Ingrid Buhigas

Garca
MIR 3 ao

Jornada Interhospitalaria de Residentes

de Laboratorio
Diagnstico Alergolgico in vitro:
Alergeno y respuesta IgE

Alergeno
Allos= otro, ergon= actividad.
genes= produccin,
descendencia.
Antgenos, normalmente de
naturaleza proteica, que
sensibilizan al husped
provocando reacciones
alrgicas.

ALERGENOS Y ENFERMEDADES ALRGICAS

Asma y/o rinitis

Polen de herbceas
Alergenos de alimentos
Polen de rboles
Polen de plantas leosas
Hongos
caros del polvo domstico
Epitelio de animales
Alergenos profesionales
Alergenos de alimentos

Anafilaxia

Dermatitis atpica

Veneno de insectos
Frmacos
Alergenos de
alimentos

caros del polvo

domstico
Alergenos profesionales

FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE LA ALERGENICIDAD

Intrnsecos

Complejidad molecular (tamao)

Concentracin
Solubilidad
Distancia filogentica
Estabilidad
Actividad bioqumica

Extrnsecos

Contaminantes
Humo del tabaco
Infecciones vricas
Sexo y predisposicin gentica
Estacin del ao en que se nace
Higiene
Peso al nacer

Fuentes
alergnicas

 Aeroalergenos:
plenes,
hongos,
harina de cereales, productos de las
plantas,
epitelio
y
orina
de
animales, plumas de aves, caros
del polvo domstico, insectos.
Orales: alimentos, frmacos.
Inyectados: insectos, y frmacos.

Aeroalergenos:
Va de exposicin ms importante es la inhalacin, aunque
tambin pueden llegar por ingestin y por inyeccin:
1. Plenes: que son una de las fuentes principales de alergenos,
responsables del 10-20% de enfermedades alrgicas, la ms
importantes de las cuales es la rinitis. Los ppales plenes
alergnicos derivan ms de plantas polinizadas por el viento
(anemfilas) que de plantas polinizadas por insectos, y los
plenes de importancia clnica varan de acuerdo con su
ubicacin. En Espaa, por reas geogrficas, la 1 causa de
polinosis son las gramneas en el centro y norte de la pennsula,
el olivo en el Sur y la parietaria en las regiones costeras
mediterrneas (Barcelona, Murcia y Valencia). Los granos de
polen desaparecen de la atmsfera los das de lluvia, y son
liberados cuando predomina un tiempo seco y caluroso. El final
de la primavera y el verano son las pocas con recuentos
mximos de polen. La cantidad de polen necesaria para
desencadenar la sintomatologa es superior al principio que al
final de la estacin polnica.

Aeroalergenos:
2. Alergenos de hongos: Aspergillus, Cladosporium, penicilllium y
Alternaria spp as como los championes, hongos de los helechos
etc, constituyen fuentes importantes de alergenos. Las
condiciones que influyen en la liberacin de las esporas son
extremadamente variables pero sumamente especficas para una
determinada especie. De los hongos, el Aspergillus y Alternaria
parece que son sumamente importantes para el asma.
3. Alergenos derivados de animales: son de importancia clnica
primordial tanto domstica como familiar. Es especialmente
frecuente la alergia a perros y gatos. En el entorno laboral es
frecuente la alergia a ratas, caballos, conejos, ratones, jerbos
y cobayas. Los alergenos derivan de la caspa, del epitelio, del
pelo, de la orina y de la saliva, aunque es posible que los
alergenos procedan de la misma fuente ( ej orina o saliva
depositadas en el pelo)

Aeroalergenos:
4. Alergenos de los artrpodos: incluyen cucarachas, polillas,
mosquitos, mariposas, caros del polvo y saltamontes. Los caros
del polvo domstico suponen la fuente de alergenos clnicamente
ms importante en todo el mundo. Las especies de caros son
universales, pero las ms importantes son las localizadas en los
domicilios privados, que suelen vivir en las alfombras, las
tapiceras y colchones, proliferan mejor a 25C y a una
humedad relativa del 80%
5. Alergenos profesionales: oscilan desde compuestos qcos de
bajo Pm ht prots complejas derivadas de animales o plantas. La
exposicin recurrente puede ocasionar una enfermedad crnica
con escasa variabilidad perceptible, lo que hace difcil asociar la
enfermedad con la exposicin.

Alergenos por va oral

Alergenos de alimentos: Parece que estn implicados mltiples mecanismos,

incluyendo las respuestas de HS I-IV, la liberacin directa de mediadores
inflamatorios celulares
tras una exposicin a productos alimenticios y la
existencia de mediadores inflamatorios en los alimentos. Cualquier alimento
puede producir una alergia, aunque los ms frecuentes son:leche de vaca, huevo
de gallina (ms la clara), harinas (trigo.), fruta (melocotn, manzana, fresas,
kiwi, pltano, castaa.), pescado, marisco, frutos secos (nueces, almendras.),
legumbres (cacahuetes, soja.)
Alergenos de frmacos: la mayora son de bajo Pm y actan como haptenos,
combinndose con las protenas del husped. Los F tpicos implicados en las
reacciones de HS inmediata son los antibiticos y anestsicos, y las reacciones
suelen ocurrir con dosis subteraputicas. Las reacciones graves de anafilaxia se
asocian generalmente a administracin va parenteral.

Alergenos por va parenteral

Insectos: ppalmente abejas, avispas, avispones, hormigas y mosquitos. Los

alergenos de las abejas melenferas parece que son los ms importantes
clnicamente y no es rara la anafilaxia.
Frmacos.

Nomenclatura de los alergenos

Nomenclatura de los alergenos

El Allergen Nomenclature Subcommittee de la
International Union of Immunological Societies
elabor unas directrices para facilitar una
denominacin del alergeno.
Se forma tomando las tres primeras letras del
gnero y la primera letra de la especie y
combinndolas con un n arbigo que refleja, bien
el orden en el que se aisl el alergeno o bien su
importancia clnica.
Los alergenos similares de distintas especies dentro
de un gnero tendrn el mismo n de orden.
Ej: la denominacin del alergeno cistenproteasa
del caro del polvo domstico
Dermatophagoides pteronyssinus es: Der p 1

De la fuente al extracto

Determinacin de la alergenicidad

Determinacin de la alergenicidad

Pruebas de alergoabsorcin
Radioinmunoelectroforesis
cruzada
Inmunotransferencia

Pruebas de alergoabsorcin
El alergeno o el extracto alergnico se une a una matriz
insoluble como el plstico, nitrato de celulosa, celulosa
(papel) o bolas de agarosa y se incuba con el suero del
paciente con sospecha de hipersensibilidad al alergeno. Los
Ac IgE se unen al alergeno unido a la matriz insoluble y
posteriormente, son detectados mediante un Ac especfico
para IgE. Este Ac se conjuga bien con un istopo, en una
prueba de radioalergoabsorcin , o bien con una enzima (pej:
peroxidasa de rbano) en una prueba de alergoabsorcin
enzimtica y la cantidad de IgE unida se determina mediante
sistemas de deteccin adecuados.

Respuesta

RAST

Alergeno o suero de paciente alrgico

Respuesta

Inhibicin del
RAST

Alergeno

Ensayo de inhibicin:
Es una variante de la alergoabsorcin: Se aaden
concentraciones variables del alergeno a alcuotas del
suero del paciente alrgico antes de la incubacin con
el alergeno unido a la matriz, es decir, hay una
incubacin previa en fase lquida. Cuanto ms potente
sea el alergeno en fase lquida, quedar menos IgE
libre para unirse al alergeno en fase slida.
Los resultados se expresan en la cantidad de alergeno
necesaria para inhibir en un 50% la unin mxima,
siempre que se comparen extractos parecidos; cuanto
menor sea la concentracin necesaria, ms potente ser
la fuente alergnica. La pendiente de la curva de
inhibicin obtenida proporciona informacin respecto a
la diversidad de alergenos que contiene un extracto.
Se emplea regularmente en la estandarizacin de
alergenos.

Radioinmunoelectroforesis cruzada
CRIE

Radioinmunoelectroforesis cruzada
CRIE
En la CRIE, los extractos alergnicos se separan mediante
electroforesis en gel de agarosa, al cabo de la cual el gel se
rota 90 y se contina la electroforesis en una agarosa que
contiene un antisuero contra el extracto alergnico completo
(inmunoelectroforesis cruzada, CIE). Las protenas migran en el
gel hasta que se encuentran con su anticuerpo IgG homlogo, el
cual, debido a las condiciones elegidas, permanece estacionario.
Una vez que ha interaccionado una cantidad suficiente de
anticuerpo con su antgeno homlogo, se forman precipitados que
se corresponden con en n de antgenos que contena la mezcla
original. Para determinar cul de las protenas precipitadas es
alergnica, la placa de CRIE sin teir se lava y se incuba con
el suero problema.
La IgE especfica del alergeno se une a los epitopos que
se encuentran en el precipitado y se detecta empleando
una anti-IgE marcada con isotopos.

Gel de separacin

Extacto alergnico

Transferencia de las
protenas separadas
a una membrana.
Corte en tiras.

Separacin de protenas
mediante SDS-PAGE

Incubacin de los sueros de los

pacientes, lavado y
visualizacin de la unin con
anti-IgE y autorradiografa

Inmunotranferencia
La inmunotransferencia se realiza despus de una
electroforesis en gel de poliacrilamida con
duodecilsulfato sdico. Los componentes proteicos
individuales de un extracto alergnico se someten a
electroforesis tras reduccin de los puentes disulfuro
intra e inter-catenarios. Las protenas se separan en
orden decreciente segn su Pm. Las prots se transfieren
posteriormente a una mbr de nitrato de celulosa y se
incuban con el suero problema. La IgE unida a los
alergenos individuales se visualiza empleando una
anti-IgE marcada.
La inmunotransferencia proporciona informacin sobre
el n y el Pm de los alergenos de un extracto.

Aislamiento
del alergeno

alergeno

PEG
Fusin
Cs esplnicas
(resistentes
a HAT)

Cultivo en
HAT

Mieloma no
secretor
(sensible a HAT)

Tcnica de
los Ac
monoclonales

Anlisis de pocillos positivos

Clones productores de Anticuerpos

Aislamiento
de alergenos

Mapeo de
eptopos

Cuantificacin
de alergenos

Purificacin del alergeno

Cromatografa de
penetrabilidad.
Cromatografa de
intercambio inico.
Cromatografa de afinidad
e hidrofobicidad.

Estandarizacin de alergenos

Requisitos para la estandarizacin:

Garantizar que la fuente alergnica proviene de las
especies adecuadas.
Garantizar que la fuente alergnica no est contaminada
con otras fuentes alergnicas.
Determinar que estn la mayora de los alergenos.
Medir y estandarizar el contenido alergnico total.
Determinar la concentracin de los principales alergenos
seleccionados en los casos en que se puedan realizar los
anlisis oportunos.
Garantizar que el extracto es biolgicamente activo.

Alergenos principales

Alergenos procedentes de una nica

fuente, que estimulan la produccin de IgE
en ms del 50% de los pacientes alrgicos
a dicha fuente.

Por qu falla el diagnstico el diagnstico

de alergia a un material biolgico en algunos
pacientes en los que los sntomas y la historia
clnica nos hablan de tal afeccin?

Por qu la inmunoterapia con extractos

alergnicos naturales funciona en unos pacientes
y no en otros?
qu utilidad tiene conocer cuales son los alergenos concretos de una fuente biolgica dada a
los que un paciente determinado presenta hipersensibilidad?

Ventajas
1) Cantidades limitadas.
2) Bajo rendimiento del proceso de purificacin.
3) Obtencin de la forma natural del alergeno,
nunca de formas modificadas.
4) Ausencia de estandarizacin.
5) Concentraciones muy diversas de alergenos.
6) Presencia significativa de productos
indeseables.
7) Desnaturalizacin, dao y degradacin proteica.

Inconvenientes

1) Mezcla completa de las isoformas.

Alergenos recombinantes

Ventajas
1) Disponibilidad de productos muy bien
definidos.
2) Produccin ilimitada de la protena.
3) Estabilidad del producto.
4) Posibilidad de expresar alergenos modificados.

Inconvenientes

1) Plegamiento.

Diagnstico alergolgico con separacin de componentes:

Discriminar entre co y cross- sensibilizacin
Co- sensibilizacin, frente a determinados
componentes moleculares alergnicos
presentes en diferentes fuentes de manera
separada e independiente.
I-

II-Reactividad cruzada entre alergenos presentes en

distintas fuentes

Alergenos Marcadores

Alergenos marcadores de Multisensibilizacin.

Predicen sensibilizacin cruzada frente a dif.alergenos
Profilina
Alergenos marcadores especficos
Alergenos que se producen exclusivamente en ciertos tejidos
vegetales y algunas plantas

Diagnstico alergolgico con separacin de componentes:

Aportaciones a la Inmunoterapia

-Permiten seleccionar estrategias terapeticas ptimas

-Discriminar si un paciente es adecuado de recibir
Inmunoterapia
-Disear tratamiento de Inmunoterapia a medida
-Disminuir el riesgo de sensibilizaciones de novo en la IT

IgE

sIgE

La Inmunoglobulina E (IgE) fue descubierta en 1966 por los

esposos Teruko y Kimisighe Ishizaka.
La respuesta alrgica se diferencia de otras rptas inmunitarias
pq depende de la IgE y su receptor de alta afinidad FcRI, y
tambin por la naturaleza de su ppal cl efectora, el mastocito
tisular.
La cuantificacin de esta Ig en suero constituye una tca de
rutina en el dx alergolgico.
La elevacin de IgE no es patognomnica de procesos alrgicos.
Valores se modifican con la edad, sexo, antecedentes familiares
de patologa alrgica y el propio proceso alrgico.

sIgE
La IgE es una molcula glicoproteica compuesta en su mayor parte
por protena y en una pequea proporcin por carbohidrato. Consta
de 4 cadenas de aminocidos, dos cadenas ligeras (L) y dos cadenas
pesadas (H) idnticas entre s.
La cadena L tiene un dominio terminal-N variable (VL) y un
dominio constante (CL ) mientras que la cadena H tiene un dominio
terminal-N variable (VH) y cuatro dominios constantes (CH). La
clase de Ac viene determinada por la secuencia CH, que se designa
como C para la IgE. Las cadenas ligeras, de acuerdo con su
constitucin particular, pueden tener 2 variantes que se han llamado
kappa (K) o Lambda (L) pero hay que aclarar que en una sola
molcula de IgE siempre sern iguales las 2 cadenas ligeras, es
decir, tendr las 2 del tipo K o las 2 del tipo L.

sIgE
Tanto las cadenas ligeras como las pesadas estn formadas por
segmentos de aproximadamente 110 aminocidos a los que se
llaman dominios los mismos que estn unidos entre s de modo
covalente por puentes o uniones disulfuro. En la IgE existen 2
dominios en cada cadena ligera y 5 dominios en cada cadena
pesada. Al igual que como ocurre en los otros tipos de
inmunoglobulinas, hay dominios llamados constantes (porque los
aminocidos que los componen mantienen siempre la misma
secuencia) y dominios variables (porque la secuencia de sus
aminocidos varia de una molcula a otra) que son los que por su
variabilidad de secuencia determinan la especificidad para el
antgeno.

sIgE

Las funciones ms importantes de la IgE se dan en sus extremos: por

el lado de sus dominios variables se une especficamente al Ag
mientras que por el otro extremo, a travs del CH4 tiene capacidad
para unirse a la membrana de la clula cebada, esto gracias a un
receptor presente en la superficie de esta clula que tiene gran
afinidad para la IgE, receptor que es conocido como Receptor de
alta afinidad para el Fc de la IgE (FceRI). La IgE tambin puede
unirse a eosinfilos y plaquetas a travs de otros receptores
expresados en la superficie de estas clulas y que en este caso se
conocen como Receptores de baja afinidad (FceRII).

Importancia de la sIgE en el dx de alergia

Los individuos atpicos se pueden dividir
en dos grupos:
Pacientes sintomticos
Pacientes asintomticos.
La sensibilizacin a alergenos puede
preceder a los sntomas y es un fuerte
factor de riesgo para la enfermedad
alrgica.
La sensibilizacin a alergenos es un factor
de riesgo para la persistencia de los
sntomas.

Valores normales de IgE

test in vitro sIgE

Apoyo diagnstico en hipersensibilidad IgE mediada,

similar a las PC
No influencia terapia farmacolgica.
No influencia enfermedades cutneas
Independiente del alergeno testado
Elevado nmero de alergenos a testar
En general ms especfica que las PC y menos sensible
Posibilidad de evaluar multialergenos
Ausencia de reacciones adversas
No exige personal con formacin especfica
Menos impacto educativo en el paciente que las PC

Variables a evaluar en la
determinacin de IgE Especfica

Complejidad alergnica
Extracto alergnico
Obtencin extracto
Variables
inmunoensayos
Caractersticas ptimas
de un ensayo de IgE
especfica

 Son realmente negativos los niveles bajos

de sIgE.

Boyano Martinez et al. Validity of specific IgE

antibodies in children with egg allergy. Clin Exp
Allergy 2001;31: 1464-9
Sasai K et al. Early detection of specific IgE antibody
against house dust mite in children at risk of allergic
disease. J pediatr 1996; 128:834-40.

El laboratorio en el Dx de la alergia alimentaria

EL RETO
Ayudar a establecer cuando un nivel de IgE es lo suficientemente
bajo para realizar de un modo seguro el test de provocacin

The relationship of allergen-specific IgE levels and oral food challenge outcome
Perry T, Matsui E, Conover- Walker M, Wood R: JACI;144-149;2004.04.09

GRACIAS