Procedimientos para la correcta toma y transporte de muestras

micolgicas
Objetivos:

Realizar anlisis micolgicos de muestras clnicas de animales, de ambiente,

alimentos y de sustancias industriales usadas para control de hongos.
Promover en el estudiante el inters por la investigacin cientfica mediante la
revisin de literatura, presentacin de casos, y desarrollo de trabajos cortos de
investigacin en micologa.

Marco Teorico:
Los hongos pueden causar enfermedad aun cuando no estn presentes...
Algunas especies de hongos filamentosos producen toxinas como metabolitos
secundarios que al ser inhalados, ingeridos o absorbidos por va cutnea, y en
cantidades suficientes pueden causar enfermedad y hasta la muerte de las
personas y animales. Sin embargo, cuando los profesionales de salud realizan la
bsqueda de la causa de las enfermedades no encuentran el hongo sino los daos
en el organismo causados por la micotoxina.
1. Consideraciones previas a la toma de muestras:
Antes de tomar y enviar una muestra clnica a un laboratorio para estudio
micolgico debe considerar lo siguiente:

Laboratorio especializado: es conveniente remitir material a un laboratorio

familiarizado con el procesamiento de muestras veterinarias, pues el
diagnstico ser ms certero de esta manera.
Horario de recepcin de muestras: es importante conocer esta informacin
para contar con un lapso de 12 horas mximo para remitir el material, de
esta manera se debe evitar tomar muestras al inicio del fin de semana o
cuando el da siguiente sea feriado.
Servicios ofrecidos por el laboratorio: con esto se pretende cerciorar que la
muestra enviada va a ser procesada y se cuenta con los reactivos
necesarios para su diagnstico final (p.e. medios de cultivo especiales).
Animal sin tratamiento antifngico, cremas o champs: el uso de
antifngicos tpicos o sistmicos, ciertas cremas o champs pueden
repercutir negativamente en el diagnstico micolgico, por lo tanto se debe
procurar que el animal no se le aplique nada tpico o sistmico por al
menos 2 semanas previas a la toma de muestra.
Histopatologa y citologa: las biopsias, lavados y aspirados deben ser
enviadas tambin a un laboratorio especializado en histopatologa y
citologas animales para complementar y corroborar el diagnstico
micolgico.

2. Hoja de datos:
Para realizar un mejor diagnstico se recomienda completar una hoja de datos
con informacin relevante sobre:

Datos del propietario y/o mdico veterinario remitente: nombre, telfono,

fax,
correo electnico, direccin, fecha de recepcin de la muestra.
Datos epidemiolgicos del animal: edad, sexo, raza, proveniencia,
identificacin,
cantidad de animales afectados.
Hallazgos clnicos e historia mdica: signos clnicos, tiempo de
presentarlos,
tipo, cantidad y distribucin de la o las lesiones,
tratamientos recibidos y duracin de los mismos, si est en cuadra o en
potrero, alimentacin, situaciones
de estrs, traslados o salidas de
la finca recientes, enfermedades crnicas o
condicin de portador de
las mismas, si hay secreciones describir el color, consistencia y olor de las
mismas, presencia de signos respiratorios, ganglios linfticos aumentados,
etc. Rotular el recipiente con la identificacin del animal, la fecha y hora de
la toma de muestra, el tipo de muestra y nombre del mdico veterinario
remitente.
Sobre la muestra: tipo, cantidad, tiempo transcurrido desde la toma de la
misma, medio de transporte utilizado.
Sobre los exmenes de laboratorio: indicar si se desea examen directo y/o
cultivo

3. Tipos de muestras clnicas, toma y transporte:

Los tipos de muestras biolgicas dependen de la presentacin clnica y agente
sospechado, en el siguiente cuadro, se resumen los diferentes tipos de muestras
clnicas, cmo tomarlas y transportarlas correctamente.
Es importante el uso de guantes para protegerse de posibles
infecciones mientras se tome la muestra.

TIPO DE
UTILIDAD

MUESTRA Y COMO SE TOMA

TRANSPORTE

Micosis superficiales
Raspados: para lesiones Se desinfecta el rea con
planas,
lceras
y alcohol de 70, se realiza
onicomicosis.
con una hoja de bistur #
20, raspando el borde de
la lesin (no es necesario
que
sangre)
y
recolectando la mayor
cantidad de escamas y
pelos.

En un recipiente seco y
estril (placa de petri,
tubo de ensayo, etc) a
temperatura
ambiente.
Mantener la muestra lejos
de la luz solar. Viabilidad
1 semana.

Cinta
adhesiva:
Este
mtodo se utiliza en
lesiones planas de tipo
generalizado sospechosas
de Malassezia
pachydermatis y dermatitis
interdigitales.

Se debe colocar la parte

adhesiva
sobre
la
superficie que se desea
muestrear y despegar
rpidamente.

Pegar la cinta adhesiva a

un portaobjetos con la
parte
adhesiva
hacia
arriba, se pega con la
ayuda de otra cinta
adhesiva en los extremos
del
portaobjetos.
Temperatura ambiente.
Si la muestra es fijada
con metanol, la viabilidad
es de 3 das.

Improntas: para
lesiones
superficiales ulcerativas o
con
algn
tipo
de
secresin.

Se
realiza
con
un
portaobjetos limpio y se
presiona
sobre
la
superficie
que
desea
muestrearse (previamente
desinfectada con alcohol
de 70)

En una placa de petri

limpia con la parte de la
muestra hacia arriba o
bien en la caja de los
portaobjetos con algodn.
Temperatura
ambiente.
Fijar en metanol para
tincin de Giemsa.

Hisopados: se utiliza para

tomar
muestras
de
cavidades
corporales
(odos,
boca,
narinas,
vagina,
ano,
prepucio,
cloaca) o bien de lesiones
supurativas con el fin de
cultivarlas.

Con la ayuda de un
hisopo largo estril, se
rozan las paredes de la
cavidad
o
bien
la
superficie deseada. Tomar
siempre 2 muestras, unas
para el frotis y otra para el
cultivo.

En un tubo de plstico
estril
con
tapa,
preferiblemente con un
medio
de
transporte
lquido,
puede
ser
solucin salina estril 2
ml. Transportar a 4C.
Viabilidad con medio de
transporte y fro 24 horas,
sin medio de transporte 4
horas.

Frotis: se
utiliza
para
recolectar el material de un
hisopado
de
lesiones
hmedas, cavidades u
obtenidas por raspado (p.e.
levaduras intracelulares).

Se debe rodar el hisopo

sobre la superficie del
portaobjetos dejando al
menos
3
lneas
impregnadas.

Se puede transportar un
porta- portaobjetos o bien
de la misma manera que
la cinta adhesiva, la
viabilidad es la misma y a
la misma temperatura.
Fijar en metanol en caso
de sospecha de levaduras
intracelulares.

Barridos de pelambre: se Un trozo de alfombra

utiliza
para
recolectar estril o cepillo, se pasa
esporas
de
hongos sobre el pelo del animal.
presentes en la superficie
de los animales y as
determinar portadores de
dermatofitos.

Se
guarda
en
un
recipiente estril (placa de
petri, papel kraf), a
temperatura
ambiente,
lejos de la luz solar.
Viabilidad 2 semanas.

Pelos, costras, escamas,

plumas,
espinas: para
lesiones
alopcicas
y
descamativas.

Micosis subcutneas
cutneas

Se deben arrancar el Tranporte, viabilidad y

pelo, plumas, espinas, tempertatura igual que los
costras o las escamas raspados.
que estn en los bordes
de la lesin, con la ayuda
de pinzas limpias o
guantes.

Aspirados: son de utilidad Se realiza con una aguja

en lesiones ulcerativas, de calibre 18 o 16 y una
nodulares y polifistulosas. jeringa de 3 cc. El mbolo
debe estar en la marca de
1cc y se punza varias
veces la superficie. Ese
material es expulsado
sobre un portaobjetos
limpio y despus, se
puede
aspirar
ms
contenido para que se
realice el cultivo.

Se pueden transportar en
la jeringa donde se
recolect el material o
bien en un tubo de
ensayo estril, a 4C. La
viabilidad es de 24 horas
a esa temperatura y con
solucin salina, si no se
mantiene
a
esa
temperatura dura 2 horas.
Si la muestra es muy
poca se debe adicionar 1
cc de solucin salina
estril.

Raspados: Sirven
para
tomar material de lesiones
ulcerativas, supurativas y
polifistulosas.

Con ayuda de una hoja de

bistur # 20, limpindo el
rea con solucin salina
estril a presin, se retira
la mayor cantidad de
material posible.

El material recolectado,
se deposita en un tubo de
ensayo o placa de petri
estril y se desechar el
bistur, pues se oxida con
la sangre y dificulta el
diagnstico. Para que la
muestra no se seque,
puede adicionarse 2 cc de
solucin salina estril.
Conservar
a
4C.
Viabilidad 12 horas.

Biopsia: es la muestra ms Se puede hacer tipo

confiable en caso de punch o con bistur,
lesiones
nodulares
o siempre del borde de la
plipos.
lesin. Tomar suficiente
muestra
para
envar
estudio histopatolgico y
micolgico.

La porcin que se enva

para
estudio
micolgico no se debe
congelar!!!, ni colocar
en
formalina,sino
transportar a no menos
de 4C porque algunos de
los hongos pueden morir
a bajas temperaturas.
Adicionar solucin salina
estril para evitar que la
muestra
se
seque.
Viabilidad 24 horas.

Improntas: son de utilidad Se realizan de la misma Ver improntas en micosis

en lesiones ulcerativas, forma que en micosis superficiales.
supurativas y polifistulosas. superficiales.
Frotis: se
utiliza
para Se expulsa sobre la Ver frotis en
transportar material de los superficie del portaobjetos superficiales.
aspirados y raspados.
el material del aspirado.
Si se trata de un raspado,
se debe esparcir el
material
en
el
portaobjetos.
Clavos de espundia: para
aislar Pythium
insidiosum,elaboracin de
autovacuna.

Son
unas
masas
formadas por detritos
celulares
y
restos
de Pythium insidiosum. Es
la muestra ms confiable
para detectar este agente
en estas lesiones.

micosis

Enviar en un tubo de 50ml

estril, adicionado con
solucin salina fisiolgica,
preferiblemente a 4C.
Viabilidad de la muestra:
2 das.

Se deben retirar lo ms
aspticamente
posible
con ayuda de una pinza
estril
y
limpiando
previamente el rea con
solucin salina estril.
Crnea: para determinar la Debe retirarse de forma
presencia
de asptica una porcin de la
queratomicosis
crnea
afectada,
realizando un raspado
profundo con una hoja de
bistur # 10.

Micosis
profundas
diseminadas

Se transporta en un
recipiente estril como
placa de petri con 5 gotas
de
solucin
salina
fisiolgica estril. Llevarse
de
inmediato
al
laboratorio
a
4C.
Viabilidad de la muestra:
2 horas.

Lavados: bronqueoalveolar
, traqueal, de los sacos
areos, del buche. Sirven
para el diagnstico de
hongos que han ingresado
por
inhalacin
p.e.
histoplasmosis,
aspergilosis, blastomicosis,
criptococosis, etc.

Se realizan infiltrando a Ver aspirados en micosis

presin solucin salina subcutneas y cutneas.
estril en el rea que se
va
muestrear
y
recolectando la mayor
cantidad posible con una
bomba de vaco o una
jeringa adaptada a un
venoclsis.

Lquido cefalorraqudeo: es
de ayuda diagnstica en el
caso de histoplasmosis
diseminada
o
bien
criptococosis.

Con
el
animal
completamente
anestesiado, se extrae el
lquido cefaloraqudeo del
canal medular en la
articulacin
atlantooccipital.

Se debe transportar en un
tubo estril con tapa, o en
la jelinga en la que se
extrajo, a 4C, de forma
inmediata, viabilidad 1
hora.

Aspirados: traqueales,
La toma debe ser lo ms Ver aspirados en micosis
nasales, de lquido sinovial asptica posible, de igual subcutneas y cutneas.
y de cavidades.
manera que las micosis
subcutneas y cutneas.

Biopsias: es la muestra
que mayor informacin
provee, sin embargo, en el
animal vivo es difcil de
obtener (p.e. pulmn).

Se toma de manera Ver biopsias en micosis

asptica,
con
pinzas cutneas y subcutneas.
biopsiadoras,
aguja
easytrap, sacabocados
o bistur.

Sangre o suero: son de

ayuda diagnstica en el
caso
de
que
los
laboratorios cuenten con
pruebas
para
determinacin
de
inmunoglobulinas
contra
diferentes
antgenos
fngicos.
Los frotis sanguneos de
sangre preservada con
anticoagulante,
pueden
ayudar al diagnstico de
histoplasmosis diseminada.

Puede tomarse de la vena

yugular, ceflica o safena,
con
anticoagulante
cuando se sospecha de
histoplasmosis
o
sin
anticoagulante
para
determinacin
de
inmunoglobulinas.

Transportarlo en un tubo
sin
anticoagulante
evitndo la hemlisis
(mximo 5 horas) o bien,
el suero separado en un
tubo de ependorff de
1.5ml. El suero puede
refrigerarse o congelarse.
Viabilidad es de 1 semana
(en
refrigeracin)
y
congelado a
-20C puede durar aos.

4. Tiempo de espera de los resultados

Es importante recordar que el tiempo de espera de los resultados varan con el tipo
de muestra y examen realizado, de esta manera:

Exmenes directos de biopsias, raspados, aspirados, lavados, frotis,

improntas, cinta adhesiva, pelos y costras: los resultados se obtienen el
mismo da.
Cultivos: los agentes fngicos presentan un creciemiento entre los 3 a 22
das, sin embargo en algunas ocasiones se requiere ms tiempo para la
identificacin de las especies y/o gneros ya que se requiere de medios
especiales de esporulacin y de cultivos en lmina adicionales.

REFERENCIAS

Arenas, R. 2003. Micologa Mdica Ilustrada. 2da ed. McGraw Hill. Mxico
D.F., Mex.

Clinkenbeard, K.D.,C.G. MacAllister, R.L. Cowell, R.D. Tyler & S. Beaudin.

2002. Oral and Nasal Cavities, Pharynx, Guttural Pouches, and Paranasal
Sinuses. In: Cowell, R.L. & R.D. Tyler. Diagnostic Cytology and Hematology
of the Horse. 2nd Ed. Mosby. Missouri, U.S. Pp: 66.

Cork, S. & R. Halliwell. 2002. The veterinary laboratory and field manual.
Nottingham University. Nottingham, U.K.

Cowell, R.L., R.D. Tyler, K.E. Dorsey & M.A. Guglick. 2002. Lymph
Nodes. In: Cowell, R.L. & R.D. Tyler. Diagnostic Cytology and Hematology
of the Horse. 2nd Ed. Mosby. Missouri, U.S. Pp: 99-101.

Drouhet. E., G. Segretain y F. Mariat. 1977. Micologa Mdica p. 311-400.

In: Golvan, Y.J. y J.C. Petithory (ed). Tcnicas en parasitologa y micologa.
Jims. Barcelona, Espaa.

Aislamiento e identificacin de agentes

micticos
Introduccin:
Los dermatofitos forman un grupo de hongos relacionados taxonmicamente, que
muestran afinidad por tejidos queratinizados tales como piel, pelo, plumas, uas, y
cuernos. Dentro de este grupo de hongos se incluyen tres gneros: Epidermophyton,
Microsporum y richophyton, de los cuales nicamente los dos ltimos tienen
importancia en Medicina Veterinaria. La mayora de los dermatofitos son habitantes
del suelo. Algunas especies que se han adaptado al husped son parsitos de los
animales. Las infecciones por dermatofitos se conocen como dermatofitosis y se
caracterizan por producir lesiones superficiales. En los animales domsticos no existe
diferencia clnica notoria en cuanto a tipo y forma de las lesiones. Estas son
generalmente circulares, con descamacin, alopecia y prurito, con o sin formacin de
costras.

Objetivo:

Identificar los principales agentes micticos de importancia veterinaria.

El alumno describir las caractersticas de cultivo y morfolgicas ms
relevantes de las micosis ms importantes del grupo de los dermatofitos de
mayor importancia en Medicina Veterinaria.
Capacitar al estudiante en la deteccin de hongos en muestras clnicas
usando tcnicas adecuadas y la interpretacin de los resultados de laboratorio

Competencias:

Realizar la tincin de lactofenol azul de Algodn en las diferentes muestras de

trabajo para conocer su morfologa microscpica.
Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de dermatofitos, as
como sus requerimientos atmosfricos.
Identificar las principales especies de cada gnero mictico de importancia
Medicina Veterinaria.
Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de
cada microorganismo.
Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan los
gneros pertenecientes al grupo de los dermatofitos.

Tiempo Destinado a la Prctica: 4 Horas (dos sesiones, separadas por una semana
una de otra)

Material:
General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos,
cubreobjetos, papel secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero,
Estufa Bacteriolgica entre 24 y 28 C (temperatura constante). Microscopio ptico

binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X, 40X, 100X), Hojas y mangos de
Bistur, pinzas sin dientes de uso clnico.
Por Equipo:

Agar sangre.
Medio selectivo: Agar Sabouraud, agar para seleccin de hongos (agar
micobitico) o agar tripticasa de soya.
Agar MacConkey
Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol, trehalosa, sorbitol y
maltosa.
Tren de tincin lactofenol azul de algodn

Metodologa:
Primer Da (Sesin Uno)
Preparacin y Acondicionamiento de la Muestra:
La muestra a utilizar para el aislamiento e identificacin micolgica debe ser
caracterstica, y debe ser tomada bajo las debidas medidas de bioseguridad exigidas
para este gnero y del tamao adecuado, y procesarse inmediatamente.
Procedimiento:
1. Con un hisopo estril se toma la muestra y se siembra en una caja de agar
Sabouraud o agar micobitico, agar sangre y agar Mc Conkey, e inocular bajo el
procedimiento de aislamiento en cultivo puro incubando a 30 C por 24 a 72 h.
2. Sembrado en el microcultivo:
a. Dentro de una caja petr estril agregar entre 2 a 4 mL de agua bidestilada
estril.
b. Colocar un soporte y poner un portaobjetos con un cuadro de Agar Sabouraud
o Agar para hongos de aproximadamente 1 cm2.
c. Con el asa tomar la muestra y sembrar por picadura en cada lado del agar,
posteriormente colocar el cubreobjetos, tapar la caja e incubar de 24 a 28 C
de entre 24 a 120 h aprox.
d. Una vez observado crecimiento se procede a la realizacin del frotis, previa
inactivacin del cultivo.
3. Preparacin del frotis.
a. Introduce un algodn impregnado con formol al 10 % en la caja y djalo actuar
durante 30 minutos con el fin de inactivar al hongo.
b. En un portaobjetos coloca dos gotas separadas de lactofenol azul de algodn.
Con las pinzas toma cada uno de los cubreobjetos y colcalos sobre cada una
de las gotas del colorante.
c. Obsrvese las preparaciones en el microscopio de campo claro con los
objetivos 10 X y 40 X
d. Observa las estructuras fungales y sus caractersticas morfolgicas.
Segundo Da (Sesin Dos)

Interpretacin de Resultados:
La identificacin se lleva a cabo mediante la observacin de las colonias fungales y la
preparacin de frotis hmedos a partir de estas o a partir de microcultivos con el fin de
determinar la morfologa microscpica.
1. Identificacin en medio de cultivo: las cajas de estos medios deben ser revisadas
peridicamente hasta por 190-200 h a 24 a 28 C y observar la textura, tamao y
pigmento de la superficie y base de las colonias desarrolladas. La mayora de los
dermatofitos producen colonias con micelio de aspecto algodonoso o polvoso.
2. Tincin de Azul de Algdon: los dermatofitos producen dos tipos de aleuriosporas;
las macroaleuriosporas (multicelulares, septadas) y las microaleuriosporas
(unicelulares, no septadas) la morfologa caracterstica de dichas estructuras permite
la identificacin de cada una de las especies.

Epidermophyton produce abundantes macroaleuriosporas de pared gruesa y

lisas, en forma de raqueta y no produce microaleuriosporas.
Trichophyton produce pocas macroaleuriosporas con forma alargada (forma de
basto), de pared lisa y delgada, y produce abundantes microaleuriosporas.
Microsporum produce abundantes macroaleuriosporas en forma de huso, con
pared gruesa y spera (a menudo descritas como ornamentadas) y produce
pocas
microaleuriosporas.
Otras
estructuras
microscpicas
que
ocasionalmente son tiles para la identificacin de los dermatofitos son la
presencia de hifas espirales o en forma de peine (hifas pectinadas); la
presencia de clamidosporas terminales; de artrosporas.

Resultados:
Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr
que realizar el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.
Cuestionario:
1. Menciona las principales diferencias morfolgicas entre las bacterias y los hongos
microscpicos?
2. Qu diferencia hay entre la tincin de Gram y la tincin Lactofenol azul de
algodn?
3. Qu medidas de bioseguridad utilizaras para manipular y procesar muestras de
enfermedades micticas?
BIBLIOGRAFIA.

Departamento de Microbiologa e Inmunologa (2004): Manual de laboratorio

para bacteriologa y micologa veterinarias. Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico D.F.
Garca T. R. y Crdoba P. R. (1988): Manual ilustrado de tcnicas de laboratorio
utilizadas en bacteriologa y micologa veterinarias. Instituto Internacional de
Cooperacin para la Agricultura. Mxico.