. Estimates of N 2
fixation based on differences in the natural abundance of 15N
nodulating and nodulating isolines of soybeans. Plant Physiol
66: 61-65.
Ledgard, S., F., and M. B. Peoples. 1988. Measurement of nitrogen
fixation in the field. In: Advances in Nitrogen Cycling in
Agricultural Ecosystems (J. R. Wilson, ed.). CAB International,
Wallingford, Ox., UK. pp: 351-367.
Ledgard S. F., J. R. Simpson, J. R. Freney, and F. J. Bergersen. 1985.
Field evaluation of 15N techniques for estimating nitrogen
fixation in legume grass associations. Australian J. Agric. Res.
36: 247-258.
Lewis, O. A. M. 1986. Plants and Nitrogen. Edward Arnold, Ltd.,
London, U.K. 104 p.
Mariotti A. 1983. Atmospheric nitrogen is a reliable standard for
natural 15N abundance measurements. Nature 303: 685-687.
McAuliffe C., D. S. Chamblee, H. Uribe-Arango, and W. W.
Woodhouse. 1958. Influence of inorganic nitrogen on nitrogen
fixation by legumes as revealed by 15N. Agron. J. 50: 334-337.
Melchor-Marroquin J.I., J.J. Vargas-Hernndez, R. Ferrera-Cerrato,
J.D. Etchevers-Barra, y A. Velsquez-Martnez. 1999. Actividad de la nitrogenasa en Gliricidia sepium en diferentes regmenes de poda. Terra 17: 299-308.
Middelboe, V., and H. S. Johansen. 1990. Analysis of nitrogen, carbon
and oxygen isotope ratios by optical emission spectrometry. In:
Soil Analysis. Modern Instrumental Techniques (K. A. Smith,
ed.). Marcel Dekker, Inc., New York, USA. pp: 433-464.
Peoples M., B., and D. F. Herridge. 1990. Nitrogen fixation by
legumes in tropical and subtropical agriculture. Advances in
Agron. 44: 155-223.
Peoples M., B., A. W. Faizah, B. Rerkasem, and D. F. Herridge.
1989. Methods for Evaluating Nitrogen Fixation by Nodulated
Legumes in the Field. Australian Centre for International
Agricultural Research, Canberra, Australia. 76 p.
Reynolds S., G. 1982. Contributions to yield, nitrogen-fixation and
transfer by local and exotic legumes in tropical grass-legume
mixtures in Western Samoa. Tropical Grasslands 16: 76-80.
Robinson, D., and K. A. Smith. 1991. Analysis of nitrogen isotope ratios
by mass spectrometry. In: Soil Analysis. Modern Instrumental

128

AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NMERO 2, MARZO-ABRIL 2003

Techniques Smith, K. A. (ed.). Marcel Dekker, Inc., New York,

USA. pp: 465-504.
Salgado G.S., R. Nez E., J.J. Pea-Cabriales, J.D. Etchevers-Barra, D.J. Palma, y R. Marcos. 2001. Eficiencia de recuperacin
del nitrgeno fertilizante en soca de caa de azcar sometida a
diferentes manejos de fertilizacin. Terra 19: 155-162.
Sanford P., J. S. Pate, M. J. Unkovich, and A. N. Thompson. 1995.
Nitrogen fixation in grazed and ungrazed subterranean clover
pasture in south-west Australia assessed by the 15N natural
abundance technique. Australian J. Agric. Res. 46: 1427-1443.
Seiffert N., M., Zimmer, A. H., Schunke, R. M., and Miranda, C. H.
B. 1985. Reciclagem de nitrogenio em pastagem consociada de
Calopogonium mucunoides com Brachiaria decumbens. Pesquisa Agropecuaria Brasileira 20: 529-544.
Shearer, G., and D. H. Kohl. 1986. N2 fixation in field settings Estimations based on natural 15N abundance. Australian J. Plant
Physiol. 13: 699-756.
Thomas R., J. 1995. Role of legumes in providing N for sustainable
tropical pasture systems. Plant and Soil 174: 103-118.
Thomas D., and R. P. de Andrade. 1984. The persistence of tropical
grass-legume associations under grazing in Brazil. J. Agric. Sci.,
Camb.107: 257-263.
Thomas R., J., N. M. Asakawa, M. A. Rondon, and H. F. Alarcon.
1997. Nitrogen fixation by three tropical forage legumes in an
acid-soil savanna of Colombia. Soil Biol. Biochem. 29: 801808.
Turner, G. L., and A. H. Gibson. 1980. Measurement of nitrogen
fixation by indirect means. In: Methods for Evaluating Biological

Nitrogen Fixation Bergersen, F. J. (ed.). John Wiley and Sons,

Chichester, UK. pp: 111-138
Unkovich M., J., J. S. Pate, P. Sanford, and E. L. Armstrong. 1994.
Potential precision of the delta 15N natural abundance method
in- field estimates of nitrogen fixation by crop and pasture
legumes in South-West Australia. Australian J. Agric. Res. 45:
119-132.
Vallis I., E. F. Henzell, and T. R. Evans. 1977. Uptake of soil nitrogen
by legumes in mixed swards. Australian J. Agric. Res. 28: 413425.
Viera-Vargas M., S., C. M. Souto, S. Urquiaga, and R. M. Boddey.
1995. Cuantification of the contribution of N2 fixation to tropical forage legumes and transfer to associated grass. Soil Biol.
Biochem. 27: 1193-1200.
Vose, P. B., A. P. Ruschel, R. C. Victoria, S. M. T. Saito, and E.
Matsiu. 1981. 15N as a tool in biological nitrogen fixation
research. In: Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture Graham, P. H. and S. C. Harris, (eds.). Centro
Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia. pp: 575592.
Wagner H.G., and F. Zapata. 1982. Field evaluation of reference
crops in the study of nitrogen fixation by legumes using isotope
techniques. Agron J. 74: 607-612.
Witty J., and K. Ritz. 1984. Slow-Release 15N fertilizer formulations
to measure N 2-fixation by isotope dilution. Soil Biol. Biochem.
16: 657-661.