MATERIALES Y MTODOS

1)
1.1)
-

EXUDADO VAGINAL
Observacin directa o en fresco
Suero o muestra obtenida del exudado vaginal
Tubo de ensayo
Hisopo de observacin
Porta-objetos
Cubre- objetos
Microscopio ptico

Metodologa: 1. Dejar caer muestra con ayuda del hisopo de

observacin, se hace un extendido pequeo en el cubreobjetos. 2. Observar al microscopio a 10x y 40x.
Hallazgos: Buscar agente Trichonoma
caractersticas morfolgicas y movilidad.

Vaginalis,

sus
Imagen 1. Observacin en fresco.

1.2)
TINCIN EN SECO/ TINCIN DE GRAM
Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en
dos grupos, grampositivas y gramnegativas, de acuerdo a la composicin de su pared
bacteriana.
Material:
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- Microscopio ptico
- Solucin de cristal violeta al 1 %
- Solucin de lugol.
- Solucin decolorante (alcohol etlico y
acetona 1:1)
- Solucin de safranina al 1 %
- Ansa de punta y ansa de aro.
- Mecheros
- Alcohol

Imagen 2. Secuencia de Tincin.

Metodologa:
1. Se toma muestra del exudado con el hisopo de observacin y se extiende en el
cubre-objetos.
La secuencia de la tincin, despus de haber fijado el frotis es la siguiente:
2. Aplicar una gota de Violeta Cristal durante un minuto y lavar con agua,
3. Aplicar gota de lugol durante un minuto y lavar de nuevo con agua,
4. Decolorar con una gota de alcohol acetona durante 30 segundos y escurrir
5. Cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 min. Lavar y secar.
6. Observar a 40x y 100x con aceite de inmersin.
Considerar:
1) EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo
para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas.
2) Cultivos de ms de 24 horas de teidos pueden perder su habilidad de retener el cristal
violeta

Hallazgos:
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin
de cristal violeta (todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn
teidas de azul.
En alcohol-acetona, las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas
son incoloras. Con la safranina se evidencan las clulas gramnegativas, tindose de
color rojo.
CULTIVO
Agar Sabouraud
Este medo es utilizado para el cultivo de mohos y levaduras
patgenas y no patgenas.
Material:
- Agar Sabouraud en caja de Petri.
- Asa de punta.
Metodologa:
1. Tomar muestra con el asa de punta
2. Inocular con estras transversales sobre la
superficie del medio de cultivo, Agar Sabouraud.
3. Incubar en aerobiosis a 20-25C, durante 5 das.
4. Observar caractersticas de las colonias
despus de la tincin de gram a 100x, con
aceite de inmersin.

Imagen 3.. Agar Sabouraud

Hallazgos:
Agar Sangre.
Este medio es utilizado para el cultivo de hongos y
bacterias (no selectivo).
Material:
- Agar Sangre en caja de Petri
- Asa de punta.
Metodologa:
1. Tomar muestra con el asa de punta
2. Inocular con estras transversales sobre la
superficie del medio de cultivo, Agar Sangre.
3. Incubar a 37C, durante 24-48 hrs.
4. Observar caractersticas de las colonias
despus de la tincin de gram a 100x, con
aceite de inmersin.

Imagen 4. Agar Sabouraud

Hallazgos:
Hemlisis alfa: lisis parcial de glbulos rojos. Se observa un halo de color verdoso
alrededor de la colonia en estudio (por oxidacin de hemoglobina a metahemoglobina).
Hemlisis beta: lisis total de glbulos rojos. Se observa un halo claro, brillante alrededor de
la colonia en estudio.
Hemlisis gamma: ausencia de la lisis de glbulos rojos. El medio no presenta
modificaciones de color y aspecto.

TUBO GERMINATIVO
El tubo germinal es una extensin filamentosa de la
levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho
suele ser la mitad de la clula progenitora y su longitud
tres o cuatro veces mayor que la clula madre. Esta
prueba es selectiva para el agente Candida Albicans.
Material
- Plasma de conejo o plasma de humano.
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- Microscopio
Imagen 5. Candida albicans. Tubo
- Aceite de inmersin (opcional)
germinativo positivo.
Metodologa
1. Emulsionar una porcin de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano o de conejo.
2. Incubar a 37 C durante 3 a 5 h.
3. Depositar una gota de la emulsin sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, colocar
un
cubre-objetos y visualizar a x100, x400 x1.000.
Hallazgos: Es positiva si se visualizan los tubos germinales por Candida Albicans.

HARINA DE MAZ
Este medio confirma la determinacin de tubo
germinal y clamidosporas en agar.
A este medio comercializado (Oxoid) debe agregarse
Tween 80 (polisorbato) a una concentracin final de
0,02% para reducir la tensin superficial y aumentar
la formacin de hifas y blastoconidias.
Material:
- Agar harina de maz en caja de Petri
- Porta-objeto
- Cubre-objeto
- Microscopio
- Aceite de inmersin (opcional)

Imagen 6. Observacin macroscpica

en Agar harina de maz.

Metodologa:
1. La inoculacin se debe realizar, segn la tcnica de Dalmau, haciendo tres cortes
paralelos en el agar (separados 1 cm) manteniendo el asa en un ngulo aproximado de
45.
2. Colocar un cubre-objeto sobre la superficie de agar cubriendo una parte de las estras
de siembra.

3. Incubar las placas sembradas a 30 C durante 24- 48 h y luego examinar al microscopio

a travs del cubre-objetos a x100, x400 x1.000
Hallazgos: visualizar el desarrollo de clamidosporas, hifas y blastoconidias.