Universidade Federal do ABC

Centro de Cincias Naturais e Humanas (CCNH)

Bacharelado em Qumica

Bioqumica Experimental

MARCUS AUGUSTO LAMIM

Projeto
Extrao e Caracterizao de Lipdios em levedura Saccharomyces cerevisiae

Trabalho apresentado como

requisito parcial para aprovao
na disciplina Bioqumica Experimental
3 Quadrimestre de 2013

Professora Dra. Giselle Cerchiaro

Santo Andr, 2014

1. Introduo
Para a disciplina de Bioqumica Experimental da UFABC, o modelo experimental utilizado durante
todas as prticas foi o da espcie Saccharomyces cerevisiae, um fungo unicelular que possui alm
de importncia industrial, presente em bebidas e pes, um modelo interessante para aplicao em
pesquisa bsica e aplicada. Isso advm do fato de que a levedura um organismo simples e
unicelular, mas tambm eucarioto, o que muito til para o estudo desse modelo de clulas em
laboratrio. Alm disso, um organismo que no txico para os ser humano e tambm possui a
peculiaridade de j ter o seu sequenciamento gentico completo em 1996, possuindo tambm a
facilidade na manipulao gentica.
No programa da disciplina os experimentos versam sobre o cultivo da linhagem de levedura, sua
lise celular e obteno do lisado. Os experimentos ento visam quantificao de protenas,
extrao e caracterizao de uma enzima, nesse caso, a -glicosidase, enzima que atua em
polissacardeos, liberando unidades de glicose.
Neste projeto proposta a extrao e caracterizao dos lipdios contidos nas clulas de
Saccharomyces cerevisiae.
Lipdios so substncias que divergem entre si, mas possuem como caracterstica bsica e comum
serem compostos orgnicos insolveis em gua. Suas funes biolgicas so as mais diversas.
Gorduras e leos so a principal forma de estoque energtico em vrios organismos. Fosfolipdios e
esterides so os principais componentes sas membranas celulares. Outros lipdios em menor
quantidade podem tambm desempenhar um importante papel, como hormnios, cofatores de
enzimas e mensageiros intracelulares.
O estudo da composio lipidica da levedura envolve o isolamento quantitativo e fracionamento dos
lipdios. Os cidos graxos mais comuns em leveduras Saccharomyces cerevisiae so os cidos
linoleico e palmitico. Os lipdios so geralmente extrados com uma mistura de solventes orgnicos
com ou sem preparao prvia. Destacam-se os mtodos de Bligh e Dyer (1959) e Folch et. al.
(1957) para extrao total de lipdios, e o mtodo de Hartman & Lago (1973) para determinao da
composio de cidos graxos. Os mtodos de extrao lipdica podem envolver ou no a
desintegrao celular. Quando se deseja uma caracterizao mais sensvel, ou uma anlise estrutural
mais detalhada das diferentes classes lipidicas, prefervel que as clulas permaneam intactas.
Caso contrrio, quando apenas uma quantificao total e de cidos graxos desejada, as clulas
podem sofrer lise (LAMACKA, AJBIDOR, BOHOV, 1998). Esse o caso estudado nesse
experimento proposto.

2. Objetivos
Extrair e quantificar lipdios da cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae.

3. Materiais, Equipamentos e Reagentes

gua Destilada;
Precipitado de Saccharomyces cerevisiae, obtido na prtica 1, derivado da lise celular da qual se
obteve tambm o lisado de levedura;
Pipetadores e ponteiras;
Benzeno;
Hexano;
Metanol;
Clorofrmio;
Soluo Metanol-BF3 (14 g/L);
Cromatgrafo a gs equipado com software de aquisio de dados e coluna capilar de silica;
Funil de Bchner;
Papel de Filtro;
Funil de separao;
Banho-maria
Evaporador rotatrio;
Balana Analtica;
Agitador Vrtex;
Agitador eletrnico;
Erlenmeyer com tampa;
Tubos Falcon de 50 mL;

4. Procedimento
Parte 1 Extrao de lipdios totais
Transferir o precipitado obtido na lise celular da prtica 1 para um tubo falcon;

Adicionar 2 mL de gua destilada e misturar;

Adicionar 15 mL de uma mistura entre clorofrmio e metanol (na proporo de 2:1 em volume);
Fechar imediatamente o tubo;
Agitar em vrtex;
Transferir para erlenmeyer (com tampa) e agitar em agitador eletrnico por 24 horas temperatura
ambiente;
Retirar o erlenmeyer do agitador e transferir para um funil de Bchner equipado com papel de filtro;
Fazer lavagem do filtro com uma mistura de gua, metanol e clorofrmio (1:1:2 em volume);
Obtido o filtrado, transferi-lo para um funil de separao e adicionar 10 mL de gua, 10 mL de
clorofrmio e uma soluo 0,12 mol/L de KCl
Agitar o funil por quatro vezes;
Esperar pela separao de fases e a fase inferior transferir para um segundo erlenmeyer;
Adicionar o sal Sulfato de Sdio soluo para remoo da gua residual;
Levar a mistura solvente-lipdios para um evaporador rotatrio at completa evaporao do
clorofrmio e metanol;
O resduo obtido da evaporao deve ser levado para pesagem em balana analtica;
Aps pesagem, ressuspender em clorofrmio(2 mL) e conservar temperatura de -20C;
Parte 2 Anlise de cidos graxos;
Novamente reevaporar o solvente clorofrmio e adicionar 2 mL de soluo de BF 3 em metanol (14
g/L) ao resduo e misturar;
Aquecer a mistura por 90 C por 1 hora para que ocorra a destilao;
Depois de resfriado, adicionar 2 mL de gua destilada e extrair com o solvente hexano (5 mL);
Transferir a camada de hexano (superior) para um tubo de ensaio;
Evaporar o hexano em capela;
Adicionar 50 L de benzeno e 2 mL de soluo alcoolica de KOH (0,5 mol/L). Misturar;
Incubar a soluo por 1 hora temperatura de 80 C;
Aps resfriamento, adicionar 0,5 mL de gua destilada e 3 mL de hexano para extrair lipdios que
no foram esterificados;
Descartar em local apropriado a frao de hexano superior e adicionar a frao inferior com 0,35
mL de HCl (4 mol/L). Adicionar novamente hexano;
Evaporar o solvente hexano;
Estocar a soluo a -20 C;

Parte 3 Cromatografia a gs
Condies para a anlise: velocidade do gs da fase mvel (38 cm/s); corrente de hidrognio (ar)
pelo detector (15 ml/min); temperatura do injetor (235 C);
Injetar 1 L da soluo de hexano e metil-estres obtida anteriormente;
Aps anlise integrar com ajuda de software a rea para obteno quantitativa dos dados sobre a
composio de cidos graxos na levedura;
Discutir os dados obtidos em relao aos encontrados na literatura;

5. Referncias Bibliogrficas
NELSON, D.L.; COX, M. M.; Lehninger Principles of Biochemistry. 5th ed. W. H. Freeman. Nova
Iorque, 2008. 1100p.
PINHEIRO, F. G.; cido linoleico conjugado em cortes bovinos e laticinios: Avaliao de
metodologias analticas para a quantificao dos ismeros conjugados majoritrios. 2010. 69p.
Dissertao (Mestre em Cincia dos Alimentos). Faculdade de Cincias Farmacuticas.
Universidade de So Paulo, So Paulo.
LAMACKA, M.; SAJBIDOR, J.; BOHOV, P. Lipid isolation and fatty acid analysis in
Saccharomyces cerevisiae. Comparison of different methods. Biotechnology Techniques, Vol 12,
No 8, August 1998, pp. 621625.
SUBK, J. Conditions of Isolation of Lipids from Yeast. Chem. zvesti v. 23, pp.616619 (1969)
GUTIERREZ, L. E.; SILVA, R. C. M. Fatty Acid Composition of Cane Molasses and Yeasts. Sci.
Agric., Piracicaba, 50 (3), Outubro/Dezembro de 1993, pp. 473-477.
CABALLERO-CRDOBA, G. M.; PACHECO, M. T. B.; & SGARBIERI, V. C. Composio
qumica da biomassa de levedura (Saccharomyces sp.) e determinao do valor nutritivo da protena
e clulas integrais ou rompidas mecanicamente. Cinc. Tecnol. Aliment., v. 17 (2), maio/agosto de
1997. pp. 102-106.