Cromatografa En Capa Fina

Introduccin
La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa,
uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de
vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro
para aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se
desarrollen las placas cubiertas. Es preciso tambin poder guardar con
facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.
La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La
fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo
general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los
componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos
polares.
Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente:
Hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehdo
Aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas
Ventajas de la cromatografa en capa fina
La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a
otros mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase
gaseosa, ...) ya que el utillaje que precisa es ms simple. El tiempo que
se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la
separacin es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores
corrosivos, que sobre papel destruiran el cromatograma. El mtodo es
simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que
sea un mtodo adecuado para fines analticos.
Adsorbentes
Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao
de las partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est
mayor ser su adhesin al soporte, aunque tambin sele puede aadir
un adherente (yeso,...). Algunos de los adsorbentes ms utilizados son:
-Celulosa
-Almidn
-Azucares
-Gel de slice (silicagel)
-xido de aluminio (almina)
-Carbn activo (carbn en polvo)
-Kieselguhr
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes poli funcionales
de plantas y animales.

Silicagel
El gel de slice o cido silcico es uno de los ms utilizados, es
dbilmente cido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deber
utilizar con sustancias que se corrompan con los cidos. Los geles de
slice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este
factor tambin se debe tener en cuentas respecto al uso de
componentes. El tamao del grano suele ser de 10 a 40 micras () y el
tamao de poro vara de 20 a 150.
Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato
de clcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente.
Tambin han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o
por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de slice.
Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con
hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga
apto para separar componentes lipfilos (esteroides, cidos grasos,
ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina
cromatografa de fase reversa (silanizado).
Almina
La almina u xido de aluminio es un adsorbente ligeramente bsico
debido a que en el proceso de extraccin de la almina a partir de la
bauxita quedan algunas molculas de hidrxido de aluminio adheridas a
la almina, dndole a sta un carcter bsico. No consigue un desarrollo
tan alto de la sustancia depositada como el gel de slice.
La almina puede ser tratada qumicamente para conseguir alminas
cidas, bsicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores
ultravioletas. Es un adsorbente de carcter polar, de tal forma que
retendr con mayor avidez a los componentes polares.
Preparacin de placas.
El adsorbente se desle en agua destilada. Para mezclar la papilla
homogneamente es preferible agitar de modo mecnico. La proporcin
de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos partes de
agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general, no
obstante, habrn de consultarse las instrucciones del fabricante.
Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, lminas de
vidrio, pero en la actualidad tambin se utilizan lminas de otros
compuestos orgnicos ms flexibles. Dependiendo del tipo de
separacin que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizar un
tamao de placa u otro. En general para realizar una separacin
preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de
20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80 ml. de agua destilada.

Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la

adicin de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para
mantener el pH deseado. En la preparacin de las placas tambin se
pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes. Cabe
destacar la adicin de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le
denomina argentacin, y se utiliza para separar componentes
insaturados.
El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la
placa, en general suele ser de:
0.1-0.2 mm. para separaciones analticas.
0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.
La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectaran al
desarrollo del proceso cromatogrfico. Para ello existen en el mercado
extensores que se utilizan para crear de forma mecnica placas
homogneas del espesor deseado. Si no se disponer de extensor, el
proceso a seguir es el siguiente:
-Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.
-Agitar enrgicamente.
-Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.
-Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
-Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.
Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo
despus de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metlicas. En este
momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas
reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien calentndolas
durante 30-60 minutos a 105-110 C (las placas de celulosa no deben
calentarse ms de 10 minutos a 105 C) para expulsar as el aire. Es
conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los
agrietamientos que se produciran por efecto del cambio de
temperatura.
Aplicacin de las muestras
Los productos a examinar se disolvern, cuando sea posible, en un
disolvente orgnico no polar que tenga un punto de ebullicin lo
suficientemente bajo para que se evapore despus de la aplicacin.. Sin
embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla
cloroformo: metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean
disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 l resulta en la carga 20
g de producto slido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar
0.1 g de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un
5% de impurezas.

Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para

realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. Tambin pueden
usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la
punta del capilar (micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada.
Dejando una distancia al borde inferior de un centmetro
aproximadamente. El punto de aplicacin de la muestra se denomina
toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de
forma que en la placa solo quedar la muestra a analizar.
Eleccin del eluyente
La eleccin del eluyente depender lgicamente del componente que se
va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
Eter de petrleo.
Eter dietlico.
Ciclohexano.
Acetato de etilo.
Tetracloruro de carbono.*
Piridina.
Benceno*
Etanol.
Cloroformo*
Metanol.
Diclorometano.
Agua.
cido actico.
*compuestos cancergenos.
En la eleccin del eluyente influyen varios factores:
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar
la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos
polares.

Eleccin del eluyente

a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente.
b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente ms polar.
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir
utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes ms polares,
hasta dar con el ms apropiado.
Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar
varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo
capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite
desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se
aprecie el eluyente con el cual la separacin se realiza de una manera
ms eficaz.
Desarrollo de la cromatografa
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente
por el mtodo ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda
por una placa casi en vertical, por la accin de la capilaridad. La
cromatografa se realiza en una cubeta. Para conseguir la mxima
saturacin posible de la atmsfera de la cmara, las parades se tapizan
con papel impregnado del eluyente. A veces pueden obtenerse
separaciones mejores sin poner papeles en las paredes, cosa que no
debe olvidarse.
Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del
desarrollo, para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de
desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una
cromatografa cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que
el tiempo de una cromatografa preparativa puede llegar a un par de
horas.

Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta

que se alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen.
Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta
distancia es de 10 cm.; parece ser la ms conveniente para medir
valores de RF. Despus del desarrollo, las placas pueden secarse
rpidamente con una corriente de aire caliente.
La mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio
entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las
impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del
eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.
Si la placa se estropea por accin del aire o de la luz, se secar en una
cmara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.

Localizacin de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la
posicin de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:
Mtodos qumicos.
Mtodos fsicos.
Mtodos qumicos
Consisten en ralizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y
los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los
reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una
pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire
comprimido.
Es preferible pulverizar con las placas en posicin horizontal. Si el
reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverizacin deber
realizarse en una vitrina de gases bien ventilada. La pulverizacin se
realizar poco a poco. En cromatografa en capa fina no puede realizarse
el baado del cromatograma (en cromatografa en papel s).
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma
complejos coloreados con los componentes orgnicos (con tonos
amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo
que es conveniente sealar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que
reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras.

El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de

componente separado.
Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:
-2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).
-Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos).
-Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
-Ninhidrina (para aminocidos).
Mtodos fsicos.
El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador
fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lmpara
ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda,
aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay
componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal)
con lo que pueden ser detectados directamente en una lmpara de
ultravioleta.

Constantes Rf Y Rx
La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar
la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal,
mide la retencin de un componente. Se define como:

Constantes Rf Y Rx
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el
centro de la mancha, los clculos se simplifican si el denominador es 10.
Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de
condiciones (Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad
de muestra). El mximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo
ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la
misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados
se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad
que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son
iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo.

Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre

la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta
apreciar una separacin mnima. En este caso no se pueden usar
reveladores qumicos, ya que alteraran los compuestos, sino indicador
ultravioleta.
Tambin se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un
compuesto (X), que tenga una posicin de desarrollo conveniente; todos
los dems compuestos sobre la placa se relacionan con ste. De esta
manera se tiene el, RX, ya que:

La roca natural denominada aljez (sulfato de calcio dihidrato:

CaSO42H2O), mediante deshidratacin, al que puede aadirse en
fbrica determinadas adiciones de otras sustancias qumicas para
modificar sus caractersticas de fraguado, resistencia, adherencia,
retencin de agua y densidad, que una vez amasado con agua, puede
ser utilizado directamente.