Practica determinacin de salmonella

Introduccin

Los miembros del gnero Salmonella son agentes causantes de infeccin intestinal
en seres humanos y animales.
Entre los agentes de enfermedades transmitidas
por los alimentos, el gnero Salmonella es uno de los principales causantes de casos
mortales por las complicaciones surgidas entre los pacientes afectados. La tasa de
mortalidad se sita alrededor del 4.1 % y los huevos, carnes y productos crnicos
derivados, son los alimentos que ms comnmente transmiten la Salmonella al
hombre.
El hbitat principal de los microorganismos de este gnero es el conducto intestinal
del ser humano, de los animales domsticos, de los pjaros, de los reptiles y,
ocasionalmente, de los insectos. Debido a que es una bacteria de origen intestinal, es
excretada por las heces que contaminan el ambiente y las aguas. Cuando las aguas
contaminadas o los alimentos contaminados son ingeridos por el ser humano o
por los animales, el
microorganismo
vuelve al sistema digestivo
donde se multiplica
y ser
nuevamente eliminado a travs de las heces, continuando el ciclo. Los insectos y
roedores tambin participan en la diseminacin ambiental de estos microorganismos.
La dosis infectante es variable, segn el serotipo; en general, el nmero de
clulas necesarias para desencadenar la sintomatologa (nusea, vmitos, dolores
abdominales, cefaleas escalofros y diarreas) oscila entre 103
y 106 UFC/g de
alimento para algunos serotipos y entre 109 y 1011 para otros.

Cerca de 5% de las personas que sufren la enfermedad, siguen siendo portadoras

por tiempo considerable y pasan a ejercer un importante papel en la diseminacin del
agente, especialmente si participan en la cadena de produccin y comercializacin de
alimentos.
El agente etiolgico
lo constituye la Salmonella entrica con 7 subespecies
divididos en serotipos; actualmente se reconocen ms de 2000 serotipos.
Son bacilos Gram-negativos, aerobios no esporulados, mviles por flagelos pertricos,
no encapsulados y poseen 3 tipos de antgenos: O somtico, Flagelar H y Envoltura Vi,
son bacterias mviles que producen cido sulfhdrico (H2S). Emplean glucosa por poseer
una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa ni tienen metabolismo
fermentativo.

Fundamento
En el hombre causan dos cuadros clnicos: fiebre tifoidea y gastroenteritis. Esta ltima es
considerada como una intoxicacin alimentaria y se manifiesta tras 12-36 horas de ingerir
el alimento con vmitos, nuseas, dolores abdominales, fiebre y diarrea que persisten
durante 1 a 7. El reservorio son las personas portadoras y animales enfermos. La
transmisin se realiza a travs de los alimentos, destacando la carne y productos crnicos
la leche y los huevos.
Cuando un alimento est contaminado con salmonelas suele contener tambin gran
cantidad de entero bacterias muy similares. Por ello es necesario realizar un
enriquecimiento de la muestra en medios selectivos que propician el crecimiento de
Salmonella frente a otras bacterias presentes. Por otra parte, como se suele exigir la
ausencia de este microorganismo en el alimento, los anlisis deben ir enfocados a
demostrar que efectivamente no se encuentra en el alimento.
La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema
general que consiste de 5 pasos bsicos:

Pre enriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio

nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas, logrando
de esta manera una condicin fisiolgica estable.

Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos

condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir
otros microorganismos presentes en la muestra.

Seleccin en medios slidos, este punto se deriva directamente del anterior y se

utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a
Salmonella y que permitan el reconocimiento visual caracterstico de colonias
sospechosas.

Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los cultivos

de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.

Serotipificacin, es una tcnica inmunolgica (antgeno-anticuerpo) que permite la

identificacin especfica de un microorganismo.

Objetivo

La presente prctica tiene como objetivo desarrollar la metodologa llevada a cabo para
realizar la deteccin, aislamiento e identificacin de Salmonella en muestras de
alimentos. En nuestro caso carne molida de res.

Materiales

200 gr muestra(Carne de res molida)

1.Portaobjetos
1.Cubreobjetos
1.Pipeta Pasteur
1.Gradilla
1.Asa bacteriolgica
1.Asa recta
1 mechero Fisher
2 matraz Erlenmeyer de 250 Ml
1 Incubadora a 42.5 C
1 Incubadora a 35 C
Refrigerador
Plumn marcador para vidrio.
Pipetas de 10 ml y de 2 ml
Homogeneizador stomacher

Medios de cultivo

2 cajas con agar (AVB)

2 cajas con agar Agar Bismuto Sulfito (ASB)
1 tubo con caldo (CTT)
1 tubo con Caldo Rappaport Vassiliadis (CRP)
1 tubo con agar triple azcar hierro (TSI)
1 tubo con agar hierro lisina (LIA)
3 tubos de caldo urea.
Diluyente agua peptonada 250ml

Procedimiento
Preenriquecimiento

Tarar el recipiente estril que se vaya a utilizar para la trituracin Introducir,

aspticamente, el alimento 25g agregar el medio diluyente 225ml.
Procesar en el stomacher u otro homogeneizador por 30 segundos.
Incubar a 35C durante 24 horas.
Homogenizar por 30 segundos.

Enriquecimiento

Con una pipeta de 2 ml medir 1 ml de muestra colocarla en el tubo que contiene

9 ml de caldo (CTT) y agregar 0.2ml de yoduro yodurado.
Con una pipeta de 2 ml medir 1 ml de muestra colocarla en el tubo que contiene
9 ml de caldo (CRP) y agregar 0.2ml de yoduro yodurado.
Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco
de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos.
Incubar a 42.5C durante 24 horas.

Aislamiento

Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco

de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos.
Tomar dos gotas biconvexas y descargar en el medio de cultivo
Extender el inculo sobre una pequea zona de la placa de Petri.
Esterilizar el asa para trazar dos estras a partir del inculo depositado. Una de
ellas se hace slo hasta el centro de la placa de Petri.
Volver a esterilizar el asa y se realizan una serie de estras paralelas a las dos
primeras.
Luego de esterilizar el asa nuevamente, se hacen una serie de estras
perpendiculares a las dos primeras, pero comenzando desde el lado opuesto al
depsito y sin llegar a tocarlo
El aislamiento se realizara del caldo (CTT) hacia los medios (AVB, ASB) y del
caldo (CRT) hacia los medios (AVB, ASB).
Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) a 35C durante 48
horas.

Prueba presuntiva

Observar si existe colonia sospechosa. Agar (AVB) colonias rojas o rosas que
pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias
fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. Agar (ASB) las colonias tpicas
de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo metlico.
Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente
negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro.

Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24

horas adicionales si en este tiempo no hay la prueba se considera negativa.

Identificacin bioqumica

Seleccionar al menos dos colonias tpicas de cada medio selectivo, que se

encuentren bien aisladas.
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple
azcar hierro (TSI), otro con agar hierro lisina (LIA), por estra en la superficie
inclinada y por puncin en el fondo.
Incubar por 24 horas 2 a 35C.
Almacenar en refrigeracin de 5 a 8C las placas con medios selectivos por si es
necesario retomar ms colonias.
Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para
Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:

1. Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la
fermentacin de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo
ms intenso que el medio original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de
la sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin negra a lo largo de
la puncin debido a la produccin de cido sulfhdrico.

2. Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la
descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que
produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las cepas
de Salmonella producen cido sulfhdrico en este medio con ennegrecimiento a lo
largo de la puncin.

Prueba de ureasa

Con un asa estril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de

cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de
medio para comparar el vire prpura de las reacciones positivas con el color
del medio original. Incubar 24 horas a 35C.

Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que
den la prueba negativa

Identificacin serolgica

Colocar con un asa dos gotas separadas de solucin salina estril sobre un
portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinacin. Suspender en
cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en TSI.

Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somtico (O) y mezclar
con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.

Agitar inclinando la lmina hacia atrs y hacia adelante durante aproximadamente

un min. Observar bajo buena iluminacin sobre un fondo oscuro

Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva.

La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo

y el antisuero y no aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin
salina.

Si se observa aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe

continuar con las pruebas bioqumicas complementarias

Prueba de
ureasa

Diagrama de flujo
Preenriquecimi
ento

Positiva
Si

Enriquecimient
o
Fin
No

Seleccin

Confirmacin
serolgica
Colonias tpicas
No

Prueba caracterstica

Si

Fin
Si

No

Identificacin
TSI TSI -

Si

LIANo

Puede ser
salmonella

Fin
Efectuar
pruebas
bioqumicas
complementari

Identificacin
de salmonella

TSI +
TSI LIA-

Resultados

TSI

LIA

Fermentacin de
glucosa

Desaminacin de la
lisina(rojo oscuro en tendido)

Fermentacin
Lactosa/o sacarosa

Descarboxilacin
de Lisina

Produccin de H2S

Fermentacin de
glucosa

Ureasa

Positivo color prpura

Negativo color amarillo en el

fondo del agar

Pruebas de grupo
somticas (O).

Positivo aglutinacin en
mezcla de prueba

Negativo ninguna aglutinacin

en mezcla de prueba

Anlisis y discusin de resultados

Las carnes crudas son uno de los principales vehculos de transmisin, ya que este
patgeno ha estado implicado en una buena cantidad de brotes en esta prctica se
analiz carne de res

Conclusiones
Bibliografa

Escartin FE. Microbiologa Sanitaria, agua y alimentos. Mxico: Editorial EDUG

Guadalajara, 1978.

American Public Health Association: Compendium of methods the Microbiological

Examination of Food Second Edition. USA: Washington DC, 1984.

Secretara de Salud. Proyecto de norma oficial mexicana. N.O.M. - 114 - SSA1 - 1994:
Determinacin de Salmonella en alimentos. Mxico (DF): SSA, 1995.

Secretara de Salud. Manual de procedimientos para el examen microbiolgico de

superficies y utensilios. Mxico (DF): SSA, 1995.

Anexos
Tabla TLM INTERPRETACIN DEL GNERO SALMONELLA BASADO EN MEDIOS
DE CULTIVOS: AGA TSI, LIA y MIO. (M.E. Valenzuela, J. Astorga, ISP 1991

TSI GAS H2S

LIA GAS H2S

Microorganismo

K/A

K/K

Salmonella subespecie I Otras

Salmonella choleraesuis. Otras

Salmonella thyphi.

K/A K/A
+
A/A,
+, +
K/A +
+

K/A K/A
K/K, +
K/ K +

+
+
+

K/A

K/A

K/A +

K/K

K/A

K/K

K/K
K/A

K/A
K/A +

Salmonella .thyphi
Salmonella sp.
Salmonella.Paratyphi A
Salmonella.Paratyphi A
Salmonella.typhi (excepcin)
Salmonella subg.3 (Arizona)
Salmonella sub-especie I y
Salmonella. Sp. y Citrobacter
freundi