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ESCUELA DE GRADUADOS
UNIVERSIDAD DE CONCEPCION
ESCUELA DE GRADUADOS
Ha sido
(U
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(U
AGRADECIMIENTOS
Concluida esta etapa, no puedo dejar de agradecer, a quienes de una u otra manera,
colaboraron para hacer posible, este, mi primer gran sueo:
- A mi tutor, el Dr. Francisco Nualart, cuya experiencia cientfica ha sido el alero bajo el cual
me he formado durante todos estos aos.
- A la Prof. Karin Reinicke, por su constante apoyo, crtica cientfica y organizacin del
laboratorio.
- A los miembros del Departamento de Histologa y Embriologa, por permitir el desarrollo
de mi trabajo en un ambiente cmodo y agradable.
- A CONICYT, por confiar en m y brindarme apoyo econmico.
- Al Dr. Juan Carlos Vera, por su apoyo y sabios consejos.
- A la Sra. Mara de la Luz, por compartir su gran experiencia tcnica conmigo.
- A mi amigo Emilio, con quien compart gratos momentos de mi vida.
- A mis compaeras de laboratorio: Mnica, Esther, Carolina, Sofia, Mara de los Angeles y
Maite, quienes con su sincera amistad, hicieron ms grata mi estada en esta ciudad.
- Al Dr. David Golde, por el apoyo brindado fruto de la colaboracin entre ambos
laboratorios.
- A Viviana y Rosita, por su apoyo incondicional.
- A mi amigo Juan Carlos Tapia, por su chispeante y grata amistad.
A todos quienes me apoyaron, escucharon y soportaron durante todo este tiempo.
A todos ellos...
Muchas Gracias.
Esta Tesis de Grado ha sido financiada por los Proyectos de la Direccin de Investigacin de
la Universidad de Concepcin DIUC 96035001-1 y 98035001. En forma adicional,
parcialmente financiada por el Proyecto FONDECYT 1980130.
AlrmaPezoC.
Q.E.P.D.
INDICE GENERAL
Pginas
Indicegeneral. . ...................................................................... ... .........
VIII
IX
XII
1.
1.1
1.2
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.3.1
1.2.3.2
1.2.3.3
1.2.3.4
1.2.3.5
1.3
1.3.1
10
1.3.2
11
1.3.3
13
1.4
15
1.5
17
1.6
Hiptesis de trabajo
19
1.7
20
2.
21
2.1
21
2.1.1
21
2.1.2
21
2.1.3
21
2.1.4
21
2.2
23
2.2.1
23
2.2.1.1
23
2.2.1.2
23
2.2.1.3
Inclusin...............................................................................
23
23
2.2.2
24
2.2.2.1
24
2.2.2.2
24
2.2.2.3
24
24
2.2.3
24
2.2.3.1
24
25
25
25
2.2.3.2
26
2.2.4
26
II
26
26
27
28
2.2.4.3
29
29
30
3.
31
3.1
31
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.2
3.2.1
3.2.2
47
ifi
3.2.3
3.3
3.3.1
62
3.3.2
62
3.3.3
..
....
...
..................
4.
4.1
4.2
73
73
4.3
65
77
5.
87
6.
89
My
INDICE DE FIGURAS
Pgina
Figura 1. Modelo propuesto para la orientacin del transportador
facilitativo de glucosa (GLUT1) en la membrana plasmtica.................................
33
46
49
51
kTA
52
55
57
70
VII
INDICE DE TABLAS
Pgina
12
Vm
ABREVIATURAS
ABC
AEC
AP
ATP
BC IP
BSA
CDI
DAB
DEPC
DTT
dUTP
EDTA
FITC
GLUT
IgG
Km
NBT
PA P
PBS
PCNA
PEG
POD
SBR
SDS
SGLT
SSC
TdT
TEMED
TUNEL
complejo avidina-biotina-peroxidasa
3-amino-9-etilcarbasole
fosfatasa alcalina
trifosfato de adenosina
bromo-cloro-indol ii-fosfato
albmina de suero de bovino
carcinoma ductal invasor de mama
3,3-diaminobencidina
dietilpirocarbonato
ditiotreitol
trifosfato de deoxiuridina
etilendiamintetraacetato
isotiocianato de fluoresceina
transportador facilitativo de glucosa
inmunogiobulina G
constante de M ichael is-Menten
azul de nitrotetrasolio
complejo peroxidasa anti-peroxidasa
tampn fosfato salino
antgeno nuclear de proliferacin celular
polietilen glicol
peroxidasa
clasificacin Scar-Blom-Richardsoon
dodecil sulfato de sodio
transportador de Na7glucosa
tampn citrato de sodio standart
transferasa deoxinucleotidil terminal
N,N,Nt,N'-tetrametiletilendiamina
terminal; dUTP; nick; end; labeling
RESUMEN
La glucosa es incorporada a las clulas por medio de los transportadores facilitativos
de hexosas (GLUT), de los cuales se han descrito 5 isoformas (GLUT1-5). Las clulas
tumorales poseen un metabolismo de glucosa incrementado, lo que ha sido asociado a una
elevada expresin de GLUT1, y en algunos casos, de otras isoformas de GLUTs. Hasta el
momento, no se ha establecido claramente qu isoformas de GLUTs se encuentran presentes
en los distintos tipos tumorales, y menos an, si la sobre-expresin de GLUT1 y/o de otras
isoformas constituye una propiedad general de los tumores o se relaciona especialmente con
neoplasias de mayor agresividad. En este trabajo llevamos a cabo un anlisis detallado de la
expresin de diferentes isoformas de transportadores de glucosa en diversos tumores de
origen humano. Como una primera etapa, estandarizamos diferentes protocolos de
inmunocitoqumica para el anlisis de muestras frescas y de archivo, adems de las
condiciones de uso de los anticuerpos policlonales preparados contra cada isoforma de
GLUT. Posteriormente, analizamos mediante inmunocitoqumica, la expresin de GLUTs en
una serie de 110 muestras de tumores humanos, incluyendo 31 muestras de tumores de
mama. En este tipo tumoral, estudiamos la expresin de GLUT1 y GLUT5 a nivel de
microscopa ptica y electrnica, as como tambin a nivel de ARN mensajero, mediante RTPCR iii situ. Adems, intentamos correlacionar la expresin de GLUT1 con parmetros
biolgicos determinantes de agresividad tumoral, como la expresin de marcadores de
proliferacin celular (PCNA y Ki-67) y los ndices de apoptosis. Por ltimo, analizamos la
expresin de GLUT1 y GLUT5 en la lnea celular MDA-468 la que ha sido ampliamente
utilizada para modelar el comportamiento de clulas de cncer mamario in vitro, y en un
modelo biolgico de cncer de mama inducido en ratones "nude". Se encontr una relacin
directa entre la sobre-expresin de GLUTI en diferentes neoplasias y la expresin de otras
isoformas de transportadores de glucosa (GLUT2-GLUT5); los tumores que no expresan
GLUT1 tampoco sobre-expresan otras isoformas. En cncer de mama, los anlisis de RTPCR in situ mostraron una sobre-expresin del mensajero para GLUTI y GLUT5 con
respecto al tejido normal. GLUT1 se estudi realizando inmunocitoqumica a nivel ptico y
electrnico, observandose una localizacin preferencial en membranas plasmticas que
forman estructuras semejantes a "canaliculos intercelulares". Esta adaptacin indicara que la
clula tumoral realiza un "sorting" diferencial de GLUTI a regiones particulares de la
membrana de la clula tumoral. GLUT5 en cambio se localiz a nivel citoplasmtico y
especificamente en estructuras de tipo vesicular. Los estudios en clulas MDA-468 en
cultivo confirmaron los resultados obtenidos in vivo, observndose en este caso un "sorting"
diferencial de GLUT1 a regiones de membrana que contactan clulas adyacentes. La
xl
SUMMARY
Facilitative glucose transporters are a family of transmembrane proteins that mediate the
transport of glucose across cellular membranes and include five isoforms,
GLUT 1 /erythrocyte, GLUT2/liver, GLUT3/brain, GLUT4/muscle-fat, and GLUT5/sma!1
intestine. Tumor celis show increased uptake of glucose compared to normal celis, due to
enhanced metabolic needs and aerobic glycolysis. Although it has been established that the
increased uptake of glucose in sorne human malignant tumors is related to the overexpression of glucose transporters, no detailed study of the simultaneous expression of
distinct transporter isoforms in different tumors has been presented. Moreover, no
ultrastructural analysis of glucose transporter expression in tumors is available. In this
work, we standarized a number of imrnunocytochemical methods to study the expression of
glucose transporters in human samples. We analyzed the expression of different GLUTs
isoforms in 110 human tumor samples and additionally performed a detailed analysis of
GLUT1 and GLUT5 expression in malignan breast tumors at the optical and ultrastructural
levels. The expression of GLUT1 and GLUT5 mRNAs was confirmed by iii situ reverse
transcription coupled to a polymerase chain reaction (in situ RT-PCR). We also studied the
presence of different GLUTs in breast cancer ccli unes MDA-468 and MCF-7. GLUT1
expression was correlated with markers of cellular proliferation (PCNA) and apoptosis in
breast tumors during several stages of differentiation. The analysis of human breast tumors
was compared with tumors xenografted in nude mice injected with MDA-468 cells.
Immunocytochemical analysis revealed low to undetectable !eve!s of GLUTI
immunoreactivity in normal cells, with a clear increase in immunoreactivity in the tumor
cells. Wc observed a positive correlation between GLUT1 expression and the presence of
other GLUTs isoforms in the same tumors. Thus, the tumors that showed a low level of
GLUT1 expression did not show expression of glucose transporter isoforms. In breast
tumors, GLUTI immunoreactivity was localized in the celi periphery in 22% of the tumors.
GLUT 1 was preferentially localized in lateral membrane domains involved in ccli to ccli
contact between adjacent tumor cells, and was less evident in membranes in contact with
connective tissue. A similar GLUTI subcellular localization was observed in MCF-7 and
MDA-468 ce!ls grown in vitro, suggesting that it represents an intrinsic property of the
tumor ce!is that is maintained in the tumor celi unes. Ultrastructural analysis revealed the
presence of GLUT1 in specia!ized ceil membrane areas of adjacent ce!ls maintained in close
opposition by junctiona! complexes. We observed increased GLUT5 immunoreactivity iii
breast tumor cells as compared to normal tissue, and the expression of GLUT5 mRNA was
confirmed by in situ RT-PCR. Ultrastructural analysis revealed GLUT5 immunoreactive
MI
1. INTRODUCCION
1.1 Aspectos generales.
Los carbohidratos estn ampliamente distribuidos en vegetales y animales, donde
desempean funciones estructurales y metablicas muy vanadas. Glucosa, el carbohidrato
ms abundante, corresponde a una molcula altamente hidrofilica, y es considerada como el
principal combustible metablico requerido por las clulas para la produccin oxidativa y no
oxidativa de ATP (Lienhard y cols,, 1992; Mueckler, 1994; Mueckler, 1995).
En los mamferos, la absorcin de glucosa y otros monosacridos, se realiza en el
intestino delgado (Ferraris y Diamond, 1989), siendo la glucosa almacenada principalmente
en el hgado, msculos y tejido adiposo. Su concentracin a nivel sanguneo est regulada en
todo momento, por factores como la ingestin diaria y el balance homeosttico realizado por
hormonas secretadas en las clulas A y B del pncreas, entre otras.
La gliclisis es la principal va metablica para la utilizacin de glucosa, y se lleva a
cabo en todas las clulas en algn momento de su desarrollo. Es una va nica, ya que puede
utilizar oxgeno si est disponible (aerbica) o puede proseguir sin l (anaerbica). En
condiciones anaerbicas, la gliclisis prosigue hasta la formacin y acumulacin de lactato,
con produccin de 2 moles de ATP por molcula de glucosa hidrolizada. Sin embargo,
cuando se introduce el oxgeno, no hay acumulacin de lactato y el piruvato se convierte en
el principal producto final. Este ltimo no se acumula, debido a que prosigue a travs de la
va de la piruvato dehidrogenasa, hasta el ciclo de los cidos tricarboxlicos, en donde se lleva
a cabo el catabolismo de los residuos acetilos, en forma de acetil-coA, producidos a partir
del piruvato. En este proceso se liberan equivalentes de hidrgeno, los que al ser
introducidos a la fosforilacin oxidativa, permiten aumentar considerablemente la
produccin de ATP por molcula de glucosa hidrolizada (36 moles de ATP/mol de glucosa).
De este modo, la presencia y utilizacin de oxgeno por la clula, permite optimizar en gran
medida la produccin de energa a partir de la metabolizacin de esta hexosa.
Gliclisis no slo es la va principal para el metabolismo de glucosa, si no que
tambin, proporciona una ruta importante para metabolizar fructosa y galactosa
procedentes de los alimentos. Sin embargo, poco se conoce sobre los procesos que median la
incorporacin y metabolismo de estos monosacridos, los cuales son utilizados por un
reducido nmero de tejidos en el organismo humano.
O1igosacrido
mutaciones genticas en una misma clula. De esta forma, la clula neoplsica expenmenta
diversas alteraciones con respecto a su equivalente normal, como son: a) cambios
proliferativos, b) alteracin en su sobrevida y c) cambios metablicos (Rubin y Farber,
1990; Robbins y cols., 1995).
1 .3.1 Cambios proliferativos: Los tejidos normales controlan su nmero celular, regulando
por un lado, la proliferacin, y por otro, la tasa de recambio. Estos procesos, como se
mencion anteriormente, estn bajo el control de los proto-oncogenes, genes supresores de
tumores y genes que inducen y regulan la muerte celular (apoptosis). Las alteraciones que
pueden experimentar los proto-oncogenes son numerosas y a distintos niveles en las vas de
transduccin de seales, resultando generalmente, en la sobre-estimulacin de la actividad de
estas molculas y por ende en una proliferacin descontrolada y anormal. Por otro lado,
mutaciones en los genes supresores de tumores se traducen por una parte, en una falla de la
inhibicin del ciclo celular en los puntos de restriccin especficos, con lo cual el ciclo
prosigue sin control, aumentando el nmero celular, y por otra, en una falla en el control de
la estabilidad del ADN, con lo cual, las posibles mutaciones no pueden ser reparadas y la
clula aumenta sus probabilidades de una futura transformacin maligna. Uno de los genes
supresores de tumores ms estudiados hasta el momento, ha sido el gen P53, cuyo producto
de expresin tiene como funcin, supervisar la integridad del genoma sirviendo como un
punto de control a nivel de G1IS. Si p53 detecta alguna alteracin en el material gentico,
activa la maquinaria de reparacin del ADN y la secuencia del material gentico es
restaurada. Sin embargo, cuando las alteraciones son demasiado extensas y no pueden ser
reparadas, p53 activa la cascada de proteasas especficas (caspasas) las que conducen a la
muerte de la clula daada, asegurando de esta forma, que estas mutaciones no se transmitan
a las futuras generaciones celulares (Shostak y cois., 1999). Ahora bien, cualquier mutacin
en el gen P53 se traducir en la produccin de una protena alterada, incapaz de cumplir su
funcin adecuadamente, por lo que las probabilidades de desarrollar una neoplasia aumentan
considerablemente, ms an, se ha documentado alta expresin de la protena p53 mutada en
neoplasias malignas de mama y colon (Soong y cols., 1997).
Est bien establecido que el aumento en la proliferacin es un evento comn en la
gran mayora de las neoplasias, siendo considerado adems, como un factor pronstico en
algunos tipos tumorales. La determinacin del estado proliferativo de un tumor, es un
anlisis de rutina en patologa, y se realiza mediante la determinacin inmunohistoqumica de
ciertos marcadores o indicadores de proliferacin, los cuales corresponden a protenas
nucleares, que tienen la particularidad de ser expresadas en clulas que estn en cualquier
10
etapa del ciclo celular, pero que no se expresan en aquellas clulas que estn en estado Go.
Dentro de estos indicadores, los ms conocidos son Ki-67 y el antgeno nuclear de
proliferacin celular (PCNA) (Takasaki y cols., 1981; Veronese y cols., 1993). La deteccin
inmunocitoqumica de estos marcadores permite establecer con bastante claridad el nivel de
proliferacin in situ, que presenta un determinado tumor en un momento dado y de esta
manera poder evaluar su comportamiento y desarrollar terapias adecuadas, considerando el
estado proliferativo real del tumor (Veronese y cols., 1993).
1.3.2 Alteraciones de la apoptosis: La regulacin del nmero celular en los tejidos, se realiza
en parte, por un proceso fisiolgico denominado muerte celular programada o apoptosis.
Este proceso se caracteriza por la expresin de un conjunto de genes activados por diversos
estmulos, los que se traducen en cambios morfolgicos y bioqumicos de la clula. Estos
cambios le dan a la clula apopttica una caracterstica morfolgica muy particular (ver tabla
1). Como se dijo anteriormente, apoptosis es un evento fisiolgico, lo que implica que existe
una homeostasis constante en los tejidos en los cuales se est desarrollando este proceso, a
diferencia de la necrosis, que es un tipo de muerte celular inducida por un proceso de injuria
tisular.
Se ha determinado que la apoptosis se produce por la accin concertada de un
conjunto de proteasas que han sido denominadas caspasas, y cuya activacin desencadena
variados eventos en la clula. Un evento temprano y caracterstico en apoptosis, es la
fragmentacin internucleosomal del ADN celular, lo que ha servido para el desarrollo de
metodologas destinadas a identificar las clulas apoptticas in situ, mediante el uso de una
enzima (TdT), que aade nucleotidos marcados a los extremos 3'OH del ADN fragmentado,
pudiendo estos nucleotidos ser detectados por mtodos inmunolgicos.
Se ha establecido adems, que el proceso de apoptosis est regulado negativamente
por un conjunto de genes, de los cuales Bcl-2 ha sido uno de los ms analizados hasta el
momento, y cuyo producto de expresin ha sido relacionado con la inhibicin de muerte
celular en modelos biolgicos in vivo e in vitro (Larsen, 1994).
Teniendo en cuenta los antecedentes presentados anteriormente, se puede deducir
que cualquier mutacin en los genes que promueven la apoptosis o en los inhibidores de los
genes represores, produce el bloqueo de los eventos de apoptosis, con el consecuente
aumento en la sobrevida de las clulas del tejido sometido a este tipo de alteracin, lo que
Tabla 1. Comparacin entre los tipos de muerte celular, apoptosis y necrosis, desde el
punto de vista morfolgico y bioqumico.
APOPTOSIS
NECROSIS
CRITERIOS MORFOLGICOS
Delecin de clulas nicas
Lisosomas intactos
Ruptura de lisosomas
CRITERIOS BIOQUIMICOS
Inducida por estmulos fisiolgicos
No fisiolgica
Requiere de energa
No requiere de energa
12
1.3.3 Alteraciones metablicas: Entre los cambios metablicos destacan, bsicamente, las
modificaciones en el metabolismo glicoltico, el cual se hace principalmente anaerbico, lo
que conlieva a una menor produccin de ATP por molcula de glucosa hidrolizada (Robbins
y cols., 1995; Younes y cols., 1996a). Este cambio en la actividad glicoltica celular, persiste
an en presencia de oxgeno; siendo el consumo de oxgeno, notoriamente reducido en estas
clulas. Anlisis tumorales in vitro e in vivo, han demostrado que la captacin y consumo de
glucosa por parte de clulas neoplsicas aumenta en un 300%, con respecto a sus
equivalentes normales, mientras que el consumo de oxigeno disminuye dramticamente.
Estudios de medicin de la actividad de las enzimas del ciclo de Krebs y la fosforilacin
oxidativa han evidenciado una dramtica disminucin, sugiriendo incluso, que algunas de
estas enzimas dejan de funcionar, lo que resulta en una excesiva acumulacin de piruvato y
un aumento notable de la concentracin de lactato en la clula. Ms an, tanto las enzimas
del ciclo de Krebs, como las de la fosforilacin oxidativa estn localizadas en las
mitocondrias, organelos que se encuentran muy disminuidos en la clula tumoral con
respecto a la normal. No obstante, an no se tiene una explicacin satisfactoria del por qu
de esta modificacin en las rutas metablicas de la clula neoplsica. Sin embargo, se postula
que uno de los mecanismos de sobrevivencia de los tumores anaplsicos, es la utilizacin de
rutas metablicas menos complejas, de manera de simplificar al mximo su metabolismo
para poder obtener ventajas comparativas sobre su tejido huesped.
13
tasa de incorporacin mayor en las clulas tumorales que en el tejido normal (Nieweg y
cois., 1993), pudindose detectar con bastante certeza, la localizacin y magnitud de una
determinada masa tumoral. Este mtodo se ha utilizado principalmente para el diagnstico y
evaluacin del curso clnico experimentado por los pacientes con neoplasias de esta
naturaleza (Nieweg y cols., 1993b)
14
15
Carcinomas no invasoresa
la. Carcinoma intraductal.
lb. Carcinoma intraductal con enfermedad de Paget.
2. Carcinoma lubulillar ,z situ.
Carcinomas In vasoresa
la. Carcinoma ductal, sin otra especificidad.
lb. Carcinoma ductal infiltrante con enfermedad de Paget.
2. Carcinoma lobulillar infiltrante.
3.- Carcinoma medular.
4.- Carcinoma coloide (mucinoso).
5.- Carcinoma tubular.
6.- Carcinoma adenoide qustico.
7.- Carcinoma apocrino,
8.- Carcinoma papilar infiltrante.
aRbbflS
16
casos pueden verse tambin componentes intraductales. Las clulas malignas invaden el
estroma de tejido conectivo, siendo, frecuentemente fcil, observar invasin de espacios
perivasculares y perineurales, as como de vasos sanguneos y linfticos, lo que sin duda
pone de manifiesto la presencia de clones metastsicos en estas neoplsias.
La graduacin de estos tumores obedece a una estimacin de su diferenciacin, la que
est limitada a la porcin invasiva del tumor. Hasta el momento, esta clasificacin se realiza
segn dos criterios ampliamente establecidos. El primero de ellos evala el grado de atipia
nuclear y el segundo, la diferenciacin histolgica (tabla 2).
La primera clasificacin (atipia nuclear), considera la citologa de los ncleos
tumorales en comparacin con los ncleos de las clulas epiteliales normales, reportndolos
en trminos de tres categoras: Bien diferenciados (grado III), intermedio (grado II) y
pobremente diferenciado (grado 1). La graduacin nuclear no proporciona informacin sobre
el patrn de crecimiento del tumor, por lo tanto, esta clasificacin puede ser aplicada,
indistintamente, a los carcinomas ductales invasores, como a cualquier otro subtipo de
carcinoma mamario (Rossen, 1996). El segundo tipo de clasificacin (histolgica), describe el
patrn de crecimiento microscpico de los CDI, as como tambin, los rasgos citolgicos de
diferenciacin. El grado histolgico es, usualmente, expresado en tres categoras: Bien
diferenciado (grado 1), moderadamente diferenciado (grado II) y pobremente diferenciado
(grado III). Con respecto a este tipo de clasificacin, existen muchas variantes, dentro de las
cuales, una de las ms utilizadas es la propuesta por Scar-Bloom-Richardsoon (SBR). Esta
clasificacin es ampliamente utilizada en los servicios de patologa y es la que se ha
considerado para la evaluacin de las muestras tumorales proporcionadas para nuestro
estudio.
1.5 Expresin de GLUTs en cncer de mama.
El cncer de mama, al igual que la gran mayora de las neoplasias, tiene la
caracterstica de poseer una actividad metablica y de captacin de glucosa elevada (Brown
y Wahl, 1993). Diferentes estudios (Brown y Wahl, 1993; Younes y cols., 1996a; ZamoraLen y cols., 1996) y resultados obtenidos en nuestro laboratorio (Godoy y cols., 1996;
Castro y Nualart, 1997; Godoy y cols., 1997), evidencian una sobre-expresin de la
isoforma GLUT1 en este tipo tumoral. Referente a la expresin de las otras isoformas,
Brow y Wahl (1993) detectaron GLUT2, GLUT3 y GLUT4 en adenocarcinoma de mama,
no observando expresin de GLUT5. Anlisis posteriores (Zamora-Len y cols., 1996) han
17
propuesto que la clula tumoral de mama tambin expresa GLUT5, y por lo tanto, posee la
capacidad de metabolizar fructosa. Este hecho, como se mencion anteriormente, tiene
particular importancia puesto que se tiene muy poca informacin sobre el metabolismo de
esta hexosa en el organismo humano y adems, se sabe muy poco sobre el metabolismo de
hexosas, diferentes de glucosa, por la clula mamaria tumoral. La expresin de GLUT5 en
cncer de mama sugiere, por tanto, que esta neoplasia tiene la capacidad potencial de
incorporar fructosa, la cual podra ser utilizada como una fuente alternativa para la
obtencin de energa metablica por parte de estas clulas. Este hecho, abre nuevas
posibilidades para una mejor comprensin de las adaptaciones metablicas que pudiesen
realizar las clulas neoplsicas mamarias.
Si bien se han realizado diferentes estudios tendientes a determinar la expresin de
GLUTs en cncer de mama, no existen anlisis detallados de la expresin y distribucin de
GLUTs en cncer de mama a nivel celular y subcelular, como tampoco, estudios que
permitan correlacionar estos hallazgos con parmetros de progresin tumoral, proliferacin
celular y muerte celular programada. Es fundamental realizar estudios que permitan dilucidar
estas interrogantes y que ayuden a comprender en parte, la biologa de la clula tumoral de
una manera ms completa y globalizada, considerando todos los aspectos que determinan el
comportamiento ms o menos agresivo de una determinada neoplasia, para as poder abordar
su tratamiento clnico de manera ms integral. Estos estudios permitirn, adems, avanzar en
la bsqueda de nuevos criterios para la clasificacin de estas neoplasias, basndose no solo
en las caractersticas morfolgicas de la clula, sino que tambin en aspectos moleculares,
propios de la neoplasia. Junto con esto, se abren perspectivas para la aplicacin de nuevas
tcnicas de diagnstico precoz y tratamiento del cncer.
lo
1 .6 Hiptesis de trabajo.
Existe un conjunto de estudios tendientes a establecer la expresin de
transportadores de hexosas en diferentes tipos de neoplasias. Estos anlisis han permitido
observar que algunos tumores expresan altas concentraciones de GLUT 1, sin embargo, no se
han considerado importantes preguntas relacionadas con la localizacin de la expresin de
GLUT1 en estos tumores y su relacin con malignidad tumoral. Anlisis iniciales realizados
en cncer de colon, permiten sugerir que a medida que avanza el tumor y aumenta su
malignidad existe una mayor expresin de GLUT1, sugiriendo que la expresin de esta
isoforma puede ser utilizada como un marcador de malignidad tumoral (Younes y cols.,
1996b) Si bien existen algunos estudios relacionados con la expresin de GLUTI, poco se
conoce sobre la expresin y funcin de otras isoformas de GLUTs en cncer, as como
tambin de la relacin que pudiese existir entre la expresin de las diferentes isoformas de
GLUTs y marcadores de proliferacin celular y apoptosis.
En nuestro estudio, nos hemos propuesto la siguiente hiptesis de trabajo: " La
sobre-expresin de GLUTI en diferentes neoplasias humanas est directamente relacionada
con el grado de agresividad tumoral. La expresin de otras isoformas de GLUTs es una
propiedad particular de cada tumor, permitiendo a estas neoplasias metabolizar hexosas
diferentes de glucosa, que presentan vas metablicas menos reguladas".
19
1.7 Obtjetivos.
Los objetivos planteados en nuestro estudio, son los siguientes:
Estandarizar diferentes mtodos inmunohistoqumicos y de hibridacin in situ para la
deteccin de GLUTs a nivel de protena y RNA, respectivamente.
2.- Analizar la expresin de transportadores de hexosas GLUTI-5 en diversas neoplasias
humanas y establecer su correlacin con el tejido normal.
3.- Determinar la expresin, a nivel celular, de GLUT1 y GLUT5 en neoplasias de mama
con diferentes grados de desarrollo tumoral.
4.- Determinar la expresin de GLUT1 y GLUT5 en cncer de mama a nivel subcelular
utilizando microscopa electrnica.
5.- Analizar y correlacionar la expresin de marcadores de proliferacin celular Ki-67 y
PCNA con la expresin de GLUT1, en cncer de mama.
6.- Correlacionar el nivel de expresin de indicadores de muerte celular programada con
expresin de GLUT1, en cncer de mama.
2. MATERIALES Y METODOS
2.1- Materiales biolgicos.
2.1.1 Anticuerpos: Nuestro laboratorio dispone de una completa batera de anticuerpos
primarios para la deteccin de las diferentes isoformas de GLUTs, as como tambin, para
diferentes tipos de marcadores celulares. Poseemos adems, un conjunto de anticuerpos
secundarios conjugados a diferentes enzimas, fluorocromos y partculas de oro, adems de
complejos multienzimticos (PAP) para la deteccin de los anticuerpos secundarios
respectivos (ver tabla 3).
2.1.2 Tumores de archivo y tejidos normales: Para el estudio de neoplasias de diversos
orgenes, se analiz un conjunto de muestras de archivo provenientes de 20 tumores
diferentes. Estas muestras fueron facilitadas por los Servicios de Anatoma Patolgica del
Hospital Regional de Valdivia, Departamento de Patologa de la Universidad de Concepcin
y el Programa de Farmacologa Molecular del Memorial Sloan-Kettenng Cancer Center
(MSKCC), Nueva York, USA. En el caso del cncer de mama, se analizaron 33 muestras de
carcinoma ductal invasor, con diferentes grados de diferenciacin histopatolgica (2
muestras SBR 1, 17 de grado SBR II y 11 de grado SBR III). La totalidad de las muestras de
carcinoma ductal invasor de mama, fueron facilitados por el servicio de Patologa de la
Universidad de Concepcin. Las muestras de 5 tumores de mania inducidas en ratones
"nude" fueron donadas por el MSKCC. Paralelamente, se analizaron tejidos controles,
provenientes de 17 muestras de mama humana normal, donadas por el MSKCC.
2.1.3 Clulas en cultivo: Para los anlisis de expresin in vitro, se utilizaron las lneas
celulares de cncer de mama MDA-468 y MCF-7 (American Type Culture Collection), las
que fueron donadas por el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nueva York. USA. Las
clulas se hicieron crecer en una mezcla de medio Eagle modificado por Dulbecco, el cual
contiene glucosa 17.5 mM y medio F- 12 (1:1 vollvol), suplementado adems con suero
bovino fetal 10% y penicilinalestreptomicina 1%.
2.1.4 Aislamiento de membranas de eritrocitos: Se obtuvo sangre fresca por puncin venosa
y se centrifug a 3000 rpm por 10 min para separar los eritrocitos del resto de los
componentes sanguneos. El sobrenadante se elimin por aspiracin y el "pellet" de
21
Dilucin
GLUTI
conejo
1:1000
GLUT2
1:1000
GLUT3
conejo
conejo
GLUT4
conejo
1:1000
1:1000
GLUT5
Antgeno Nuclear de
conejo
1:1000
Proliferacin Celular
ratn
1:100
DAKO
conejo/ratn
1:500
DAKO
ratn
Inmunoglobulina de conejo
cerdo
1:200
1:100
DAKO
DAKO
Inmunoglobulina de ratn
conejo
conejo
1:100
1:100
DAKO
DAKO
ratn
1:50
DAKO
Digoxigenina-POD
oveja
1:500
B. Mannheim
Digoxigenina-AP
oveja
oveja
1:500
1:50
B. Mannheim
biotinilada
Inmunoglobulina de ratn
biotinilada
Inmunoglobulina de conejo-
cerdo
1:400
DAKO
conejo
1:200
DAKO
FITC
Inmunoglobulina de conejo-
cerdo
1:30
DAKO
AP
cabra
1:500
SIGMA
Nombre
-
-PAP conejo
PAP ratn
FITC-AP
Inmunoglobulina de conejo
B. Mannheim
DAKO
Sistema ABC
Inmunoglobulina de conejoPartculas de oro
Marca
1:50
cabra
22
BBlnternational
eritrocitos se lav 3 veces en PBS 150 mM (pH 7.4) para eliminar el resto de plasma.
Luego, los eritrocitos fueron usados en fosfato de sodio 5 mM (pH 7.4) y se centrifug la
muestra a 10.500 rpm por 30 mm. Posteriormente, el "pellet" se lav en fosfato de sodio 10
mM (pH 7.4) 4 a 5 veces y luego se alicuot y almacen a 70C hasta su uso como control
positivo en la metodologa de "immunoblotting".
2.2 Mtodos.
Los mtodos que comprenden, el procesamiento previo y posterior anlisis de las
muestras, son los siguientes:
2.2.1. Procesamiento de las muestras.
2.2.1.1 Fijacin: Las muestras se fijaron por inmersin en formalina acuosa al 10%, durante
un perodo de 24 a 48 hrs, luego de lo cual, se lavaron en agua corriente por 1 hr
aproximadamente. Algunas de las muestras se fijaron por inmersin en solucin Bouin,
durante un perodo de 72 hrs.
2.2.1.2 Deshidratacin y aclaramiento: Previo a la inclusin en parafina, las muestras se
sometieron, indistintamente, a los procesos de deshidratacin y aclaramiento:
- Deshidratacin: Las muestras fueron pasadas por una batera de etanoles a concentraciones
crecientes (etanol 70%, etanol 95%, etanol 100% 1-1V) por 15-20 min cada vez.
- Aclaramiento: Las muestras se pasaron por benzoato de metilo (1411), por 30 min cada
vez, luego de lo cual, se incluyeron en benzol (141) por 5 mm.
2.2.1.3 Inclusin: Una vez sometidas al proceso de aclaracin, las muestras fueron incluidas
en parafina o paraplast a 60C y luego enfriadas rpidamente en agua, para solidificar el
paraplast.
2.2.1.4 Obtencin y montaje de los cortes: De cada muestra, incluida en bloque de paraplast,
se obtuvieron cortes de 7 ptm de espesor con un micrtomo Reichert jung 2040, luego, los
cortes se montaron en porta-objetos cubiertos en poli-L-lisina al 0.1% (Sigma) o gelatina al
1% (BDH), para favorecer la adhesin de la muestra al vidrio, en un bao termorregulado
23
24
utilizados, las muestras se incubaron con los anticuerpos primarios correspondientes (tabla
3), durante toda la noche en cmara hmeda a temperatura ambiente.
2.2.3.1.1 Mtodos PAP: Posterior a la incubacin con el anticuerpo primario, las muestras
analizadas por el mtodo de PAP, se lavaron 3 veces en tampn Tris-fosfato 10 mM (pH
7.8) por 10 min cada vez, luego de lo cual, se incubaron con el segundo anticuerpo anti IgG
de ratn o conejo, segn correspondi, durante un periodo de 2 a 4 hrs a temperatura
ambiente. Posteriormente, las muestras se lavaron 3 veces en tampn Tris-fosfato 10 mM
(pH 7.8) por 10 min cada vez y se incubaron con PAP de ratn o conejo, durante 30
minutos a temperatura ambiente. Por ltimo, la reaccin enzimtica fue revelada utilizando
diferentes sustratos:
a) 3,3 diaminobenzidina y perxido de hidrgeno, por 15 minutos (Nualart y Rodrguez,
1996).
b) Complejo "DAB/METAL concentrate" (Pierce) diluido 1: 10 en "buffer sustrato stable
peroxide" (Pierce), durante 3 a 5 mm.
e) PAP-AEC en cambio, se revel con una solucin tampn acetato 0.1 M (pH 5.2), en
presencia de 3-amino-9-etilcarbasol y perxido de hidrgeno al 3%, por 15-20 mm.
2.2.3.1.2 Mtodos de segundo anticuerpo marcado: Posterior a la incubacin del anticuerpo
primario, las muestras fueron incubadas utilizando:
a) Un segundo anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina (tabla 3), por 2 hrs en cmara
hmeda a temperatura ambiente. La actividad enzimtica fue revelada con bromo-cloroindolil-fosfato (BCIP) y "nitro-blue-tetrazolium" (NBT) en presencia de tampn Tris-HC1
0.1 M (pH 9.5) NaC1 0.1 M, MgC1 2 0.05 M.
b) Un segundo anticuerpo conjugado con partculas de oro (tabla 3), durante 2 hrs en cmara
hmeda a temperatura ambiente. Este sistema fue revelado con una solucin de nitrato de
plata (Silver enhancer, SIGMA).
c) Un segundo anticuerpo conjugado a fluorescena (tabla 3) por 3 hrs, protegido de la luz
directa. La imagen fluorescente fue procesada utilizando un sistema de digitalizacin "Axon
Imagin Worbench 2.1" acoplado al microscpio de epifluorescencia.
2.2.3.1.3 Mtodo de avidina-biotina (ABC): El mtodo de deteccin ABC, incorpora el uso
del complejo avidina-biotina (DAKO), un sistema de alta sensibilidad para deteccin de
antgenos. Se utiliz un anticuerpo secundario biotinilado (DAKO) el cual fue incubado por
30 min en cmara hmeda a temperatura ambiente. Luego de lavar las muestras en tampn
Tris-fosfato 10 mM (pH 7.8), se incub con el complejo ABC [A: avidina en PBS (pH 7.2)
25
B: Peroxidasa biotinilada en PBS (pH 7.2) C: Tampn Tris-HC1 0.05 M (pH 7.6)] por 30
min en cmara hmeda. La actividad enzimtica fue revelada como el mtodo de peroxidasa
convencional (revelado DAB normal).
2.2.3.2 Inmunolocalizacin ultraestructural: Cada muestra fue fijada en Karnovsky [tampn
fosfato 0,1 M (pH 7.4), p-formaldehido 4%, glutaraldehido 2.5%], post-fijadas con
tetrxido de osmio al 1% por 1 h a 4 C, e incluida en epon-araldita. Los cortes ultrafinos
fueron contrastados, para su observacin, con acetato de uranilo y citrato de plomo al 1%.
Para inmunocitoqumica, previo a la incubacin con el primer anticuerpo, los cortes
ultrafinos se trataron con perxido de hidrgeno 3% y/y por 5 minutos para eliminar el
osmio. El suero anti-GLUT1 fue diluido 1:500 en Tris-HC1 10 mM (pH 7.4), conteniendo
BSA 1% e incubado por 16 h a 4C. Como segundo antisuero se utiliz anti-IgG de conejooro (jartculas de 10 nm) diluida 1:25 en tampn-Tris-HC1 10 mM sin BSA. La incubacin
se realiz por 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, los cortes fueron contrastados con
uranilo y plomo al 1%, cubiertos con una membrana de carbn y observados al microscopio
electrnico.
2.2.4. Mtodos de biologa molecular.
2.2.4.1 Marcaje de sondas: Las sondas oligonucleotdicas utilizadas en la tcnica de
hibridacin in situ con "oligo-probe" fueron diluidas a una concentracin de 2 pg/ml en
tampn Tris-EDTA 10 mM (pH 8.0). Luego, se marcaron con biotina-14-dUTP, utilizando
la enzima TdT (Gibco) por 2 h a 37C (Sambrook y cols., 1989). Esta enzima aade
nucleotidos marcados a los extremos 3'OH del DNA. Las sondas oligonucleotdicas para
cada transportador corresponden a los ltimos 40 nucletidos de la regin 3' de los RNA
mensajeros respectivos.
GLUT 1: 5 'CACTTGGGAGTCAGCCCCCAGAGGGTGGAAGAGCTCCTA3'
GLUT5: 5 'CTGTTCCGAAGTGACAGGTGGAAGCTCTTTCAGTTCCTCC3'
2.2.4.2 Obtencin de sondas de RNA por transcripcin iii vitro: El proceso de transcripcin
in vitro se realiz a partir del cDNA para GLUT1 y GLUT5 donado en un vector de
expresin plasmidial (pcDNA3). El inserto para GLUTI y GLUT5 se localiz entre los
sitios de restriccin para Kpn y Xho 1 del plasmidio (pcDNA3). El vector de expresin
contiene dos sitios promotores para RNA polimerasas virales SP6 y T7, ubicados a cada
27
29
30
3. RESULTADOS
En una primera etapa de este trabajo de tesis, nos propusimos estandarizar las
condiciones para el desarrollo de la metodologa de inmunocitoqumica, comenzando por
analizar la especificidad de los anticuerpos policlonales, hechos contra las diferentes
isoformas de GLUTs (GLUT1-GLUT5). Para esto, estudiamos la expresin de cada
isoforma en tejidos controles, teniendo en cuenta que cada una de ellas posee un patrn de
expresin caracterstico. La expresin de GLUT1 se analiz en tejido cerebral, en donde se
observ una fuerte reaccin en membranas de clulas endoteliales de los micro-capilares que
forman la barrera hemato-enceflica (Fig. 2, A, flecha). GLUT2 fue analizado en tejido
heptico, donde se observ inmunoreactividad en las membranas plasmticas de los
hepatocitos (Fig. 2, B, flecha). GLUT3 se estudi en testculo humano, detectndose
expresin en membranas celulares de espermtidas (Fig. 2, C, flecha). La expresin de
GLUT4 se comprob en tejidos insulino-sensibles como es el caso del tejido adiposo. En
este tejido, se observ expresin de GLUT4 en la membrana plasmtica de los adipocitos
(Fig. 2, D, flecha). La expresin de GLUT5 se confirm en eritrocitos humanos (Fig. 2, E,
flecha). No se observ reactividad cuando el anticuerpo primario fue omitido o incubado
previamente con el pptido inductor correspondiente (Fig. 2, F). Adicionalmente, se analiz
la especificidad de GLUT1 y GLUT5 mediante la tcnica de inmunodeteccin de protenas
inmobilizadas en papeles de nitrocelulosa despus de la electroforesis. Se observ que antiGLUT1 reconoce una banda de un tamao molecular entre 45 y 66 kDa (Fig. 2, A, surco 1).
Anti-GLUT5 en cambio, reconoce una banda de 66 kDa aproximadamente (Fig 2, A, surco
3). En ambos casos se observ que la reactividad no se present cuando el anticuerpo
primario fue incubado previamente con el pptido inductor correspondiente (Fig. 2, B,
surcos 2 y 4). Ambos resultados estn de acuerdo con lo descrito previamente en la
literatura (Concha y cols., 1997; Zamora-len y cois., 1995).
31
32
f..
GLUT1
GLUT3
GLUT
GLUT5
GLUT1 GLUT5
97 66
. I
45 -*
29 -
23 4
33
Control
34
35
+DRB
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PAP DAB
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ABC
36
4 .
Tincin
negativa
dbil
moderada
intensa
++
+++
citoplasma
citoplasma
Smbolos
Localizacin
negativa
dbil. +
-'
i-
moderada +4-
.;fl:..
membrana celular
y citoplasma
tenp
4++
37
Diagnstico
Clon
Normal
Adenocarcinoma
Normal
Carcinoma invasor
Normal
Rhadomiosarcoma
Normal
Carcinoma
Normal
Melanoma
Basocelular
Normal
Carcinoma
Normal
Carcinoma
Carcinoma indiferenciado
Mesotelioma (pleura)
Normal (ceis. germinales)
Seminoma
Carcinoma embrionario
G. Mamaria
M.Esquelt.
Ovario
Piel
Prstata
Pulmn
Testculo
Total
*
Solo en clulas basales.
** Reaccin focal en reas cercanas a necrosis
ND: No determinado.
Positivos/total
013
Intensidad
-
818
0/12
28133
Nl)
112
015
313
3/3
212
1/1
10/15 *
5122**
0/5
212
4/4
2/2
3/3
315
212
16146 61/86
+
+/+++
+++
+++
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MESOTEL1TiA
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1.
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AL
4.
CARCINMA DE COLON
Control
40
plasmtica que estn en contacto con el tejido conectivo (Fig. 5, C, cabeza de flecha). Junto
con la elevada reaccin a nivel de membrana plasmtica, tambin se observ
inmunoreactividad para GLUTI en el citoplasma de las clulas tumorales, no obstante, esta
reactividad fue siempre de menor intensidad que la observada en la membrana plasmtica
(Fig. 5, C, 1, L).
El anlisis de inmunocitoqumica permiti determinar que existe un grupo de tumores
que poseen bajos niveles de expresin de GLUT1. Dentro de este grupo de tumores se
clasificaron adenocarcinoma de pncreas, astrocitomas, carcinoma de rion, hgado,
estmago, y leiomioma de tero (Tabla 5). La deteccin de GLUT1 en estas neoplasias, se
observ preferencialmente a nivel citoplasmtico (Fig. 6, A-H), adems, se determin que la
gran mayora de las clulas de una misma muestra presentaron similares niveles de
reactividad para GLUT1 (Fig. 6, E-H, flechas). La reactividad celular contrast con la
reaccin negativa del parnquima tumoral (Fig. 6, G). Slo el linfoma de Hodgkin y el
carcinoma papilar de ovario no presentaron reaccin positiva para GLUT 1, an cuando, se
analiz un nmero bastante significativo de muestras.
3.1.4 Anlisis de otras isoformas de GLUT (GLUT2-GLUT5) en diferentes tumores
humanos.
Anlisis previos de expresin de GLUTs en tipos particulares de neoplasias, como
por ejemplo, el cncer de pulmn (Younes y cols., 1997a) sugieren que estos tumores
pudiesen estar expresando otras isoformas de GLUTs (en este caso particular, la isoforma
GLUT3), conjuntamente con la expresin de la isoforma GLUT1. Para determinar si la
expresin de otras isoformas de GLUTs es un evento generalizado en los tejidos tumorales
y, si las otras isoformas de GLUTs muestran un patrn de expresin complementario a
GLUT1, en neoplasias donde se detect esta isoforma, se procedi a analizar y correlacionar
la expresin de GLUT1 con la expresin de las isoformas GLUT2, GLUT3, GLUT4 y
GLUT5, en un amplio rango de tumores humanos.
La expresin de estas isoformas en tejidos normales fue ms restringida an, ya que
solo algunos tejidos mostraron expresin de algunas de ellas. Es el caso del tejido prosttico,
el cual present expresin de GLUT5 especficamente en las clulas columnares del epitelio
glandular pseudoestratificado (Tabla 6). Por otro lado, en muestras de testculo, se observ
expresin de GLUT3 y GLUT5 asociada principalmente a clulas germinales
(espermtidas).
Il
(segunda parte).
Diagnstico
Cerebro
Estmago
Hgado
Linfoide
Pncreas
Rin
Tiroides
Utero
Positivos/total
515
515
2/2
011
213
015
212
3/3
1112
0/5
212
3/3
+
+
+
+
-
++
+
212
015
016
015
42
++
315
8/32
Intensidad
212
24/41
%
-
0
IIEIOMIOMA DE WERO
Cn
'.
*
'
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1,
CARCINOM.t GASTRICO
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1INFOM4 DE HODGKIN
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Fig 6. Tumores malignos con dbil o moderada expresin de GLUT1. (A) Leiomioma de
tero, (B) carcinoma renal, (C) carcinoma gstrico, (D) linfoma de Hodgkin. La reactividad se
localiz, principalmente, a nivel citoplasmtico. Con mayores aumentos (E, F, G y H), se
aprecia una distribucin homognea de la reactividad para GLUT 1 en el citoplasma de la
clulas tumorales (flechas). En todos los tumores se observaron glbulos rojos con intensa
tincin en la membrana celular (D, cabeza de flecha). Cn: conectivo. Imgenes con menor
aumento: x 150. Imgenes con mayor aumento: x 420.
43
44
Diagnstico
Cerebro
Normal
Colon
Estmago
GLUT2
-
GLUT4
012
GLUTS
-
(++)
515
(+/+++)
0/5
315
(+/++)
1/2
(+++)
0/5
7/7
(+/+++)
2/2
0/2
012
0/2
Astrocitoma
Normal
Adenocarcinoma
0/5
5/5
Normal
Carcinoma
GLUT3
015
(~)
G. Mamaria
Normal
Carcinoma invasor
30/33
3/33
2133
28133
112
(+)
213
(+)
0/12
012
012
(+/++)
(+/++)
Normal
Carcinoma
112
0/2
0/2
Linfoide
Linfoma
013
013
013
M. esquel.
Ovario
Linfoma de Hodgkin
Rhadomiosarcoma
Carcinoma
0112
012
112
0112
012
012
0112
0/2
0/2
Hgado
(+++)
(+)
Pncreas
Normal
Adenocarcinoma
112
0/2
012
(+)
(+)
Piel
Prstata
Pulmn
Rin
Testculo
Tiroides
Utero
112
Normal
Melanoma
Normal
0/4
014
015
015
0/4
0/5
014
9/10*
Carcinoma
Carcinoma
Carcinoma indiferenciado
015
012
013
015
012
113
015
012
013
(+++)
0/5
012
013
Mesotelioma (pleura)
212
012
2/2
Carcinoma
Normal (ceis. germinales)
(+)
012
013
Seminoma
Carcinoma embrionario
Carcinoma papilar
Leiomioma
012
0/2
2/2
(++)
212
(+/+++)
0/2
313
012
0/3
3/5
NL)
0/2
012
ND
012
012
(++)
012
3/3
(+++)
115
(+++)
ND
012
212
"
GLUT2
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GLUT2
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'GJUT2
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(H(I'O1% HrPI(xII II %R
CARCIbO'1 E)ICOLO
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H:
(%LUT3
J0,1
-
A-
SEMINOMA
GLIJT5
CtRCINOMkDE CL4?4
-
Vu
lSTROCITOM
46
este grupo particular de tumores, seleccionamos el cncer de mama, para realizar un anlisis
detallado de la expresin de GLUT1 y GLUT5. La expresin de la isoforma GLUT5 en
estas neoplasias es de particular importancia ya que esta molcula solo transporta fructosa,
un sustrato metablico que es utilizado por muy pocos tejidos en el organismo humano y
sobre el cual se conoce muy poco acerca de su metabolismo, ms an, se conoce muy poco
acerca de la posible captacin y metabolismo de fructosa por parte de las clulas tumorales.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, se analiz la expresin de las isoformas
GLUT1 y GLUT5 en muestras de archivo de carcinoma ductal invasor de mama y clulas
tumorales de mama en cultivo (MDA-468 y MCF-7), mediante las metodologas de RTPCR in situ e inmunocitoqumica a nivel ptico y electrnico.
3.2.1 Anlisis de expresin del RNA mensajero para GLUT1 y GLUT5 en mama normal y
tumoral.
En una primera etapa, se comenz por detectar la presencia del mensajero para
GLUT1 y GLUT5 en tejidos normales y tumorales. Con este propsito, nosotros
empleamos en nuestro estudio, tres metodologas diferentes, estas son: Hibridacin in situ
con oligo-sondas, hibridacin in situ con ribosondas y RT-PCR iii situ.
La utilizacin de oligo-sondas y ribosondas no lograron detectar de manera eficiente
el mRNA para GLUTI y GLUT5 en tejidos mamarios (datos no mostrados). La deteccin
de los mensajeros para estos transportadores, utilizando los mtodos no isotpicos
mencionados anteriormente, ha sido un objetivo complejo de resolver, posiblemente debido
a la baja sensibilidad de los mtodos empleados.
Considerando los problemas con los mtodos convencionales para realizar
hibridacin in situ, estandarizamos el mtodo de RT-PCR in situ, el cual nos permiti
amplificar la seal para su posterior deteccin en estas muestras. Si bien, el mtodo de RTPCR in situ es de compleja estandarizacin, tiene la ventaja de que permite detectar
secuencias de mRNA con una sensibilidad muy superior a los mtodos convencionales de
hibridacin in situ, presentando una sensibilidad aproximada de dos copias de mRNA por
clula.
El anlisis de RT-PCR in situ requiere de variados controles que aseguren la
especificidad de la reaccin, uno de los ms importantes es comprobar la especificidad de los
47
partidores que se utilizaron para amplificar el cDNA de cada transportador. Esto se realiz
mediante la tcnica de RT-PCR iii vitro en tejidos controles en los cuales la expresin de
GLUTI y GLUT5 est ampliamente confirmada. Para esto, se realiz PCR ti vitro a los
cDNAs obtenidos por transcripcin reversa a partir del RNA aislado de cerebro, placenta e
hgado, con el propsito de detectar el producto correspondiente a GLUT1 (Fig. 8, A).
Tambin se utiliz RNA aislado de testculo para la deteccin de los productos de PCR
correspondientes a GLUT5 (Fig. 8, B). En el caso de GLUT1, se amplific un producto de
aproximadamente 400 pb, solo en placenta y cerebro, que son tejidos en los cuales se ha
demostrado que expresan el transportador GLUT1, por el contrario, no se detect el
mensajero en muestras aisladas de hgado, las que expresan mayoritariamente GLUT2 (Fig.
8, A). Estos productos de PCR para GLUT1 se corresponden con el tamao esperado. En el
caso de GLUT5 se amplific el cDNA para este transportador, que se obtuvo a partir de
una muestra de RNA total aislado de testculo y se amplific un producto de aprox. 400 pb,
que tambin se corresponde con el tamao esperado (Fig. 8, B). Este anlisis nos permiti
confirmar que los partidores son especficos para reconocer el cDNA de las isoformas
GLUTI y GLUT5.
En el anlisis de RT-PCR ti situ, tanto para GLUT1 como para GLUT5, es
necesario hacer notar que no todas las muestras analizadas presentaron reactividad positiva
para el mensajero de ambos transportadores, lo que se atribuy preferentemente a la falta de
control en el proceso previo de fijacin e inclusin de la muestra, proceso que por supuesto,
no fue controlado por nosotros, dado que la totalidad de las muestras correspondieron a
especmenes de archivo ya procesados en los servicios de patologa.
El anlisis de RT-PCR in situ para GLUTI en tejido de mama tumoral, mostr una
reaccin intensa, localizada mayoritariamente en las clulas del parnquima neoplsico, y
especficamente, en el citoplasma de dichas clulas tumorales (Fig. 9, A y B). En todos los
casos analizados, la reactividad para el mRNA de GLUT1 se caracteriz por ser heterognea,
presentndose reas con mayor reactividad que otras, dentro del mismo tumor (Fig. 9, A
flechas). La gran mayora de las reas analizadas que presentaron una elevada marca por RTPCR, se correlacionaron espacialmente con las reas que mostraron elevada expresin de la
protena para dicho mensajero, lo que se comprob realizando inmunohistoqumica y RTPCR in situ en cortes vecinos (datos no mostrados). Se observ adems, que las clulas
estromales presentaron un bajo grado de tincin (Fig. 9, A y B). En mama normal se pudo
evidenciar diferentes niveles de reaccin dentro de una misma muestra, observndose
glndulas con mayor reactividad que otras, ms an, dentro de una
GLUT1
RT:+++-
GLUT5
RT:
-+
600 pb
1234
12
Fig 8. Anlisis de la especificidad de los partidores, mediante RT-PCR iii vitro. (A)
Deteccin del cDNA de GLUTI, amplificado a partir de RNA aislado de hgado (1), cerebro
(2) y placenta (3). Cuando el procedimiento de RT fue omitido, la reaccin de PCR no
mostr producto amplificado en todas las muestras analizadas (4). (B) Deteccin del cDNA
de GLUT5, amplificado a partir de RNA aislado de testculo (2). No se detect el producto
de amplificacin cuando no se realiz el procedimiento de RT (1). Las flechas indican la
migracin del producto amplificado. Se seala la migracin de un marcador de tamao de 600
pb.
49
misma glndula, la reactividad fue variable en cada una de las clulas (Fig. 9, D flecha). La
tincin se localiz en el citoplasma de las clulas del epitelio glandular, tambin se observ
reactividad en el componente mioepitelial y en algunas clulas del estroma, aunque en estas
ltimas, la reactividad fue de menor intensidad. Se realizaron controles negativos adicionales
como fueron la omisin del procedimiento de transcripcin reversa (Fig. 9, E), para controlar
que la reaccin correspondiese especficamente al cDNA obtenido en este paso. Otro
control negativo fue la omisin de los partidores en la mezcla de reaccin de PCR (Fig. 9, F),
lo que permiti controlar la actividad reparadora de la polimerasa. Adems de los controles
mencionados anteriormente, se probaron una serie de otros controles tendientes a verificar
otras etapas de la reaccin, estos son: la omisin de la DNA polimerasa, el tratamiento con
RNasa, la digestin previa de las muestras con DNasa 1, lo que permiti eliminar la reaccin
asociada al gen que codifica para los transportadores y que est presente en todas las
clulas, y el estudio de la actividad de digoxigenina endgena y especificidad del anticuerpo.
Todos los controles resultaron segn lo esperado, sugiriendo una elevada especificidad de la
reaccin (datos no mostrados).
Los anlisis de GLUT5 en tejido tumoral, al igual que para GLUT1, mostraron una
elevada reactividad asociada mayoritariamente al epitelio neoplsico, observndose tambin,
reaccin de menor intensidad en las clulas del estroma (Fig. 10, A y B). La reactividad se
localiz especficamente en el citoplasma de las clulas tumorales (Fig. 10, A y B, flechas).
La reaccin fue de tipo heterognea, con zonas tumorales que presentaron elevada tincin,
en tanto que otras zonas presentaron menor reactividad e incluso algunas fueron negativas
(datos no mostrados). En mama normal la reactividad se localiz preferentemente en el
citoplasma de las clulas mioepiteliales, las que se observaron intensamente teidas en la
periferia de las glndulas (Fig. 10, D, flecha M). Muy pocas clulas epiteliales de las
glndulas normales mostraron reactividad para el mRNA de GLUT5 (Fig. 10, C-E; flecha),
ms an, la mayora de las glndulas no evidenciaron reaccin para el mRNA de GLUT5
(Fig. 10, C; flechas). Las clulas del conectivo mostraron muy baja reactividad (Fig. 10, CF). Las clulas endoteliales de los vasos sanguneos fueron negativos (Fig. 10, E; flecha y).
in situ,
nos
propusimos analizar, con mayor detalle, la expresin y localizacin de las protenas GLUT1
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Fig 9. Anlisis de RT-PCR in silu para la deteccin del mensajero de GLUT1 en tejido
mamario normal y tumoral. (A, B) Tejido mamario tumoral. Las clulas tumorales
muestran una intensa reaccin localizada en el rea citoplasmtica (flechas). En las clulas del
tejido conectivo, se observa una reactividad menor. (C, D) Tejido mamario normal. Las
clulas normales presentan diferentes niveles de reactividad citoplasmtica (flechas). (E-F)
Tejido mamario tumoral. Controles negativos sin procedimiento de RT (E) y. realizando la
reaccin de RT sin partidores (F). Imgenes A, B: x 420. Imgenes C-F: x 350.
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Fig 10. Anlisis de RT-PCR iii situ para la deteccin del mensajero de GLUT5 en
tejido mamario normal y tumoral. (A, B) tejido mamario tumoral. Las clulas tumorales
muestran una intensa reaccin localizada en el rea citoplasmtica (flechas). En las clulas del
tejido conectivo, se observa una reaccin de menor intensidad. (C-F) Tejido mamario normal.
Las clulas epiteliales presentan diferentes niveles de reactividad (C, D, E, flechas marcadas
con E), sin embargo, la mayor reactividad se observ en las clulas mioepiteliales (D, E,
flechas marcadas con M). Las clulas endoteliales de los vasos sanguneos no mostraron
reacin positiva (E, flechas marcadas con y). Imgenes A, B: x 420. Imgenes C-F: x 350.
52
y GLUT5, tanto en tejido normal como tumoral, con el fin de establecer si la expresin del
mensajero se correlaciona con una elevada expresin de la protena en estos tumores. Para
esto desarrollamos inmunocitoqumica a nivel ptico, inmunofluorescencia con digitalizacin
de imgenes e inmunocitoqumica a nivel de microscopa electrnica.
La reactividad para la isoforma GLUT1 en tejidos tumorales fue muy heterognea
entre una muestra y otra, as como tambin, en diferentes reas de una misma muestra
tumoral, presentndose regiones del parnquima neoplsico con elevada inmunotincin y
regiones en que la reactividad fue menor e incluso negativa (Fig. 11, C). La mayor reactividad
se present generalmente en grupos de clulas que rodean las zonas de elevada necrosis, por
lo general, hacia el centro de los nidos de clulas tumorales en crecimiento, en donde la
densidad celular es mayor que en el resto del tumor (Fig, 11, D). Estos anlisis mostraron
tambin que, a nivel celular, la inmunotincin se localiz con mayor intensidad en la
membrana plasmtica de las clulas tumorales (Fig. 11, D flecha), sin embargo, tambin se
observ reaccin citoplasmtica, la que se distribuy de manera homognea en las clulas
tumorales (Fig. 11, D). Las clulas del tejido conectivo presentaron una baja expresin de la
protena GLUT1 (Fig. 11,C).
Los anlisis de inmunofluorescencia acoplados a digitalizacin de imgenes en tejidos
tumorales de mama, permitieron obtener una apreciacin semicuantitativa del nivel de
reactividad para GLUT 1 dentro de una muestra tumoral, comprobndose primero, que la
reactividad es heterognea entre las distintas reas del epitelio neoplsico en activa
proliferacin (Fig. 11, E y G). Este anlisis evidenci adems, que el mayor nivel de
inmunotincin se localiz preferencialmente en regiones de membrana plasmtica que
contactan clulas vecinas (Fig. 11, D, F, H flechas), en cambio, las regiones de la membrana
plasmtica que estn en contacto con el tejido conectivo, presentaron muy bajos niveles de
reactividad para este transportador, como se pudo observar en las reas apicales de la
membrana plasmtica de estas clulas tumorales (Fig. 11, F y H, cabezas de flechas). Al
igual que con el mtodo de peroxidasa, la reactividad se focaliz principalmente en el
parnquima neoplsico, no detectndose tincin asociada al tejido conectivo (Fig. 11, G).
Uno de los aspectos ms sorprendentes observados con esta tcnica, fue la localizacin
del transportador preferentemente en las membranas plasmticas que contactan clulas
vecinas (Fig. 11, D, F, H; flechas). Sin embargo, la expresin a nivel de las membranas
citoplasmticas que contactan el tejido conectivo fue muy baja (Fig. 11, F y H, cabezas de
flecha) Si bien, la reaccin en membranas celulares laterales se observ de un
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espesor demasiado grande para ser producto del contacto de las membranas de dos clulas,
es factible que en estas reas se desarrollen interdigitaciones de membranas con gran cantidad
de transportador. Sin embargo, un anlisis ptico mostr pequeos espacios en el centro de
estas reas de tincin. Para tener mayores evidencias de estas posibles adaptaciones
presentes en clulas tumorales de mama, se realiz un estudio ultraestructural.
El anlisis ultraestructural permiti confirmar las evidencias previas obtenidas por
microscopa ptica y digitalizacin de imgenes fluorescentes, las que sugeran una
localizacin preferencial del transportador GLUT1 en regiones de la membrana plasmtica
que estn en relacin con clulas vecinas (Fig. 12, A). Sin embargo, estos anlisis
permitieron determinar que GLUTI se localiza selectivamente en zonas de la membrana
plasmtica que estn involucradas en la formacin de estructuras semejantes a "canalculos
intercelulares" (Fig. 12, B y C), ms an, no se observ marca en aquellas regiones de la
membrana que contactan clulas vecinas pero que no forman este tipo de estructuras
canaliculares (Fig. 12, B, M). La regin apical de la membrana plasmtica que esta en
contacto con el tejido conectivo, prcticamente no evidenci marca para GLUTI o present
una marca de mucho menor intensidad que la observada en las membranas de los canalculos
(Fig. 12, D; flecha, M), lo que concuerda con los anlisis de inmunoperoxidasa e
inmunofluorescencia. Se observaron adems, complejos de unin entre las clulas tumorales
en la periferia de estas estructuras canaliculares, estos complejos de unin fueron del tipo
"desmosomas" (Fig. 12, D).
Los anlisis en tejido mamario normal mostraron que solo el 50% de las muestras
analizadas present inmunoreactividad para GLUT5, siendo esta, de menor intensidad
comparada con la inmunotincin del tejido tumoral (Fig. 13, A-D). En el tejido mamario
normal, la reactividad se localiz mayoritariamente en el citoplasma de las clulas
mioepiteliales (Fig. 13, A y B, flechas M). La expresin de la protena GLUT5 se
corresponde con la expresin del mensajero en las clulas mioepiteliales, determinado por
RT-PCR in situ. En las clulas del epitelio mamario normal, la reaccin para GLUT5 se
present solo en algunas glndulas (fig. 13, C, E). Las clulas del tejido conectivo no
mostraron reactividad para esta isoforma.
Los anlisis inmunocitoqumicos para GLUT5 en cncer de mama, mostraron que la
expresin de esta molcula es ms generalizada que la expresin de GLUT1 en este tipo
tumoral, observndose reactividad positiva en un 95% de las muestras analizadas. Sin
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Fiz 13. Deteccin inmunocitoqumica de CLI LJT5 en tejido mamario normal y tumoral.
(A-C) Tejido mamario normal. (D-H) Tejido mamario tumoral. En el tejido normal, se
observaron clulas epiteliales glandulares con reacin positiva citoplasmtica (C; E+) y con
reaccin negativa (A, B; E-). Las clulas mioepiteliales tambin mostraron reactividad
citoplasmtica para GLUT5 (A y B; M). Las clulas tumorales evidenciaron una mayor
intensidad de inmunotincin, fundamentalmente asociada al citoplasma (E, F, G, flechas). (H)
Control negativo con anticuerpo pre-adsorbido con el pptido inductor del suero. Asterisco
en imagen E: vaso sanguneo. Imgenes A-E: x 160. Imgenes F, H: x 200. Imagen G: x 250.
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Fig 15. Expresin de GLUTs en la lnea celular de cncer de mama MDA-468. Anlisis
inmunocitoqumico para GLUT1 (A), GLUT2 (B), GLUT3 (C), GLUT4 (D) y GLUT5 (E).
Los estudios de localizacin in vitro solo mostraron expresin de las isoformas GLUT1 (A)
y GLUT5 (E). La expresin de GLUTI se localiz, preferentemente, en zonas de la
membrana plasmtica que contactan clulas vecinas (A, flechas). La expresin de GLUT5 en
cambio, se localiz en el citoplasma celular, an cuando, se observ tambin reaccin a nivel
de la membrana plasmtica (E, flecha). GLUT4 se expres dbilmente en el citoplasma de las
clulas (D), en tanto que GLUT2 y GLUT3 fueron inmunocitoqumicamente no detectables
(B y C). (F) Control negativo. Imgenes A-F: x 450.
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Moderada
(++)
Leve
(+)
Negativa
(-)
Intensa
(+++)
Total
Positivos
n
SBR1
100
100
SBR2
18
33.3
38.8
27.7
18
100
SBR3
11
54.4
18.1
18.1
10
90.7
Total
31
3.2
14
45.1
29
22.5
30
96.6
63
IRI
Tabla 8. Niveles de expresin de PCNA e ndice de apoptosis en Carcinoma Ductal Invasor con diferentes
grados de diferenciacin.
Indice
Grados
No
detectado
n
%
Indice de
apoptosis
Proliferacin
de
Bajo
(1-20%)
n
%
Moderado
(20-50%)
n
%
Alto
(sobre 50%)
n
%
Total
Positivos
n
%
100
4.6
27.7
18
100
2.1
27.2
10
90.9
0.8
25.7
30
96.7
SBR 1
50
50
SBR2
18
50
22.2
SBR3
11
36.3
27.2
Total
31
3.2
14
45.1
25,7
GLUT1
PCNA
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Fig 16. Expresin de GLUT1 y PCNA en cncer de mama con diferentes grados de
diferenciacin. (A, C y E) Expresin de GLUT 1 en muestras con grados de diferenciacin
histopatolgica SBR1, 2 y 3, respectivamente. (B, C y E) Expresin de PCNA en regiones
adyacentes a las analizadas con GLUTI. En el caso de GLUTI, la reaccin se localiz
preferentemente en las membranas plasmticas (C, flecha), en tanto que la expresin de
PCNA fue eminentemente nuclear (D, flecha). N: necrosis. E: estroma. Tu: tejido tumoral.
Aumento imagenes: A,B x250. C, B x300. E, F x350.
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Fig 17. Anlisis comparativo del ndice de apoptosis en tumores de mama con
diferentes grados de diferenciacin histopatolgica. Las imgenes se muestran en
fluorescencia (A, C y E) y campo claro (B, D y G). (A y B) Tumores de clasificacin SBR
1. (C y D) tumores de clasificacin SBR 2. (E y F) Tumores de clasificacin SBR 3. Los
cuerpos apoptticos se localizaron principalmente, en las reas de necrosis o zonas del
epitelio neoplsico cercanas a ellas (A y B, flechas). A microscopia de campo claro, los
cuerpos apoptticos se observaron como fragmentos nucleares muy picnticos (D, flechas).
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Fig. 18. Anlisis ultraestructural de tumores inducidos en ratones "nude". (A) Clulas
del tumor mostrando caractersticas ultraestructurales tpicas de un tumor de mama. Se
observan los ncleos voluminosos y condensaciones de la cromatina (flechas). (B, C)
Canalculos intracelulares. Secrecin de aspecto flocular se observa en el centro de cada
canalculo (flechas). (C) Uniones intercelulares de las clulas tumorales (flechas). Aumento en
imagen A: x4000. B-C: x14.000.
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GLUT1
GLUT1.
GLUT2
GLUT5
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4. DISCUSION
En nuestro estudio analizamos la expresin de todas las isoformas de
transportadores de hexosas (GLUT1-GLUT5), en un importante conjunto de muestras
normales y tumores. Adems, realizamos un anlisis detallado, a nivel ptico y
ultraestructural, de la expresin de las isoformas GLUT 1 y GLUT5 en carcinoma ductal
invasor de mama, que corresponde al tipo tumoral de mayor frecuencia dentro de estas
neoplasias. Por ltimo, se realiz un anlisis preliminar de correlacin entre la expresin de
GLUTI y marcadores de proliferacin celular (PCNA) y apoptosis.
74
75
76
77
Este resultado podra sugerir una posible regulacin transcripcional de la expresin del
mensajero. Sin embargo, se debe considerar que las muestras utilizadas para el anlisis de
RT-PCR in situ, provenan de tejidos de archivo procesados para patologa rutinaria, por lo
tanto, en ninguna de estas se pudo controlar las condiciones de manejo y fijacin de la
muestra, por lo que una reactividad negativa, bien podra estar asociada a un proceso de
degradacin del mensajero, producto de las malas condiciones de manejo, y no a una
expresin disminuida del mensajero per se en el tumor.
Luego de este anlisis, quisimos determinar si la mayor expresin del mensajero para
GLUT1 y GLUT5, se correlaciona con una mayor expresin de la protena en estos tejidos.
Estudios previos de expresin de GLUTs en cncer de mama, realizados por el grupo de
Brown y cols. (1993), evidenciaron mayoritariamente la expresin de las isoformas GLUTI,
GLUT2 y GLUT4 en este tipo tumoral, no evidenciando expresin de la isoforma GLUT3
y GLUT5. En nuestro estudio, contrario a lo obtenido por Brown y cols. (1993),
detectamos expresin de todas las isoformas de GLUTs, pero mayoritariamente de las
isoformas GLUT1 y GLUT5. Se debe hacer notar que nuestro estudio fue desarrollado con
una casustica mucho mayor que la de Brown y cols. (1993).
Nuestros estudios confirmaron la sobre-expresin de GLUT1 en el tejido tumoral,
con respecto al tejido normal. Sin embargo, los datos inmunocitoqumicos a nivel ptico y
ultraestructural confirman una sorprendente polarizacin de la localizacin de GLUT1 en la
membrana plasmtica de las clulas tumorales, involucrada en la formacin de "estructuras
canaliculares", limitadas por complejos de unin. Este resultado aporta evidencias para
sugerir un posible "sorting" diferencial de la isoforma GLUT1 en clulas tumorales de
mama. El "sorting" diferencial tendra que estar determinado por algn dominio presente en
la secuencia aminoacdica de la protena transportadora.
En un estudio realizado por Verhey y cols. (1993), se desarrollaron protenas
quimricas para GLUT1 y GLUT4, intercambiando las regiones carboxilo y amino terminal
entre estos transportadores. Estos estudios revelaron que el dominio carboxilo terminal
podra tener un rol protagnico en el "sorting" de estas protenas. Sin embargo, otro estudio
desarrollado por Nakazaki y cols. (1997), postula que sera el asa intracelular M6-M7, y no
el extremo carboxilo terminal, el que contendra las seales de "sorting" para estas protenas.
No obstante estos resultados, an no se tienen antecedentes acabados para determinar que
dominio de la protena podra dar cuenta de este fenmeno y como es regulado en clulas
tumorales.
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clulas tumorales como un futuro modelo para estudiar ms en detalle los procesos que
regulan este mecanismo de "sorting" diferencial.
4.3 ifi PARTE. ANALISIS PRELIMINARES DE LA CORRELACION ENTRE LA
EXPRESION DE GLUT1, GRADO DE DIFERENCIACION DEL TUMOR,
PROLIFERACION CELULAR Y APOPTOSIS.
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estos tumores, y por otro, incorporar criterios que permitan una mejor evaluacin del tumor
desde una perspectiva ms generalizada, considerando todos los aspectos que determinan el
comportamiento de una determinada neoplasia.
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GLUCOSA
Diferenciado
Proliferacion +
Necrosis
SBR 1
Apoptosis
GLUCOSA
-
Tejido
conectivo
Expresin de GLUTI
Localizacin diferencial (-)
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Proliferacin
Necrosis
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Localizacin diferencial (+)
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GLUCOSA
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Diferenciado
Proliferacin
Necrosis
Apoptosis
Expresin de GLUT1
GLUCOSA
+
+
+
+
5. CONCLUSIONES
En nuestro estudio analizamos la expresin de todas las isoformas de transportadores de
hexosas (GLUT1-GLUT5), en un importante conjunto de muestras normales y tumores.
Adems, realizamos un anlisis detallado, a nivel ptico y ultraestructural, de la expresin de las
isoformas GLUT1 y GLUT5 en carcinoma ductal invasor de mama, que corresponde al tipo
tumoral de mayor frecuencia dentro de estas neoplasias. Por ltimo, se realiz un anlisis
preliminar de correlacin entre la expresin de GLUT1 y marcadores de proliferacin celular
(PCNA) y apoptosis. Con este anlisis de concluye que:
- Los anticuerpos utilizados en este estudio son de alta especificidad y localizaron selectivamente
a cada isoforma de los transportadores de glucosa.
- La sobre-expresin de GLUT1 en cncer humano no es un fenmeno general, estando
restringido a un conjunto de neoplasias, que en la mayora de los casos son altamente agresivas.
Sin embargo, este estudio no pudo concluir una relacin directa entre agresividad y expresin de
GLUT1.
- Las neoplasias que no sobre-expresan GLUT1 tampoco sobre-expresan otra isoforma de
transportador de glucosa. En cambio, la mayor parte de los tumores que presentaron altos niveles
de GLUT1, sobre-expresaron otra isoforma de GLUTs.
- La expresin de GLUT5 sugiere que algunas neoplasias se adaptan metablicamente para
incorporar y utilizar fructosa como fuente de energa.
- En cncer de mama, la sobre-expresin de GLUT1 en tumores SBR2, seala una adaptacin
particular de este tipo tumoral, que junto a la gnesis de estructuras tipo "canalculos" y el
"sorting" diferencial de GLUT1 a membranas canaliculares, muestran que la expresin y
localizacin celular de GLUT 1 est directamente relacionada con el tipo de crecimiento de los
brotes tumorales y su relacin con el tejido conectivo. Este tipo de tumores posee una gran
capacidad de captacin de glucosa que impide la induccin de muerte celular. De esta forma se
observa un tumor con baja necrosis y apoptosis, aun cuando las clulas tumorales se alejan
considerablemte del estroma.
- En tumores de mama de tipo SBR3, no sera necesario la sobre-expresin de GLUT1 y su
localizacin diferencial, debido a que las clulas proliferan en un ntimo contacto con el estroma,
teniendo un acceso directo a la glucosa sangunea.
- Los fenmenos que regular la expresin de GLUT1 en cncer de mama no parecen estar
relacionados con el grado de proliferacin o apoptosis.
- La expresin de transportadores de fructosa en cncer de mama, indica que estas clulas
neoplsicas poseen la capacidad de metabolizar fructosa, que presentan una va metablica menos
regulada que la va de la glucosa.
- La localizacin intracelular de GLUT5 en cancer de mama, sugiere que este transportador
estara involucrado en transporte subcelular de esta hexosa.
5. CONCLUSIONES
En nuestro estudio analizamos la expresin de todas las isoformas de transportadores de
hexosas (GLUT1-GLUT5), en un importante conjunto de muestras normales y tumores.
Adems, realizamos un anlisis detallado, a nivel ptico y ultraestructural, de la expresin de las
isoformas GLUT1 y GLUT5 en carcinoma ductal invasor de mama, que corresponde al tipo
tumoral de mayor frecuencia dentro de estas neoplasias. Por ltimo, se realiz un anlisis
preliminar de correlacin entre la expresin de GLUT1 y marcadores de proliferacin celular
(PCNA) y apoptosis. Con este anlisis de concluye que:
- Los anticuerpos utilizados en este estudio son de alta especificidad y localizaron selectivamente
a cada isoforma de los transportadores de glucosa.
- La sobre-expresin de GLUT1 en cncer humano no es un fenmeno general, estando
restringido a un conjunto de neoplasias, que en la mayora de los casos son altamente agresivas.
Sin embargo, este estudio no pudo concluir una relacin directa entre agresividad y expresin de
GLUT1.
- Las neoplasias que no sobre-expresan GLUT1 tampoco sobre-expresan otra isoforma de
transportador de glucosa. En cambio, la mayor parte de los tumores que presentaron altos niveles
de GLUT1, sobre-expresaron otra isoforma de GLUTs.
- La expresin de GLUT5 sugiere que algunas neoplasias se adaptan metablicamente para
incorporar y utilizar fructosa como fuente de energa.
- En cncer de mama, la sobre-expresin de GLUT1 en tumores SBR2, seala una adaptacin
particular de este tipo tumoral, que junto a la gnesis de estructuras tipo "canalculos" y el
"sorting" diferencial de GLUT1 a membranas canaliculares, muestran que la expresin y
localizacin celular de GLUT1 est directamente relacionada con el tipo de crecimiento de los
brotes tumorales y su relacin con el tejido conectivo. Este tipo de tumores posee una gran
capacidad de captacin de glucosa que impide la induccin de muerte celular. De esta forma se
observa un tumor con baja necrosis y apoptosis, aun cuando las clulas tumorales se alejan
considerablemte del estroma.
- En tumores de mama de tipo SBR3, no sera necesario la sobre-expresin de GLUTI y su
localizacin diferencial, debido a que las clulas proliferan en un ntimo contacto con el estroma,
teniendo un acceso directo a la glucosa sangunea.
mo
- Los fenmenos que regular la expresin de GLUT1 en cncer de mama no parecen estar
relacionados con el grado de proliferacin o apoptosis.
- La expresin de transportadores de fructosa en cncer de mama, indica que estas clulas
neoplsicas poseen la capacidad de metabolizar fructosa, que presentan una va metablica menos
regulada que la va de la glucosa.
- La localizacin intracelular de GLUT5 en cancer de mama, sugiere que este transportador
estara involucrado en transporte subcelular de esta hexosa.
6. BIBLIOGRAFIA
- Aiiard, WJ., Lienhard, GE. (1985). Monoclonal antibodies to the glucose transporter from
human erythrocytes. Identification of the transporter as a Mr 55,000 protein. J Biol Chem.
260:8668-8675.
- Agus, D., Vera, J. C., Golde, D. (1999). Stromal ceil oxidation: a mechanism by which
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