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I.

INTRODUCCION:
Los distintos tipos de mtodos de pruebas bioqumicas permiten determinar las
caractersticas metablicas de las bacterias objeto de identificacin. Algunas de
estas pruebas son tcnicas rpidas, ya que evalan la presencia de una enzima
preformada y su lectura vara entre unos segundos hasta unas pocas horas. Otras
pruebas requieren para su lectura el crecimiento del microrganismo con una
incubacin previa de 18 a 48h; a este grupo pertenecen la mayora de las pruebas
que detectan componentes metablicos o aquellas que determinan la sensibilidad
de un microorganismo a una sustancia dada tras cultivo en medios de
identificacin que contienen el sustrato a metabolizar.
En el laboratorio disponemos de numerosas tcnicas para la caracterizacin
bioqumica de una especie.
En general el microrganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia
nutritiva especfica o sustrato y despus de la incubacin del cultivo se examina
para ver los cambios qumicos que hayan ocurrido.

II. OBJETIVOS:
1. Demostrar la accin de los microrganismos sobre diferentes substratos.
2. Identificar los microrganismos por la accin enzimtica que ejercen sobre dichos
substratos.
III. MATERIALES:
- Caldo peptonado o caldo
triptosa en tubos de 5 ml
- Citrato Simons en tubos plano
inclinado.
- Triple sugariron (TSI) en tubos
plano semi-inclinado
- Mechero de alcohol
- Asa de siembra
- Lpiz de cera
- Cepas puras de bacterias
coliformes
- Reactivos de kovacs
- Test de identificacin de
enterobacterias
- (coliformes)

IV.

PROCEDIMIENTOS:
4.1. Prueba de indol (metabolismo del triptfano)
1. Sembrar en el tubo con caldo nutritivo las cepas puras en estudio.
2. Dejar incubar a 37 C por 24 horas.
3. Proceder a la prueba de confirmacin aadiendo a cada tubo unas gotas
del reactivo de kovacs, (2 a 4 gotas).
4. Hacer la lectura de inmediato, que consiste en observar la formacin de un
anillo rojo grosella, lo cual es indol positivo y si se mantiene transparente,
se anotara como indol negativo.
4.2. Prueba del TSI (metabolismo de los aminocidos azufrados y del carbono,
glucosa, sacarosa lactosa)
1. Sembrar por picadura profunda y por estras las bacterias en estudio en
tubos con TSI (o kliger).
2. Incubar a 37 C por 24 horas.
3. Observaar el cambio de color del medio.
La degradacin del azcar se comprueba por el cambio de color del medio
de rojo naranja a amarillo. La formacin de grietas o cavidades es por
formacin de gas (CO2), en el proceso de degradacin de los azucares. La
presencia de un color pardo oscuro, demuestra la formacin de H2O como
el producto de metabolismo de aminocidos.
4.3. Prueba del citrato Simons (metabolismo del cido ctrico)
1. Sembrar por estras en el tubo con el medio de citrato Simons en plano
inclinado.
2. Llevar a la estufa a 37 C por 24 horas.
3. Observar el cambio de color del medio e interprete.
4. El indicador azul de bromotimol, virara el medio del verde inicial al azul
Prusia y la reaccin ser indicada como citrato positivo.

V.

REBICION BIBLIOGRAFICA:

5.1Prueba del indol:


Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol en un cultivo bacteriano.
Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante el
enzima triptofanasa.

Para la realizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un


caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptfano).
Para la posterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede
preparar con los siguientes ingredientes:
Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por alc.butlico)........150ml
p-dimetilamino-benzaldehdo..........................................................10g
HCl (concentrado).........................................................................50ml
Reactivo de kovacs
Adicionar 5 gotitas y agitar suavemente el tubo y interpretar rpidamente.
Interpretacin
1. Ornitina descarboxilasa:
Positivo: color purpura del medio
Negativo: color amarillo en el fondo del tubo que puede ser purpura al final
2. Indol :
Positivo: anillo rojo en la superficie del medio (desarrollo del escatol).
Negativa: no se produce color
Negativa: color naranja en la superficie del medio
3. Movilidad:
Positiva: los organismos mviles migran en la lnea de siembra y se difunden en
el medio provocando turbiedad.
Negativa: crecimiento bacteriano atenuado siguiendo la lnea de siembra.

5.2. Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Azcar Hierro):


El Agar-hierro-triple azcar es un medio de cultivo. Gracias a su composicin es uno de los
medios de cultivo ms empleados para la diferenciacin de enterobacterias segn:
1. Fermenten o no glucosa.
2. Fermenten o no lactosa o sacarosa.
3. Produzcan o no cido sulfhdrico.

4. Produzcan o no gas.
Correspondientemente las reacciones sobre agar TSI son:
1. Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificar el medio haciendo virar a
amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de
glucosa, el medio permanecer de color rojo.
2. Si la bacteria problema fermenta lactosa o sacarosa, acidifica el medio en su
superficie volvindolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del
medio continuar de color rojo.
3. Si produce cido sulfhdrico (debido a la reduccin de las sales de hierro), se
presentar un ennegrecimiento del tubo. La produccin de sulfhdrico y el
consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentacin de la glucosa
(fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es
fermentadora de glucosa.
4. Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es
productora de gas.
Bacterias existentes

Pico alcalino/fondo alcalino: no hay fermentacin de azucares. Caracterstica de


bacterias no fermentadoras como Pseudomonas sp.

Pico alcalino/fondo cido: Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas.


Shigella spp.

Pico alcalino/fondo negro: Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentada,


produccin de cido sulfhdrico. Salmonela spp.

Pico cido/fondo cido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede


producirse SH2 o no. Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas.

5.3. Prueba del citrato simons:


Determina si un microorganismo es capaz de fijar citrato es capaz como nica fuente
de carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando una alcalinizacin del
medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al
alcalino a pH 7,6.
Normalmente el metabolismo comprende una condensacin del acetilo con la coenzima
A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs.

Entre las enterobacterias estas caractersticas se dan en los siguientes gneros:


Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella.
Sin embargo, Escherichia, Shigella, Yersinia, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi
son incapaces de crecer utilizando citrato como nica fuente de carbono.
Se encuentran
Negativa: Escherichia Coli

Positiva: Klebsiella spp.

VI.

RESULTADOS:

Primera parte

Tubos conteniendo caldo nutritivo

Preparacin de medios

cepas de bacterias

INDOL estado lquido (vertical)

TSI: menor
inclinacin

C.SIMONS: mayor
inclinacin

Segunda parte (siembra de colonias en los tres medios)

Citrato simn, TSI, caldo pectonado

Realice esquemas de las pruebas y fundamente sus resultados.

MEDIO DIFERENCIAL
INDOL

TSI

MUESTRA DE SUELO

LECTURAS

(+) positivo
Cambio de color claro a uno ms oscuro
observndose un anillo cremoso en la parte
superior .Los organismos mviles migraron de la
lnea de siembra y se difunden en el medio
provoca una turbiedad.

Formacin de tres azucares es positivo por que


cambiaron de color quiere decir que la bacteria
creci por que fue capaz de degradar el sustrato y
el medio se acidifico.
Lactosa = +(aerbica)
Sacarosa = +(aerbica)
Glucosa = +(anaerbica)

CITR ATO SIMON

Azul (+)

Porque contiene fuente de carbono y energa y


cido ctrico y la bacteria fue capaz de degradar al
citrato y a acidificado al medio

VII.

BIBLIOGRAFIA

VIII.

http://www.seimc.org/
http://www Wikipedia, la enciclopedia libre.htm
microbitos.files.wordpress.com/2010/06/atlasmicrobiologia1.pdf
http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-v/pb-v-3-imvic.htm

ANEXOS:

TSI

Caldo pectonado

Observaciones finales

Citrato simn