EFECTO DEL PLASMA

ATMOSFRICO NO
TRMICO SOBRE EL
AGUACATE
Investigacin, desarrollo e innovacin en
tecnologas de origen vegetal

Marina de Abajo Delgado

Silvia Fernndez Prez
Sara Gmez Fernndez

1. INTRODUCCIN
El aguacate (Persea americana) es una fruta con un sabor caracterstico
y una textura cremosa. Su contenido lipdico el cual est constituido
predominantemente por cidos grasos monoinsaturados suministra beneficios
potencialmente saludables previniendo el cncer y las enfermedades
vasculares (Awad & Fink, 2000 y Plaza et al, 2009). Desafortunadamente la
vida til del aguacate est determinada en gran medida tanto por la alteracin
microbiana como por los procesos oxidativos (Elez- Martinez el al., 2005; Yahia
& Gonzlez- Aguilar).
La mayora de los cambios de calidad observados a lo largo del
almacenamiento de la pulpa del aguacate son el resultado del pardeamiento
enzimtico, catalizado por la polifenol oxidasa y la oxidacin lipdica que
involucra la produccin de perxidos y otros productos secundarios a travs del
ataque oxidativo a los cidos grasos insaturados (Gunstone & Norris, 1982;
Soliva- Fortuny et al., 2001). Este proceso se traduce en el enranciamiento y la
produccin subsecuente de aromas indeseables y prdidas en la calidad. Por
otra parte, los pigmentos como las clorofilas son tambin importantes
contribuyentes en la apariencia y propiedades saludables del aguacate (Ashton
et al., 2006). Sin embargo, la presencia de pigmentos de clorofila naturalmente
presente promueve la fotooxidacin del aceite de aguacate bajo condiciones
luminosas. El radical oxgeno se produce y reacciona con los cidos grasos
insaturados con los que forma hidroperxidos. La descomposicin de estos
hidroperxidos inicia un tipo de autooxidacin de radicales libres que induce el
cambio de color (Werman & Neeman, 1986).
El aguacate como otras frutas y vegetales puede estar contaminado
microbiolgicamente durante el crecimiento cultivo, post-cultivo, procesado,
almacenamiento

y distribucin (Cervallos-Cervallos et al., 2012). Los

tratamientos sanitarios y lavados convencionales no son efectivos en estos

productos, consiguindose

nicamente dos reducciones logartmicas en

patgenos (Niemira, 2012a). Los tratamientos antimicrobianos no trmicos

aplicados a frutas, vegetales y a otros productos alimenticios son objeto de
muchas investigaciones. El plasma atmosfrico no trmico es una tecnologa
con un desarrollo relativamente nuevo que permite reducir la carga

microbiolgica manteniendo los atributos sensoriales de los alimentos. Este

tratamiento puede ser efectivo para la inactivacin de bacterias, mohos y
levaduras y otros microorganismos dainos, como esporas y biofilms, que son
generalmente difciles de inactivar (Niemira, 2012a). Se han demostrado
reducciones multilogartmicas de biofilms de Escherichia coli 0157:H7 y
Salmonella typhimurium en agar y en alimentos despus de tratamientos cortos
con esta tecnologa (Niemira, 2012a).

El plasma atmosfrico no trmico se genera a partir de aire u otras

mezclas de gases. Descargas elctricas de alto voltaje, microondas u otras
fuentes de energa provocan la ionizacin de esta mezcla de gases, generando
una compleja mezcla de iones, electrones libres, radicales y otras especies
reactivas. El efecto de inactivacin microbiana puede atribuirse a diversos
mecanismos sinrgicos incluyendo la generacin de radiacin UV, ozono,
partculas cargadas, radicales de oxgeno y la mezcla con otras especies
reactivas (Niemira, 2012a; Laroussi & Leipold, 2003). Este dao se produce en
las membranas microbianas, ADN y/o protenas (Niemira, 2012a; Fernndez et
al., 2013). Los daos especficos del plasma atmosfrico dependen de la
mezcla de gases empleada, del equipo de plasma empleado y de otros factores
intrnsecos como la actividad de agua, la textura y el contenido en protenas y
cidos grasos, que pueden alterar los efectos antimicrobianos y la calidad del
producto final (Niemira, 2012a).

La demanda por parte de los consumidores de productos frescos

mnimamente procesados ha provocado el aumento en la investigacin de
procesos que permitan la produccin de alimentos seguros y libres de aditivos
(Ziuzina et al., 2013). El plasma atmosfrico no trmico puede facilitar la
produccin de alimentos con elevada calidad y con un aumento en la vida til.

Los objetivos de este estudio fueron determinar el efecto del plasma

sobre el color, la inactivacin microbiana en concreto en E. coli y la
oxidacin lipdica del aguacate.

2. MATERIAL Y MTODOS
A. COLOR:
Para la medicin del color se prepararon cinco muestras por
tiempo, cada muestra era un cilindro de 1 milmetro de grosor; adems
se prepararon cinco duplicados control. A continuacin se procedi a la
medida del color mediante un colormetro de reflectancia CM- 500
(Minolta, Osaka, Japn) con iluminante de D65, modo SCI, 10C de
ngulo observador y 8 mm de dimetro de la ventana de medida. Los
parmetros de color de la escala CIELab estudiados fueron las
coordenadas

luminosidad

(L*),

componente

rojo-

verde

(a*)

componente amarillo- azul (b*). Se hicieron mediciones el da 0, el da 3

y el da 6 del experimento.

B. INACTIVACIN MICROBIANA:
Se parti de una dilucin de Escherichia coli de concentracin
desconocida de la que se realizaron seis diluciones. Se sembr en
superficie la 0,1 Ml de la dilucin 10-6 en seis placas que posteriormente
fueron tratadas con plasma durante 15 segundos, 30 segundos, 45
segundos, 1 minuto, 1.5 minutos y 2 minutos; 0,1 mL de la dilucin 10-5
en cuatro placas que fueron tratadas con plasma durante 2.5 minutos, 3
minutos, 4 minutos y 5 minutos; adems se sembraron dos placas con la
dilucin 10-7 como controles.
Se tomaron seis muestras cilndricas de aguacate que se
inocularon con 30L de la dilucin 10-3 . Una vez el inculo fue
absorbido las muestras se metieron por separado en tubos Falcon que
contenan 10 mL de agua de peptona. A continuacin, se agitaron en un
vrtex durante 2 minutos, despus se procedi a la siembra en
profundidad en medio BHI. Todas las placas fueron incubadas durante
24 horas a 37 C.

C. DETERMINACIN DE OXIDACIN LIPDICA (MTODO TBARS)

Para determinar el enranciamiento oxidativo se emple el mtodo
de determinacin del malonaldehido (MDA), que es un compuesto que
se origina por descomposicin y posterior asociacin de diversas

sustancias responsables del olor y sabor a rancio. Este compuesto es

relativamente estable y aparece cuando el alimento es rico en cidos
grasos poliinsaturados. La cuantificacin del MDA, se basa en la
reaccin de dos molculas de cido-2-tiobarbitrico con una de MDA
para formar un compuesto de color rosa que se puede determinar
espectrofotomtricamente a 532nm.
- TCA(cido tricloroactico) al 5%.
- TBA(cido 2-tiobarbitrico) 0,02M en actico glacial.
- BHT(2,6 di-terc-butil-4-metifenol) 7,2% v/v en etanol.
- TEP (1,1,3,3 tetraetoxipropano)
- Agua ultrapura
Preparacin de curva estndar
1. Se prepar la solucin madre de TEP 3*10-4 M. Se pipetearon 81L de
TEP en un vaso de precipitado pequeo apuntando el peso. Se diluyo en
agua ultrapura y se trasvas y enras en un matraz aforado de 1l.
2. Se prepar la disolucin de trabajo de TEP 3*10-5 M. Se pipetearon
10ml de disolucin madre en un matraz aforado de 100ml y se enras
con TCA.
3. Se prepararon 6 patrones de TEP pipeteando los siguientes volmenes
de la disolucin de trabajo a matraces aforados de 10ml:

1s: 0,10ml solucin de trabajo

2s: 0,30ml solucin de trabajo

3s: 0,50ml solucin de trabajo

4s: 0,70ml solucin de trabajo

5s: 0,90ml solucin de trabajo

6s: 1,00ml solucin de trabajo

Se enrasaron los matraces aforados con solucin de TCA 5% hasta
10ml.

4. Se colocaron 5ml de cada patrn en tubos de ensayo de 10ml con tapn

de rosca, a los que se aadieron 5ml de TBA 0,02M.
Se prepar un blanco directamente en un tubo de rosca aadiendo 5ml
de TCA al 5% y 5ml de TBA0,02M.
5. Se agitaron en vortex. Se incubaron en bao de agua durante 30 min a
80C en oscuridad. Transcurridos los 30 min, se enfriaron los tubos.

6. Se midi la absorbancia de cada patrn en espectofotmetro a una

longitud de onda de 532nm.
Preparacin de muestras
1. Tras el tratamiento con plasma a 0, 1, 2, 4, 8 y 15 min, se coloco cada
muestra en un vaso de precipitado previamente tarado y se pesaron en
balanza de precisin apuntando el peso exacto.
2. Se aadi a cada vaso con muestra 45 ml de TCA al 5% y 100l de BHT
al 7,2%.
3. Se homogeneizaron las muestras con ultraturrax durante 2 min a
velocidad 2, limpiando siempre el equipo entre muestra y muestra.
4. Se filtro cada homogeneizado con filtro de pliegues en un matraz
Erlenmeyer.
5. Se colocaron 5ml de cada filtrado en tubos de ensayo de 10ml con tapn
de rosca a los cuales se aadieron 5ml de TBA0,02M.
6. Se agitaron en vortex y se incubaron en oscuridad a 80C durante 30
min. Transcurridos los 30 min se enfriaron los tubos.
7. Se midi la absorbancia de cada muestra a 532nm.

3. RESULTADOS Y DISCUSIN

A. COLOR
El estudio sobre el color se realiz en las muestras tratadas con plasma,
el mismo da del tratamiento, y a los dos y siete das de almacenamiento
tras el tratamiento. Para poder conocer la evolucin en el pardeamiento, se
calcul el ndice de Pardeamiento (IP), empleando para ello los valores L, a
y b del CieLab (Olivas et al., 2007). Una vez obtenidos estos valores se
aplicaron las siguientes frmulas para calcular el IP:
=

+ ,

+ ,

,
=

( ,
,

Una vez aplicadas las formulas se obtuvieron los resultados que se

muestran en la figura 1, donde se puede observar la evolucin del
pardeamiento en funcin del tipo de tratamiento aplicado con respecto al
control. Se puede concluir que cuanto mayor es el tiempo de tratamiento
mayor es el pardeamiento.

Media var IP
40

Variacin IP

20
0
-20
-40

Media var IP

-60
-80
-100

10

15

Tiempo tratamiento (min)

Figura 1. Variacin de valores IP en todas las muestras tratadas

En la figura 2, se pueden observar las comparaciones entre las muestras

tratadas durante 2 y 4 minutos a diferentes das de almacenamiento con la
muestra control, sin tratar.

Evolucin del ndice de

pardeamiento durante el
almacenamiento
35
30
Media IP

25
20

0min

15

2min

10

4min

5
0

Da 0

Dia2

Dia 7

Figura 2. Evolucin del pardeamiento a lo largo del almacenamiento.

En vista de los resultados se puede observar, que en la muestra tratada

con 2 min de plasma, se produce un aumento en el pardeamiento con el
tiempo, lo mismo que ocurre con la muestra control sin tratar. Los valores
obtenidos en el caso de la muestra 2, son similares a los obtenidos en el
control, por lo que podra decirse que el tratamiento del plasma para evitar
el pardeamiento no sera suficiente con dos minutos para un tiempo de
almacenamiento de 7 das. Sin embargo con la muestra tratada durante 4
minutos si se observan diferencias en cuanto al pardeamiento, ya que los
valores de IP, son inferiores a la muestra control.
Este pardeamiento se produce cuando, tras el corte del aguacate, se
produce la salida de productos intracelulares, tales como enzimas que
pueden afectar al color, al flavor y a la textura (Ahvenainen, 1996). Las
enzimas, polifenoloxidasas, cuando se liberan entran en contacto con
diversos sustratos provocando el pardeamiento.
El plasma en tratamientos cortos (60 segundos) como indican algunos
autores (Bjoern Surowsky et al., 2013) puede detener este proceso de
oxidacin de sustratos por parte de la polifenoloxidasa, pero en
tratamientos de tiempos superiores, este efecto puede ser contratio, como
sucede en las muestras con tratamientos fuertes (figura 1) pues el plasma
puede ejercer un mayor efecto de liberacin de esta enzima. En nuestro
caso la aplicacin de mayor tiempo de tratamiento (4 min) ha sido positiva
en la reduccin del pardeamiento, por lo que hay que tener en cuenta otros
factores a parte del tiempo de tratamiento, como el tipo de gases
empleados, la zona donde se aplica el plasma, etc.

B. INACTIVACIN MICROBIANA:

Las reducciones logartmicas de Escherichia coli en placa y en aguacate

estn representadas en la figura 1. Se puede observar que en placa hasta
los 3 minutos de tratamiento se produce una reduccin de 2,25 unidades
logartmicas, en cambio los tratamientos de 4 y 5 minutos no producen
inactivacin. En comparacin con el tratamiento en placa, el realizado en
aguacate produce una menor inactivacin; el tratamiento ms fuerte de 15
minutos logr nicamente una reduccin de una unidad logartmica.

LOG(TX/T0)

-0,5

E.coli
0

200

400

600

800

1000
PLACA

-1

AGUACATE

-1,5
-2
-2,5

TIEMPO (s)

Figura 3: Eficacia de inactivacin del plasma atmosfrico no trmico frente a

Escherichia coli cultivado en placa e inoculado en aguacate.
La mayor eficacia en el tratamiento en placa puede deberse a las
caractersticas de superficie que posee en comparacin con la del
aguacate. Cuanto ms compleja sea la matriz tratada existen ms nichos
disponibles para las bacterias a los que no accede el plasma (Ziuzina et al.,
2014).
Como se ha observado en otros estudios, nuestros resultados
corroboran que a mayor tiempo de tratamiento existe una mayor
inactivacin.

C. DETERMINACIN DE OXIDACIN LIPDICA (MTODO TBARS)

Para conocer el grado de oxidacin lipdica fue necesario elaborar una
recta patrn (Figura 4) para poder luego calcular los miligramos de MDA
(malonaldehdo) que se generaban en cada muestra a diferentes
tiempos de tratamiento (Figura 5).

nmol TEP/ml
3,5

y = 22,806x - 0,0122
R = 0,9917

3
2,5
2

nmol TEP/ml

1,5

Lineal (nmol TEP/ml)

1
0,5
0
-0,5

0,05

0,1

0,15

Figura 4. Recta patrn para el clculo de nmol TEP/ml.

mg MDA/kg muestra
8
mg MDA/kg muestra

7
6
5
4
3
2
1
0

10

15

ABS de cada muestra tratada

Figura 5. Miligramos de malonaldehdo de cada muestra

Como puede observarse en la figura 5, a medida que aumenta el tiempo de
tratamiento (en tiempos cortos), aumenta la oxidacin lipdica (aumento de la
concentracin de MDA), pero este efecto se estabiliza para tiempos de tratamiento
superiores (8 y 15 minutos). Algunos autores, sealan que este aumento en la
oxidacin puede ser debido a la intensidad del plasma y el tiempo empleado en el
tratamiento. Esta oxidacin lipdica esta muy influenciada por la concentracin de
oxgeno empleada en la formacin del plasma, cuanto mayor es la concentracin de
este gas, mayor es la oxidacin (Katrine Rod et al., 2011). La estabilizacin de la

oxidacin a lo largo del tiempo de tratamiento, puede explicarse por que todos los
cidos grasos presentes en la superficie, ya hayan sido oxidados en su totalidad.

4. CONCLUSIONES
En vista de los resultados podemos concluir:
-

Para la inactivacin microbiana, en concreto para E.coli, esta tecnologa resulta

adecuada, ya que se ha conseguido una reduccin logartmica, por lo que
siempre que la concentracin inicial de microorganismo sea baja, podra
tomarse como alternativa.

En cuanto al color, se consiguen efectos positivos a bajos tratamientos.

El efecto del plasma sobre la oxidacin lipdica, es elevado, aunque sera

conveniente complementar el estudio del TBA, con un anlisis organolptico,
para ver si la concentracin de los compuestos generados en la oxidacin, esta
por debajo de su umbral de deteccin.

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