MTODO ESTANDARIZADO ESPECTROFOTOMTRICO PARA LA NICOTINA

MTODO ESPECTROFOTOMETRICO PARA

RESIDUOS DE NICOTINA EN CULTIVOS DE
HOJAS Y CEROSOS
INTRODUCCIN
Es un mtodo estandarizado correspondiente al 964.20 AOC, el cual
fue estandarizado luego de que este mtodo fuera muy til para ver
el origen de un problema de intoxicacin que se produjo en Estados
Unidos en el estado de Arizona en 1963, Arizona es un estados de
mucha produccin vegetal en especial la ciudad de Scottsdale, en
esos tiempos no haba un control a los productos que utilizaban los
agricultores para hacer crecer sus cultivos, algunos compraban sus
insecticidas y pesticidas a empresas especializadas, sin embargo un
grupo aun preparaba sus propios insecticidas y pesticidas, en 1963 un
ao donde hubo pocas lluvias y por lo tanto carencia de agua, hubo
un brote de enfermedades estomacales muy fuertes en la ciudad de
Scottsdale, mdicos y cientficos arribaron a Scottsdale para ver el
motivo de esa intoxicacin.
Primero analizaron el agua de la zona , no se encontr absolutamente
nada; luego analizaron el suelo de los cultivos aledaos, no
encontraron nada fuera de lo comn; sin embargo cuando analizaron
las hojas de la lechuga encontraron la existencia de nicotina, para ese
entonces no exista un mtodo adecuado que brindar de manera
cuantitativa la concentracin de nicotina en muestras. Se probaron
diferentes maneras, algunas producan un margen de error moderado
pero las cantidades de nicotina se encontraban por debajo de las
concentraciones a la que trabajan los mtodos gravimtricos y
volumtricos para nicotina, entonces se encontr un mtodo
instrumental que satisficiera los parmetros dados.
Luego buscaron otro mtodo para aquellos alimentos que no eran a
bases de hojas, como mandarinas y manzanas.

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PRINCIPIOS TEORICOS
ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE
La espectrometra ultravioleta-visible o espectrofotometra UV-Vis
implica la espectroscopia de fotones en la regin de radiacin
ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el
ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano.
En esta regin del espectro electromagntico, las molculas se
someten a transiciones electrnicas.
Esta tcnica es complementaria de la espectrometra de
fluorescencia, que trata con transiciones desde el estado excitado al
estado basal, mientras que la espectrometra de absorcin mide
transiciones desde el estado basal al estado excitado.

LEY DE BEER-LAMBERT
La espectrometra UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma
cuantitativa para determinar las concentraciones de especies
absorbentes en solucin, usando la Ley de Beer-Lambert:
-

donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz

incidente a una determinada longitud de onda, I es la intensidad de
transmisin, L la longitud de ruta a travs de la muestra, y c la
concentracin de las especies absorbentes. Para cada especie y
longitud de onda, es una constante conocida como absortividad
molar o coeficiente de extincin. Esta constante es una propiedad
fundamental molecular en un solvente dado, a una temperatura y
presin particular, y tiene como unidades 1/M * cm o, a menudo, U/M
* cm.

La absorbancia y extincin a veces son definidas en trminos de

logaritmo natural en lugar de logaritmo de base 10.

La ley de Beer-Lambert es til para la caracterizacin de muchos

compuestos, pero no sirve como relacin universal para la
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concentracin y absorcin de todas las

complejas de gran tamao, como los
Naranja o Rojo Neutro, por ejemplo), a
relacin polinmica de segundo orden
concentracin.

sustancias. En molculas
tintes orgnicos (Xylenol
veces se encuentra una
entre la absorcin y la

ESPECTROFOTMETRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE
El instrumento utilizado en la espectrometra ultravioleta-visible se
llama espectrofotmetro UV-Vis. Mide la intensidad de luz que pasa a
travs de una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes
de pasar a travs de la muestra (Io). La relacin I / Io se llama
transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T).
La absorbancia (A) se basa en la transmisin:

A = - log (%T)

Las partes bsicas de un espectrofotmetro son una fuente de luz (a

menudo una bombilla incandescente para las longitudes de onda
visibles, o una lmpara de arco de deuterio en el ultravioleta), un
soporte para la muestra, una rejilla de difraccin o monocromador
para separar las diferentes longitudes de onda de la luz, y un
detector. El detector suele ser un fotodiodo o un CCD. Los fotodiodos
se usan con monochomadores, que filtran la luz de modo que una
sola longitud de onda alcanza el detector. Las rejillas de difraccin se
utilizan con CCDs, que recogen la luz de diferentes longitudes de
onda en pxeles.

Un espectrofotmetro puede ser nico o de doble haz. En un

instrumento de un solo haz (como el Spectronic 20), toda la luz pasa a
travs de la clula muestra. La Io debe medirse retirando la muestra.
Este fue el primer diseo, y todava est en uso en la enseanza y
laboratorios industriales.

En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes

de llegar a la muestra. Un haz se utiliza como referencia, y el otro haz
de luz pasa a travs de la muestra. Algunos instrumentos de doble
haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de referencia y el de
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la muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos

haces pasan a travs de un bloqueador que impide el paso de un haz.
El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la del haz de
referencia.

Las muestras para espectrofotometra UV-Vis suelen ser lquidas,

aunque la absorbancia de los gases e incluso de los slidos tambin
puede medirse. Las muestras suelen ser colocadas en una clula
transparente, conocida como cubeta. Las cubetas suelen ser
rectangulares, con una anchura interior de 1 cm. Esta anchura se
convierte en la longitud de ruta, L, en la Ley de Beer-Lambert.
Tambin se pueden usar tubos de ensayo como cubetas en algunos
instrumentos. Las mejores cubetas estn hechas con cuarzo de alta
calidad, aunque son comunes las de vidrio o plstico. El cristal y la
mayora de los plsticos absorben en el UV, lo que limita su utilidad
para longitudes de onda visibles.

ESPECTRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE
Un espectro ultravioleta-visible es esencialmente un grfico de
absorbancia de luz frente a una longitud de onda en el rango del
ultravioleta o la luz visible. Este espectro puede ser producido
directamente con los espectrofotmetros ms sofisticados, o bien
pueden registrarse los datos de una sola longitud de onda con los
instrumentos ms simples. La longitud de onda se representa con el
smbolo . Del mismo modo, para una determinada sustancia, puede
hacerse un grfico estndar del coeficiente de extincin () frente a la
longitud de onda (). Este grfico estndar sera efectivamente "la
concentracin corregida" y, por tanto, independiente de la
concentracin. Para una sustancia determinada, la longitud de onda
en la cual se produce el mximo de absorbancia en el espectro se
llama max, y se pronuncia "lambda-max".

Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones

empricas que pueden utilizarse para predecir max, la longitud de
onda de la absorcin UV-Vis, para compuestos orgnicos conjugados
como dienos y cetonas.

Las longitudes de onda de los picos de absorcin pueden

correlacionarse con los tipos de enlace en una determinada molcula,
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y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la

molcula. La absorcin UV-Vis no es, sin embargo, una prueba
especfica para ningn compuesto determinado. La naturaleza del
disolvente, el pH de la solucin, la temperatura, la concentracin de
electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden influir
en los espectros de absorcin de los compuestos, as como las
variaciones en la anchura de la hendidura (ancho de banda efectivo)
en el espectrofotmetro.

NICOTINA
La nicotina es un compuesto orgnico, un alcaloide encontrado
principalmente en la planta del tabaco (Nicotiana tabacum), con alta
concentracin en sus hojas (constituye cerca del 5% del peso de la
planta y del 3% del peso del tabaco seco)1 estando tambin presente
en otras plantas de la familia Solanacea aunque de forma marginal
(en el rango de 27 g/kg), como en el caso del tomate, la berenjena,
el pimiento y la patata.2 En cantidades an ms marginales, ha sido
encontrado en otras plantas como la coliflor, la pimienta verde o el t
negro.3 La nicotina debe su nombre a Jean Nicot, quien introdujo el
tabaco en Francia en 1560. Se sintetiza en las zonas de mayor
actividad de las races de las plantas del tabaco y es trasportada por
la savia a las hojas verdes. El depsito se realiza en forma de sales de
cidos orgnicos.

Es un potente veneno e incluso se usa en mltiples insecticidas

(fumigantes para invernaderos). En bajas concentraciones, la
sustancia es un estimulante y es uno de los principales factores de
adiccin al tabaco. Es soluble en agua y polar.
La nicotina permitida en alimentos debe ser menor a 5ppm.

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OBJETIVO DEL MTODO

Este proceso tiene como objetivo identificar la cantidad de

nicotina que tienen algunos productos agrcolas.
Se analizaran cultivos con hojas y con ceras.

INSTRUMENTO
Se utiliz un Espectrofotmetro Ultravioleta/Visible GENESYS de haz
simple, acoplado a una computadora con el software correspondiente
para el anlisis de los datos obtenidos

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MTODO PARA EL CULTIVOS DE HOJAS

(LECHUGAS)
REACTIVOS:
1. cido clorhdrico diluido, aproximadamente 0.05N; diluir 5ml de
HCl en 1L.
2. Solucin estndar de nicotina, 1mg/mL, diluir 100mg de
nicotina ( Eastman Kodak Co.No 1242 o equivalente ) con
100mL de HCL 0.05N
3. Solucin intermedia , 0.01mg/mL pipetear 1mL de la solucin
stock en una fiola de 100 mL y diluir con HCl 0.05N .
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4. Solucin extractora, diluir 20mL de NH4OH en 2L, que se

prepara cuando se utilice.

PREPARACION DE LA MUESTRA
1. Pesar 500 g de espinaca o lechuga (picada, limpia y al seco).
2. Aadir 800 ml de benceno, 200 ml de CHCl3 (cloroformo) y 10
ml de NH4OH (hidrxido de amonio).
3. Agitar aproximadamente 10 minutos y drenar la solucin de la
forma ms completa posible en un vaso de la 1 L.
4. Filtrar a travs del plegado de papel 38.5 cm en el frasco y
proceder inmediatamente con la determinacin

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DETERMINACIN
1.
2.
3.
4.

Colocar 400 ml de solucin filtrada en un separador de 500 ml

Aadir aprox. 25 ml de HCl 0.05 N y 2 ml HCl
Agitar vigorosamente
Dejar que las fases se separen (aprox. 5 minutos) y drenar la
capa inferior en el separador de 250 ml
5. Arremolinar a lo largo del separador (deje reposar aprox. 2
minutos), drenar cualquier adicional y llevarlo a un separador de
250 ml
6. Repetir unas cuantas veces.
7. Extraer soluciones de 25, 25, 15 y 10 ml aprox. 0.05 N de HCl
8. Repetir remolinada como anteriormente
9. Drenar todo el cido extrado a un separador de 250 ml
10.
Extraer 2 porciones de 50 ml y 4 de 25 ml de CHCl3
11.
Combinarlo en un separador de 250 ml
12.
Adherir 2 ml de HCl en el separador y estar seguros de que
la solucin es cida (tornasol)
13.
Extraer porciones de 25, 25, 20, 10 y 5 ml de HCl 0.05 N
(aprox.)
14.
Combinarlo todo con el pequeo sistema externo en el
separador de 125 ml
15.
Lavar lo externo con 15 ml de ter de petrleo.
16.
Drenar la fase acuosa en un segundo separador de 125 ml
y limpiar ter de petrleo con 5 ml de HCl 0.05 N (aprox.), la
adicin de lavado a la solucin de cido combinado
17.
Extraer solucin con otros 15 ml de ter de petrleo
18.
Drenar la fase acuosa en un frasco de 100 ml, y lavar ter
de petrleo con 5 ml de HCl 0.05 N (aprox.)
19.
Drenar cido en un frasco y diluir a volumen con HCl 0.05 N
(aprox).
20.
Combinar y verter a un vaso de 50 ml y deje reposar 10 a
15 minutos
21.
Determinar A en 236, 259 y 282 nm con la referencia de
HCl 0.05 N
22.
Confirme presencia de nicotina con lecturas de intervalos
de 2 nm
23.
Determinar A con la solucin estndar de nicotina con la
referencia del HCl 0.05 N.

CALCULOS:
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Tomar la absorbancia de la solucin estndar como:

A std = A '259 0.5 ( A ' 236 + A' 282 )

Y la absorbancia de la muestra como:

A muestra =A 259 0.5 ( A 236 + A 282 )

Despus:

mg Nicotina=

A muestra
2.5
A std

RESULTADOS
El espectro fundamental de cada uno de los extractos de nicotina
present fuerte absorcin entre 250 y 265 nm. Un Espectro
representativo se muestra en la figura2

10

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CURVA DE CALIBRADO:
La curva de calibrado se obtuvo con diez diferentes concentraciones de
estndar y cada una con diez repeticiones. La grfica se muestra en
la figura 3.

PRECISIN:
Los valores de absorbancia corregida promedio y de concentracin, con
sus respectivas desviaciones estndar y %RSD al igual que % de
nicotina segn el mtodo propuesto por la A.O.A.C. y los obtenidos
utilizando la tcnica de espectrofotometra, muestran una
concordancia aceptable. Los datos se observan en las tablas 2, 3 y 4.
Tabla 2

11

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Tabla 3

Tabla 4

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CULTIVOS CEROSOS
REACTIVOS:
A) cido clorhdrico diluido: (Aproximadamente 0.05N) Diluir
4.1mL de cido clorhdrico a 1L.
B) Solucin estndar de nicotina:
(1)Solucin Stock: 1mg/mL. Diluir 100mg de nicotina (Eastman Kodak
Co. No. 1242, o equivalente) a 100mL aproximadamente en un matraz
a volumen con HCl 0.05N.
(2)Solucin de trabajo: 0.01mg/mL. Pipetear 1mL de solucin stock y
diluir a 100mL aproximadamente en un matraz a volumen con HCl
0.05N.
C) Solucin de extraccin: Diluir 20mL de NH4OH a 2L en un matraz a
volumen. Preparar en el momento de uso.

PREPARACION DE LA MUESTRA:
1. Pesar 2 a 2.5kg de manzanas en una jarra limpia y seca (3 a 5
galones; 11 a 20L).
2. Aadir 1L de solucin de extraccin, revolverlas por 10 minutos
aproximadamente.
3. Drenar cuidadosamente en un vaso de 1L.
4. Filtrar a travs de un papel filtro de 38.5cm en el matraz y
proceder inmediatamente con la determinacin.

DETERMINACIN:
1. Colocar 400mL de la solucin de filtrado en un separador de
500mL (1).
2. Aadir 50mL de CHCl3, invertir el separador ida y vuelta
suavemente por 2 minutos aproximadamente y dejar que las
fases se separen.
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3. Drenar la porcin clara de la extraccin y llevar a un separador

de 250mL (2).
4. Sacar la capa de CHCl3 (1) en un separador de 125mL (3) y
luego agitar vigorosamente. El separador debe estar seco.
5. Dejar que las fases se separen (3) y drenar la porcin clara en el
separador de 250mL (2).
6. Aadir 35mL de CHCl3 al separador de 125mL (3), agitar
gentilmente, y drenar en el separador de 500mL (1).
7. Extraer como anteriormente y combinar la extraccin clara en el
separador de 250mL (2).
8. Extraer con 35, 35, y 10mL de CHCl3, combinar las extracciones
en el separador de 250mL (2).
9. Aadir un poco ms de 1mL de HCl a los extractos hasta que el
tornasol indique que el medio es cido.
10.
Extraer con 3 porciones de 15mL de HCl 0.05N
aproximadamente, combinar los extractos cidos en un
separador de 125mL (4).
11.
Lavar el separador de 250mL (2) con 10mL de HCl 0.05N
aprox., despus de dicha extraccin, y agregar al separador de
125mL en donde se sola romper la emulsin (3).
12.
Agitar, pero no tratar de romper ninguna emulsin en este
separador.
13.
Combinar todos los extractos cidos en el separador de
125mL (3) y agitar con 15mL de ter de petrleo.
14.
Dejar reposar por 5 minutos aproximadamente y drenar la
fase acuosa en otro separador de 125mL (5).
15.
Lavar el ter de petrleo con 5mL de HCl 0.05N
aproximadamente (no agitar vigorosamente), y aadir el lavado
al separador.
16.
Repetir el lavado con 15mL de ter de petrleo, y drenar la
fase acuosa en un matraz de 100mL.
17.
Lavar el ter de petrleo como anteriormente, aadir el
lavado al matraz, y dejar reposar de 10 a 15min.
18.
Diluir a volumen con HCl 0.05N aproximadamente y
determinar las absorbancias a 236, 259 y 282nm, con HCl 0.05N
aproximadamente como referencia.
19.
Confirmar la presencia de nicotina leyendo en intervalos
cada 2nm y plotear la curva de absorcin, usando el
espectrofotmetro.
20.
Determinar la absorbancia se la solucin estndar de
nicotina, con HCl 0.05N aproximadamente como referencia.
CALCULOS:

Tomar la absorbancia de la solucin estndar como:

A std = A '259 0.5 ( A ' 236 + A' 282 )

Y la absorbancia de la muestra como:

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A muestra =A 259 0.5 ( A 236 + A 282 )

Despus:

mg Nicotina=

A muestra
2.5
A std

GRFICA

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