AISLAMIENTO, SELECCION Y PRESERVACION

DE CEPAS FERMENTADORAS DE PAJA DE TRIGO

PARA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL

INTEGRANTES:

• AGUIRRE PABLO

• ALMEIDA ALEXANDRA

• CUICHAN CRISTINA

• FLORES MIRYAN

• HUERTAS CATALINA

NOVENO SEMESTRE
 INDICE

1. INTRODUCCION 2

2. JUSTIFICACION
2

3. ANTECEDENTES 3

4. PROBLEMA 4

5. OBJETIVOS 4

General
4

Específicos
4

6. MARCO TEORICO 4

7. MARCO METODOLOGICO
7

Muestreo
7

Formulación y diseño del medio de Cultivo

7

Selección de microorganismos
8

Preservación de microorganismos
9

8. FACTIBILIDAD
9

9. BIBLIOGRAFIA
10
1.- INTRODUCCION:
El mundo encara el agotamiento progresivo de sus recursos energéticos basados
mayoritariamente en combustibles no renovables. El consumo global de combustibles
genera enormes cantidades de gases contaminantes que son liberados a la atmósfera.
Este tipo de contaminación ha causado cambios en el clima del planeta, por lo que se
ha convertido en una de las problemáticas de opinión pública.
La única forma de encarar esta problemática es mediante el uso de recursos
energéticos renovables; para ello la biotecnología ofrece múltiples alternativas
tecnológicas, una de las soluciones está representada en los materiales
lignocelulósicos (paja de trigo).
En el mundo se llevan a cabo estudios para desarrollar a gran escala la producción de
etanol a partir de biomasa lignocelulósica. Se considera que la denominada biomasa
lignocelulósica, que incluye residuos agrícolas, forestales, así como residuos
agroindustriales, comprende aproximadamente el 50% de la biomasa en el mundo, la
misma que puede ser procesada de diferentes formas para la obtención de una gran
variedad de productos además del EtOH, el metanol, hidrógeno y electricidad.
El biocombustible más importante es el alcohol carburante (etanol), el cual puede
ser utilizado como oxigenante de la gasolina, elevando su contenido en O2, lo que
permite una mayor combustión de la misma disminuyendo las emisiones
contaminantes.

2.- JUSTIFICACIÓN:
Este trabajo de investigación ve la necesidad de proyectarse hacia la reducción de la
contaminación del medio ambiente y el desabastecimiento de combustibles.
El etanol es una fuente de bioenergía que no produce emisiones de gas; la proporción
de emisiones de CO2 evitada a través del etanol constituye aproximadamente el 85%
del total de emisiones. Esta sustitución equivale a la retirada de la atmósfera de un
promedio de 2036010 toneladas de CO2 al año. Estados Unidos envía a la
atmósfera anualmente 5.739.3 millones de toneladas de CO21.
Este trabajo beneficiará principalmente al sector público, ya que se beneficiaría toda la
población por la no contaminación del medio ambiente.
La matriz energética en cuanto a tipos de combustible, proviene en una proporción
considerable de fuentes de energía renovables (Tabla 1).

Tabla1. Cantidad de etanol obtenido a partir de algunos productos agrícolas

primarios y secundarios.
L de etanol/T de
Producto L etanol/ha
producto
1
http://www.ecologiaverde.com/emisiones-de-co2-en-todo-el-mundo-paises
http://www.scribd.com/doc/6389405/Produccion-de-BioEtanol
 Caña de azúcar 70 3500
Melaza 270 ---
Yuca 180 2100
Sorgo azucarero (grano) 85 3000
Camote 125 1900
Maíz (grano) 370 2400
Remolacha azucarera 3000
Madera 160 3200
Papa (tubérculo) 80 5000
(parte aérea) 250 1400
Residuos de poda 300 700 - 1200
Los materiales lignocelulósicos a partir de la paja de trigo son un recurso relativamente
abundante y ubicado fuera de las cadenas alimenticias lo que los hace una materia
prima poco costosa para la fabricación de etanol industrial con un buen rendimiento y
una alternativa a la quema de rastrojos dejados después de las cosechas de cereales.

3.- ANTECEDENTES:
El trigo se cultiva prácticamente en todas las partes del mundo, es el cultivo al que se
le dedica más proporción de tierras cultivables. Se calcula unas 230 millones de
hectáreas de superficie mundial destinada a este cultivo; el primer país productor del
mundo es Turquía que acoge más del 20 % de la producción mundial y Estados
Unidos en donde existe un 3 % de la producción mundial.
La producción mundial de trigo totaliza 567 millones de toneladas, en Ecuador en el
2008 se cosechó 629.601 toneladas, con un desecho aproximado de 1500 toneladas,
siendo la mayor parte paja de trigo.
La mayor producción de esta gramínea a nivel nacional se concentra en la provincia
de Pichincha y específicamente el 40% corresponde al cantón Rumiñahui en los
sectores de Rumipamba, Patichubamba y San Antonio.

Parámetros de Biomasa del trigo en Ecuador en el año 2008

Rubro % Toneladas métricas
PAJA 67.30 1295.73
TRIGO CON CASCARA SECO Y LIMPIO 32.70 629.65
TOTAL BIOMASA 100 1925.38

Los residuos normalmente se dejan en el campo, son arados, enterrados y se quema

después de las cosechas, lo que representa 1295.73 toneladas métricas de paja que
acrecientan las emisiones de dióxido de carbono a la atmosfera.
Los procesos agrícolas comprenden el 54% de las emisiones de metano,
aproximadamente el 80% de las emisiones de óxido nitroso, y prácticamente todas las
emisiones de dióxido de carbono vinculadas a la utilización de la tierra; cerca de un
tercio del calentamiento de la atmósfera y el cambio climático obedece a la agricultura.
En parte la emisión de CO2 se reduciría si se recolecta apenas una tercera parte de
estos, para destinarla a la producción de etanol. En EEUU se ha calculado, que los
residuos agrícolas que hoy podría cosechar, rendirían 54 mil 375 millones de litros
de etanol, cuatro veces la producción actual, sin demandas adicionales de superficie
de tierra, o importaciones.

En base a las investigaciones realizadas sabemos que es posible obtener etanol a

partir de la degradación de paja de trigo; investigaciones realizadas, con el fin de de
obtener etanol, se han desviado, obteniendo otros resultados también favorables
como:
• Szakács-Dobozi (1985), con el fin de mejorar la degradación de los sustratos
celulósicos, compararon las actividades de los sobrenadantes de los cultivos de 6
hongos, sobre celulosa pura (papel filtro) y sustrato rico en celulosa (paja de trigo).2
• Maheswari (1993), determinaron la eficiencia en la conversión de paja de trigo por
enzimas celulolíticas en un medio suplementado con celulosa en polvo.3
• Ecuador (2006), la Universidad Católica desarrollo algunos proyectos, entre ellos la
producción de etanol lignocelulósico.
• Dinamarca (2009), se inauguró una planta de etanol celulósico a escala
demostrativa que utilizará 30 mil toneladas de paja de trigo para producir 5,4 mil m3
anuales de etanol celulósico.4

4.- PROBLEMA:
La paja que queda en los rastrojos de trigo presenta dificultades para cualquier faena
de labranza o siembra directa que se quiera realizar sobre ellos; la paja es acumulada
en la naturaleza ocasionando grandes problemas de contaminación ambiental al ser
quemada con la consecuente generación de CO2, CH4, CO, NO2 y otros gases;
además se destruye la materia orgánica, el N orgánico y el S se pierden por
volatilización, se reduce parte importante de la actividad biológica del suelo, se pierden
cenizas ricas en K, y se incrementa la pérdida de agua.
La agricultura es un sector primordial en la economía de la región, empleando una
proporción importante de la población económicamente activa. El cambio climático
afecta de forma negativa a esta región, disminuyendo la cantidad de suelos
disponibles para el cultivo debido a un riesgo elevado de desertificación y la
disminución del rendimiento.

5.- OBJETIVOS:
Objetivo General:
• Aislar, seleccionar y preservar cepas fermentadoras de paja de trigo a partir de
la paja que se encuentra en el suelo de varios puntos de los sectores de
Rumipamba, Patichubamba y San Antonio, cantón Rumiñahui, provincia de
Pichincha; para la posterior producción de bioetanol.
Objetivos Específicos:
• Recolectar sustratos (paja de trigo) de diferentes lugares que posean
características similares provenientes del cantón Rumiñahui.
• Diseñar un medio de cultivo adecuado para cepas Quimiheterorganotrofas
productoras de etanol obtenidas a partir de la degradación de compuestos
lignocelulósicos contenidos en la paja de trigo.
• Establecer mediante condiciones adecuadas de: pH, concentración de
nutrientes y temperatura; así como factores de adaptación para seleccionar
las mejores cepas con características biotecnológicas que resistan estos
ambientes.
• Preservar las cepas seleccionadas obtenidas al final del bioprocesos, y
mediante la técnica de crió conservación mantengan sus características
biotecnológicas.

6.- MARCO TEORICO:

El etanol se produce típicamente a partir de melazas de caña de azúcar y del almidón
contenido en granos y cereales, o a partir de la celulosa; que es el componente
principal de las paredes de célula de las plantas y el compuesto orgánico más
abundante en la tierra. La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado
por las levaduras, básicamente (Tabla 4).
2
http://www.espatentes.com/pdf/2164590_a1.pdf
3
http://sisbib.unmsm.edu.pe/BibVirtualData/Tesis/Basic/Vilches_P_L/T_completo.pdf
4
http://www.perafan.com/azucar/ea02come.html
Tabla 4. Principales microorganismos productores de etanol.

Bacterias Levaduras
Zymomonas mobilis. Saccharomyces cerevisiae.
Clostridium acetobutylicum Pichia stipitis
Klebsiella oxytoca Pachysolen tannophilus
Escherichia coli Candida shehate
Grupo Trófico:

• Fuente de Energía: química (quimiotrofo)

• Fuente de electrones: compuestos orgánicos (organotrofo)
• Fuente de Carbono: compuestos orgánicos (heterótrofo)
Cepas Quimioheterorganotrofas

Fórmula Maestra:
Hemicelulosa C5H10O5 + C6H12O6 + Otros azúcares
  →
pretratamiento

Xilosa Glucosa

endoglucanasas y
− glu cos idasa
(C6H10O5)2n
→ n C12H22O11
   
celobiohidrolasas a → 2n C6H12O6
Celulosa Celobiosa Glucosa

C6H12O6 + 2NH3 Cepas fermentado ras

→ 2C2H6O + 2H2O + 2CHON + ATP

Par oxido reductor:

Donador de electrones: Glucosa
Aceptor de electrones: Amoníaco

Entre los constituyentes estructurales de la paja de trigo (Tabla 3) se encuentra la

lignina esta no contiene azúcares, pero encierra a la celulosa y hemicelulosa que sí los
contienen.

Tabla 3. Composición de la paja de trigo.

Porcentaje en peso
Componente
(%)
Agua 15.0
Lignina 21.0
Celulosa 53.5
Cenizas 10.5

Los materiales lignocelulósicos son los que ofrecen un mayor potencial para la
producción de bioetanol, el uso de residuos de procesos agrícolas, forestales o
industriales, con alto contenido en biomasa. Estos residuos pueden ser la paja de
cereal o cáscaras de cereal o de arroz.

Degradación de la celulosa
La celulosa es degradada y utilizada por microorganismos aerobios (hongos,
mixobacterias y eubacterias), mientras en condiciones anaerobias, lo es por
clostridios. La celulosa, al igual que otros compuestos de alto peso molecular, no
puede ser tomada directamente por la célula, sino que tiene que ser hidrolizada fuera
de la célula por despolimerasas que son segregadas en forma de exoenzimas, en
muchos microorganismos celulíticos se puede comprobar la existencia de celulasas
que degradan la celulosa hasta glucosa o hasta el disacárido celobiosa.
La celulolisis es catalizada por un sistema constituido por enzimas:

• Endo-b-1,4-glucanasa que ataca los enlaces b-1,4 en las regiones amorfas

internas de la macromolécula dando largos fragmentos solubles
(oligosacáridos),
• Exo-b-1,4-glucanasa que separa el disacárido celobiosa desde los extremos de
la molécula, b-glucosidasa que hidroliza la celobiosa con formación de glucosa.

Entre las bacterias que son capaces de degradar la celulosa destacan algunas
especies de los géneros como: Clostridium, Streptomyces, Thermomonospora y
Thermobifida (ex-Thermomonospora). En el caso de los clostridios, Clostridium
cellulovorans hidroliza la celulasa en condiciones anaeróbicas; en tanto que las
especies celulolíticas de Streptomyces, Thermomonospora y Thermobifida la degradan
en un ambiente aeróbico.

Los hongos tienen más éxito que las bacterias durante la celulolisis en los suelos
ácidos o en la madera (lignocelulosa). Excretan celulasas que pueden ser aisladas del
medio de cultivo así como del micelio.

MICROORGANISMOS QUE DIGIEREN CELULOSA

METABOLISMO DE LOS MICROORGANISMOS CELULÍTICOS

Los microorganismos capaces de degradar celulosa secretan un sistema complejo de
enzimas extracelulares, celulasas y xilanasas, que actúan sinergísticamente en la
degradación de celulosa y hemicelulosa; las fibras de celulosa son degradadas
esencialmente por dos tipos de sistemas enzimáticos llamados agregativos y no
agregativos.

Sistemas agregativos: En las bacterias anaerobias C. thermocellum y C.

cellulovorans se ha demostrado que las enzimas que participan en la degradación de
celulosa y hemicelulosa se encuentran localizadas en la superficie de estas bacterias
formando complejos multienzimáticos de alto peso molecular. El sistema agregativo
más ampliamente descrito es el de C. thermocellum. Este complejo, conocido como
“celulosoma” comprende al menos 14 polipéptidos distintos, incluyendo varias
celulasas y xilanasas y al menos una ß-glucosidasa, acoplados a una proteína de
andamiaje de 210 kDa sin actividad enzimática que participa en el reconocimiento de
las fibras de celulosa a la superficie de la célula.
La proteína de andamiaje, llamada proteína de unión a celulosa ( CbpA: cellulose
binding protein A), contiene múltiples dominios funcionales: un péptido señal, un
dominio de unión a celulosa (CBD), un dominio hidrofílico presente en cuatro
ocasiones y un dominio hidrofóbico repetido en nueve. Cuando las enzimas se
disocian de la CbpA son capaces de hidrolizar formas amorfas de celulosa pero no
formas cristalinas del polisacárido.

Sistemas no agregativos: Estos sistemas no agregativos están compuestos

principalmente por tres tipos de enzimas:

• b-1,4-endoglucanasas, las cuales se unen, en las porciones amorfas de las

fibras de celulosa y rompen los enlaces b-1,4 glucosídicos incrementando la
disponibilidad de los extremos no reductores de las fibras de celulosa
• celobiohidrolasas (b-1,4-glucan celobiohidrolasas), las cuales liberan unidades
de celobiosa a partir de los extremos no reductores de la celulosa
• b-glucosidasas, que hidrolizan las unidades de celobiosa en monómeros de
glucosa. Estos tres tipos de enzimas actúan en forma cooperativa en la
degradación de la celulosa.

7.- MARCO METODOLÓGICO:

Muestreo
Las muestras serán recolectadas a partir de paja de trigo que se encuentra en el suelo
de varios puntos de los sectores de Rumipamba, Patichubamba y San Antonio, cantón
Rumiñahui, provincia de Pichincha.
Se pesará 10 gramos de cada muestra y serán depositadas en 90ml de medio base
para enriquecer los microorganismos, y se llevaran al shaker a 180 rpm, 37ºC por 24
horas.

Formulación del medio de cultivo

La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos, una primera aproximación
con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento
de la composición de biomasa del microorganismo a ser empleado; una composición
elemental y típica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrógeno,
7-12; Fósforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%.

DISEÑO DE MEDIO DE CULTIVO PARA LA OBTENCIÓN DE CEPAS

FERMENTADORAS A PARTIR DE LA PAJA DE TRIGO (MEDIO BASE)

Medio de cultivo (Líquido):

INGREDIENTES CONCENTRACIÓN
Agua destilada 1 litro
K2HPO4 1g
KH2PO4 1g
(NH4) NO3 3g
MgSO4.7H2O 0,2 g
FeSO4.7H2O 0,01g
CaCl2 0,01g
MnCl2.2H2O 0,002g
NaMoO4.2H2O 0,001g
EDTA 0.2 g
Celulosa 20 g
Lignina 10 g
Extracto de levadura 5g
 • En el medio minimal se utiliza como fuente de carbono la celulosa que
está presente en la paja de trigo. Los datos fueron tomados de la
microbiología de Stainer y del medio de cultivo descrito por Yahashi.

Medio de cultivo (Sólido)

INGREDIENTES CONCENTRACIÓN
Agua destilada 1 litro
K2HPO4 1g
KH2PO4 1g
(NH4)2 SO4 3g
MgSO4.7H2O 0,2 g
FeSO4.7H2O 0,01g
CaCl2 0,01g
MnCl2.2H2O 0,002g
NaMoO4.2H2O 0,001g
EDTA 0.2 g
Celulosa 20 g
Lignina 10 g
Extracto de levadura 5g
Agar- Agar 20 g

Debido a que la degradación de celulosa de la paja de trigo transcurre en un tiempo

muy prolongado, se utilizarà celulosa comercial como fuente de carbono a la
concentración en la que se encuentra en la paja de trigo (53%), logrando de esta
manera acelerar el proceso de obtención de cepas celulolìticas; optimizando tiempo y
recursos5.

La lignina es responsable de la resistencia mecánica y protege los tejidos contra el

ataque de microorganismos. Esta ocurre generalmente en la pared celular vegetal y
està formada por tres polímeros condensados como alcoholes, p-cumaril, coniferil y
sinapil, que se entrecruzan en una malla compleja, resistente a la hidròlisis ácida y
alcalina y a varios complejos enzimáticos, inclusive a enzimas microbianas y del tracto
gastrointestinal de animales superiores; por esta razón se realizará una hidrólisis ácida

5
Proyecto de Biotecnología realizado por Guanoquiza Galo y Oña Nathalia.
a la paja de trigo (H2SO4 concentrado 70 -77% una proporción de 1:25/por cada parte
de biomasa), obteniendo así únicamente lignina que será parte de la composición del
medio6.

La cantidad de nitrógeno a utilizarse por microorganismos celulolíticos varía del 7-

12%, siendo una cantidad menor a comparación de otros componentes, siendo el
extracto de levadura la fuente necesaria de nitrógeno que requieren los
microorganismos4.

Selección de los microorganismos

La selección se realizará mediante la variación de los siguientes parámetros
obteniendo las mejores cepas degradadoras de paja de trigo:

pH
Los microorganismos degradadores de materiales lignocelulósicos prefieren pH 6.5 y
8, el crecimiento se hará a pH de 6, 7, 8 y 8,5

Temperatura
La temperatura ideal para el crecimiento de microorganismos degradadores de
materiales lignocelulósicos es de 21 a 37º C, las temperaturas que se utilizarán para la
selección serán: 21, y 37º C.

Concentración de nutrientes
La celulosa y la lignina son los nutrientes esenciales para el crecimiento de estos
microorganismos, la composición de la paja de trigo es de 50:25 respectivamente, se
elaborará un medio variando las concentraciones a 45, 50 y 55% de celulosa y a 20,
25 y 30% de lignina.

Preservación de los microorganismos

Para la preservación de las cepas puras de utilidad biotecnológica, obtenidas al final
de nuestro trabajo se utilizará la técnica de criopreservación.

Este es un método a largo plazo ya que:

• Suprime los procesos metabólicos de la célula y el crecimiento del sistema
biológico manteniendo la viabilidad.
• Sus ventajas más marcadas son que ahorran resiembras y evitan
contaminación y mutación al tratarse siempre de la primera generación
inoculada.
• Las cepas se conservan por periodos ilimitados.
• Reducen espacio y costo de mantenimiento.

El líquido contenido en los crioviales está especialmente formulado para asegurar la

superviviencia del mayor número de cepas durante largo tiempo y una recuperación
cuantitativa optimizada.

8.- FACTIBILIDAD:
El laboratorio es apto para la obtención de cepas fermentadoras a través del uso de
residuos agrícolas mediante procesos biotecnológicos haciendo posible la obtención
de productos con un valor agregado.
6
Uso de indicadores para estimar consumo y digestibilidad de pasto LIPE, lignina
purificada y enriquecida.
Se obtendrán cepas fermentadoras, de las cuales no todas tendrán buenos resultados,
para ello, se realizará un seguimiento de las diferentes actividades enzimáticas
involucradas, así como de la biomasa celular formada, los polisacáridos sintetizados y
los sustratos consumidos. Se evaluará la capacidad de producción de azúcares
fermentables por parte de las enzimas producidas mediante la obtención de etanol por
fermentación.
Para el aislamiento, selección, y mantención de cepas las técnicas ha utilizarse son
factibles de realizar en el laboratorio; además todos los componentes necesarios para
la confección de medios de cultivos se puede encontrar en el laboratorio de
biotecnología y algunos se puede conseguir con ayuda de los otros laboratorios de la
facultad.

9.- BIBLIOGRAFIA:
• http://redalyc.uaemex.mx/pdf/304/30400802.pdf
• http://www.fuhem.es/media/ecosocial/File/Boletin%20ECOS/Boletin
%201/dossier%20agro%20combustibles/Art.Sastre%20et%20al._def.pdf
• http://www.bibliodigital.udec.cl/sdx/UDEC2/tesis/2006/maturana_c/doc/maturan
a_c.pdf
• http://www.inaut.unsj.edu.ar/Files/1815_08.pdf
• www.creas.bligoo.com/.../Publicaciones_cientificas.html
• www.plataformasinc.es/.../Los-expertos-estiman-en-500-las-revistas-
cientificas-espanolas-de-calidad -
• Proyecto de Biotecnología realizado por Guanoquiza Galo y Oña Nathalia.
• http://www.scribd.com/doc/6389405/Produccion-de-BioEtanol
• http://www.ecologiaverde.com/emisiones-de-co2-en-todo-el-mundo-paises