Tesis208 PDF

CONSEJO SUPERIOR
DE INVESTIGACIONES
CIENTFICAS
INSTITUTO DE AGROQUMICA Y
TECNOLOGA DE ALIMENTOS
EFECTO DEL POLVO DE CACAO Y LOS PULSOS ELCTRICOS DE

ALTA INTENSIDAD (PEF) EN LA INACTIVACIN DE CLULAS
VEGETATIVAS DE Bacillus cereus EN UNA BEBIDA MEZCLA DE
HUEVO LQUIDO Y LECHE.
ANGELA BIBIANA SILVA ANGULO
TRABAJO DE GRADO
Presentando como requisito parcial
para optar al ttulo de
Microbiloga Industrial
ANTONIO MARTNEZ LPEZ, DIRECTOR.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Bogota, D.C
2 de febrero de 2009
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946
La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario
al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia.
CONSEJO SUPERIOR
DE INVESTIGACIONES
CIENTFICAS

HUEVO
LQUIDO Y LECHE.
APROBADO
Antonio Martnez Lpez, PhD

Director
Mara Pina Prez, Ingeniera Agrnoma
Marcela Franco, PhD
Coodirectora
Asesora
Fernando Sampedro, PhD
Aurora Marco,
PhD
Jurado
Dinoraz Velez, PhD

Jurado
Mara Rodrigo, PhD

Jurado
Jurado
Vicenta Deveza, PhD

Jurado
Pablo Fernndez, PhD

Responsable Convenio UPC-PUJ
CONSEJO SUPERIOR
DE INVESTIGACIONES
CIENTFICAS

HUEVO LQUIDO Y LECHE.
APROBADO
Angela Umaa Muoz, MPhil

Decana Acadmica
Janeth Arias Palacios, M.sC-M. Ed

Director de Carrera
DEDICATORIA
A mis padres y hermano.
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer especialmente al Doctor Antonio Martnez y la Doctora Mara

Dolores Rodrigo, por permitirme estar en su grupo de trabajo e investigacin;
ensearme este mundo mgico de la investigacin y guiarme cuando lo necesite.
Tambin quisiera agradecer al Doctor Pablo Fernndez por aceptarme para

emprender este viaje.
A Chelo, por ayudarme, por ser una excelente gua en el desarrollo de mi trabajo
final de carrera y por su paciencia.
A todos mis compaeros del IATA; a Carmen por estar siempre dispuesta a
ayudarme y su alegra, a Daniela por sus consejos, a Aurora por estar siempre
dispuesta a colaborarme, a Fernando por ser como mi hermano y a su familia
porque se han convertido en mi familia Espaola.
A mis compaeros de piso: Manu, por ser un gran amigo, a Pili y a Bego.
A la Doctora Marcela Franco por su apoyo y su gran amistad.
A mis profesores, y especialmente a la Doctora Janeth Arias, por ensearme a no

rendirme y a luchar por lo que quiero y por su gua.
A mis amigos, que aunque estando lejos siguen apoyndome y estando conmigo
cuando ms los he necesitado.
Por ltimo, a mi familia, sin ellos no hubiese podido emprender este viaje y no
habra sido posible la realizacin de este trabajo final de carrera.
2 de febrero de 2009
vi
TABLA DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCIN
Pgs
1
2. MARCO TERICO
2.1. NUEVAS TECNOLOGAS
2.1.1. Pulsos elctricos de alta intensidad (PEF)
2.1.1.1. Sistemas de tratamiento por PEF
2.1.1.2. Cmaras de tratamiento
2.1.1.3. Factores relacionados con la tecnologa de PEF
2.1.1.3.1. Factores del proceso
2.1.1.3.1.1. Intensidad de campo elctrico
2.1.1.3.1.2. Forma del pulso elctrico
2.1.13.2. Temperatura
10
2.1.1.3.3. Tiempo de tratamiento
11
2.1.1.3.4. Amplitud de pulso
11
2.1.1.4. Factores relacionados con las caractersticas fsicoqumicas del producto
12
2.1.1.4.1. Conductividad, pH, antimicrobianos, fuerza inica y

tamao de partcula
12
2.1.1.5. Factores del microorganismo
14
2.1.1.5.1. Tipo de microorganismo
14
2.1.1.5.2. Tamao del inculo
14
2.1.1.5.3. Fase de crecimiento
15
2.1.1.6. Mecanismo de inactivacin microbiana por PEF
15
2.1.1.7. Mecanismo de inactivacin enzimtica por PEF
17
2.1.1.8. Ventajas y desventajas de la tecnologa de PEF
18
2.1.1.8.1. Ventajas de los PEF
18
2.1.1.8.2. Desventajas de los PEF
18
2.2. ANTIMICROBIANOS NATURALES
19
2.2.1. Cacao
20
2.2.2. Composicin de los antimicrobianos naturales
20
vii
2.2.3. Mecanismo de inactivacin microbiana y enzimtica por

antimicrobianos naturales
21
2.2.4. Efecto sinrgico de los antimicrobianos naturales y nuevas

tecnologas de conservacin alimentaria
23
2.2.5. Efecto de la adicin de antimicrobianos naturales en los

alimentos
23
2.2.6. Ventajas y desventajas de los antimicrobianos naturales
24
2.2.6.1. Ventajas de los antimicrobianos naturales
24
2.2.6.2. Desventajas de los antimicrobianos naturales
25
2.3. BEBIDA MEZCLA DE LECHE Y HUEVO
25
2.3.1. Huevo lquido
25
2.3.1.1. Microorganismos alteradores y patgenos del huevo lquido

2.3.2. Leche
30
30
2.3.2.1. Microorganismos alteradores y patgenos de la leche
32
2.4. Bacillus cereus
32
2.5. MODELOS MATEMTICOS PREDICTIVOS
34
2.5.1. Modelo de Bigelow
34
2.5.2. Modelo de Weibull
36
2.5.3. Modelo de Baranyi
37
2.6. BONDAD DEL AJUSTE
39
2.7. CLCULO DE LA ENERGA SUMINISTRADA EN EL

PROCESO
39
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
40
3.1. FORMULACIN DEL PROBLEMA
40
3.2. PREGUNTAS DE INVESTIGACIN
40
3.3. JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN
40
4. OBJETIVOS
42
4.1. OBJETIVO GENERAL
42
4.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
42
5. MATERIALES Y MTODOS
43
viii
5.1. PROTOCOLO DE PREPARACIN DE LA BEBIDA

MEZCLA DE HUEVO LQUIDO (PASTEURIZADO) Y
LECHE DESNATADA (UHT)
43
5.1.1. Materiales
43
5.1.2. Composicin de la bebida
43
5.1.3. Metodologa
43
5.2. PROTOCOLO DE PREPARACIN DE LA BEBIDA

MEZCLA DE HUEVO LQUIDO (PASTEURIZADO),
LECHE DESNATADA (UHT) Y POLVO DE CACAO
(CocoanOX 12%)
44
5.2.1. Materiales
44
5.2.2. Composicin de la bebida
44
5.2.3. Metodologa
45
5.3. CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE LAS

BEBIDAS
45
5.3.1. pH
45
5.3.1.1. Materiales
45
5.3.1.2. Metodologa
46
5.3.2. Conductividad elctrica
46
5.3.2.1. Materiales
46
5.3.2.2. Metodologa
46
5.4. RECUPERACIN Y CRECIMIENTO DE Bacillus

cereus HASTA LA FASE ESTACIONARIA DE
CRECIMIENTO
47
5.4.1. Materiales
47
5.4.2. Metodologa
47
5.5. TRATAMIENTO POR PEF
49
5.5.1. Tratamiento de la bebida mezcla de huevo lquido

pasteurizado, leche desnatada uht y CocoanOX 12% por
PEF
49
5.5.1.1. Materiales
49
5.5.1.2. Descripcin del equipo de PEF (OSU-4D)
49
ix
5.5.1.3. Funcionamiento del sistema
50
5.5.1.4. Metodologa
51
5.5.1.4.1. Parmetros
51
5.5.1.4.2. Tratamientos de inactivacin por PEF
51
5.5.2. Consideraciones a tener en cuenta para el uso del equipo

de PEF
51
5.5.3. Etapas del tratamiento por PEF
52
5.6. RECUENTO DE Bacillus cereus
52
5.6.1. Materiales
52
5.6.2. Metodologa
53
6. RESULTADOS Y DISCUSIN
54
6.1. CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE UNA

NUEVA BEBIDA MEZCLA DE LECHE DESNATADA,
HUEVO LQUIDO Y CocoanOX 12%
54
6.2. CURVAS DE CRECIMIENTO DE Bacillus cereus EN LAS

BEBIDAS DE ESTUDIO
57
6.3. CINTICAS DE INACTIVACIN POR PEF DE

Bacillus cereus EN LA BEBIDA MEZCLA DE LECHE
DESNATADA Y HUEVO LQUIDO, CON Y SIN
CocoanOX 12%
64
6.3.1. Efecto del tiempo de tratamiento e intensidad de campo

elctrico
65
6.3.2. Efecto sinrgico del CocoanOX 12% con los tratamientos

de PEF
68
6.3.3. Ajuste de los datos experimentales a modelos matemticos

predictivos
75
6.3.3.1. Modelo de Bigelow
77
6.3.3.2. Modelo de Weibull
78
6.3.3.3. Ecuacin modificada de Gompertz
80
6.3.3.4. Modelo Log-Logistic
81
6.4. ALMACENAMIENTO
86
7. CONCLUSIONES
94
8. RECOMENDACIONES
96
9. REFERENCIAS
98
TABLAS
5.1. Bebidas obtenidas y su composicin
45
5.2. Temperatura de tratamiento, campo elctrico y tiempo de

tratamiento por PEF a las bebidas
51
6.1. Diferentes formulaciones de la bebida, analizadas para el

tratamiento con PEF
55
6.2a. Variaciones del pH y la conductividad elctrica en funcin de la

temperatura de las bebidas analizadas
56
6.2b. Variacin del pH y la conductividad elctrica en funcin de la

temperatura de las bebidas analizadas
56
6.3. Condiciones para el tratamiento con PEF, intensidad de

campo elctrico (E) y tiempos de tratamiento para B1 y B3
en la inactivacin de B.cereus
65
6.4a. Parmetros cinticos de los cuatro modelos aplicados para la

inactivacin de B.cereus en las cuatro bebidas analizadas
76
6.4b. Parmetros cinticos de los cuatro modelos aplicados para la

77
6.5. Parmetros modelo de Bigelow para la inactivacin de

B.cereus en las cuatro bebidas analizadas
78
6.6. Parmetros cinticos del modelo de Weibull para la

80
6.7. Parmetros cinticos de la ecuacin modificada de

Gompertz para la inactivacin de B.cereus en las cuatro
bebidas analizadas
81
6.8. Parmetros cinticos del modelo Log-Logistic simplificado
xi
86
FIGURAS
2.1. Cmaras de tratamiento
2.2. Componentes de las cmaras de tratamiento tipo co-field
2.3. Onda de cada exponencial
2.4. Onda cuadrada
2.5. Onda cuadrada bipolar
10
2.6. Estructura de la membrana bacteriana expuesta a altas

temperaturas
11
2.7. Onda cuadrada bipolar. Amplitud del pulso (w)
12
2.8. Comparacin de tamaos celulares
14
2.9. Induccin de un potencial transmembrana en una clula

expuesta a PEF
16
2.10. Mecanismo de inactivacin celular por PEF
17
2.11. Brotes de enfermedades transmitidas por el huevo y sus

derivados. Espaa (1998-2001)
26
2.12. Relacin de brotes de enfermedades transmitidas por

alimentos y alimentos implicados en Espaa (1994-2003)
29
2.13. Curva de supervivencia de esporas de B.stearothermophilus a

temperatura constante (115C)
35
2.14. Ejemplos de curvas de supervivencia no lineales
36
5.1. pH-metro y conductmetro
46
5.2. Grfico del equipo de pulsos elctricos
50
6.1. Curva de crecimiento de B.cereus a 4C en B1
58
6.1A. Curva de crecimiento de B.cereus a 4C en B2
58
6.2. Comparacin del crecimiento de B.cereus en B1 y B2 a 4C
59
60
60
61
62
62
63
6.7. Valores de mx de Gompertz para B.cereus a las tres diferentes
xii
temperaturas de crecimiento para B1 y B2
64
6.8. Curvas de inactivacin de B.cereus en la bebida B1 en las

diferentes condiciones de tratamiento con PEF
67
6.9. Curvas de inactivacin de B.cereus en la bebida B3 en las

68
6.10. Curvas de inactivacin de B.cereus en B2 en las diferentes

condiciones de tratamiento con PEF
70
6.10A. Curvas de inactivacin de B.cereus en B4 en las

70
6.11. Inactivacin de B.cereus a 15kV/cm en las bebidas B1 y B2
72
6.11A. Inactivacin de B.cereus a 25kV/cm en las bebidas y B2
72
73
6.12A. Inactivacin de B.cereus a 15kV/cm en las bebidas B3 y B4
73
74
6.13A. Inactivacin de B.cereus a 35kV/cm en las bebidas B3 y B4
74
6.14. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los

cuatro modelos analizados para B1 a 15kV/cm
83
6.15. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los cuatro

modelos analizados Para B2 a 15kV/cm
84
6.15A. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los

84
6.16. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los

85
6.17. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura

de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento de PEF (15kV/cm)
en B3
88

de refrigeracin (5C), posterior al tratamiento con PEF (25kV/cm)
en B3
89
6.18A. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura

en B3
89
xiii

en B4
92

en B4
93
6.20A. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura

en B4
93
xiv
RESUMEN
Con el objetivo de conocer el efecto del polvo de cacao (CocoanOX 12%) y los
pulsos elctricos de alta intensidad (PEF) en el control e inactivacin de clulas
vegetativas de Bacillus cereus, en cuatro bebidas: leche semi-desnatada (B1),
leche semi-desnatada con CocoanOX 12% (B2), leche semi-desnatada y huevo
lquido (B3) y leche semi-desnatada, huevo lquido y CocoanOX 12% (B4), se
realizo el presente estudio.
La concentracin de CocoanOX 12% fue de 2.5% (p/v), ya que se conoce que es

la mnima concentracin de cacao que ejerce un efecto letal en clulas vegetativas
bacterianas. Posteriormente al tratamiento con PEF, las bebidas se almacenaron en
refrigeracin durante 15 das para as analizar el comportamiento de B.cereus
despus del tratamiento con PEF y el efecto del CocoanOX 12%. Los resultados
obtenidos fueron analizados mediante cuatro modelos matemticos predictivos;
modelo de Bigelow, Weibull, la ecuacin modificada de Gompertz y Log-logistic.
En B1 el mximo nivel de inactivacin fue de 3Log10 ciclos logartmicos de

reduccin para 35kV/cm, 300s a 15C; estos mismos resultados se obtuvieron
para B3. En las bebidas suplementadas con CocoanOX 12% el nivel de
inactivacin incremento hasta 3.30Log10 ciclos de reduccin. El modelo que
mejor se ajusto a los datos obtenidos experimentalmente para las cuatro bebidas,
fue el Log-logistic.
Durante el almacenamiento, el CocoanOX 12% ejerci un efecto bactericida en el

control de B.cereus, dando como resultado una reduccin de cuatro ciclos
logartmicos a los 15 das de almacenamiento a 5C en B2 y B4, con respecto a las
bebidas que no contenan el CocoanOX 12%. Estos resultados ponen de
manifiesto el efecto bacteriosttico del CocoanOX 12% as como el efecto
sinrgico de este producto y los PEF en el control de Bacillus cereus.
El presente estudio abre camino hacia la realizacin y propuesta de una nueva

bebida rica en nutrientes esenciales.
1. INTRODUCCIN
Gracias a los cambios en la dieta de los consumidores, debido a una mayor
concienciacin por proteger la salud y bienestar, as como tambin la falta de
tiempo, las industrias estn tratando de desarrollar alimentos procesados listos
para el consumo, ricos en nutrientes; con mnimos tratamientos de conservacin,
as como tambin alimentos orgnicos verdes los cuales carecen de
conservantes qumicos en los mismos.
Estos cambios en los hbitos de consumo, estn llevando a la industria agroalimentara a utilizar nuevas tecnologas de conservacin no trmicas. Dentro de
las ms prometedoras se encuentran la tecnologa de Altas Presiones Hidrostticas
(HHP) y ms recientemente se est trabajando a nivel de laboratorio y de planta
piloto en la posibilidad de aplicar el tratamiento por Pulsos Elctricos de Alta
Intensidad (PEAI). Ambas tecnologas se pueden aplicar solas o combinadas con
antimicrobianos naturales como sustitutos de conservantes qumicos, lo que se
denomina un tratamiento por barreras o efecto hudle. Al tratarse de tecnologas
no trmicas, permiten conservar, en mayor medida que los tratamientos trmicos,
la calidad (sabor, aroma, color y vitaminas) de determinados alimentos listos para
el consumo e inactivar microorganismos patgenos, alteradores y enzimas,
incrementando su vida til en refrigeracin y facilitando su comercializacin.
Dentro de este entorno tecnolgico y de nuevos productos, en el presente trabajo
se pretende desarrollar una nueva bebida mezcla de huevo lquido pasteurizado,
leche desnatada y antimicrobianos naturales la cual cumple con caractersticas
ideales para un pblico cada vez ms exigente.
Para conseguir la inocuidad del producto desarrollado frente a clulas vegetativas
de un microorganismo patgeno que est presente en
las materias primas
utilizadas y para mantener en lo posible sus caractersticas nutricionales y

sensoriales, se evaluar la capacidad de dos tecnologas no trmicas (Altas
Presiones Hidrostticas y Pulsos Elctricos de Alta Intensidad) solas o

combinadas con diferentes antimicrobianos naturales.
2. MARCO TERICO
Tradicionalmente los alimentos han sido preservados usando calor (esterilizacin
comercial, pasteurizacin y escaldado), preservativos (antimicrobianos), o
cambios en las condiciones del medio para los microorganismos como en el pH
(fermentacin), actividad de agua (deshidratacin), la temperatura (refrigeracin
y/ congelacin) (Barbosa et al, 2001).
A pesar de la eficacia de las tecnologas tradicionales desde el punto de vista de
seguridad microbiolgica, estas tambin causan un deterioro nutricional, sensorial
y funcional en los alimentos procesados (Barbosa et al, 2001).
La creciente demanda de alimentos frescos, mnimamente procesados a la vez que
seguros y que conserven sus cualidades nutricionales y organolpticas por parte
de los consumidores ha llevado a un gran esfuerzo de investigacin en los ltimos
veinte aos con el fin de desarrollar nuevos mtodos de conservacin capaces de
inactivar microorganismos patgenos transmitidos por alimentos, as como
tambin conservar sus valores nutricionales y sensoriales (Maas et al, 2005;
Herrero et al, 2006; Barbosa et al, 2001; Devlieghere et al, 2004).
El desarrollo de nuevas tecnologas en la Industria Alimentara est permitiendo
alargar la vida til de muchos productos y satisfacer los gustos del consumidor.
Son productos que presentan un valor aadido y una alta calidad nutritiva y
sensorial, que generalmente se consumen crudos o con un tratamiento trmico
suave. Por este motivo, resulta imprescindible conocer el efecto de las distintas
tecnologas de conservacin en su calidad (Herrero et al, 2006).
Los mayores avances en este campo se han conseguido con el desarrollo de
sistemas fsicos, que afectan la viabilidad de los microorganismos, sin un
incremento sustancial de la temperatura del alimento (Barbosa et al, 2001;
Herrero et al, 2006).
Entre las tecnologas de esta naturaleza se encuentran las altas presiones

hidrostticas (HHP), ultrasonidos, irradiacin, pulsos elctricos de alta intensidad
(PEF), campos magnticos oscilantes y luz blanca de alta intensidad (Herrero et
al, 2006; Maas et al, 2005). El proceso de irradiacin ionizante (IR) envuelve la
aplicacin de ondas electromagnticas electrones a los alimentos. Las fuentes de
radiacin incluyen rayos gamma de cobalto-60, rayos X, la cantidad de irradiacin
absorbida por el alimento es medida en kGy (1Gy = 1J/kg). La aplicacin
comercial del tratamiento por irradiacin ionizante en alimentos empez en 1980,
pero su xito ha sido poco debido a las preocupaciones en cuanto al tratamiento
por parte de los consumidores. Hoy en da, la percepcin de la sociedad en cuanto
a la IR esta cambiando y se esta reexaminando esta tecnologa (Maas et al,
2005).
El ultrasonido es definido como ondas de sonido con frecuencias por encima del
umbral de audicin humana (>16kHz). Aunque el ultrasonido fue inicialmente
descartado como un mtodo para la preservacin de alimentos debido a la
debilidad de su accin letal frente a los microorganismos, la aplicacin de una
presin hidrosttica externa de hasta 600MPa (Manosonicacin (MS)) incrementa
la letalidad del tratamiento. Adicionalmente, la combinacin de MS con
temperatura (Manotermosonicacin (MTS)) ha sido propuesta.
Las HHP envuelven la aplicacin de presiones desde 100 a 1000MPa. El primer
estudio del efecto letal de las HHP fue realizado a finales del siglo 19, pero solo
hasta aos recientes se ha empezado a aplicar comercialmente (Maas et al,
2005).
La tecnologa por PEF consiste en la aplicacin de pulsos elctricos (1050kV/cm) de corta duracin (1-100s) a un alimento puesto entre dos electrodos.
Numerosos estudios han comprobado la efectividad de los pulsos elctricos de
alta intensidad en la destruccin de microorganismos y enzimas de sistemas de
alimentos (Maas et al, 2005).
La optimizacin del empleo de estos mtodos de conservacin pasa por el diseo

de procesos combinados, en los que la asociacin o aplicacin simultnea de
varios procedimientos permita potenciar el efecto, de cada uno de ellos, en los
microorganismos patgenos y alteradores y reducir el impacto adverso en las
caractersticas de los alimentos tratados (Herrero et al, 2006).
2.1 NUEVAS TECNOLOGAS

Se ha comprobado que estas tecnologas alargan la vida de diversos productos
alimenticios y podrn en un corto o mediano plazo reemplazar parcialmente los
tratamientos trmicos convencionales existentes utilizados industrialmente para
pasteurizar y/o esterilizar los alimentos (Barbosa et al, 2001).
2.1.1
PULSOS ELECTICOS DE ALTA INTENSIDAD (PEF)
Los PEF se basan en la aplicacin de pulsos cortos de alto voltaje sobre el

alimento (tpicamente de 20 a 80kV/cm) con una duracin entre 1 y 10 ms (hasta
300s) y se ajusta teniendo en cuenta diversos factores del alimento y de la
microbiota contaminante; el alimento producto se pone entre dos electrodos
dentro de una cmara. Es un proceso no trmico, ya que los alimentos tratados se
mantienen a temperatura ambiente o por debajo de la misma por algunos
microsegundos, minimizando la energa prdida causada por el calentamiento.
Esta tecnologa es considerada superior al tratamiento calrico convencional
debido a que reduce grandemente los cambios que ocurren en las propiedades
sensoriales (sabor, color) y fsicas (textura, viscosidad) de los alimentos. Adems
de conservar los atributos sensoriales de los alimentos, los PEF no introducen
cambios qumicos significativos en los alimentos (Barbosa et al, 2001; Herrero et
al, 2006; Devlieghere et al, 2004).
Los resultados de estudios experimentales han demostrado la eficacia y validacin
de estos mtodos en la preservacin y extensin de la vida de
productos
alimenticios como la leche, huevos lquidos, jugos de manzana, naranja y yogurt
entre otros. Los pulsos elctricos de alta intensidad y los pulsos de luz son las dos
tecnologas ms estudiadas y que parecen estar listas para su aplicacin industrial
como se ha demostrado en pruebas a nivel de laboratorio y de planta piloto
(Barbosa, 2000).
2.1.1.1 SISTEMAS DE TRATAMIENTO POR PEF

Los aspectos mas importantes de esta tecnologa son la generacin de pulsos
elctricos de alta intensidad, el diseo de cmaras para el tratamiento del alimento
de tal manera que ste reciba un tratamiento uniforme con un mnimo de
incremento de la temperatura y el buen diseo de electrodos para minimizar la
electrolisis.
Los diferentes componentes con los que cuenta el equipo de tratamiento por PEF
son los siguientes (Grahl et al, 1996):
Generador de alto voltaje
Interruptor de alto voltaje
Cmaras de tratamiento
Transformador
Sondas de temperatura, voltaje e intensidad de corriente
Osciloscopio
Sistema de refrigeracin
El osciloscopio se utiliza para comprobar el voltaje y la intensidad de corriente

aplicada durante el tratamiento. La energa es suministrada por una fuente de alto
voltaje y sta se almacena en uno o varios condensadores y se descarga a los
alimentos a tratar en forma de pulsos y as obtener un campo elctrico. La energa
contenida en los condensadores puede ser descargada casi instantneamente en
una millonsima de segundo. Esto se produce en una cmara de tratamiento donde
el alimento circula a travs de un conducto cilndrico pequeo. Cuando una seal
de activacin se genera, un interruptor de alta tensin se cierra y la carga
almacenada en el condensador pasa a travs de las cmaras de tratamiento que

contienen el alimento (Barbosa et al, 2001).
Un factor limitante a tener en cuenta en el tratamiento por PEF es el fenmeno de
la ruptura dielctrica. El fenmeno de la ruptura dielctrica consiste en un cambio
brusco de la conductividad elctrica en el interior de la cmara de tratamiento que
produce a su vez un aumento brusco de la intensidad de corriente provocando la
interrupcin del tratamiento. Este cambio brusco puede ser debido a una excesiva
intensidad del tratamiento, valor alto de conductividad elctrica del producto o a
la presencia de burbujas de aire. Durante el fenmeno se observa la formacin de
una chispa en el interior de la cmara de tratamiento, por lo que el fenmeno se
conoce tambin como arqueo o chispa.
2.1.1.2 CMARAS DE TRATAMIENTO

Las cmaras de tratamiento consisten en dos electrodos separados por un material
aislante resistente al alto voltaje en los cuales se aloja el alimento lquido a tratar.
Existen distintos tipos de cmaras segn el volumen almacenado, distribucin y
geometra. Dependiendo del tipo de estudio a realizar, podemos encontrar cmaras
estticas utilizadas para estudios preliminares de laboratorio y cmaras en
continuo utilizadas para estudios en planta piloto y escala industrial por ser ms
econmicas y eficientes. (Barbosa et al, 1999).
Los tipos de cmaras ms importantes son:
Cmara co-field: Son cmaras continuas, donde la direccin del campo

elctrico generado es paralela al flujo del alimento.
Cmara coaxial: Son cmaras continuas, constituidas por dos electrodos

cilndricos concntricos, donde el alimento fluye entre ellos recibiendo el
tratamiento.
Cmara de placas paralelas: Son cmaras estticas, constituidas por dos

electrodos con una distancia menor que la superficie de los mismos.
CONTINAS
Co-field
ESTTICA
Coaxial
Placas Paralelas
Figura 2.1. Cmaras de tratamiento. (Barbosa et al., 1998)
1.
Figura 2.2. Componentes de las cmaras de tratamiento tipo co-field (IATACSIC, 2008)
Las cmaras deben estar diseadas de tal modo que consigan distribuir
uniformemente la intensidad de campo elctrico y as conseguir una mayor
efectividad en el tratamiento, evitando las variaciones de campo que podran
aumentar las probabilidades de ruptura dielctrica (Barbosa et al, 1999).
2.1.1.3 FACTORES RELACIONADOS CON LA TECNOLOGIA DE PEF
2.1.1.3.1
FACTORES DEL PROCESO
2.1.1.3.1.1 INTENSIDAD DE CAMPO ELCTRICO

La intensidad de campo elctrico se produce en el interior de las cmaras y se
define como la diferencia de potencial aplicada a los dos electrodos por la
distancia entre ellos. Segn la ley de Gauss, el campo elctrico en geometra plana
se puede definir como:
E=
V
d
Ecuacin 2.1
donde E es la intensidad de campo elctrico (kV/cm), V diferencia de potencial

(Voltios) y d es la distancia entre electrodos (cm) (Barbosa et al, 1999).
Es uno de los factores ms importantes en la inactivacin de microorganismos por
PEF, ya que para producir la ruptura de la membrana y posterior muerte del
microorganismo
es
necesario
superar
el
denominado
potencial
crtico
transmembrana o intensidad de campo elctrico crtica (Ec) que suele situarse en

un valor de 5 kV/cm (Hlsheger et al., 1980; Qin et al., 1998).
2.1.1.3.1.2 FORMA DEL PULSO ELCTRICO

La forma del pulso interviene directamente en la inactivacin de microorganismos
por PEF. Existen diversos tipos de onda que forman el pulso, entre los cuales
podemos destacar:
Onda de cada exponencial: Este tipo de onda presenta un pico con corto
tiempo en el mximo voltaje y una larga cola con un bajo campo
elctrico, hasta llegar a su valor inicial (0kV/cm); en donde el exceso de
calor generado en el alimento no produce un efecto letal en los
microorganismos (Barbosa et al, 1999; Barbosa et al, 2001) (Figura 2.3).
Figura 2.3. Onda de cada exponencial (Barbosa et al., 1999)
Onda cuadrada: Este tipo de onda se basa en alcanzar rpidamente el valor

de voltaje aplicado, mantenindose durante cierto periodo de tiempo y
descendiendo rpidamente hasta su valor inicial. Existen diversos estudios
que han observado que la onda cuadrada es ms eficaz en la inactivacin
de microorganismos gracias a que mantienen el voltaje mximo dado por
un periodo de tiempo largo utilizando a su vez menos energa que la onda
de cada exponencial (Rodrigo et al., 2003;Barbosa et al, 2001 ) (Figura
2.4).
Figura 2.4. Onda cuadrada (Barbosa et al., 1999).

Dependiendo de la polaridad de los pulsos de onda cuadrada estos pueden tener
caractersticas monopolares o bipolares. Los pulsos bipolares son aquellos que
aplican un pulso de onda positiva seguido de un pulso de onda negativa (Figura
2.5). La aplicacin de pulso bipolar produce cambios en la orientacin de las
molculas cargadas de las clulas provocando un estrs aadido en la membrana
celular, facilitando su ruptura (Ho et al., 1995). En el caso de los pulsos
monopolares (Figura 2.4) se mantienen las polaridades, por lo que parecen ser
menos efectivos, produciendo adems una mayor electrolisis y aumento de los
slidos adheridos a los electrodos (Barbosa et al, 1999).
Figura 2.5. Onda cuadrada bipolar (Barbosa et al., 1999).
2.1.1.3.2
TEMPERATURA
La temperatura es otro de los factores importantes en el tratamiento por PEF.

Durante el tratamiento por PEF se produce un aumento de la temperatura que
depender, principalmente, del campo elctrico aplicado y del tiempo de
tratamiento. Un aumento de la intensidad del tratamiento por PEF provocar un
mayor aumento de la temperatura. El incremento de la temperatura inicial del
tratamiento favorecer, en general, la inactivacin tanto de enzimas como de
microorganismos, producindose un efecto sinrgico (pulsos-temperatura) a
temperaturas comprendidas entre 35-60 C. Esto es debido a cambios en la
permeabilidad y fluidez de la membrana y conductividad elctrica del alimento,
aumentando as las probabilidades de ruptura de la membrana (Figura 2.6)
(Jayaram et al., 1992; Rodrigo et al., 2002, Sampedro et al., 2006; Barbosa et al,
2001).
Algunos autores han demostrado que un aumento moderado de la temperatura de
tratamiento disminuye tambin la cantidad de energa necesaria para lograr un
mismo grado de inactivacin microbiana, debido a los cambios en los
componentes de la membrana inducidos por la temperatura (Wouters et al, 1999;
Heinz et al., 2003; Barbosa et al, 2001).
10
Baja temperatura
Alta temperatura
Figura 2.6. Estructura de la membrana bacteriana expuesta ha altas temperaturas

(Amiali, 2005)
2.1.1.3.3
TIEMPO DE TRATAMIENTO
El tiempo de tratamiento (t) es otro de los parmetros directamente relacionados

con la inactivacin de microorganismos por PEF y se define como:
t = n w
Ecuacin 2.2
donde t es el tiempo de tratamiento (s), n es el nmero de pulsos aplicados y w

es la amplitud o duracin del pulso (s). En general, un incremento del tiempo de
tratamiento produce un incremento de la temperatura y una mayor inactivacin
pero varios estudios han demostrado que se consigue una mayor inactivacin
microbiana aplicando tiempos de tratamiento cortos e intensidades de campo altas
(Sampedro et al., 2006). La aplicacin de tiempos de tratamientos largos y por
tanto de un aumento del gasto energtico no produce un aumento significativo de
la inactivacin (Raso et al., 2000, Aronsson et al., 2001).
2.1.1.3.4
AMPLITUD DE PULSO
La amplitud del pulso (w), se define como el tiempo o duracin de un pulso en

microsegundos y depende de la forma del mismo (Figura 2.7). En general, si se
aplica una amplitud de pulso excesiva y un tiempo largo de tratamiento se puede
producir un incremento excesivo de la temperatura y alterar la conductividad del
alimento, con la consiguiente reduccin en la efectividad del tratamiento por PEF.
Es fundamental combinar de forma adecuada esta variable para optimizar el
tratamiento, logrando una mayor inactivacin con un menor incremento de
temperatura. Diversos autores han tratado de optimizar la amplitud del pulso
11
basndose en la inactivacin microbiana conseguida. Se ha comprobado que un

valor cercano a los dos microsegundos logra una mayor reduccin microbiana. Un
aumento de la amplitud del pulso no logra en muchos casos un aumento de la
inactivacin.
Figura 2.7. Onda cuadrada bipolar. Amplitud de pulso (w).
2.1.1.4 FACTORES RELACIONADOS CON LAS CARACTERSTICAS

FSICO-QUMICAS DEL PRODUCTO
Es necesario conocer las caractersticas fsico-qumicas de los productos
susceptibles de ser tratados por PEF ya que estas afectan directamente a la
efectividad del tratamiento. Las principales son: la conductividad elctrica, fuerza
inica, pH, actividad de agua (aw), presencia de burbujas, antimicrobianos y
tamao de partcula. ltimamente se ha comprobado que la composicin del
alimento es tambin un factor importante a tener en cuenta. La efectividad del
tratamiento con PEF se reduce cuanto ms compleja es la composicin de un
alimento (Sampedro et al., 2006; Barbosa et al, 1999).
2.1.1.4.1
CONDUCTIVIDAD,
pH,
ANTIMICROBIANOS,
FUERZA
INICA Y TAMAO DE PARTICULA

La conductividad esta relacionada con la transferencia de energa, cuando hay una
baja conductividad esto conduce a una mayor eficacia en el tratamiento de PEF;
los alimentos que actan como buenos conductores presentan dificultades para ser
tratados con PEF debido a que se genera un pequeo pico del pulso elctrico en
las cmaras de tratamiento. Por lo tanto, es conveniente que la conductividad del
12
alimento sea baja para obtener un buen grado de inactivacin. Un incremento en

la conductividad incrementa la fuerza inica de los lquidos, por lo tanto un
incremento de la fuerza inica del alimento genera la disminucin en la taza de
inactivacin.
La conductividad y la fuerza inica estn estrechamente
relacionadas. La presencia de iones en el alimento produce efectos variados en los

patrones de inactivacin. Iones como Ca2+, Na+, K+ y Mg2+ actan sobre la
membrana y alteran las funciones celulares de est; sin embrago, iones como
Ca2+ y Mg2+ ejercen un efecto protector al tratamiento con PEF (Barbosa et al,
1999).
Factores adicionales que intervienen en el tratamiento con PEF son el pH del
alimento producto y la presencia de antimicrobianos, estos pueden actuar
sinrgicamente con el tratamiento para la destruccin de microorganismos; el pH
del medio juega un papel importante en las cinticas de inactivacin en el
tratamiento con PEF. El efecto sinrgico entre el pH y los PEF es atribuido a una
posible disminucin del pH citoplasmtico por un incremento en la taza de
transferencia de protones a travs de la membrana cuando sta es electroporada.
La presencia de antimicrobianos en el alimento producto, como nisina
lisozima, reduce la viabilidad de microorganismos patgenos, lo que a su vez
aumenta la efectividad del tratamiento con PEF. Cada uno de estos factores genera
un estrs adicional a los microorganismos, y el resultado es un incremento en la
inactivacin total (Barbosa et al, 1999; Barbosa et al, 2001).
La presencia de partculas suspendidas y de burbujas en el alimento lquido
semislido representan un desafi extra al tratamiento con PEF; las partculas
suspendidas impiden una distribucin homognea del campo elctrico aplicado y
las burbujas de aire, causan una ruptura dielctrica, arcos elctricos chispas, as
como tambin cuasar daos en las cmaras electrodos. Diferentes estudios han
determinado que alimentos lquidos con partculas de mayor tamao son menos
susceptibles a ser tratados por PEF debido a que el fenmeno de ruptura
dielctrica o arqueo se produce de forma ms repetida (Barbosa et al, 1999).
13
2.1.1.5 FACTORES DEL MICROORGANISMO

El tipo de microorganismo (bacterias Gram positivas, Gram negativas, levaduras
esporas), caractersticas especficas, como el dimetro de los microorganismos, la
estructura de la membrana intervienen para escoger las condiciones de
tratamiento. As como tambin, la fase de crecimiento y la concentracin de
microorganismos (Barbosa et al, 1999).
2.1.1.5.1
TIPO DE MICROORGANISMO
La sensibilidad de los microorganismos al tratamiento con PEF vara con cada

tipo de microorganismo; las clulas vegetativas son ms sensibles que las esporas.
Sin embargo, dependiendo de las condiciones experimentales, se puede lograr una
inactivacin irreversible de esporas bacterianas despus del tratamiento con PEF
(Marquez et al 1997). El tamao de los microorganismos tambin influye en la
eficacia de la inactivacin microbiana producida por PEF (Figura 2.8). Las
grandes clulas de las levaduras son ms fciles de inactivar que las clulas
bacterianas. Las bacterias Gram positivas son ms resistentes al tratamiento con
PEF que las Gram negativas, y las clulas que se encuentran en fase logartmica
son ms sensibles que las que estn en la fase estacionaria (Barbosa et al, 2001;
Barbosa et al, 1999).
Figura 2.8. Comparacin de tamaos celulares (Qin et al., 1998)
2.1.1.5.2
TAMAO DEL INCULO
La eficiencia de la inactivacin con PEF se ve afectada por la concentracin

inicial de microorganismos en el alimento a tratar. Jeantet et al (1999), reportaron
14
que cuando el tamao del inculo es grande se reduce el efecto letal del
tratamiento por PEF (Amiali, 2005).Sin embrago, se comprob que el aumento de
poblacin de E. coli (103-108 UFC/mL) en leche ultrafiltrada, no afect a la
efectividad del tratamiento (Barbosa et al., 1999). En conclusin parece que la
influencia de este parmetro sobre la efectividad de los pulsos se ve afectado por
el tipo de microorganismo y las condiciones de tratamiento estudiadas (Torres,
2006).
2.1.1.5.3
FASE DE CRECIMIENTO
Las caractersticas de la clula y en especial su membrana son diferentes en cada

etapa de desarrollo del microorganismo. En la fase logartmica las clulas son ms
sensibles a un factor externo como los pulsos elctricos, que en la fase
estacionaria;
ya que las clulas se encuentran en divisin y por tanto
la
membrana celular es ms susceptible a los cambios externos (Barbosa et al, 2001;

Barbosa et al, 1999; Amiali, 2005). Gskov et al (1996), reporto que la
inactivacin con PEF en la fase logartmica es del 30% mayor que en la fase
estacionaria (Amiali, 2005). Por lo tanto, en estudios de inactivacin microbiana
por PEAI se debera recoger las clulas en fase estacionaria consiguiendo las
condiciones ms desfavorables (Torres, 2006)
2.1.1.6 MECANISMO DE INACTIVACIN MICROBIANA POR PEF

Durante la fase de desarrollo de una nueva tecnologa de conservacin de
alimentos es necesario conocer al mximo los mecanismos por los cuales se
inactivan los microorganismos. Varias teoras han sido propuestas para estudiar la
inactivacin de los microorganismos con PEF. Las ms estudiadas son la ruptura
dielctrica y la electroporacin (Torres, 2006).
La electroporacin es la teora ms aceptada, sta describe el fenmeno que ocurre
en la membrana celular cuando se aplica una intensidad de campo elctrico que da
lugar a una diferencia de potencial entre ambos lados de la membrana (potencial
15
transmembrana) resulta del hecho de que la membrana tiene una constante

dielctrica mucho ms baja que la mayora de los alimentos, por lo tanto, la
aplicacin de los pulsos elctricos induce a la acumulacin de cargas negativas y
positivas dentro de la clula (Figura 2.9), este campo elctrico aplicado
desestabiliza temporalmente la capa lpidica y las protenas de la membrana
celular; el plasma de las membranas celulares se hace permeable a pequeas
molculas y la permeabilidad causa hinchazn y una eventual ruptura de la
membrana celular. Cuando esta diferencia de potencial alcanza un valor crtico de
1 voltio la repulsin entre las cargas lleva a cabo el movimiento de las molculas,
que vara en funcin del tipo de microorganismo, el dimetro del mismo, y sus
condiciones de crecimiento, para Eschericia coli corresponde a un campo
elctrico externo de aproximadamente 10kV/cm, y se origina la formacin de
poros irreversibles en la membrana celular (electroporacin) y en consecuencia la
prdida de su integridad, incremento de la permeabilidad y finalmente destruccin
de la clula afectada (Barbosa et al, 2001; Herrero et al, 2006).
Figura 2.9. Induccin de un potencial transmembrana en una clula expuesta a

PEF (Grahl, 1996)
La ruptura elctrica es la teora en la cual la membrana puede ser considerada
como un capacitador lleno con circuito elctrico. El potencial elctrico normal en
ambos lados de la membrana es de aproximadamente 10mV. La exposicin de la
membrana a un campo elctrico conduce al desarrollo en sta de un potencial
diferencial promovido por la separacin de cargas elctricas a travs de la
membrana celular. El aumento del potencial elctrico de la membrana conlleva a
una reduccin del espesor de la membrana celular. La ruptura de la membrana
16
celular ocurre si el voltaje de ruptura crtico Vc (~1V) es alcanzado por un

incremento adicional del campo elctrico externo. Se asume que la ruptura es
causada por la formacin de poros transmembrnicos, lo cual conduce a una
descarga inmediata de la membrana y a la descomposicin de esta (Barbosa,
2000)
Hamilton y Sale (1967), concluyeron que los pulsos elctricos posiblemente
causan una perdida irreversible en la funcin de la membrana como barrera semipermeable entre las clulas y su entorno (Figura 2.10) (Barbosa et al, 2001).
Figura 2.10. Mecanismo de inactivacin celular por PEF (Mercado, 1997)
2.1.1.7 MECANISMO DE INACTIVACIN ENZIMATICA POR PEF

Diversos estudios han observado el mecanismo de inactivacin de enzimas por
PEF; estos pueden causar la desnaturalizacin de las enzimas, afectar las
interacciones hidrofobicas, puentes de hidrogeno, interacciones de van der Waal,
fuerzas electrostticas (Barbosa et al, 1999).
Adems, los PEF influyen en el estado conformacional de las protenas. Las
cargas de los grupos y sus estructuras son altamente susceptibles a cambios
externos, en este caso a la aplicacin de los PEF. Asociaciones y disociaciones de
grupos ionizables, movimientos de las cargas de las cadenas, cambios en la
alineacin de las hlices, y la forma de una protena pueden ser inducidos por el
tratamiento con PEF (Barbosa et al, 1999).
17
Gracias a que los PEF afectan la estructura proteica y enzimtica, estos se pueden
utilizar para prevenir reacciones no favorables en los alimentos como: reacciones
de oxidacin, cambio del sabor y cambio del color de los alimentos (Barbosa et al,
1999)
2.1.1.8 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA TECNOLOGA DE PEF
2.1.1.8.1
VENTAJAS DE LOS PEF
9 Los PEF son efectivos en la inactivacin de microorganismos patgenos y

alteradores en los alimentos.
9 El proceso de tratamiento con PEF extiende la vida til de zumos de fruta,
productos lcteos, huevo lquido, y cremas de vegetales.
9 Mantiene las caractersticas organolpticas, sensoriales (olor, sabor y
aroma) y nutritivas (vitaminas, minerales), de los alimentos productos
tratados.
9 Los PEF, son una alternativa a la pasteurizacin y esterilizacin sin calor
de alimentos lquidos en la industria agroalimentaria.
9 Los PEF actan sinrgicamente con otras tecnologas ya existentes como
el tratamiento por calor, o nuevas tecnologas como la adicin de
antimicrobianos naturales y HHP para as obtener una mayor inactivacin
microbiolgica con menores tiempos de exposicin y tratamientos
moderados.
2.1.1.8.2
DESVENTAJAS DE LOS PEF
8 Tecnologa limitada a alimentos productos lquidos, sin partculas en

suspensin.
18
8 Es aplicable nicamente a alimentos productos que tengan una baja

conductividad, ya que productos con alta conductividad reducen la eficacia
del tratamiento, favoreciendo la ruptura dielctrica.
8 Si la composicin del alimento es compleja limita su potencial de
inhibicin.
8 Solo logra inhibir las esporas bacterianas si se mezcla con otro tratamiento
de inactivacin.
8 El gasto energtico es mayor que en el tratamiento trmico convencional
con lo que se incrementar el coste de produccin y venta.
2.2
ANTIMICROBIANOS NATURALES
El creciente inters en la sustitucin de conservantes alimentarios qumicos y

productos con bajo impacto al medio ambiente, ha fomentado la investigacin
sobre la seleccin de materiales vegetales con el fin de identificar nuevos
compuestos, antimicrobianos as como tambin antioxidantes. Los productos
naturales y los compuestos derivados de los mismos, tienen aplicaciones en el
control de microorganismos patgenos. Por lo tanto, existen buenas perspectivas
para nuevos mtodos de procesamiento y control de alimentos (Valero et al, 2003;
Burt, 2004).
Los compuestos fenlicos de los antimicrobianos naturales, son los responsables
de su actividad antibacteriana. Existen pruebas que revelan que los componentes
traza juegan una parte fundamental en cuanto a la actividad antibacterial de los
extractos de plantas posiblemente mediante un efecto sinrgico con otros
componentes presentes (Burt, 2004).
Los antimicrobianos naturales actan sinrgicamente con un gran nmero de
mtodos de preservacin: pH bajo, baja actividad de agua del alimento, presencia
19
de agentes quelantes, calor leve, presiones moderadas, pulsos elctricos aunque

no todos se han investigado en productos alimenticios (Burt, 2004).
Posiblemente el rea de aplicacin ms interesante de los antimicrobianos
naturales como antibacterianos es en la reduccin e inhibicin del crecimiento de
microorganismos patgenos como E.coli Salmonella, B.cereus y L.monocytogenes
(Burt, 2004).
El uso de los antimicrobianos naturales por parte de los consumidores se espera
que incremente en el futuro gracias al aumento de los consumidores verdes los
cuales estimulan el uso y desarrollo de productos derivados de plantas, as como
tambin la medicina es cada vez ms receptiva al uso de antimicrobianos y otros
frmacos derivados de las plantas (Burt, 2004; Cowan, 1999).
2.2.1
CACAO
Cacao (Theobroma cacao) tiene varios usos en la industria, siendo el mayor de

estos la produccin de chocolate, y con menor impacto el uso como aromatizante.
Los componentes con accin antibacteriana ms importantes del cacao son las
antocianinas y
flavonoides, estos ltimos han demostrado tener propiedades
antioxidantes (Busta et al, 1968). Los flavonoides aportan varios beneficios a la

salud como, baja tasa de mortalidad cardiovascular, papel protector contra
enfermedades coronarias, eliminacin de radicales libres derivados del oxigeno y
de nitrgeno, quelacin de metales de transicin (hierro, cobre), estudios in Vitro
han demostrado que tambin poseen propiedades antiinflamatorias, antialrgicas,
antivirales, anticancergenas (Keen et al, 2005; Nijveldt, 2001). El CocoanOX
12% (CCX) es cacao en polvo; es un compuesto de alta biodisponibilidad y
garantiza contener al menos 12% de polifenoles en su composicin.
2.2.2
COMPOSICIN DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES
20
Las plantas tienen una capacidad casi ilimitada para sintetizar sustancias
aromticas, la mayora de las cuales son fenoles sus derivados. La mayora son
metabolitos secundarios, en muchos casos estos sirven como mecanismo de
defensa vegetal contra la depredacin por microorganismos, insectos y
herbvoros; algunos de ellos como terpenoides (dan el olor a la planta), quinonas y
taninos (pigmentacin de las plantas). Muchos de los compuestos son
responsables del sabor de la planta, y algunas de estas son utilizadas por el
hombre para dar sabor y aroma. Algunos de los compuestos ms simples constan
de un sustituto del anillo fenlico (Cowan, 1999).
Los componentes mayoritarios de algunos antimicrobianos naturales son: aldehdo
cinnamic y eugenol en canela (Valero et al, 2003), antocianinas y otros
componentes en el cacao (Busta et al, 1968), el ans consta de 85% de anothole
como ingrediente activo, as como tambin de eugenol, metilchavicol,
anisaldehyde y estragol (Ciftic et al, 2005), la vainilla tiene como componente
ms abundante a la vainillina, as como tambin sustancias voltiles que son las
responsables de su aroma, phydroxybenzoic, cido p-hidroxibenzladehido, cido
vainillic, alcohol p-hydroxybenzyl y alcohol vanillyl (Mao et al, 2002).
2.2.3
MECANISMO
DE
INACTIVACIN
MICROBIANA
ENZIMATICA POR ANTIMICROBIANOS NATURALES

Los antimicrobianos naturales estn compuestos por diferentes grupos qumicos,
lo ms probable es que sus propiedades antibacterianas no se deban a un solo
mecanismo sino a la mezcla de varios de los mismos los cuales tienen diferentes
sitios de actuacin en la clula bacteriana. Se conoce que los antimicrobianos
naturales poseen fenoles y estos la presencia de grupos hidroxilo; estos
componentes a su vez poseen fuertes propiedades antibacteriales contra
microorganismos patgenos. La posicin del grupo hidroxilo en los anillos
fenlicos no afecta su actividad antibacterial. Algunos autores han encontrado que
los fenoles con estado de oxidacin ms alto aumentan su poder antibacterial
(Cowan; 1999; Burt, 2004).
21
El modo de accin de los antimicrobianos naturales es similar al de otros

compuestos fenlicos; los sitios de accin de estos en la clula bacteriana son:
degradacin de la pared celular dao en la membrana citoplasmtica,
permeabilizacin de la membrana celular, dao en las protenas de membrana,
perdida del contenido intercelular al exterior, coagulacin del citoplasma y
perdida de la fuerza motriz de protones. Todos estos mecanismos de inactivacin
no actan independientemente; algunos afectan a la clula bacteriana como
consecuencia del dao anteriormente producido por otro mecanismo de
inhibicin. La estructura qumica de cada antimicrobiano natural afecta en su
modo de accin y actividad antibacteriana (Burt, 2004).
Los diferentes componentes de los antimicrobianos naturales tambin parecen
tener accin sobre las protenas presentes en el citoplasma, las enzimas envueltas
en la regulacin de la energa y en la sntesis de compuestos estructurales;
afectando tambin la unin de las protenas, logrando tambin la inhibicin de
enzimas por la oxidacin de compuestos, posiblemente a travs de la reaccin con
los grupos sulfhdrilo por medio de interacciones no especificas con las
protenas. Enzimas como la ATPasa se localiza en el citoplasma de la membrana
celular y en el borde de las molculas lipidias, por lo cual se ve inhibida por la
accin de los antimicrobianos naturales (Cowan; 1999; Burt, 2004).
La actividad antibacterial de los antimicrobianos naturales vara de acuerdo con el
tipo de microorganismo y se ve influenciada por la temperatura de
almacenamiento del alimento. Las bacterias Gram positivas son generalmente ms
sensibles a los antimicrobianos naturales que las Gram negativas. Se ha reportado
que
altas
concentraciones
de
antimicrobianos
naturales
prolongan
considerablemente la fase exponencial de los microorganismos como B.cereus

logran su inhibicin. Se ha encontrado que el aceite de canela, es efectivo en la
inhibicin de B.cereus (Valero et al, 2003; Burt, 2004).
Dependiendo del tipo de material vegetal utilizado, en trminos de su naturaleza
(especias, extracto aceite esencial), el origen (pas de origen, altitud a la que
22
crece, temporada de cosecha), el proceso de produccin, grado de pureza y su

conservacin, ayudan a determinar la presencia y concentracin de sustancias
antimicrobianas en el producto final (Valero et al, 2003).
2.2.4
EFECTO
SINERGICO
DE
LOS
ANTIMICROBIANOS
NATURALES Y NUEVAS TECNOLOGAS DE CONSERVACIN

ALIMENTARIA
El uso de antimicrobianos naturales con otra tcnica de conservacin de alimentos
da grandes beneficios de cada tcnica reduciendo el tiempo y la cantidad de cada
uno. Por esta razn, la aplicacin de temperaturas moderadas, tratamiento con
HHP y PEF y/ la preservacin de los productos alimenticios en fri juegan un
papel importante en la inhibicin de microorganismos (Valero et al, 2003).
Desde que se conoce que las HHP causan dao en la membrana celular, se sugiere
que esta tecnologa y la adicin de antimicrobianos naturales tienen el mismo
rgano blanco en las clulas bacterias, obtenindose as un efecto sinrgico. El
timol y el carvacol muestran un efecto sinrgico con el tratamiento de altas
presiones. Obtenindose reducciones de L.monocytogenes con 300MPa y
3mmol/L de timol carvacol (Burt, 2004).
La presencia de cacao y calor en el medio aumentan su efecto de inactivacin
(sinergismo), pero la presencia de calor no es esencial para el efecto letal del
cacao (Busta et al, 1968).
El efecto sinrgico puede ser explotado para maximizar la actividad antibacterial
de los antimicrobianos naturales y minimizar de esta manera su concentracin
(Burt, 2004).
2.2.5
EFECTO
DE
LA
ADICIN
NATURALES EN LOS ALIMENTOS
23
DE
ANTIMICROBIANOS
Generalmente se asume que altas concentraciones de lpidos y/ protenas en los

alimentos protegen a las bacterias de la accin antibacterial de los antimicrobianos
naturales, contrariamente una concentracin alta de agua y/ sal facilita la accin
antibacteriana. La estructura fsica del alimento puede limitar la accin
antibacterial de los antimicrobianos naturales. Se ha comprobado que se requieren
concentraciones mayores de los antimicrobianos naturales cuando se adicionan a
los alimentos, para generar el mismo efecto antimicrobiano que en ensayos in
vitro. Por ejemplo, para lograr el efecto antimicrobiano en leche semi desnatada se
requiere el doble de concentracin que en ensayos in vitro. Este efecto puede ser
debido a que los alimentos poseen ms nutrientes que el medio de cultivo y por tal
razn permite que las clulas bacterianas daadas reparen su dao en menos
tiempo; pero no nicamente actan las propiedades intrnsecas (contenido de
grasas, protenas, concentracin de agua, antioxidantes, preservativos, pH, sal y
otros aditivos) del alimento en la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos
naturales,
las
caractersticas
extrnsecas
(temperatura,
empaque
las
caractersticas del microorganismo) son determinantes (Burt, 2004).

Generalmente, la susceptibilidad de las bacterias al efecto antibacteriano de los
antimicrobianos naturales se incrementa con un pH bajo del alimento, temperatura
de almacenamiento y la concentracin de oxigeno presente (Burt, 2004).
Los efectos organolpticos se pueden limitar, seleccionando el tipo de
antimicrobiano natural de acuerdo con el tipo de alimento, para as no cambiar el
aroma sabor original del mismo (Burt, 2004).
2.2.6
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS ANTIMICROBIANOS

NATURALES
2.2.6.1 VENTAJAS DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES

9 La adicin de antimicrobianos naturales prolonga la fase exponencial de
muchos microorganismos patgenos y alteradores.
24
9 Los antimicrobianos naturales pueden realzar el aroma de los alimentos.

9 El tratamiento con antimicrobianos naturales acta sinrgicamente con
otras tecnologas ya existentes como el tratamiento por calor, o nuevas
tecnologas como PEF y HHP, para obtener una mayor inactivacin
microbiolgica con menores concentraciones y tiempos de tratamiento.
2.2.6.2 DESVENTAJAS DE LOS ANTIMICROBIANOS NATURALES

8 Su modo de accin aun no esta completamente claro.
8 Si la composicin del alimento es compleja se limitara su poder
antimicrobiano.
8 En algunos casos, se aumenta la concentracin de antimicrobianos
naturales en los alimentos para lograr la misma inhibicin que en ensayos
in vitro.
2.3 BEBIDA MEZCLA DE LECHE Y HUEVO
2.3.1
HUEVO LQUIDO
El huevo es un alimento de gran valor nutritivo que de forma natural se encuentra

protegido de la contaminacin exterior gracias a su cscara (Instituto Estudios del
Huevo, 2004). A pesar de ello en ocasiones se ve involucrado en las
toxiinfecciones alimentaras las cuales presentan una incidencia preocupante en
cuanto a su repercusin global sobre la salud pblica. Los datos epidemiolgicos
relativos a los brotes de toxiinfecciones alimentaras registrados durante los
ltimos aos ponen de relieve una elevada frecuencia de los originados por la
ingestin de alimentos de consumo inmediato que contienen huevo (Instituto
Estudios del Huevo, 2004).
25
Segn el informe elaborado por el Centro Nacional de Epidemiologa entre los

aos 1998 al 2001, el 38.5% de los brotes alimentarios se relacionan con el
consumo de huevo y sus derivados, de los cuales el 85.5% se asociaron con la
salmonelosis. El principal factor que contribuye a estos brotes es la inadecuada
temperatura de conservacin de los alimentos, entre otros factores se destacan, el
consumo de alimentos crudos y la preparacin con antelacin. El hogar con una
frecuencia superior al 59% es el lugar donde ocurren la mayora de los brotes
(Figura 2.11) (Instituto Estudios del Huevo, 2004)
Figura 2.11. Brotes de enfermedades transmitidas por el huevo y sus

derivados. Espaa (1998-2001) (Instituto Estudios del Huevo, 2004)
El huevo cuenta con barreras fsicas y qumicas que lo protegen de la
contaminacin por microorganismos:
26
La cutcula es la capa compuesta de queratina que recubre la cscara de acta

a modo de tapn sellante de sus poros. Es una excelente barrera frente a la
prdida de humedad del huevo y frente a la entrada de microorganismos.
(Instituto Estudios del Huevo, 2004)
La cscara est compuesta por sales de carbonato clcico, fosfato clcico y

protenas. Sus miles de poros permiten el intercambio gaseoso con el exterior.
(Instituto Estudios del Huevo, 2004)
El albumen o clara formada por protenas capaces de impedir la multiplicacin

de los microorganismos invasores mediante diferentes mecanismos de accin,
adems su viscosidad dificulta el movimiento de las bacterias. La clara
contiene, ovoalbmina (55% de la protena de la clara), lecitina, lisozima, la
cual es un conservante natural por su actividad antimicrobiana; es importante
resaltar que el efecto antimicrobiano de la lisozima y de la ovoalbmina
desaparece cuando la clara se mezcla con la yema del huevo(Instituto Estudios
del Huevo, 2004)
Un gran nmero de industrias utilizan el huevo para elaborar sus productos en el

sector de alimentacin humana. El huevo aporta adems de su valor nutritivo, una
amplia gama de propiedades funcionales que son necesarias para los procesos de
fabricacin de muchos alimentos (Lee et al, 1999; Instituto Estudios del Huevo,
2004).La produccin y comercializacin de productos derivados del huevo ha
progresado de forma importante en los ltimos aos. Las razones de este
desarrollo son variadas, por un lado, la evolucin de la industria alimentaria, para
responder al creciente consumo de platos precocinados, que cada vez demanda
materias primas ms fciles de manipular y adecuadas a su proceso productivo,
evitando las complicaciones de manejar las cscaras y el huevo crudo. Por otra
parte, este desarrollo tambin se ha debido a la prohibicin del uso de huevo
fresco en la restauracin colectiva, para cualquier alimento cocinado a una
temperatura inferior a 75C (Instituto Estudios del Huevo, 2004).
Para la industria alimentaria los ovoproductos ofrecen algunas ventajas frente al
huevo en cscara:
27
Mayor versatilidad
Fcil empleo y dosificacin
Eliminacin de los residuos que supondran las cscaras
Mayor seguridad bacteriolgica
Manipulacin ms sencilla: fcil almacenamiento, ahorro de tiempo y

de mano de obra
Facilita la distribucin y el comercio internacional
El ovoproducto que ms se utiliza en la hostelera, restauracin colectiva y en la

industria alimentaria es el huevo lquido pasteurizado. Aproximadamente el 85%
de la produccin de huevos en Espaa se dirige al consumo humano directo como
huevo fresco, y el 15% restante est destinado a la industria de fabricacin de
ovoproductos, sobre todo industrias alimentarias (Instituto Estudios del Huevo,
2004).
El huevo lquido se pasteuriza a 60C por 3 minutos para obtener un producto
estable y libre de microorganismos. La pasteurizacin por calor es efectiva frente
a casi todos los microorganismos pero no frente a microorganismos termfilos
esporulados; adems esta tiene efectos negativos frente a la calidad y cantidad del
alimento tratado, en este caso huevo lquido. La pasteurizacin del huevo lquido
genera un descenso en la viscosidad (Miranda, 1999; Lee et al, 2001; Lee et al,
1999). Someter el huevo lquido a altas temperaturas (60-68C) reduce la
capacidad espumante del huevo. Varios mtodo alternativos a la pasteurizacin
por calor se estn estudiando como el uso de pulsos elctricos de alta intensidad
(PEF), el cual inactiva a los microorganismos patgenos y alteradores, as como
tambin el uso de ultrasonido, uso de agentes antimicrobianos y las HHP, estas
ltimas dan un tratamiento homogneo a todo el alimento en su envase
inactivando a los microorganismos sin generar cambios fsicos del alimento
(Miranda et al, 1999; Lee et al, 2001; Lee et al, 1999). El huevo lquido acta
como un importante factor para determinar el proceso de tratamiento debido a su
fcil desnaturalizacin de protenas y puede enmascarar a los microorganismos, de
esta manera hacer ms difcil su inactivacin (Lee et al, 2001).
28
La vida til del huevo lquido esta determinada por los microorganismos
alteradores que contiene: Micrococcus, Staphylococcus, Arthrobacter, Bacillus,
Pseudomonas spp y coliformes. En el huevo lquido pueden crecer
microorganismos patgenos como: Salmonellae spp y Listeria monocytogenes, as
como tambin algunos gneros resistentes a la pasteurizacin como: Alcaligenes,
Bacillus, Proteus, Escherichia, Pseudomonas y cocos Gram positivos (Miranda et
al, 1999; Lee et al, 2001; Lee et al, 1999). La presencia de coliformes en el huevo
lquido es un indicador de malas condiciones del proceso de produccin del
mismo y tambin indica una alta probabilidad de la presencia de Salmonella
(Nieto, 2003).
Las caractersticas intrnsecas del alimento son determinantes en el desarrollo de
las contaminaciones por la proliferacin de bacterias. Los alimentos de alto
contenido proteico, como la carne, el pescado, los huevos, la leche y derivados,
son alimentos considerados de alto riesgo (Figura 2.12).
Figura 2.12. Relacin de brotes de enfermedades transmitidas por alimentos y

alimentos implicados en Espaa (1994-2003)
29
Es interesante sealar, en relacin con la evolucin del consumo de huevos en los

pases desarrollados, el auge de la alimentacin fcil como resultado de
determinadas tendencias sociales. Como resultado de ello, los ovoproductos estn
sustituyendo cada vez ms a los huevos con cscara, tanto en los hogares como en
la restauracin colectiva (Instituto Estudios del Huevo, 2004).
2.3.1.1 MICROORGANISMOS ALTERADORES Y PATGENOS DEL

HUEVO LQUIDO
La flora del huevo lquido est constituida por muchos tipos de bacterias Gram
positivas y Gram negativas que provienen principalmente de cscaras
contaminadas con heces y otros materiales, de la existencia en el lote en cuestin
de huevos contaminados del estado de limpieza, de la maquinaria y utensilios
empleados as como de las conducciones, bombas, filtros, recipientes, batidoras o
tanques de almacenamiento (Instituto Estudios del Huevo, 2004).
La simple presencia de un huevo deteriorado puede contaminar la instalacin de
rotura y aadir millones de bacterias al huevo lquido. La utilizacin para la
elaboracin de huevo lquido de huevos con la cscara rota incrementa el grado de
contaminacin
por
Salmonellas,
otros
microorganismos
patgenos
microorganismos causantes de alteracin (Instituto Estudios del Huevo, 2004;

Amiali, 2005).
Janssen y Mulder (1971), hallaron que el huevo lquido elaborado a partir de
huevos rechazados de incubacin, contena una gran variedad de microorganismos
pertenecientes a la familia Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae,
Micrococcaceae y Pseudomonadaceae (Instituto Estudios del Huevo, 2004;
Amiali, 2005).
2.3.2
LECHE
La leche es un lquido de composicin y estructura compleja con un pH cercano a

la neutralidad. La materia grasa se encuentra en emulsin, las protenas
constituyen una suspensin, mientras que los restantes componentes (lactosa,
30
otras sustancias nitrogenadas, minerales, entre otros) estn disueltos (Taverna et

al, 2001).
La leche es un excelente medio de cultivo para muchos microorganismos, cuyo
desarrollo ocasiona una prdida de calidad pudiendo incluso llegar a niveles que
la inutilicen para su consumo transformacin. El objetivo principal de la
pasteurizacin de la leche es la eliminacin de microorganismos patgenos que
sta pudiese contener, un propsito secundario es la destruccin de otros
microorganismos alteradores para salvaguardar la calidad del producto (Buffa,
2003).
El tratamiento de pasteurizacin que se utiliza con mayor frecuencia en la
industria consiste en un calentamiento de la leche a 72C durante 15s, denominada
por sus siglas en ingls HTST (High temperatura short time) (Buffa, 2003).
La leche contiene ms de sesenta enzimas endgenas, algunas de las cuales tienen
importantes aplicaciones tecnolgicas relacionadas con el flavor, la textura y la
estabilidad de los productos lcteos (Buffa, 2003). La mayora de la grasa de la
leche (98%) est constituida por triglicridos. La fraccin nitrogenada de la leche
est compuesta por dos grandes grupos: las protenas y el nitrgeno no proteico.
La lactosa es un disacrido compuesto por glucosa y galactosa. Los minerales
representan una pequea fraccin de los slidos de la leche. Su concentracin es
de alrededor 0,7% de la materia seca de la leche (Taverna et al, 2001).
La leche contiene una gran cantidad de componentes en muy pequeas
concentraciones (gases disueltos, enzimas, entre otros) muchos de los cuales
tienen relevancia nutricional, en los procesos de transformacin y/o de
degradacin de propiedades qumicas y organolpticas de la leche y productos.
La leche es una fuente importante de vitaminas para el hombre. Las hidrosolubles
(vitaminas del grupo B y C) estn presentes en la fase acuosa. La concentracin es
poco variable ya que provienen de la biosntesis de las bacterias del rumen. En
31
cuanto a las liposolubles (A,E y D) estn asociadas a la materia grasa y varan,

entre otros aspectos, segn el tipo de alimentacin (Taverna et al, 2001).
2.3.2.1 MICROORGANISMOS ALTERADORES Y PATGENOS DE LA

LECHE
En el proceso de pasteurizacin de la leche los microorganismos patgenos, los
coliformes y la mayora de los psicrfilos son destruidos, no as un gran grupo de
mesfilos termorresistentes, conocidos todos ellos como termodricos. Los ms
frecuentes en la leche pertenecen a especies del gnero Micrococcus sp, algunos
enterococcos, aerobios formadores de esporas (Bacillus subtilis y
Bacillus
cereus) y algunos lactobacilos (Lactobacillus casei, entre otros). Es importante

resaltar que la pasteurizacin no elimina totalmente la microbiota endgena de la
leche y est puede desarrollarse posteriormente (Buffa, 2003).
Bacillus cereus es uno de los microorganismos ms importantes encontrado en la
leche pasteurizada y los productos derivados de la leche (Pirttijrvi et al, 1998).
2.4 Bacillus cereus

Los datos epidemiolgicos muestran como Clostridium botulinum, Clostridium
perfringens, Staphilococcus aureus, Salmonella spp, Bacillus cereus y
Escherichia coli entre otros, se convierten en la causa de la gran mayora de las
infecciones e intoxicaciones que se producen por la ingesta de alimentos.
Las especies de Bacillus se encuentran comnmente deteriorando una amplia
gama de productos, dentro de los cuales se encuentran la leche y sus derivados,
productos crnicos, productos de panadera, purs de vegetales, productos de
pasta, pur de papas, ovoproductos, hiervas y especias (Abdou, 2007).
Bacillus cereus, pertenece a la familia Bacillacea, la cual contiene una diversidad
de bacterias formadoras de esporas, incluyendo desde aerobios estrictos hasta
anaerobios obligados, cocos y bacilos, tanto psicrfilos como termfilos. Es un
microorganismo Gram positivo mvil en los cultivos jvenes y a medida que
32
envejece puede verse como Gram variable o Gram negativo. Las esporas pueden
estar dentro de la pared bacteriana o pueden deformar la pared, estas son aerobias,
son altamente resistentes al tratamiento con temperatura. La termoresistencia de
los microorganismos esporoformadores y las propiedades sicotroficas de las
especies de Bacillus son factores determinantes para los procesos de produccin y
para determinan el tiempo de vida til de los alimentos, el cual acortan (Abdou,
2007).
Su temperatura de crecimiento mnima esta entre 15 a 20C y la mxima es entre
40 a 45C con un ptimo de 37C.
Son saprofitos ampliamente distribuidos en el ambiente natural en suelos de todo
tipo, y puede ser encontrado en el polvo y en el aire, por lo tanto tiene
considerable oportunidad para estar presente en o sobre los alimentos. En la
industria alimentara, la contaminacin producida por Bacillus se genera
principalmente desde el suelo, y los procesos en los que interviene el agua
(Abdou, 2007). Las esporas fcilmente sobreviven la distribucin en polvos y
aerosoles siendo vehiculizadas desde estos lugares a otros hbitats. Los alimentos
secos como condimentos, leche en polvo y harinas pueden estar contaminados con
esporas.
Este microorganismo produce dos enterotoxinas durante su crecimiento
exponencial:
1. Toxina diarreica. El sndrome diarreico por el contrario, est producido por la
ingestin de alimentos inadecuadamente refrigerados. Resulta de la esporulacin
del organismo in vivo y de la produccin de una enterotoxina preformada y
termolbil (Pirttijrvi et al, 1998; Granum et al, 1997).
2. Toxina Emtica. El sndrome emtico est producido por una toxina
preformada y termoestable. Se asocia frecuentemente con arroz frito (Pirttijrvi et
al, 1998; Granum et al, 1997).
33
Los sntomas de la toxiinfeccin tienen dos formas de presentacin con presencia

de diarrea, dolores abdominales y vmitos. Su periodo de incubacin vara de 4 a
16 horas luego de la ingesta del alimento contaminado (Granum et al, 1997).
2.5 MODELOS MATEMTICOS PREDICTIVOS

Habitualmente, para el estudio de la resistencia microbiana a distintos agentes
letales se utilizan las denominadas curvas de supervivencia en las que se
representa el logaritmo decimal del nmero de supervivientes frente al tiempo de
tratamiento. Estas grficas se suelen describir mediante distintos modelos
matemticos a partir de los cuales se obtienen diferentes parmetros que permiten
cuantificar y predecir la resistencia bacteriana.
La obtencin de modelos y parmetros cinticos son bsicos para el desarrollo de
nuevos procesos de conservacin de alimentos. Su aplicacin directa en la
industria se aprovecha para optimizar procesos y mejorar la seguridad
microbiolgica de los alimentos, as como para implementar planes de anlisis de
peligros y puntos de control crticos (APPCC).
2.5.1 MODELO DE BIGELOW

Los modelos cinticos clsicos asumen una relacin de primer orden entre la
poblacin microbiana y la intensidad de tratamiento. El modelo desarrollado por
Bigelow, Ball y Stumbo (Stumbo, 1973) (Ecuacin 2.4) se ha usado
principalmente para explicar las curvas de supervivencia debidas al tratamiento
trmico:
Log S =
t
D
Ecuacin 2.4
donde S es la fraccin de supervivientes calculada como la fraccin entre el

nmero de microorganismos vivos tras un tratamiento especifico y el numero
34
inicial de microorganismos; D es el tiempo de reduccin decimal definido como

el tiempo requerido para reducir un ciclo logartmico la concentracin de
microorganismos (s) (Figura 2.13); y t es el tiempo de tratamiento (s). El valor de
D o tiempo de reduccin decimal se calcula a partir de la pendiente de la recta.
Figura 2.13. Curva de supervivencia de esporas de B. stearothermophilus a

temperatura constante (115 C).
En el caso del tratamiento por PEF existe la evidencia de la aparicin de varios
tipos de desviacin del modelo tradicional (Figura 2.14), con la aparicin de
hombros y colas en las curvas de supervivencia. Por lo tanto se debera evaluar la
validez del modelo de Bigelow para interpretar datos cinticos de inactivacin por
PEF.
35
Figura 2.14. Ejemplos de curvas de supervivencia no lineales.
2.5.2 MODELO DE WEIBULL

La distribucin de Weibull se ha aplicado en la industria mecnica para inquirir el
tiempo de fallo de un determinado componente. Este modelo consiste en una
distribucin de frecuencias que considera al microorganismo como una poblacin,
donde cada individuo tiene una resistencia al tratamiento, por lo tanto las curvas
de inactivacin representan la distribucin de la resistencia del conjunto de la
poblacin al tratamiento. Bajo esta perspectiva es ms fcil explicar que no exista
una relacin lineal entre el tiempo de tratamiento y la muerte del microorganismo.
Aparte de su sencillez, puede interpretar curvas con hombros y colas, y lneas
rectas. Esta distribucin ha servido para describir curvas de inactivacin por calor
y por PEF (Rodrigo et al., 2003, Sampedro et al., 2006) (Ecuacin 2.5).
t n
S (t ) = exp
a
Ecuacin 2.5
36
donde S es la fraccin de supervivientes, t es el tiempo de tratamiento expresado

en s, a es el parmetro de escala expresado en s relacionado con la intensidad
del tratamiento y n es el parmetro de forma, cuyo valor depende de la forma de la
curva de supervivencia. Cuando el valor de n<1 las curvas de supervivencia
presentan colas, es decir, la fraccin residual de clulas que quedan por inactivar
tienen menos probabilidades de morir, son las mas resistentes o las que mejor se
han adaptado al estrs producido por los tratamientos. Cuando el valor de n>1, las
curvas de supervivencia presentan hombros indicando que durante las primeras
condiciones del tratamiento las clulas son resistentes al tratamiento y conforme
aumentamos la intensidad del tratamiento se produce un aumento de la
inactivacin. En el caso que el valor de n=1 la probabilidad que el
microorganismo muera no depende del tiempo de tratamiento, en otras palabras,
cada clula es igual de sensible al tratamiento sin importar lo que dure el mismo.
Otro de los parmetros utilizados en el modelo de Weibull es el tiempo crtico
(tcw) que se puede definir como el tiempo donde se produce la mayor muerte del
microorganismo tras el tratamiento y se puede expresar con la siguiente ecuacin:

tcw = a * (1 + b 1 )
Ecuacin 2.6
donde a y b son los parmetros de la ecuacin 1.4 y es la funcin gamma.
2.5.3 MODELO DE BARANYI

El modelo de Baranyi fue desarrollado originalmente para curvas de crecimiento
microbiano (Baranyi et al., 1993; Baranyi et al., 1994), sin embargo Xiong et al.,
1999 adaptaron el modelo a las curvas de supervivencia, obteniendo la siguiente
ecuacin:
log
N
= log(q B + (1 q B )e k max ( t B ( t )) )
N0
siendo
37
Ecuacin 2.7
r 1
(r + t ) 2
2t r
1
B(t ) = ( ln 2
+ 3 arctan
+ 3 arctan ) Ecuacin 2.8
2
3 2 r rt + t
r 3
3
Este modelo se adapta bien a curvas de supervivencia sigmoidales, donde qB
B
puede ser usado como indicador de la existencia de colas en las curvas de

supervivencia. El parmetro kmax es el ndice de muerte mximo y puede ser
considerado como una constante en la fase lineal de la curva de supervivencia.
B(t) es una funcin que explica la fase lag (hombro) de la curva y viene definida
por el parmetro r.
Este modelo tambin se adapta a curvas de supervivencia no sigmoidales. En caso
de la no existencia de colas en las curvas (qB=0), la Ecuacin 1.8 se transformara
B
en:
log(
N
t B (t )
)=
N0
Dmin
Ecuacin 2.9
donde Dmin=2.303/kmax., siendo Dmin el tiempo de reduccin decimal. Como kmax

se puede considerar como una aproximacin del ndice de muerte para la fase
lineal de la curva, Dmin se define como el tiempo mnimo requerido para disminuir
un ciclo logartmico la poblacin de microorganismos a una temperatura de
referencia. En caso de no presentar la curva fase lag, entonces el modelo se puede
simplificar a un modelo cintico lineal de primer orden:
log(
N
t
)=
N0
D
Ecuacin 2.10
donde D es el tiempo de reduccin decimal.
38
2.6
BONDAD DEL AJUSTE
Los modelos se validan por medio de tres replicas usando el parmetro Accuracy
factor (Af). Este parmetro nos da una idea del ajuste del modelo a la curva de
supervivencia del microorganismo y se define como:
Af = 10
Log ( predicho / observado)

n
Ecuacin 2.11
donde n es el nmero de valores observados, los valores predicho y observado

hacen referencia a la fraccin de supervivientes. Los valores de Af cercanos a 1
nos indican un mejor ajuste del modelo a los valores experimentales.
El Mean Square Error (MSE) se calcul utilizando la siguiente ecuacin:
( predicho observado)
MSE =
n p
Ecuacin 2.12
donde n es el nmero de valores observados, los valores predicho y observado

hacen referencia a la fraccin de supervivientes y p es el numero de parmetros
estimados por el modelo. Los valores de MSE cercanos a 0 nos indican un mejor
ajuste del modelo a los valores experimentales.
2.7
CLCULO DE LA ENERGA SUMINISTRADA EN EL PROCESO
Es necesario estudiar la energa consumida en cada uno de los tratamientos, para

determinar el efecto directo sobre microorganismos y enzimas en cada uno de los
casos mediante la siguiente ecuacin:
Q( J / ml ) = E 2 t
Ecuacin 2.13
donde E es la intensidad de campo elctrico (kV/cm), es la conductividad

elctrica del producto para cada una de las temperaturas de proceso (mS/cm) y t es
el tiempo de tratamiento (s).
39
3.1
FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
FORMULACIN DEL PROBLEMA
Debido al alto contenido de nutrientes en la nueva bebida, el desarrollo de

microorganismos patgenos es alto generando as un problema evidente de
salud pblica. Por esta razn es de suma importancia conocer el nivel de
inactivacin y el control durante el almacenamiento de un microorganismo
patgeno, presente en las dos materias primas con las que se realiza la nueva
bebida, como consecuencia del uso combinado de tecnologas emergentes, como
lo son los PEF y los antimicrobianos naturales para su control.
3.2
PREGUNTAS DE INVESTIGACIN
Evaluacin de la capacidad de los procesos no trmicos solos o combinados con

antimicrobianos naturales, para conseguir la inocuidad alimentaria de una bebida a
base de leche y huevo lquido.
Las preguntas a responder seran:
1) Cunto microorganismo se puede inactivar en las condiciones que permita
el alimento.
2) Cul es la cintica de inactivacin del microorganismo
3) Si existe un efecto sinrgico entre las tecnologas no trmicas y el
antimicrobiano natural
4) Cul sera la vida til de dicho alimento
3.3
JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN
Tradicionalmente los alimentos han sido preservados por calor, estos mtodos son
efectivos en la inactivacin de microorganismos patgenos y alteradores, pero
producen un gran impacto sobre las caractersticas nutricionales y organolpticas
de los alimentos tratados; lo que ha generado una inquietud en la industria
40
agroalimentaria que la ha llevado a explorar nuevas tecnologas de conservacin

no trmicas que permitan armonizar inocuidad alimentaria y calidad nutricional
de los alimentos elaborados.
Los Pulsos Elctricos de Alta Intensidad (PEF) solos o combinados con
antimicrobianos naturales, son tecnologas de conservacin
no trmicas que
podran aunar ambos requisitos, inocuidad y calidad nutricional.

En el mercado, existen distintos tipos de bebidas que pretenden proporcionar al
consumidor unos niveles de nutrientes adecuados mientras que mantienen la
inocuidad. Las bebidas de este tipo suelen ser combinaciones de leche con zumo,
huevo con zumo, partiendo de productos tratados por calor. En estos casos las
tecnologas no trmicas que se proponen podran jugar un papel importante puesto
que al ser no trmicas daran valor aadido al producto final ya que permitiran
una mayor retencin de los nutrientes que se encuentran en las materias primas
frescas. Un buen candidato para este tipo de estudios seria la mezcla de leche y
huevo, junto con algn tipo de antimicrobiano natural que permita el control de
los microorganismos patgenos que sobrevivan a los tratamientos proporcionados
mediante ambas tecnologas emergentes.
Los resultados del estudio, son de un elevado nivel cientfico-tecnolgico, ya que
adems de proponer una bebida con un elevado valor nutritivo, partiendo de
materias primas de primera necesidad, se obtendrn datos del potencial de estas
tecnologas emergentes para conseguir la estabilidad o inocuidad microbiolgica
del alimento, y una vida til larga. Por otro lado, al tratarse de materias primas
comunes en las granjas y no excesivamente caras, permitira producir alimentos
de un elevado valor aadido con el consiguiente impacto social-econmico
beneficioso.
41
OBJETIVOS
4. 1 OBJETIVO GENERAL
El objetivo general del trabajo ha sido el estudio de la inactivacin de clulas
vegetativas de Bacillus cereus por tratamientos combinados de PEF y polvo de
cacao (CocoanOX 12%), en una nueva bebida mezcla de leche desnatada y huevo
lquido.
4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Elaboracin y caracterizacin fsico-qumica de una nueva bebida mezcla de leche
desnatada, huevo lquido y polvo de cacao (CocoanOX 12%).
Evaluar la inactivacin por PEF y CocoanOX 12% de clulas vegetativas de
Bacillus cereus en la bebida mezcla de leche desnatada y huevo lquido.
Estudiar y analizar la prolongacin de la vida til de la nueva bebida en
temperaturas de almacenamiento (5C) y el efecto del polvo de cacao.
Analizar el efecto del polvo de cacao en la inactivacin de clulas vegetativas de
Bacillus cereus.
Estudio de las cinticas de inactivacin de Bacillus cereus en el producto mezcla
de leche desnatada y huevo lquido mediante las tecnologas de PEF y la adicin
del polvo de cacao.
Modelizacin de los datos experimentales obtenidos en las cinticas de
inactivacin microbiana.
42
MATERIALES Y MTODOS
Aunque se trate de desarrollar una bebida a base de materias primas frescas, para
poder establecer las cinticas de inactivacin del microorganismo patgeno y
poder controlar convenientemente cada fase experimental, es necesario partir de
materias primas libres o con concentraciones muy bajas de microorganismos y
especficamente de Bacillus cereus. En consecuencia, se debe partir de materias
primas pasteurizadas o esterilizadas, a las cuales se les aadir, como se explica
en material y mtodos, una cantidad controlada del microorganismo patgeno a
estudiar.
5.1
PROTOCOLO DE PREPARACIN DE LA BEBIDA MEZCLA DE
HUEVO LQUIDO (PASTEURIZADO) Y LECHE DESNATADA (UHT)
5.1.1 MATERIALES
Material de vidrio de laboratorio
Placa calefactora-agitadora: Basicmagicmix Plus, OVAN
Agitador magntico: Agimatic-E
Balanza analtica: Precisa 2200C (+/- 0,01g)
5.1.2 COMPOSICIN DE LA BEBIDA
Huevo lquido pasteurizado comercial mantenido a 4C hasta su uso: 20%

(v/v).
Leche desnatada UHT comercial mantenida a temperatura ambiente hasta su

uso: 80% (v/v).
5.1.3 METODOLOGA
Se mide la cantidad de leche y huevo necesaria.
43
Se aade la leche y se mantiene en agitacin a temperatura ambiente;

posteriormente se aade el huevo y se mantiene en agitacin.
5.2
Por ltimo, el producto se mantiene a 4C para su posterior uso.
PROTOCOLO DE PREPARACIN DE LA BEBIDA MEZCLA DE
HUEVO LQUIDO (PASTEURIZADO), LECHE DESNATADA (UHT) Y

POLVO DE CACAO (CocoanOX 12%)
5.2.1 MATERIALES
Materiales de vidrio de laboratorio
Placa calefactora-agitadora: Basicmagicmix Plus, OVAN
Agitador magntico:Agimatic-E
Balanza analtica: Precisa 2200C (+/- 0,01g)
5.2.2 COMPOSICIN DE LA BEBIDA
Huevo lquido pasteurizado comercial mantenido a 4C hasta su uso: 20%

(v/v).
Leche desnatada UHT comercial mantenida a temperatura ambiente hasta su

uso: 80% (v/v).
CocoanOX 12% en polvo (Natraceutical): 2,5% (p/v).
A 500mL de la bebida se le agregan 7gramos de CocoanOX 12% resultando en

una concentracin final de 2.5% (p/v), as un total de cuatro bebidas se crearon
para el anlisis final de la inactivacin de B.cereus (Tabla 5.1).
44
Tabla 5.1. Bebidas obtenidas y su composicin

Bebidas
Composicin
B1
Leche desnatada
B2
Leche desnatada y CocoanOX 12%
B3
Leche desnatada y Huevo lquido
B4
Leche desnatada, huevo lquido y CocoanOX 12%
5.2.3 METODOLOGA
Se mide la cantidad de leche y huevo necesaria.
Se aade la leche y se mantiene en agitacin a temperatura ambiente;

posteriormente se aade el huevo y se mantiene en agitacin.
Se pesa la cantidad de CocoanOX 12% necesaria y se agrega a la mezcla de

huevo lquido y leche desnatada en agitacin.
Se mantiene en agitacin por un perodo de tiempo corto, para as garantizar la

homogeneidad de la mezcla.
5.3
Por ltimo, el producto se mantiene a 4C para su posterior uso
CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE LAS BEBIDAS
5.3.1 pH
5.3.1.1 MATERIALES
pH-metro: Crisol micro pH GLP 21 (Figura 5.1)
Sonda de compensacin de temperatura: Crisol
Electrodo de medida del pH: Crisol
Soluciones tampn de calibracin: Crisol (pH: 4 y pH: 7)
45
Figura 5.1. pH-metro y conductmetro (IATA, 2008)
5.3.1.2 METODOLOGA
Se calibra el pH-metro mediante las soluciones tampn, que se atemperan
previamente a la temperatura requerida. Se introduce el electrodo y la sonda de
compensacin de temperatura en la muestra. Tras su estabilizacin se toma la
lectura del pH.
5.3.2 CONDUCTIVIDAD ELCTRICA
5.3.2.1 MATERIALES
Conductmetro: Crisol Conductimeter 525 (Figura 5.1)
Sonda de compensacin de temperatura: Crisol
Electrodo de lectura de la conductividad elctrica: Crisol
Solucin tampn de calibracin (KCl 0,01M)
5.3.2.2 METODOLOGA
Se calibra el conductmetro mediante la solucin tampn atemperada previamente
a la temperatura requerida. Se introduce el electrodo y la sonda de temperatura en
46
la muestra previamente atemperada. Tras su estabilizacin se toma la lectura de la

conductividad en mS/cm.
5.4
RECUPERACIN Y CRECIMIENTO DE Bacillus cereus HASTA
LA FASE ESTACIONARIA DE CRECIMIENTO

Para realizar los estudios cinticos de inactivacin de Bacillus cereus es necesario
que la poblacin de microorganismos utilizada en los tratamientos sea
homognea. Por tal razn, las clulas son llevadas a fase estacionaria de
crecimiento, debido a que en esta etapa las clulas son ms resistentes a los
diferentes tratamientos.
5.4.1 MATERIALES
Vial madre de B.cereus proporcionado por la Coleccin Espaola de Cultivos

Tipo.
Caldo infusin cerebro corazn (BHI): Scharlau Chemie, S.A.
Agar infusin cerebro corazn (BHIA): Scharlau Chemie, S.A.
Agua de peptona: Scharlau Chemie, S.A
Glicerol: Scharlau Chemie, S.A
Botes de centrfuga de 250 mL estriles: BECKMAN COULTER TM
Material de laboratorio estril
Bao de agua con agitacin: Unitronic OR.
Espectofotmetro: Spectronic Gnesis 5 (Figura 2.9).
Centrfuga: DuPont Instruments Sorval RC-5B.
Congelador (-80C): Brunswick Scientific U570 Premium
Cmara de siembra: Telstar BV-100
Vortex: Heidolph- Reax Top
Incubadora: Wulkex Modelo C-80
5.4.2 METODOLOGA
47
Se rompe la cpsula del lifilo y se resuspende en 10mL de caldo BHI y se

mantiene en 37C por 20minutos. Despus de este tiempo, los 10mL fueron
inoculados en 500mL de caldo BHI e incubados a 37C en agitacin continua a
200rpm por 24 horas, para obtener clulas en fase estacionaria de crecimiento. El
seguimiento se realiza mediante la toma de muestras y correspondiente lectura de
absorbancia a 600 nm en un espectrofotmetro, a intervalos de tiempo
determinados.
Transcurridas las 24 horas de crecimiento, es necesario separar las clulas del
material de desecho. Para ello, se separa el contenido en dos botes de centrifuga
de 250 mL y se centrifuga a 7000 rpm durante 15 minutos a 4 C. Se elimina todo
el sobrenadante y se disuelve el precipitado con 100mL de caldo BHI. Se somete
a una segunda centrifugacin en las condiciones descritas anteriormente y se
elimina el sobrenadante. Se redisuelve el precipitado con 15mL de caldo BHI.
Posteriormente, se llenan 50 viales con 1mL de suspensin celular y 1mL de caldo
BHI con glicerol al 20%. Las muestras de 2mL fueron inmediatamente congeladas
y almacenadas a -80C. Estos viales se denominan viales madre a partir de los
cuales se harn los viales para las experiencias. Se obtuvieron 15 viales madre con
una concentracin final de 109UFC/mL.
El siguiente paso consiste en repetir el proceso anterior teniendo un vial de
clulas madre y diluyendo con caldo BHI para obtener una concentracin de
106UFC/mL. Un mililitro de esta solucin fue trasferido a un matraz que contena
500mL de BHI e incubado a 37C en agitacin contina a 200rpm por 14 horas
para obtener clulas en fase estacionaria de crecimiento. El seguimiento se realiza
mediante la toma de muestras y correspondiente lectura de absorbancia a 600 nm
en un espectrofotmetro, a intervalos de tiempo determinados. Las suspensiones
celulares fueron centrifugadas dos veces a 7000rpm, 4C por 15minutos. Se
elimina todo el sobrenadante y se disuelve el precipitado con 50mL de BHI y se
prepararon 50 viales de 2mL, cada uno con 1mL de suspensin celular y 1mL de
BHI con glicerol al 20%, con una concentracin final de 1-3x109UFC/mL.
Inmediatamente los viales fueron congelados a -80C para el uso en los
experimentos.
48
5.5
TRATAMIENTO POR PEF
5.5.1 TRATAMIENTO DE LA BEBIDA MEZCLA DE HUEVO LQUIDO

PASTEURIZADO, LECHE DESNATADA UHT Y COCOANOX 12% POR
PEF
Las bebidas B1, B2, B3 y B4 (Tabla 5.1) fueron tratadas por PEF, para as obtener
los daos de inactivacin celular necesarios.
5.5.1.1 MATERIALES
Equipo de tratamiento por pulsos elctricos de alta intensidad: OSU-4D
Bao termostatado: Cole Parmer Polysat
Bomba peristltica: Milipore No. 7017
Agitador magntico: Agimatic- E
Osciloscopio: Tektronix TDS-210
Lectores termopares: Tecnikmax
5.5.1.2 DESCRIPCIN DEL EQUIPO DE PEF (OSU-4D)

El equipo de PEF es un prototipo diseado por el laboratorio de Tecnologa de
Alimentos de la Universidad Estatal de Ohio (EEUU) en 1.999. Consta de un
transformador, un generador de pulsos de alto voltaje, una batera de
condensadores, un interruptor, un microordenador, un set de cmaras de
tratamiento del tipo co-field en serie y sondas de temperatura, voltaje e
intensidad (Figura 5.2).
El equipo esta diseado para abarcar condiciones de tratamiento de 1 a 20 s de
amplitud de pulso, una frecuencia de pulsado de 40 a 4000 pulsos por segundo y
un campo elctrico de hasta 40 kV/cm.
49
Las cmaras de tratamiento estn formadas por dos electrodos de acero inoxidable
soportados por un materia aislante (tefln) que los separa 0.29 cm, conectado uno
de los electrodos a tierra mientras el otro a una fuente de alto voltaje.
Figura 5.2. Grfico del equipo de pulsos elctricos (Montaner et al. 2007)
5.5.1.3 FUNCIONAMIENTO DEL SISTEMA

El producto a tratar se mantiene en hielo y en agitacin previamente al
tratamiento. Se introducen los parmetros del proceso (intensidad de campo
elctrico, tiempo de tratamiento y amplitud de pulso). Posteriormente el producto
es impulsado mediante una bomba peristltica por el interior de un bao
termostatado para conseguir la temperatura de tratamiento deseada. El control de
la temperatura se realiza mediante cuatro termopares (a la entrada del alimento en
la primera cmara de tratamiento, a la salida de la segunda cmara de tratamiento,
a la entrada de la penltima cmara de tratamiento y a la salida de la ltima
cmara de tratamiento). El primer termopar indica la temperatura inicial del
tratamiento mientras que el cuarto termopar la temperatura final. El sistema se
completa con el osciloscopio que permite registrar el voltaje, la intensidad de la
corriente y la amplitud del pulso (Figura 5.2).
50
5.5.1.4 METODOLOGA
5.5.1.4.1
PARMETROS
Intensidades de campo elctrico: 15, 25 y 35kV/cm
Flujo de trabajo: 60mL/min
Forma del pulso: cuadrada
Polaridad del pulso: bipolar
Tiempos de tratamiento (Tabla 5.3)
Duracin del pulso: 10 microsegundos
5.5.1.4.2
TRATAMIENTOS DE INACTIVACIN POR PEF
En primer lugar se estudiaron las cinticas de inactivacin por PEF de clulas

vegetativas de B.cereus en las bebidas (B1 y B2; Tabla 5.1) a diferentes
intensidades de campo elctrico y tiempos de tratamiento (Tabla 5.2). En segundo
lugar se estudi el efecto y cinticas de inactivacin y/ control de B.cereus
causadas por el tratamiento con PEF y CocoanOX 12% en almacenamiento de las
bebidas tratadas hasta un tiempo final de 15 das a 5C, tomando muestras cada
cinco das de almacenamiento empezando por el da cero.
Tabla 5.2. Temperatura de tratamiento, campo elctrico y tiempo de tratamiento
por PEF a las bebidas
Temperatura
Campo elctrico
Tiempo de tratamiento (s)
bao (C)
(kV/cm)
15
60, 360, 420, 600, 850, 1000, 1900
25
60, 120, 220, 360, 500, 600, 750
35
60, 80, 100, 120, 150, 180, 200
5.5.2 CONSIDERACIONES A TENER EN CUENTA PARA EL USO DEL

EQUIPO DE PEF
51
Como ya se ha comentado anteriormente, el equipo de pulsos tiene como factor

limitante la conductividad elctrica del producto. Cuanto mayor es la
conductividad, el funcionamiento del equipo se ve limitado debido al fenmeno
de la ruptura dielctrica. El aumento de la conductividad puede venir del propio
producto, por un aumento de la temperatura y por la presencia de burbujas de aire
en la muestra. Por este motivo, es muy importante tratar de eliminar todas las
burbujas de aire de las conducciones antes de que entren en el equipo de pulsos.
En los equipos actuales se sita una vlvula de sobrepresin a la entrada del
alimento para eliminar las posibles burbujas de aire.
5.5.3 ETAPAS DEL TRATAMIENTO POR PEF
Conexin del bao a la temperatura de trabajo deseada.
Limpieza diaria de las conducciones con leja al 10% y enjuagado con agua
destilada estril. Limpieza semanal de las conducciones con hidrxido de
sodio (NaOH) al 10%, enjuagado con agua destilada, cido ntrico (HNO3) al
2 por mil y enjuagado con agua destilada.
Calibracin del flujo de trabajo a 60 mL/min usando la bebida a tratar.
Se inocula en la bebida un vial de B.cereus descongelado previamente,

manteniendo en agitacin la bebida.
Paso de la bebida inoculada a travs del sistema para eliminar burbujas de aire
y mantener un flujo homogneo.
Introduccin de las caractersticas de tratamiento en el equipo.
Tratamiento y toma de muestras en tubo universales estriles mantenidos en

hielo.
5.6
Limpieza del equipo por el mtodo anteriormente descrito.
RECUENTO DE Bacillus cereus
5.6.1 MATERIALES
52
Cmara de siembra: Telstar BV-100
Incubadora: Wulkex-C
BHIA (Agar infusin cerebro corazn): Scharlau Chemie S.A
Agua de Peptona: Scharlau Chemie, S.A
Material de laboratorio estril
5.6.2
METODOLOGA
Se realiza el recuento de B.cereus, sembrado en profundidad, para conocer la

concentracin inicial y nivel de inactivacin alcanzado en cada uno de los
tratamientos. Tras recoger la muestra tratada en tubos universales estriles, se
procede a su dilucin con agua de peptona estril y siembra en BHIA. Todo el
proceso se realiza en cmara de siembra para mantener las condiciones de
esterilidad. Las muestras se incuban a 37 C durante 24h. Se cuentan las unidades
formadoras de colonias (UFC) y se expresan los recuentos como UFC/mL.
53
RESULTADOS Y DISCUSIN
Actualmente la industria alimentaria busca satisfacer las necesidades de los

consumidores, quienes cada da aumentan sus exigencias en lo que se refiere a su
alimentacin. Adems de la calidad nutricional, organolptica y factores
econmicos, los consumidores estn transformando su modo de vida por lo que
algunos tipos de alimentos se estn implantando en el mercado actual. Estos
cambios nos motivaron a investigar y analizar los productos que actualmente se
comercializan en el mercado, en lo que a bebidas se refiere, encontrando en buena
medida las caractersticas idneas para la realizacin de una nueva bebida que en
este trabajo se concreta, ya que su composicin no se encuentra en ningn otro
producto que se comercialice.
6.1 CARACTERIZACIN FSICO-QUMICA DE UNA NUEVA BEBIDA

MEZCLA DE LECHE DESNATADA, HUEVO LQUIDO Y CocoanOX
12%
La tabla 6.1 muestra las distintas formulaciones realizadas de la bebida, variando
la cantidad de leche semi-desnatada y huevo lquido, la concentracin de
CocoanOX 12% fue constante en todo el estudio, 2.5% p/v, est se eligi ya que
se conoce que es la concentracin mnima inhibidora gracias a estudios realizados
por Busta y Peck (1968) quienes observaron que a esta concentracin se lograba
obtener una reduccin significativa de la poblacin de clulas viables.
Los porcentajes idneos de leche desnatada y huevo lquido escogidos para el
tratamiento con PEF y formulacin de la bebida final fueron los encontrados en la
bebida B3, ya que no representaron ningn inconveniente frente a las condiciones
de tratamiento de PEF escogidas, especialmente por su bajo contenido de huevo
lquido.
54
Tabla 6.1. Diferentes formulaciones de la bebida, analizadas para el tratamiento

con PEF.
Bebidas
Leche
Huevo lquido
semi-desnatada
mL
mL
B1
1000
100
Bb1
750
75
250
25
B3
800
80
200
20
Bb2
850
85
150
15
El anlisis de la inactivacin por PEF de clulas vegetativas de B.cereus se llevo a

cabo en las siguientes bebidas:
-
B1: Leche desnatada (100% v/v)
B2: B1 con CocoanOX 12% (2.5%w/v)
B3: Leche desnatada (80% v/v), huevo lquido (20% v/v)
B4: B3 con CocoanOX 12% (2.5% w/v)
Aunque la formulacin de la bebida final fue la B4, para el correcto anlisis de las
cinticas de crecimiento e inactivacin y para conocer el efecto del CocoanOX
12% en el control de las clulas vegetativas de B.cereus, se realiz el estudio en
estas cuatro bebidas.
Las tablas 6.2a y 6.2b muestran la variacin del pH y la conductividad elctrica
(C) de las bebidas tratadas con PEF, frente a un aumento gradual de la
temperatura, ya que el tratamiento con PEF aumenta levemente la temperatura en
funcin de la intensidad del mismo (Sampedro, 2008).
55
Tabla 6.2.a. Variacin del pH y la conductividad elctrica en funcin de la

temperatura de las bebidas analizadas.
Temperatura (C)
Bebidas
25
B1
C (mS/cm)
3.38 0.14
pH
6.68 0.07
C (mS/cm)
5.77 0.10
pH
6.69 0.03
B2
3.58 0.10
6.50 0.11
5.97 0.08
6.55 0.04
B3
4.27 0.08
6.21 0.11
7.23 0.03
6.18 0.05
B4
4.25 0.11
6.20 0.08
7.16 0.04
6.21 0.02
Tabla 6.2.b. Variacin del pH y la conductividad elctrica en funcin de la

temperatura de las bebidas analizadas.
B1
Temperatura (C)
35
C (mS/cm)
pH
7.02 0.11
6.68 0.03
B2
7.22 0.03
6.53 0.02
B3
8.70 0.25
6.18 0.03
B4
8.45 0.12
6.19 0.02
Bebidas
En las tablas 6.2a y 6.2b, se observa un aumento de la conductividad elctrica de

las bebidas a medida que se aumento gradualmente la temperatura; resultados
acordes con lo encontrado por lvarez, et al, 2007, quienes afirman que la
conductividad aumenta conforme se va aumentando la temperatura. Como se
comento en pginas anteriores, alimentos con alta conductividad no son buenos
candidatos para el tratamiento con PEF. A medida que aumenta la conductividad
de un sistema alimentario tambin aumenta la energa necesaria para desarrollar
un campo elctrico de la intensidad requerida para lograr un efecto letal contra los
microorganismos. La temperatura y la conductividad, tiene un impacto importante
en la calidad y magnitud de la intensidad del campo elctrico. (Keener et al,
2007).
56
A diferencia de la conductividad elctrica, no se observ una variacin importante

del pH de las bebidas a medida que se va aumentando la temperatura de las
mismas (Tablas 6.2a y 6.2b), el pH de las bebidas es cercano a la neutralidad (7)
por lo que no se puede llegar a pensar que exista relacin del mismo con el grado
de inactivacin final alcanzado. En algunos alimentos cidos, como zumos de
frutas, aumenta el rango de inactivacin de los microorganismos con PEF
(lvarez, I, et al. 2007; Sampedro, 2008; Keener et al, 2007).
6.2 CURVAS DE CRECIMIENTO DE Bacillus cereus EN LAS BEBIDAS

DE ESTUDIO
El anlisis del crecimiento de Bacillus cereus se realizo en las bebidas B1 y B2,
debido a que el componente mayoritario de todas las formulaciones fue la leche
semi-desnatada; este anlisis se realiz mediante curvas de crecimiento a tres
diferentes temperaturas (4C, 20C y 37C), temperatura de refrigeracin,
temperatura ambiente y temperatura ptima de crecimiento del microorganismo
respectivamente, todas las muestras se sembraron en Agar BHI.
A continuacin, se muestran las graficas de crecimiento de B.cereus a dichas
temperaturas y su comparacin con la bebida que contena el antimicrobiano y la
que no a la misma temperatura (Figura 6.1, 6.2 y 6.2A); es importante sealar que
no se realizaron curvas de crecimiento con las bebidas que contenan huevo
lquido ya que el porcentaje de ste en la bebida fue insignificante.
57
4C B1
8
7
Log (UFC/mL
6
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tiempo (h)
Figura 6.1. Curva de crecimiento de B.cereus a 4C en B1.
4C B2
8
7
Log (UFC/mL
6
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
100
Tiempo (h)
120
140
160
Figura 6.1A. Curva de crecimiento de B.cereus a 4C en B2.
58
180
4C
8
Log (ufc/ml)
7
6
5
4
3
2
1
0
0
12 16 18 22 36 48 52 60 74 100 120 137 166
t (h)
Leche
Leche +CCX
Figura 6.2. Comparacin del crecimiento de B.cereus en B1 y B2 a 4C.

A 4C (Figura 6.1, 6.1A y 6.2), el crecimiento de B.cereus se vio controlado por la
temperatura que le impide duplicarse de forma ptima as los nutrientes en las
bebidas sean los idneos para su crecimiento, por tal razn esta temperatura
represento una barrera para el crecimiento del microorganismo en estudio.
Adems cuando en la bebida se aade CocoanOX 12%, se observo un menor
crecimiento del microorganismo, bajo las mismas condiciones de incubacin
(Figura 6.1A), observando de esta manera el efecto bacteriosttico que ejerce el
CocoanOX 12% en las clulas vegetativas de B.cereus.
Este control del crecimiento se observ ms claramente en la Figura 6.2 donde se
compar el crecimiento de B.cereus a 4C en las dos bebidas, se observa
claramente que en la bebida B2 el crecimiento de B.cereus es menor que en la
bebida que carece del CocoanOX 12%, resultados acordes a los encontrados en
estudios realizados por Busta et al (1968).
59
Log (UFC/mL
20C B1
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Tiempo (h)
Log (UFC/mL
20C B2
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (h)
60
70
Log (ufc/ml)
20C
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
t (h)
20 22
24 48 64
Leche
Leche+CCX

A 20C (Figuras 6.3, 6.3A y 6.4), el crecimiento de B.cereus fue ms rpido que el
observado a 4C, ya que esta temperatura favorece ms su crecimiento; en cuanto
a la fase de latencia, sta disminuy con respecto a lo observado a la temperatura
de refrigeracin, confirmando as la barrera que representa la temperatura en el
crecimiento de este microorganismo.
Al igual que lo observado a 4C, en B2 el crecimiento de B.cereus fue ligeramente
menor (Figura 6.3A y 6.4), pero la concentracin final de microorganismos es la
misma, dejando de manifiesto que el CocoanOX 12% tiene un ligero efecto
bacteriosttico, el cual puede tener relevancia si se aplica con otras tcnicas de
conservacin actuando sinrgicamente.
61
37C B1
8
Log (UFC/mL
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
12
14
Tiempo (h)
37C B2
8
Log (UFC/mL
7
6
5
4
3
2
1
0
0
6Tiempo (h)8
10
12
62
14
37C
7
Log (ufc/ml)
6
5
4
3
2
1
0
0
t (h)
10
Leche
11
12
Leche +CCX

A 37C, que es la temperatura ptima de crecimiento de B.cereus, el crecimiento
de ste fue mayor que en las anteriores temperaturas analizadas, como era de
esperarse; al igual que en las temperaturas anteriormente analizadas, en la bebida
B2 el crecimiento del microorganismo fue ligeramente menor que en B1 (Figura
6.6).
En general, el crecimiento de B.cereus se vio controlado en las dos bebidas
estudiadas por la temperatura de almacenamiento y la presencia del CocoanOX
12%, observndose siempre un menor crecimiento cuando en las bebidas se aade
el antimicrobiano, confirmando as su accin bacteriosttica, posiblemente debido
a la presencia de flavonoides y otros compuestos fenlicos.
Tal como se observa en la Figura 6.7, mediante la realizacin de una anlisis de
varianza (ANOVA), se observaron diferencias significativas (P<0,05) entre los
valores de de la ecuacin de Gompertz para B1 y B2, los valores de para la
bebida B2 son ms bajos que los obtenidos para B1, lo que puso de manifiesto
el posible efecto bacteriosttico del CocoanOX 12% sobre el crecimiento de
B.cereus para el intervalo de temperaturas de estudio. Estos resultados
coinciden con los obtenidos por Busta y Peck (1968) quienes usaron el efecto
antimicrobiano del cacao para inactivar Salmonella spp; igualmente, Garbis y
63
Langlois (1967) reportaron que el crecimiento de varios microorganismos en

leche se retras con la presencia en la leche de cacao en polvo.
0,8
0,7
(Log UFC/h)
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
15
20
25
30
Temperatura(C)
35
40
B1
B2
Figura 6.7. Valores de mx de Gompertz para B.cereus a las tres diferentes

temperaturas de crecimiento para B1 y B2.
Estos estudios junto con los resultados obtenidos en el presente trabajo, ponen de
manifiesto el efecto antimicrobiano del cacao en microorganismos patgenos
como B.cereus; potenciando as el consumo del mismo y de alimentos que lo
contengan, ya que adems de este efecto letal para los microorganismos, el cacao
es un alimento rico en compuestos benficos para la salud.
6.3 CINTICAS DE INACTIVACIN POR PEF DE Bacillus cereus EN LA

BEBIDA MEZCLA DE LECHE DESNATADA Y HUEVO LQUIDO,
CON Y SIN CocoanOX 12%
La inactivacin de B.cereus por PEF se estudio primero en B1 y B3, para as
conocer la inactivacin mxima obtenida por el tratamiento con PEF;
posteriormente se analiz la inactivacin en B2 y B4 para conocer el efecto
sinrgico del CocoanOX 12% con los tratamientos de PEF aplicados, los cuatro
tratamientos de inactivacin se llevaron a cabo bajo las mismas condiciones
(Tabla 6.3) ya que uno de los objetivos del presente estudio fue determinar el
efecto sinrgico del CocoanOX 12% con los PEF y posteriormente conocer su
64
efecto en la vida til de las bebidas en refrigeracin en cuanto al control de clulas

vegetativas de B.cereus. Durante todo el estudio de inactivacin la temperatura se
mantuvo a 15C, para que sta no afectara el nivel de inactivacin obtenido ni las
caractersticas organolpticas de las bebidas.
6.3.1
EFECTO DEL TIEMPO DE TRATAMIENTO E INTENSIDAD DE

CAMPO ELCTRICO
En el estudio de las cinticas de inactivacin por PEF de B.cereus en las bebidas

B1 y B3, se utilizaron diferentes combinaciones de intensidad de campo elctrico
y de tiempo de tratamiento (Tabla 6.3). El microorganismo en fase estacionaria de
crecimiento se inocul en 500mL de cada bebida obteniendo una concentracin
inicial de 1x107UFC/mL.
Tabla 6.3. Condiciones para el tratamiento con PEF, intensidad de campo
elctrico (E) y tiempos de tratamiento para B1 y B3 en la inactivacin de
B.cereus.
E (kV/cm)
15
25
35
Tiempo de tratamiento (s)

t1
60
60
60
t2
360
120
80
t3
420
220
100
t4
600
360
120
t5
850
500
150
t6
1000
600
180
t7
1900
750
200
En las Figuras 6.8 y 6.9, se muestran las curvas de inactivacin de B.cereus a

diferentes intensidades de campo elctrico y tiempo de tratamiento, a una
temperatura constante de 15C. Para B1 y B3 el nivel de inactivacin se
incremento con el incremento de la intensidad del campo elctrico (35> 25>
65
15kV/cm); y para una misma intensidad de campo elctrico la inactivacin

aumenta al aumentar el tiempo de tratamiento, demostrando as que estas dos
variables estn estrechamente relacionadas para alcanzar un nivel de inactivacin
adecuado.
El mximo nivel de inactivacin alcanzado fue de 3.03 0.02 ciclos Log10 en la
bebida B3 para una intensidad de campo de 35 kV/cm y un tiempo de
tratamiento de 200s (Figura 6.8A); mientras que en la bebida B1 este fue de
3.05 0.02 ciclos Log10 en las mismas condiciones de tratamiento (Figura 6.8).
Por otra parte, se encontr que intensidades de tratamiento de 25kV/cm a
360s y 35kV/cm a 60s eran equivalentes en cuanto al nivel de inactivacin
alcanzado, el cual fue de 1.356 ciclos logartmicos en B3. Igualmente para B3
en 15kV/cm a 1900s y 35kV/cm a 150s se encontr el mismo nivel de
inactivacin el cual fue de 1.985 ciclos logartmicos.
El efecto del sustrato fue analizado mediante el anlisis de varianza
(ANOVA); indicando que la inactivacin obtenida por el tratamiento con PEF
a las diferentes condiciones establecidas, no se ve afectada por el sustrato
(P>0.05). En B1 y B3 B.cereus tena un comportamiento similar despus del
tratamiento con PEF para las mismas condiciones de intensidad de campo
elctrico y tiempo de tratamiento; posiblemente debido a la mayor proporcin
de leche semi-desnatada en B3 (80%v/v). Resultados acordes a los reportados
por Dutreux et al (2000), quienes no encontraron un efecto protector dado por
alimentos de composicin compleja en la inactivacin de microorganismos.
Por lo tanto se descarto, el posible efecto protector que pudiese tener el huevo
lquido en la inactivacin de las clulas vegetativas de B.cereus.
Se observ que para 15kV/cm en las bebidas B1 y B3, la forma de las curvas
de inactivacin presentaron colas (Figura 6.8 y 6.9). Es decir, la curva se pudo
dividir en dos fases; una primera fase donde la inactivacin aument
rpidamente debido a la inactivacin de las clulas ms sensibles al
66
tratamiento; pero tras alcanzar un grado de inactivacin determinado un

aumento del tiempo de tratamiento no logr aumentar significativamente la
inactivacin conseguida quedando una fraccin residual resistente al
tratamiento, probablemente debido a que 15kV/cm es un tratamiento con una
intensidad suave.
En cambio en las curvas de inactivacin para 25 y 35kV/cm para las bebidas
B1 y B3, se observ una forma lineal de inactivacin (Figura 6.8 y 6.9). Dicho
fenmeno fue producido presumiblemente por una resistencia similar de las
clulas al tratamiento gracias a la intensidad del mismo. Debido a esta
homogeneidad celular y a la mayor intensidad de tratamiento las curvas
obtenidas son similares a una lnea recta, razn por la cual no se pueden dividir
por segmentos a diferencia de lo encontrado para 15kV/cm; el comportamiento
celular es diferente para cada intensidad de tratamiento, hacindose las clulas
ms sensibles a intensidades de tratamiento mayores.
B1
0
Log (N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
-3,5
0
500
1000
t(s)
1500
15 kV/cm
25kV/cm
2000
35kV/cm
Figura 6.8. Curvas de inactivacin de B.cereus en la bebida B1 en las

diferentes condiciones de tratamiento con PEF.
67
B3
0
Log (N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
-3,5
0
500
1000
t(s)
1500
15 kV/cm
25kV/cm
2000
35kV/cm
Figura 6.9. Curvas de inactivacin de B.cereus en la bebida B3 en las

diferentes condiciones de tratamiento con PEF.
6.3.2
EFECTO
SINRGICO
DEL
CocoanOX
12%
CON
LOS
TRATAMIENTOS DE PEF
Para el anlisis del efecto sinrgico del CocoanOX 12% en la inactivacin de
B.cereus los parmetros de tratamiento con PEF fueron los mismos que para las
bebidas que carecan del antimicrobiano para de est manera establecer una
comparacin y as conocer el efecto del CocoanOX 12% en el control de B.cereus,
Tabla 6.3. La temperatura se mantuvo controlada en todo el estudio a 15C.
Los resultados de la inactivacin por PEF para B.cereus obtenidos en las bebidas
B1, B2, B3 y B4 fueron sometidos a un anlisis de varianza (ANOVA) con el
objetivo de conocer
el efecto del CocoanOX 12% en los resultados de
inactivacin obtenidos. Los resultados del ANOVA ponen de manifiesto la

existencia de diferencias significativas (P 0.05) entre los niveles de inactivacin
conseguidos en las bebidas suplementadas con CocoanOX 12% (2.5% p/v), B2 y
B4 y las que no, B1 y B3.
De acuerdo a los resultados obtenidos, parece que existi un efecto sinrgico entre
la tecnologa de PEF y el antimicrobiano, reflejado en niveles de inactivacin ms
68
elevados en las bebidas que contenan CocoanOX 12% (B2 y B4) con respecto a
los obtenidos en las bebidas que no lo contenan (B1 y B3) (Figuras 6.10 ha
6.13A). La expresin efecto sinrgico es utilizada cuando la inactivacin de un
microorganismo para unas condiciones determinadas aumenta con la combinacin
de dos ms tratamientos, que cuando estos tratamientos se aplican por separado;
en el presente estudio, el efecto sinrgico se vio afectado directamente por la
intensidad de campo elctrico (P<0.05), siendo mayor en el campo elctrico de
menor intensidad (15kV/cm) y disminuyendo conforme se aumento dicho
parmetro (15 > 15> 35kV/cm), estos resultados eran de esperarse, ya que campos
elctricos de poca intensidad generan electroporacin reversible de la membrana
celular, dando como resultado la perdida de la selectividad de la membrana por un
determinado periodo de tiempo, de esta manera se facilita la entrada a la clula de
los compuestos antimicrobianos presentes en el medio (lvarez et al, 2007), en
este caso de los polifenoles y ms concretamente los flavonoides del CocoanOX
12%, permitiendo el acceso de estos a los rganos celulares que ataca, dando
como resultado la inactivacin celular. Por lo tanto, el mximo nivel de
inactivacin en B4 se alcanzo a 35kV/cm y 200s a 15C (Tabla 6.3; Figura
6.10A); y el mximo efecto sinrgico del CocoanOX 12% con el tratamiento de
PEF se observo a 15kV/cm para tiempos de tratamiento de 850s, 1000s y
1900s (Tabla 6.3).
El tiempo de tratamiento es una variable que al igual que la intensidad de campo
elctrico influye directamente en el efecto sinrgico del CocoanOX 12% en B2 y
B4 (P 0.05). A tiempos bajos de tratamiento (t1-t3; Tabla 6.3) para los tres
campos elctricos analizados, el nivel de inactivacin alcanzado no difiere
considerablemente entre las bebidas con y sin CocoanOX 12%, ya que la
exposicin del microorganismo al tratamiento es muy corta y posiblemente la
formacin de poros no ocurra su duracin en el tiempo sea minima por lo tal el
antimicrobiano no logra ingresar en la clula. A medida que el tiempo de
tratamiento aumenta desde t4 a t7 para 15kV/cm (Tabla 6.3), el efecto sinrgico
del CocoanOX 12% con los PEF aumenta, aumentando as los resultados de
inactivacin celular (Figuras 6.10 y 6.10A). Los niveles de inactivacin
69
alcanzados bajo estas condiciones de tratamiento en B3 fueron de 1.523, 1.834 y

1.986 ciclos logartmicos de reduccin respectivamente (Figura 6.9), mientras que
para B4 a estas mismas condiciones de tratamiento los niveles de inactivacin
alcanzados fueron de 2.297, 2.427 y 2.730 ciclos logartmicos de reduccin
(Figura 6.10A).
B2
0
Log (N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
-3,5
0
500
1000
1500
15kV/cm
t(s)
25kV/cm
2000
35kV/cm
Figura 6.10. Curvas de inactivacin de B.cereus en B2 en las diferentes

condiciones de tratamiento con PEF.
B4
0
Log (N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
-3,5
0
500
1000
t(s)
1500
15kV/cm
25kV/cm
2000
35kV/cm
Figura 6.10A. Curvas de inactivacin de B.cereus en B4 en las diferentes

condiciones de tratamiento con PEF.
70
En general, se puede decir que a mayor campo elctrico con un tiempo de

tratamiento largo dar como resultado una mayor inactivacin; ya que a campos
elctricos de mayor intensidad (35kV/cm) la inactivacin celular se produce por la
produccin de poros irreversibles en la pared de los microorganismos dando como
resultado la salida al exterior del material intracelular provocando la lisis celular
relegando la actividad antimicrobiana de los flavonoides del CocoanOX 12%;
mientras que, a campos elctricos de poca intensidad (15kV/cm) se generan poros
reversibles en la pared celular de los microorganismos permitiendo la salida y
entrada de molculas a la clula por un periodo determinado de tiempo, de esta
manera sustancias que estaban en el exterior celular como los flavonoides del
CocoanOX 12% ingresan en la clula provocando un dao control en la misma
que genera lisis celular, segn Rodrigo et al (2007), despus de un tratamiento de
intensidad baja con PEF la clula puede reparar los daos sufridos pero este
proceso genera injuria haciendo que est sea ms susceptible a cualquier agente
externo.
Los resultados obtenidos fueron de gran importancia de acuerdo con el objetivo
principal de este estudio, ya que la reduccin de la intensidad del tratamiento con
PEF no significa una reduccin de la inactivacin de las clulas vegetativas de
B.cereus y por lo tanto la seguridad microbiolgica de las bebidas se mantiene
mejorando sus caractersticas organolpticas y nutricionales. De esta manera, fue
posible reducir 2.297 ciclos logartmicos a 15kV/cm para 850s (Tabla 6.3) para
B4 (Figura 6.10A), mientras que en B3 para lograr una inactivacin similar fue a
35kV/cm a 150s (Figura 6.9).
71
15 KV/cm
0,5
Log (N/No)
0
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
60
360
420
600
850
1000
t(s)
1900
B1
B2
Figura 6.11. Inactivacin de B.cereus a 15kV/cm en las bebidas B1 y B2.
25 KV/cm
0,5
0
Log (N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
60
360
420
600
t(s)
850
1000
1900
B1
B2
Figura 6.11A. Inactivacin de B.cereus a 25kV/cm en las bebidas B1 y B2.
72
35 KV/cm
0
-0,5
Log (N/No)
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
-3,5
60
80
100
120
150
180
t(s)
200
B1
B2
15 KV/cm
0,5
0
Log (N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
60
360
420
600
t(s)
850
1000
1900
B3
B4
73
25 KV/cm
0
-0,5
Log (N/No)
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
-3,5
60
360
420
600
850
1000
1900
B3
t(ms)
B4
35 KV/cm
0
-0,5
Log (N/No)
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
-3,5
60
80
100
120
t(s)
150
180
200
B3
74
B4
6.3.3
AJUSTE DE LOS DATOS EXPERIMENTALES A MODELOS

MATEMTICOS PREDICTIVOS.
En la inactivacin con PEF las graficas obtenidas son complejas y en su mayora

no son lneas rectas como las obtenidas en los tratamientos trmicos, razn por la
cual se han propuesto diferentes tipos de graficas y desviaciones de la linealidad
para explicar dicho comportamiento (Bhaduri et al, 1991; Cole et al, 1993;
Baranyi et al, 1994; Xiong et al, 1999); se conoce que el grado de resistencia
celular al tratamiento de PEF puede ser debido a diferentes grados de sensibilidad
ha agentes letales en la poblacin bacteriana, tambin debido a una poblacin
mixta de bacterias presente en el alimento tratado la adaptacin al estrs que
hace a las clulas ms resistentes frente a un tratamiento de inactivacin, por lo
cual cada poblacin tiene una cintica de inactivacin diferente.
Curiosamente, en el presente estudio, las curvas de inactivacin obtenidas despus
del tratamiento con PEF para todas las bebidas a 25kV/cm y 35kV/cm se pueden
considerar como lineales, mientras que para 15kV/cm las curvas de inactivacin
tenan forma sigmoidales, alcanzando un grado mximo de inactivacin de 2
ciclos logartmicos aproximadamente (Figuras 6.8, 6.9, 6.10 y 6.10A).
El modelo de Weibull ha sido utilizado con xito para describir curvas de
inactivacin no-lineales de microorganismos bajo diferentes condiciones
experimentales (Buzrul et al, 2004; Chen et al, 2003a, 2003b, 2004; Peleg et al,
1998, 2000). En cuanto a otros modelos tales como el modelo de Baranyi y la
ecuacin modificada de Gompertz, estos han demostrado ser eficaces para curvas
de inactivacin de diferentes formas, incluyendo curvas lineales, curvas con
hombros sigmoidales, pero ninguno de estos dos modelos se ajust a todas las
curvas de supervivencia obtenidas en el presente estudio (Tabla 6.4a y 6.4b).
75
Tabla 6.4a. Parmetros cinticos de los cuatro modelos aplicados para la

inactivacin de B.cereus en las cuatro bebidas analizadas.
Bebidas
Ea
R2
Weibull
RMSEb
Af c
R2
Log-logistic
RMSEb
Af c
B1
15
0.767
0.182
1.336
0.994
0.044
1.002
25
0.868
0.114
1.246
0.991
0.074
1.002
35
0.951
0.046
1.005
0.971
0.084
1.013
15
0.967
0.012
1.001
0.967
0.057
1.022
25
0.827
0.134
1.249
0.965
0.101
1.103
35
0.967
0.031
1.003
0.972
0.079
1.110
15
0.955
0.019
1.006
0.951
0.060
1.154
25
0.908
0.090
1.264
0.991
0.022
1.001
35
0.956
0.042
1.006
0.976
0.084
1.023
15
0.763
0.375
1.054
0.997
0.006
1.007
25
0.896
0.134
1.393
0.999
0.002
1.001
35
0.872
0.154
1.011
0.979
0.035
1.020
B2
B3
B4
: E (Intensidad de campo elctrico; kV/cm).
: RMSE (Error medio cuadrado).
c:
Af (Factor de exactitud).
76
Tabla 6.4b. Parmetros cinticos de los cuatro modelos aplicados para la

Bebidas
Ea
2
Gompertz
RMSEb
Af
Bigelow
RMSEb
Af c
B1
15
0.910
0.080
1.260
0.700
0.244
1.200
25
0.993
0.008
1.020
0.993
0.006
1.019
35
0.935
0.073
1.027
0.911
0.073
1.070
15
0.903
0.043
1.300
0.712
0.223
1.214
25
0.949
0.047
1.220
0.955
0.030
1.010
35
0.940
0.066
1.030
0.890
0.091
1.086
15
0.831
0.087
1.300
0.601
0.248
1.241
25
0.993
0.008
1.004
0.989
0.009
1.021
35
0.941
0.067
1.024
0.918
0.067
1.069
15
0.902
0.186
1.300
0.801
0.236
1.064
25
0.994
0.008
1.013
0.995
0.005
1.044
35
0.971
0.042
1.060
0.979
0.021
1.200
B2
B3
B4
: E (Intensidad de campo elctrico; kV/cm).
: RMSE (Error medio cuadrado).
c:
Af (Factor de exactitud).
6.3.3.1 MODELO DE BIGELOW

El tiempo de reduccin decimal (D), en el modelo de Bigelow disminuy con el
incremento de la intensidad de campo elctrico. Por lo tanto, cuanto mayor sea la
intensidad del tratamiento menor es el valor D. Adems, el valor D tambin
disminuy cuando en las bebidas se aadi el CocoanOX 12% (Tabla 6.5).
77
Tabla 6.5. Parmetros modelo de Bigelow para la inactivacin de B.cereus en las

cuatro bebidas analizadas.
Bebidas
Parmetros modelo de
(kV/cm)
Bigelow
D
B1
B2
B3
B4
15
1548.950
25
591.431
35
135.690
15
1612.830
25
701.321
35
130.124
15
1462.560
25
581.147
35
135.118
15
1194.440
25
513.639
35
135.078
6.3.3.2 MODELO DE WEIBULL

Las curvas de inactivacin obtenidas para B.cereus se analizaron mediante el
modelo de Weibull debido a que muchos autores han probado su eficacia en la
descripcin de curvas de inactivacin lineales y no lineales. En dichos trabajos las
curvas de inactivacin analizadas mediante el modelo de Weibull presentaron un
parmetro de forma n menor de 1 (n<1) indicando que todas las curvas de
inactivacin eran cncavas hacia arriba; al igual que en las curvas obtenidas para
15kV/cm en todas las bebidas en el presente estudio.
78
El factor de escala b, se considera como una medida de la resistencia de los

microorganismos al tratamiento con PEF, por tal razn es un parmetro cintico.
Los dos parmetros del modelo de Weibull (b y n), se analizaron para determinar
el efecto de la intensidad del campo elctrico en la inactivacin obtenida. El factor
de escala b para las bebidas B1 y B3 disminuyo ha medida que la intensidad de
campo elctrico aumento desde 15 hasta 35kV/cm; mientras que en las bebidas
B2 y B4 el valor de b disminuye cuando la intensidad de campo aumenta de 15 a
25kV/cm, indicando la menor resistencia de las clulas de B.cereus al tratamiento
de PEF cuando a las bebidas se les aade CocoanOX 12%; las clulas de B.cereus
mostraron una mayor resistencia al tratamiento de 15kV/cm que al de 25kV/cm; y
se observ una ligera disminucin de b cuando se pas intensidades de campo
elctrico de 25kV/cm a 35kV/cm.
Cuanto mayor fue la intensidad de campo elctrico mayor es el valor de n para
cada bebida analizada. Estos resultados del modelo de Weibull nos permiti
concluir que estos parmetros, fueron dependientes de la intensidad de campo
elctrico para las cuatro bebidas analizadas y del sustrato (P<0.05) (Tabla 6.6).
79
Tabla 6.6. Parmetros cinticos del modelo de Weibull para la inactivacin de

B.cereus en las cuatro bebidas analizadas.
Bebidas
B1
B2
B3
B4
Parmetros modelo de
(kV/cm)
Weibull
B
15
0.056
0.429
25
0.046
0.524
35
0.037
0.716
15
0.167
0.286
25
0.033
0.545
35
0.063
0.631
15
0.226
0.259
25
0.048
0.519
35
0.036
0.723
15
0.032
0.531
25
0.048
0.537
35
0.096
0.547
6.3.3.3 ECUACIN MODOFICADA DE GOMPERTZ

Linton et al (1995, 1996) utilizaron la ecuacin modificada de Gompertz para
analizar curvas de inactivacin no lineales para Listeria monocytogenes Scott A
en leche para bebes, encontrando que est es eficaz en la modelizacin de curvas
de tipo sigmoidal. De acuerdo a estas referencias, se ajustaron los datos obtenidos
en el presente estudio a la ecuacin modificada de Gompertz, y se estudio la
relacin con los parmetros de la cintica de inactivacin microbiana. La tasa de
mortalidad (B) se incrementa con el incremento de la intensidad de campo
elctrico de 15 a 35kV/cm en todas las bebidas analizadas, pero no se observ este
80
mismo aumento pasando de 15 a 25kV/cm, por tal razn, las clulas de B.cereus
resisten similarmente tratamientos de 15 y 25kV/cm (Tabla 6.7).
Tabla 6.7. Parmetro cintico de la ecuacin modificada de Gompertz para la
Bebidas
Parmetro de la ecuacin
(kV/cm)
modificada de Gompertz
B
B1
B2
B3
B4
15
0.000584
25
0.000333
35
0.001567
15
0.000707
25
0.000383
35
0.002576
15
0.000505
25
0.000508
35
0.001592
15
0.000453
25
0.000339
35
0.001679
6.3.3.4 MODELO LOG-LOGISTIC

El modelo Log-logistic es un modelo predictivo propuesto por Cole et al (1993),
el cual se basa en la distribucin de la sensibilidad microbiana a tratamientos de
inactivacin como los PEF. Guant et al (2005), utiliz este modelo para describir
la inactivacin de microorganismos en productos lcteos, como fue el caso de este
estudio.
81
El modelo Log-logistic ha sido utilizado por muchos autores para describir la

inactivacin de microorganismos y esporas bacterianas mediante tratamientos
trmicos (Ellison et al, 1994; Anderson et al, 1996). En clulas vegetativas, se ha
observado una relacin lineal entre el valor (Log ) y la temperatura de
tratamiento. En el presente estudio tambin se encontr una relacin lineal entre el
valor y el campo elctrico para todas las bebidas analizadas, como puede verse
en las siguientes ecuaciones:
B1 y B2
= 0.030E + 7.361
R2 = 0.994
B3 y B4
= 0.049E + 8.113
R2 = 0.901
En las curvas de las bebidas que contenan huevo lquido (B3 y B4) la pendiente
de la ecuacin es mayor que en las que no lo contenan, por lo tanto, existe una
relacin directa entre el aumento de la intensidad del campo elctrico y la mxima
inactivacin obtenida, lo que reduce el tiempo de tratamiento requerido para
alcanzar dicha inactivacin (, Log (min)).
El parmetro (Log ), disminuye con el incremento de la intensidad del campo
elctrico (15, 25 a 35kV/cm) en todas las bebidas. Los valores de no difieren
significativamente (P>0.05) en las bebidas B3 y B4 para los tratamientos
analizados, y este mismo resultado se observa en las bebidas B1 y B2. Estos
resultados dejaron de manifiesto que el CocoanOX 12% no ejerce un efecto
sinrgico importante durante el tratamiento con PEF en el control de B.cereus, un
anlisis de los parmetros y sugiere que en las bebidas donde hay leche
desnatada y CocoanOX 12% (B2 y B4) las clulas de B.cereus son ms resistentes
al tratamiento de PEF en todos los campos elctricos analizados.
El parmetro es el porcentaje mximo de inactivacin, este se ha utilizado para
estudiar el efecto de la intensidad de campo elctrico en el nivel de inactivacin
82
microbiana. En este estudio, para todas las bebidas el valor de disminuye a

medida que aumenta el rango de intensidad de campo elctrico (15 a 35kV/cm);
por lo tanto, cuanto mayor es la intensidad de campo elctrico mayor es el nivel
de inactivacin alcanzado.
La capacidad predictiva de los diferentes modelos fue analizada mediante el test
de accuracy factor (test de exactitud de las pruebas) (Af), R2 y RMSE (Tablas
6.4a y 6.4b). De acuerdo a los resultados obtenidos para cada modelo, el modelo
que mostr un mejor ajuste a los datos obtenidos experimentalmente en la
inactivacin de clulas vegetativas de B.cereus para todas las bebidas fue el de
Log-logistic: R2 0.979 0.015; RMSE 0.053 0.010 y Af de 1.038 0.030.
El segundo modelo que se ajusta bien a los datos fue la ecuacin modificada de
Gompertz: R2 0.946 0.035; RMSE 0.063 0.028 y Af
de 1.129 0.083.
En este orden el modelo de Weibull fue el tercero que se ajusto a los datos
obtenidos en este estudio R2 0.892 0.070; RMSE 0.111 0.082 y Af en un
rango de 1.001 ha 1.391 (Figuras6.14, 6.15, 6.15A y 6.16).
15 kV/cm B1
Log(N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0
500
Observed
1000
1500
t( s)
Gompertz
Logistic
Weibull
2000
Bigelow
Figura 6.14. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los cuatro

modelos analizados para B1 a 15kV/cm.
83
15 kV/cm B2
Log(N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0
500
Observed
1000
1500
t( s)
Gompertz
Logistic
Weibull
2000
Bigelow

15 kV/cm B3
Log(N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0
500
Observed
1000
t( s)
Gompertz
1500
Logistic
Weibull
2000
Bigelow
Figura 6.15A. Ajuste de los datos obtenidos experimentalmente a los cuatro

84
15 kV/cm B4
0,5
0
Log(N/No)
-0,5
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
-3,5
0
500
Observed
1000
t( s)
Gompertz
Logistic
1500
Weibull
2000
Bigelow

Con el objetivo de proporcionar un adecuado ajuste de los datos obtenidos
experimentalmente y una fcil interpretacin de los mismos, resulto til utilizar un
modelo simplificado del modelo de Log-logistic; por tal razn, se simplifico este
modelo dando un valor medio al parmetro de 6.901 0.301. Los nuevos
parmetros del modelo y la precisin del ajuste a los datos experimentales se
incluyen en la Tabla 6.8, donde para todas las bebidas analizadas R2 0.918
0.062; RMSE 0.042 0.012 y Af de 1.088 0.070. Por lo tanto, el modelo
simplificado de Log-logistic fue el que mejor se ajusto a los datos obtenidos
experimentalmente.
85
Tabla 6.8. Parmetro cintico del modelo Log-logistic simplificado (Donde =

6.901 0.301).
Bebidas
Parmetro para el modelo
(Kv/cm)
simplificado de Log-logistic
B1
B2
B3
B4
15
-10.420
25
-5.490
35
-8.170
15
-1.390
25
-6.070
35
-7.120
15
-1.270
25
-5.400
35
-8.320
15
-13.900
25
-6.940
35
-15.320
6.4 ALMACENAMIENTO
Despus del tratamiento con PEF, las clulas fueron almacenadas en refrigeracin
(5C) y evaluadas durante 15 das en tales condiciones, con objeto de determinar
el posible efecto del CocoanOX 12% en cuanto al control en refrigeracin de las
clulas tratadas por PEF y las que no, con el fin de establecer parmetros reales de
comparacin. Como puede apreciarse en las Figuras 6.17 ha 6.20A, existen
diferencias significativas en el comportamiento de las clulas tratadas de la bebida
B3 y las de la bebida B4 para todos los campos elctricos estudiados durante el
perodo de almacenamiento.
86
El almacenamiento se estudi en todas las bebidas (B1 a B4), pero la importancia

de este anlisis radica en el estudio e interpretacin de los datos obtenidos en la
bebida final B4 y el efecto del CocoanOX 12% en la misma en comparacin con
la bebida que careca de el (B3).
Para establecer un anlisis global de la inactivacin conseguida fue importante
tener en cuenta que el huevo lquido tiene lisozima; una enzima que ejerce una
accin ltica en la pared de las clulas bacterianas Gram positivas y Gram
negativas. Por lo tanto, la presencia de Lisozima y CocoanOX 12% en B3 y B4
puede tener un efecto sinrgico con el tratamiento de PEF aumentando as la
inactivacin total conseguida de las clulas vegetativas de B.cereus. La
concentracin celular en B4 mostr una disminucin en el nmero de clulas
sobrevivientes durante el periodo de almacenamiento. Esta reduccin en B4 fue
mayor a campos elctricos de 25 y 35kV/cm y a los 15 das de almacenamiento en
refrigeracin. Para 15kV/cm la reduccin celular vari de 7 a 15% a los cinco das
de almacenamiento y de 25 a 35% a los 15 das; mientras que para 25kV/cm la
mayor reduccin celular se observo a los 15 das de almacenamiento, alcanzando
una reduccin de 75% (reduccin de cuatro ciclos logartmicos) a 500s (Figuras
6.19 ha 6.20A).
En las Figuras 6.17 ha 6.18A, se observa el comportamiento de las clulas de
B.cereus mantenidas en refrigeracin en B3 para todos los campos elctricos
estudiados, se observo que ha medida que aumenta la intensidad de campo
elctrico y el tiempo de tratamiento disminuye la poblacin celular con respecto a
las clulas que no han recibido tratamiento. Por otra parte, a medida que aumenta
el tiempo de refrigeracin tambin la poblacin celular disminuyo paulatinamente,
resultado que responde a la temperatura de refrigeracin ya que sta acta como
barrera en el control del crecimiento de las clulas de B.cereus y que muchas de
estas clulas sobrevivientes al tratamiento de PEF, se encuentran estresadas y no
son capaces de sobrevivir bajo estas condiciones. El mximo control celular en
almacenamiento se observ a una intensidad de campo elctrico de 35kV/cm y un
87
tiempo de tratamiento de 200s, a los 15 das de almacenamiento, pasando

aproximadamente de 4.2 Log10 en 15kV/cm ha 3.5 Log10 en 35kV/cm.
Es interesante observar que a campos elctricos de poca intensidad, 15kV/cm, se
logr una reduccin de casi una unidad logartmica de la poblacin celular para
tiempos de tratamiento cortos (t1, t2; Tabla 6.3); lo que manifest el hecho de que
a tiempos de tratamiento cortos las clulas se sensibilizan y estresan, hacindolas
sensibles a factores externos como fue la temperatura de refrigeracin. As, con
tiempos cortos de tratamiento y campos elctricos de poca intensidad por PEF con
varias repeticiones se puede lograr la misma inactivacin que a campos elctricos
intensos con tiempos cortos de tratamiento sin repeticiones.
B3 (15kV/cm)
7
Log(UFC/mL
6
5
4
3
2
1
0
Not
treated
t1
t2
t3
t4
Tiempos de tratamiento
t5
t6
0 das
t7
5 das
15 das
Figura 6.17. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura de

refrigeracin (5C), posterior al tratamiento de PEF (15kV/cm) en B3.
88
B3 (25kV/cm)
8
Log(UFC/mL
7
6
5
4
3
2
1
0
Not
treated
t1
t2
t3
t4
t5
t6
0 das
t7
5 das
15 das

B3 (35kV/cm)
Log(UFC/mL
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Not
treated
t1
t2
t3
t4
t5
t6
0 das
t7
5 das
15 das
Figura 6.18A. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura de

Las Figuras 6.19 a 6.20A, corresponden al almacenamiento de la bebida B4 a
temperatura de refrigeracin (5C), despus del tratamiento de PEF bajo las
condiciones analizadas en el presente estudio (Tabla 6.3). Para campos elctricos
de 15kV/cm y 25kV/cm se observo una reduccin significativa de la poblacin
celular a lo largo del tiempo de almacenamiento; esta reduccin posiblemente se
present porque a campos elctricos de baja intensidad las clulas sufren daos en
89
su membrana, quedando stas por un periodo de tiempo expuestas a agentes

externos que les pueden causar su muerte, por lo tal, la presencia del CocoanOX
12% en B4 dej de manifiesto el efecto bactericida que tienen sus componentes
fenlicos como los flavonoides en clulas estresadas con daos en su
membrana, a una temperatura de refrigeracin la cual funciona como una barrera
para la reparacin de los daos causados por el tratamiento de PEF en las clulas
de B.cereus. Resultados similares fueron encontrados por Caldern et al (1999),
quienes utilizaron intensidades bajas de tratamiento con PEF en huevo lquido
para la inactivacin de Listeria innocua seguidos de la exposicin a nisina.
De acuerdo con Leistner et al (1992) cuando dos ms tratamientos de control
microbiolgico tienen el mismo rgano blanco en la clula bacteriana la
combinacin de sus efectos se suma para aumentar as la inactivacin final
conseguida. De esta manera, el efecto del tratamiento con PEF y la presencia de
CocoanOX 12% tienen un efecto aditivo sinrgico en la inactivacin total
conseguida ya que los dos tratamientos tienen su accin en la membrana celular
bacteriana. En el presente estudio, el efecto bactericida y/ bacteriosttico del
CocoanOX 12% se manifest en el periodo de almacenamiento en combinacin
con bajas temperaturas (5C), lo cual dio como resultado una disminucin en la
poblacin que sobrevivi al tratamiento de PEF. Resultados similares a los
reportados por Ostovar et al (1973) quienes encontraron que en chocolate con
leche y chocolate negro la poblacin de S.aureus
mora si se mantena a
temperatura de refrigeracin por dos das para el chocolate negro y 14 das para el
chocolate con leche, con una poblacin inicial de 2 ciclos Log10.
Busta y Peck (1968), reportaron una mayor inactivacin de Salmonella
typhimurium en leche con cacao que en leche sola, ambas tratadas con
tratamientos trmicos, adems indicaron que el tratamiento trmico no era
indispensable en el control de dicho microorganismo gracias a la presencia de
cacao en la leche. En el presente estudio, a diferencia de lo encontrado por Busta y
Peck, no se observo un control dado por la presencia del polvo de cacao
(CocoanOX 12%) de las clulas vegetativas de B.cereus no tratadas con PEF,
90
aunque la concentracin de cacao en los dos estudios fue la misma, 2.5% (p/v);
por otra parte, s existi un efecto sinrgico del tratamiento con PEF y la presencia
de CocoanOX 12% en las bebidas que lo contenan con respecto a las que
carecan de l.
Para 35kV/cm en B4 (Figura 6.20A), se observ que la poblacin celular
disminua con respecto al aumento del tiempo de tratamiento y a los das de
almacenamiento a 5C, esta disminucin de la poblacin de B.cereus correspondi
al pequeo grupo de clulas que sobrevivieron al tratamiento con PEF para esta
intensidad de campo elctrico y que por lo tal quedaban expuestas a factores
externos de control que en nuestro caso fueron la presencia de CocoanOX 12% en
B4 y la temperatura de refrigeracin. El efecto del control de clulas
anteriormente expuestas a un tratamiento por PEF ejercido por el CocoanOX 12%
a una temperatura de refrigeracin no se observa claramente con tratamientos de
PEF intensos como en nuestro caso fueron 35kV/cm con tiempos de tratamiento
de t5 hasta t7 (Tabla 6.3), ya que en estas condiciones se generan clulas
muertas sobrevivientes, pero la poblacin con daos es minima reduciendo el
efecto de los flavonoides del CocoanOX 12%.
A 25kV/cm se observo el mayor control de la poblacin celular en
almacenamiento a tiempos de tratamiento desde t5 a t7 (Tabla 6.3), con una
reduccin de 5 ciclos Log10. Demostrando as el efecto bactericida del CocoanOX
12% en clulas estresadas con daos previamente producidos por otro
tratamiento, y mantenidas ha 5C. De esta manera, se puede afirmar que el
CocoanOX 12% acta sinrgicamente con tratamientos leves de control de
poblaciones bacterianas en alimentos. Por lo tanto cuando ste se agrega a un
alimento se puede disminuir la intensidad del tratamiento y se obtienen productos
ms parecidos a los frescos con alta calidad sanitaria.
En resumen, campos elctricos de baja intensidad dan como resultado un gran
porcentaje de la poblacin celular con daos subletales, permitiendo a otras
tecnologas de conservacin, como los antimicrobianos naturales, actuar en el
91
control de dichas clulas; mientras que en campos elctricos de mayor intensidad

(como es el caso de 35kV/cm) se generan clulas muertas sobrevivientes, pero
el porcentaje de clulas daadas es mnimo.
B4 (15kV/cm)
Log (UFC/mL
6
5
4
3
2
1
0
Not
treated
t1
t2
t3
t4
t5
0 das
t6
5 das
t7
15 das

92
B4 (25kV/cm)
8
7
Log (UFC/mL
6
5
4
3
2
1
0
Not
treated
t1
t2
t3
t4
t5
t6
t7
0 das
5 das
15 das

B4 (35kV/cm)
Log UFC/mL
7
6
5
4
3
2
1
0
Not
treated
t1
t2
t3
t4
t5
t6
t7
0 das
5 das
15 das
Figura 6.20A. Evolucin de las clulas de B.cereus mantenidas a temperatura de

93
CONCLUSIONES
La actividad bactericida del tratamiento con PEF depende directamente de sus

parmetros elctricos, dando como resultado una mayor inactivacin conforme se
aumenta la intensidad de dicho parmetro.
La intensidad de campo elctrico y el tiempo de tratamiento son variables
indispensables para lograr la inactivacin bacteriana adecuada en matrices
alimentarias complejas.
La tasa de inactivacin celular fue diferente para cada campo elctrico estudiado,
encontrndose mayor letalidad celular mediante el aumento de la intensidad de
campo elctrico y del tiempo de tratamiento.
No se encontr un efecto protector al tratamiento con PEF dado por las protenas
y grasas presentes en las bebidas analizadas, obteniendo una mayor inactivacin
en las bebidas que contenan huevo lquido, posiblemente gracias a la presencia de
lisozima.
El efecto sinrgico del CocoanOX 12% con el tratamiento de PEF se observ
solamente en tiempos de tratamiento intensos para los tres campos elctricos
aplicados (15, 25 y 35kV/cm).
La aplicacin industrial de tratamientos por PEF en bebidas como las utilizadas en
el presente estudio tiene buenas perspectivas gracias a los resultados obtenidos.
Este estudio ayuda a reafirmar el potencial del cacao en el control de
microorganismos patgenos de alimentos, gracias a sus polifenoles y a la
biodisponibilidad de los mismos, ya que en numerosos estudios han reportado que
dicha biodisponibilidad es mayor que en el vino tinto.
94
El presente estudio demuestra la eficacia del CocoanOX 12% aadido a las

bebidas que contenan leche y huevo lquido pasterizado, con el fin de inactivar
clulas vegetativas de Bacillus cereus despus del tratamiento con PEF.
La muerte de clulas vegetativas de B.cereus durante el periodo de refrigeracin,
demostr la influencia del CocoanOX 12% como bactericida para clulas
estresadas.
Para estudios futuros, ser importante analizar la contribucin de la lisozima del
huevo lquido en el control e inactivacin total de clulas vegetativas de B.cereus.
Este estudio contribuye, a reforzar el efecto bactericida y/ bacteriosttico que
tienen muchas sustancias naturales aadidas a los alimentos, sin que su efecto se
vea alterado por la complejidad de la matriz alimentaria. Adems, de actuar
sinrgicamente con muchas tecnologas de conservacin aplicadas no
actualmente en la industria alimentara.
95
RECOMENDACIONES
Actualmente numerosos grupos de investigacin estn trabajando en tecnologas

emergentes que adems de la inactivacin de microorganismos patgenos,
mantengan las caractersticas de los alimentos procesados; dentro de estas
tecnologas cabe destacar las utilizadas en el presente trabajo (PEF y
Antimicrobianos Naturales). Con el uso de ests nuevas tecnologas se busca
principalmente satisfacer al consumidor, cada da ms exigente, y mantener la
calidad y seguridad alimentaria de los alimentos tratados; por tal razn es de suma
importancia implantar tratamientos adecuados que garanticen la completa
inactivacin de microorganismos patgenos y alteradores, as como tambin de
sus toxinas y esporas.
En el presente trabajo, se lograron establecer diferentes combinaciones de
tratamientos con PEF y CocoanOX 12%, que garantizan la seguridad
microbiolgica de la bebida mezcla de huevo lquido, leche semi-desnatada y
CocoanOX 12%; manteniendo sus caractersticas organolpticas y nutricionales,
gracias a la temperatura (15C) e intensidades de tratamiento (15, 25 y 35kV/cm)
en la que se llevaron a cabo los ensayos. En cuanto a la vida til de dicha bebida,
se establecieron curvas de crecimiento de los microorganismos sobrevivientes al
tratamiento con PEF; en este aspecto cabe destacar la importancia del CocoanOX
12% en la bebida, ya que al parecer los flavonoides contenidos en el CocoanOX
12% controlaron a las clulas sobrevivientes a los tratamientos, manteniendo as
la seguridad microbiolgica a lo largo del tiempo de almacenamiento en
refrigeracin, que en este caso fue de quince das.
Los resultados aqu expuestos, marcan un nuevo paso en el anlisis del
comportamiento de los microorganismos tratados por nuevas tecnologas notrmicas en matrices alimentarias complejas; demostrando la eficacia de stas en
la inactivacin de microorganismo patgenos para humanos como es el caso de
Bacillus cereus.
96
Este estudio contribuye a reforzar la importancia de compuestos naturales

disponibles en pases en va de desarrollo, como Colombia, en el control de
microorganismos patgenos transmitidos por alimentos; adems de proponer la
produccin de una nueva bebida rica en nutrientes esenciales.
97
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CONSEJO SUPERIOR

EFECTO DEL POLVO DE CACAO Y LOS PULSOS ELCTRICOS DE

ANGELA BIBIANA SILVA ANGULO

ANTONIO MARTNEZ LPEZ, DIRECTOR.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

EFECTO DEL POLVO DE CACAO Y LOS PULSOS ELCTRICOS DE

ANGELA BIBIANA SILVA ANGULO

Antonio Martnez Lpez, PhD

Mara Pina Prez, Ingeniera Agrnoma

Marcela Franco, PhD

Fernando Sampedro, PhD

Dinoraz Velez, PhD

Mara Rodrigo, PhD

Vicenta Deveza, PhD

Pablo Fernndez, PhD

EFECTO DEL POLVO DE CACAO Y LOS PULSOS ELCTRICOS DE

ANGELA BIBIANA SILVA ANGULO

Angela Umaa Muoz, MPhil

Janeth Arias Palacios, M.sC-M. Ed

A mis padres y hermano.

Quisiera agradecer especialmente al Doctor Antonio Martnez y la Doctora Mara

Tambin quisiera agradecer al Doctor Pablo Fernndez por aceptarme para

A la Doctora Marcela Franco por su apoyo y su gran amistad.

A mis profesores, y especialmente a la Doctora Janeth Arias, por ensearme a no

2.1. NUEVAS TECNOLOGAS

2.1.1. Pulsos elctricos de alta intensidad (PEF)

2.1.1.1. Sistemas de tratamiento por PEF

2.1.1.2. Cmaras de tratamiento

2.1.1.3. Factores relacionados con la tecnologa de PEF

2.1.1.3.1. Factores del proceso

2.1.1.3.1.1. Intensidad de campo elctrico

2.1.1.3.1.2. Forma del pulso elctrico

2.1.1.3.3. Tiempo de tratamiento

2.1.1.3.4. Amplitud de pulso

2.1.1.4. Factores relacionados con las caractersticas fsicoqumicas del producto

2.1.1.4.1. Conductividad, pH, antimicrobianos, fuerza inica y

2.1.1.5. Factores del microorganismo

2.1.1.5.1. Tipo de microorganismo

2.1.1.5.2. Tamao del inculo

2.1.1.5.3. Fase de crecimiento

2.1.1.6. Mecanismo de inactivacin microbiana por PEF

2.1.1.7. Mecanismo de inactivacin enzimtica por PEF

2.1.1.8. Ventajas y desventajas de la tecnologa de PEF

2.1.1.8.1. Ventajas de los PEF

2.1.1.8.2. Desventajas de los PEF

2.2. ANTIMICROBIANOS NATURALES

2.2.2. Composicin de los antimicrobianos naturales

2.2.3. Mecanismo de inactivacin microbiana y enzimtica por

2.2.4. Efecto sinrgico de los antimicrobianos naturales y nuevas

2.2.5. Efecto de la adicin de antimicrobianos naturales en los

2.2.6. Ventajas y desventajas de los antimicrobianos naturales

2.2.6.1. Ventajas de los antimicrobianos naturales

2.2.6.2. Desventajas de los antimicrobianos naturales

2.3. BEBIDA MEZCLA DE LECHE Y HUEVO

2.3.1. Huevo lquido

2.3.1.1. Microorganismos alteradores y patgenos del huevo lquido

2.3.2.1. Microorganismos alteradores y patgenos de la leche

2.4. Bacillus cereus

2.5. MODELOS MATEMTICOS PREDICTIVOS

2.5.1. Modelo de Bigelow