III.

Materiales y Mtodos

III.

MATERIALES Y METODOS

III.1.

PLAN DE TRABAJO
El plan de trabajo seguido consta de tres fases:

Fase 1:

Cuantificacin de la capacidad bactericida en base a un patrn de nisina.

Fase 2:

Caracterizacin de Lactococcus lactis: curva de crecimiento y actividad antilisteria.

Fase 3:

Formulacin de un medio ptimo para la produccin de metabolitos con actividad

antilisteria a partir de Lactococcus lactis.

En la figura III.1. se muestra de forma esquematizada el plan de trabajo el cual se

detalla a continuacin.
Fase 1: Cuantificacin de la capacidad bactericida en base a un patrn de Nisina
Una de las problemticas que se plantea a la hora de evaluar la actividad
bactericida de un microorganismo o/y sus productos metablicos, es estandarizar
los resultados obtenidos. Una forma de hacerlo es expresar los resultados en
base a un patrn, siendo el ms utilizado, en este caso, la nisina. Para poder
lograr este objetivo es necesario previamente elaborar un patrn de dosisrespuesta que relacione la actividad bactericida de diferentes dosis de nisina
frente a la respuesta inhibitoria observada sobre una determinada cepa diana,
listeria en el presente trabajo. As, posteriormente trasladar la respuesta
observada en el caso de los microorganismos en estudio a una actividad
equivalente de nisina.
Fase 2:

Caracterizacin de Lactococcus lactis: curva de crecimiento y actividad antilisteria.

La actividad antimicrobiana de las bacterias cido lctica (BAL) se debe en gran
medida a los metabolitos que estos microorganismos son capaces de generar.
As, con la finalidad de determinar en qu momento de su desarrollo el
Lactococcus

lactis

produce

una

mayor

concentracin

de

sustancias

antimicrobianas se: a) modeliz su curva de crecimiento, en un medio ptimo de

crecimiento y b) se evalu la actividad antilisteria de los metabolitos (sustrato
parcialmente purificado: SPP) producidos en las distintas fases de crecimiento.

19

Sustancia activa
NISINA

III. Materiales y Mtodos

Formulacin de un medio optimo para la produccin de metabolitos con actividad

antilisteria a partir de Lactococcus lactis.
En este apartado se testaron diferentes formulaciones con la finalidad de obtener
un medio que permitiese un optimo desarrollo de la actividad antilisteria de L.
lactis. Se trabajo con dos cepas de L. lactis (CECT 539 y 4434) y los componentes
utilizados en las formulaciones testadas fueron: sacarosa, peptona, extracto de
levadura, fosfato potsico, cloruro sdico y sulfato de magnesio. La determinacin
del medio ptimo se efectu considerando la actividad antilisteria de los SPPs
obtenidos para cada uno de los medios testados y utilizando la tcnica de anlisis

FORMULACIN DE UN MEDIO PTIMO PARA LA PRODUCCIN DE METABOLITOS CON ACTIVIDAD ANTILISTERIA

FASE 1

de superficie de respuesta (MSR).

Medio optimo

FASE 2

FASE 1

Evaluacin actividad antilisteria

FASE 3

Fase 3:

Figura III.1 Esquema del plan de trabajo.

20

Com
sacar

Mtodo de la superficie de

III. Materiales y Mtodos

III.2.

MATERIA PRIMA

III.2.1. Microorganismos
Los

microorganismo

productores

de

sustancias

bactericidas/bacteriostticas

utilizados para el presente estudio fueron Lactococcus lactis spp. lactis CECT 539 y CECT
4434. Como microorganismo indicador se utiliz Listeria innocua CECT 4030. Todos los
microorganismos se obtuvieron en forma de lifilos y procedan de la Coleccin Espaola de
Cultivos Tipo (CECT).
III.2.2. Medios de cultivo y reactivos
Los medios de cultivo comerciales utilizados fueron: De Man, Rogosa y Sharpe Broth
(Scharlau) (MRS caldo), Brain Heart Infusion Broth (Scharlau) (BHI caldo), De Man, Rogosa
y Sharpe agar (MRS agar) (Scharlau), Brain Heart Infusion Agar (BHI agar) (Difco).
Para los medios formulados se utilizaron los siguientes reactivos (Li et al., 2002):
sacarosa (Scharlau), peptona (Scharlau), extracto de levadura (Scharlau),

KH2PO4

(Scharlau), NaCl (Scharlau), MgSO4.7H2O (Scharlau).

III.3.3. Preparacin del patrn de nisina
Se preparo una solucin de nisina (2000 UI/mL) adicionando 0.2 g de nisina
comercial 106 UI/g en 100 mL de agua destilada estril con un pH ajustado a 5.3 para una
correcta disolucin (Pongtharangkul, 2004).

21

III. Materiales y Mtodos

III.3.

METODOLOGA

III.3.1. Aspectos generales

III.3.1.1. Recuperacin de las cepas liofilizadas y preparacin de inculos
La recuperacin de las cepas liofilizadas utilizadas en el presente estudio se llev a
cabo de acuerdo con las instrucciones de la coleccin Espaola de Cultivo Tipo (CECT).
Una vez revitalizadas las cepas se inocul 1 mL de la suspensin obtenida en 250
mL de medio de cultivo (MRS caldo para L. lactis y BHI caldo para L. innocua) y se incub
durante 12 horas a la temperatura ptima de crecimiento del microorganismo, 37C para L.
innocua y 30C para L. lactis, obteniendo as las denominadas soluciones madre.
A partir de las soluciones madre se inocul 2mL en matraces con 800 mL de los
correspondientes medios de cultivo, MRS caldo BHI caldo, en funcin del
microorganismos considerado. Estos nuevos matraces fueron incubados 12 horas a 30/37C
en funcin del microorganismo.
Transcurrido este tiempo, se centrifugaron los cultivos celulares a 11000 rpm y 5 C
durante tres ciclos de 5 minutos (centrifuga 5804 Eppendorf, Alemania).
Finalizada la centrifugacin el pellet obtenido se resuspendi con agua destilada
estril y seguidamente se distribuy en alcuotas de 1 mL en eppendorfs a los que se les
aadi un 15 % de glicerol.
La muestras as obtenidas (inculos) fueron inmediatamente almacenadas a -80C
hasta su utilizacin.
La concentracin de clulas viables en los inoculos as preparados fue de 10 9 ufc/mL
para L. innnocua y 1010 ufc/mL para L. lactis (CECT 539 y CECT 4434).

22

III. Materiales y Mtodos

III.3.1.2. Obtencin del sustrato parcialmente purificado (SPP)

El sustrato parcialmente purificado (SPP) se puede definir como el producto
obtenido tras el crecimiento de L. lactis en un determinado medio de cultivo y posterior
inactivacin de la clulas microbianas. Dicho sustrato contendra los metabolitos
microbianos con actividad antimicrobiana.

Para la obtencin del sustrato parcialmente

purificado se sigui la metodologa definida por Cabo et al. (1999); Guerra y Pastrana (2002)
con pequeas variaciones para ajustarla a las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo.
En primer lugar, las cepas de L. lactis se inocularon en el o los medios de cultivo
pertinente, en funcin del estudio a realizar, y stos se incubaron a la temperatura ptima de
crecimiento (30C).
Transcurrido el tiempo de incubacin, el cual ser funcin del estudio realizado, se
ajust el pH a 3.5 mediante la adicin de HCl 5N, para evitar la adsorcin de los metabolitos
sobre las superficies de las clulas.
Tras 10 minutos de resposo, se pasteuriz en un bao de agua a 80C durante 3
minutos con la finalidad de inactivar las clulas microbianas sin alterar los productos
metablicos, fundamentalmente las bacteriocinas. Posteriormente, se enfro en bao de
hielo durante 15 minutos.
Para finalizar, la muestra fue sometida a centrifugacin a 5000 rpm durante 10
minutos a 4C en una centrfuga (centrifuga 5804 Eppendorf) obtenindose as los
sobrenadantes libres de clulas sustrato parcialmente purificado (SPP). El pH de los
sobrenadantes se ajust a 6.2 con NaOH 1N y estos fueron almacenados en refrigeracin
hasta su uso.
III.3.1.3. Evaluacin de la capacidad bactericida
Para evaluar la actividad antimicrobiana se utilizaron dos tcnicas: la tcnica de
difusin en agar y la tcnica de dilucin en caldo.

23

III. Materiales y Mtodos

a.-Tcnica de la difusin en agar:

El mtodo de la gota en agar o mtodo de difusin en agar se basa en la capacidad
de difusin de una cierta sustancia o disolucin, en un agar o medio de cultivo solid
(Garriga et al., 2001; Montville y Winkowski, 2001; Guerra y Pastrana, 2002; Turcotte et al.,
2003).
A tal efecto, se prepararon unas placas Petri inoculadas con el microorganismo
indicador (L. innocua) para lo cual se tuvo en cuenta la carga microbiana a inocular en cada
placa, por lo que a partir de un vial ultracongelado se realizaron las diluciones deseadas
hasta alcanzar una carga final de 106ufc/mL.
En cada placa se pipete 1mL de L. innocua y se verti BHI agar (45C), se agit
convenientemente y se dej solidificar a temperatura ambiente. Una vez solidificado el agar,
las placas se mantuvieron en nevera (4C) durante 30 minutos. Transcurrido ese tiempo, se
sacaron y se realizaron aspticamente 5 agujeros (pocillos) con un sacabocados de 9 mm
de dimetro (Figura III.2.). En cuatro de los pocillos se inocularon las distintas sustancias a
testar (nisna o SPP, segn el caso) a razn de 100 L y el quinto pocillo se utiliz como
control negativo. Tras un periodo de incubacin de 24 horas a 37C se midieron los
dimetros de los halos de inhibicin obtenidos.

Figura III.2. Evaluacin de la capacidad bactericida mediante la tcnica de difusin en

agar, esquema de la distribucin de los pocillos de las placas Petri.

24

III. Materiales y Mtodos

b.- Tcnica de dilucin en caldo

Esta tcnica se basa en la preparacin de una serie tubos inoculados con el
microorganismo diana (L. innocua) y las diferentes sustancias a testar, nisina SPP en
funcin del estudio a realizar. La concentracin de L. innocua inoculada fue de 106ufc/mL. A
continuacin, se incuban los tubos durante 20 horas a una temperatura de 37C, tras lo cual
se enumeran los niveles residuales de L. innocua mediante recuento en placa en BHI agar.

III.3.2. Cuantificacin de la capacidad bactericida en base a un patrn de nisina

Con la finalidad de poder evaluar la actividad antimicrobiana de los productos
metablicos producidos por L. lactis se opt por expresar dicha actividad en base a un
patrn de nisina. A tal efecto, se tuvo que establecer la relacin dosis-respuesta para dicho
patrn, para poder trasladar las respuestas observadas en el caso de los metabolitos de L.
lactis a una concentracin equivalente de nisina. Para medir la actividad antimicrobiana del
patrn de nisina se eligi como cepa indicadora o diana L. innocua y se testaron las
respuestas observadas para diferentes concentraciones de nisina utilizando las dos tcnicas
descritas en el apartado III.3.1.3. (difusin en agar y dilucin en caldo).
En ambos casos se parti de una disolucin de nisina de 2000 mg/L equivalente a
2000 UI/mL (apartado III.2.2.1.) A partir de esta disolucin se obtuvieron disoluciones con
diferentes concentraciones de nisina.
En el caso de la tcnica de difusin en agar (ver apartado III.3.1.3.a.) se testaron las
siguientes concentraciones de nisina: 25, 50, 200, 500, 1000, 1100, 1200 mg/L).
En el caso de la tcnica de dilucin en caldo (apartado III.3.1.3.b.) se prepararon 11
diluciones con las concentraciones en nisina que se muestran en la tabla III.1., cada una de
ellas en un tubo con las cantidades de nisina y caldo BHI correspondientes. A partir de la
dilucin 11, correspondiente a 100 mg/L, se realizaron el resto de diluciones segn se
muestra en la tabla III.1. Una vez obtenidas las distintas concentraciones de nisina se
procedi como viene indicado en el apartado III.3.1.3.b. En los tubos de ensayo se
mezclaron 1 mL de las distintas disoluciones de nisina con 1 mL de L. innocua a una
concentracin de 106 ufc/mL, considerndose como concentracin de nisina testada la
correspondiente a concentracin de nisina en incubacin (tabla III.1.). La concentracin

25

III. Materiales y Mtodos

mnima inhibitoria (CMI) se estableci como la mnima concentracin de nisina que conlleva
una inhibicin total del crecimiento de listeria.
Tabla III.1. Preparacin de los tubos para la prueba de la actividad antilisteria del patrn de
nisina segn la tcnica de dilucin en tubo.
Diluci
n

Volumen
de nisina
(mL)

Volumen
de caldo
BHI
(mL)

Concentraci
n de nisina
(mg/L)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

5
4.5*
4.0*
3.5*
3.0*
2.5*
2.0*
1.5*
1*
0.5*
0.5 *
4.0**
3.0**
2.0**
1.0**

0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
9.5
1.0
2.0
3.0
4.0

2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
100
80
60
40
20

Concentraci
n
de la nisina
en
incubacin
(mg/L)***
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
50
40
30
20
10

* Concentracin de partida: 2000 mg/L

** Concentracin de partida: 100 mg/L procedente de la dilucin 11
*** Concentracin final en el tubo de ensayo

III.3.3. Caracterizacin de lactococcus lactis: curva de crecimiento y actividad

antilisteria.
Con la finalidad de determinar en qu momento de su desarrollo el L. lactis produca
mayor concentracin de metabolitos antimicrobianos se: a) modeliz su curva de
crecimiento en un medio ptimo de crecimiento y b) se evalu la actividad antilisteria de los
metabolitos producidos (SPP) a lo largo de dicha curva de crecimiento.
III.3.3.1. Modelizacin de la curva de crecimiento de L. lactis
Para obtener la curva de crecimiento se inoculo L. lactis (CECT 539) en caldo MRS,
obtenindose una concentracin inicial aproximada de 104ufc/mL. A continuacin, se incub

26

III. Materiales y Mtodos

21 horas a 30C tomndose muestra cada hora y a tiempo 0 (antes de introducir los tubos
en la estufa).
Tras cada toma de muestra se enumeraron los microorganismos mediante recuento
en placa en MRS agar. Tras el registro de los datos se representaron los valores de
unidades formadoras de colonias (ufc/mL) frente al tiempo obtenindose as la curva de
crecimiento.
Posteriormente se realiz la modelizacin de las curvas de crecimiento en base a los
modelos cinticos de Gompertz (ecuacin 1) y Baranyi (ecuacin 2).

log N=log N 0 +C .ee

B(tM )

(ecuacin 1)

Donde: N= carga microbiana (log ufc/mL)

N0= carga microbiana inicial (log ufc/mL)
C= cantidad de crecimiento que se da al aumentar t indefinidamente (log ufc/mL)
M=tiempo al que la velocidad de crecimiento es mxima (h)
B= velocidad de crecimiento relativa en el tiempo M (h-1)
t= tiempo (h)

N ( t )=N 0+ max A ( t )

1
e mu max A (t )1
ln 1+ m (N maxN )
m
e
0

(ecuacin 2)

Donde: N= carga microbiana (log ufc/mL)

N0= carga microbiana inicial (log ufc/ml)
max= velocidad mxima de crecimiento ([log ufc/mL]h -1)
m=parmetro de curvatura
Nmax= carga microbiana mxima (log ufc/mL)

Los datos experimentales (ufc/mL) obtenidos de la curva de crecimiento, se

modelizaron con ayuda del programa informatico DMFit 2.0 para Excel (Baranyi y Roberts,
1994), adems la aplicacin proporciona los siguientes parmetros de crecimiento: =
velocidad de crecimiento (log ufc/mLh-1); = tiempo de latencia (h); DP=mxima densidad
poblacional (log ufc/mL); No= carga microbiana inicial (log ufc/mL) y R2= coeficiente de
correlacin.

27

III. Materiales y Mtodos

III.3.3.2. Curva de crecimiento y actividad antilisteria del SPP

En este punto se determino la actividad antilisteria de los metabolitos producidos por
L. lactis (SPP) respecto a su nivel de crecimiento.
A tal efecto, se procedi como en el apartado anterior (III.3.3.1.) incubndose L.
lactis en caldo MRS. Se tomo muestra cada hora durante 24 horas, determinndose las
ufc/mL y extrayndose el SPP tal y como se indica en el apartado III.3.1.2. La actividad
antimicrobiana se determino frente a Listeria innocua (actividad antilisteria) utilizando la
tcnica de difusin en agar (apartado III.3.1.3.a.).
III.3.4. Formulacin de un medio ptimo para la produccin de metabolitos con
actividad antilisteria a partir de Lactococcus lactis
El objetivo que se pretendi conseguir en esta fase del trabajo fue formular un medio
ptimo de crecimiento para L. lactis que permitiese alcanzar una mxima produccin de
metabolitos con propiedades antisteria. A tal efecto, se utiliz la metodologa de superficie de
respuesta (MSR). La metodologa de superficie de respuesta es un grupo de tcnicas
matemticas y estadsticas tiles para el modelado y anlisis en aplicaciones donde la
respuesta de inters est influenciada por varias variable y donde el objetivo es el optimizar
(maximizar minimizar) esa respuesta (Chacin, 2000).
En este trabajo, mediante esta tcnica se pretendi identificar los ingredientes del
medio de cultivo que tienen efecto significativo sobre la produccin de sustancias
metablicas con actividad antimicrobiana (fundamentalmente bacteriocinas) a partir de L.
lactis.
III.3.4.1.Diseo factorial fraccionado (DFF)
En la fase inicial de este estudio se utiliz un diseo factorial fraccionado (DFF), este
tipo de diseo reduce el nmero de experimentos a realizar en comparacin con los diseos
factoriales clsicos (Li et al., 2002). Los ingredientes o factores del medio de crecimiento

28

III. Materiales y Mtodos

considerados fueron: sacarosa, peptona, extracto de levadura, KH2PO4, NaCl y MgSO4.7H2O

(apartado III.2.2.).
Para cada uno de estos factores se consideraron 2 niveles (inferior y superior) (tabla
III.2.). La variable dependiente o respuesta considerada fue la actividad antilisteria del SPP
extraido cuando el L. lactis se desarrollaba en los diferentes medios testados.
De acuerdo con los diseos factoriales y teniendo en cuenta que en el presente
diseo se han considerado 6 factores con dos niveles, se tratara de un diseo 2 6 o sea
conllevara a la realizacin de 64 experimentos. Este nmero se redujo utilizando un diseo
factorial fraccionado (DFF) de tipo 26-2 siendo en este caso necesarios 16 experimentos. A
partir de este diseo se estim las respuestas medias para un modelo lineal de primer orden
(Li et al., 2002). En la tabla III.3. se muestra el diseo utilizado.
Tabla III.2. Concentracin de los distintos componentes del medio de cultivo considerando los
niveles inferior, medio y superior.
Componente
Sacarosa
Peptona
Extracto de levadura
KH2PO4
NaCl
MgSO4.7H2O

Inferior (g/L)
6,667
6,667
6,000
6,667
1,000
0,047

Niveles
Medio (g/L)
10
10
10
10
2
0,1

Superior (g/L)
13,333
13,333
14,000
13,333
3,000
0,167

Tabla III.3. Diseo experimental factorial fraccionado (DFF)

n ensayo/ formulacin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

X1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1

Factores: X1, X2, X3, X4, X5 y X6

29

X2
-1
-1
+1
+1
-1
-1
+1
+1
-1
-1
+1
+1
-1
-1
+1
+1

Factores
X3
X4
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
+1
+1

X5
-1
+1
+1
-1
+1
-1
-1
+1
-1
+1
+1
-1
+1
-1
-1
+1

X6
-1
+1
-1
+1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
+1
-1
-1
+1
-1
+1

III. Materiales y Mtodos

Niveles: inferior (-1) y superior (+1)

Conociendo los valores correspondientes a los factores (variable independiente) y las

respuestas (variable dependiente=actividad antilisteria) se represento matemticamente el
modelo MSR mediante una ecuacin que relacionase las respuestas obtenidas con los
factores considerados. En este caso se utiliz un modelo de primer orden (lineal) sin
interacciones o productos cruzados (ecuacin 3). La tcnica de optimacin se elige segn se
alcance el objetivo deseado con el menor gasto de recursos

Y = o + 1 X 1+ 2 X 2 + 3 X 3 + 4 X 4 + 5 X 5 + 6 X 6 +

(Ecuacin 3)

Donde Y es la variable respuesta, 0.6 son los coeficientes de regresin lineal;

X1X6 las variables independientes y es el error aleatorio (Montgomery, 2003).
La metodologa seguida en esta fase del proyecto se detalla a continuacin:
a) Preparacin de los diferentes medios de crecimiento e incubacin de L. lactis
b) Extraccin del SPP
c) Determinacin de la actividad antilisteria del SPP
a) Preparacin de los medios de cultivo
Para la preparacin de los 16 ensayos a realizar se pesaron cada uno de los
componentes del medio (sacarosa, peptona, extracto de levadura, KH 2PO4, NaCl y
MgSO4.7H2O) y se disolvieron en un volumen final de 250 mL de agua destilada, en la tabla
III.4. se indican las concentraciones testadas en los 16 experimentos programados.
A continuacin, se ajust el pH a 6.8 utilizando NaOH 5N y/o HCl 5N y se esteriliz
en autoclave durante 20 minutos a 121C. Posteriormente, a los medios estriles se les
inocul L. lactis CECT 539 o CECT 4434, obtenindose una concentracin inicial
aproximada de 104 ufc/mL. Posteriormente, los medios inoculados se incubaron 12 horas a
30 C.

30

III. Materiales y Mtodos

Tabla III.4. Concentracin de los distintos componentes del medio a testar para cada uno de
los ensayos
N ENSAYO/
FORMULACIN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

X1(g/L)

X2 (g/L)

Factores
X3 (g/L)
X4 (g/L)

6,667
13,333
6,667
13,333
6,667
13,333
6,667
13,333
6,667
13,333
6,667
13,333
6,667
13,333
6,667
13,333

6,667
6,667
13,333
13,333
6,667
6,667
13,333
13,333
6,667
6,667
13,333
13,333
6,667
6,667
13,333
13,333

6,000
6,000
6,000
6,000
14,000
14,000
14,000
14,000
6,000
6,000
6,000
6,000
14,000
14,000
14,000
14,000

6,667
6,667
6,667
6,667
6,667
6,667
6,667
6,667
13,333
13,333
13,333
13,333
13,333
13,333
13,333
13,333

X5 (g/L)

X6 (g/L)

1,000
3,000
3,000
1,000
3,000
1,000
1,000
3,000
1,000
3,000
3,000
1,000
3,000
1,000
1,000
3,000

0,047
0,167
0,047
0,167
0,167
0,047
0,167
0,047
0,167
0,047
0,167
0,047
0,047
0,167
0,047
0,167

X1: Sacarosa, X2: Peptona, X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4, X5: NaCl, X6: MgSO4.7H2O

b) Extraccin del SPP

Tras las 12 horas de incubacin se extrajo el sustrato parcialmente purificado tal y
como se indica en el apartado III.3.1.2.
c) Determinacin de la actividad antilisteria del SPP
La actividad antimicrobiana de los productos metablicos de las dos cepas en
estudio L.lactis CECT 539 y CECT 4434 se evalu frente al microorganismo indicador L.
innocua utilizando la tcnica de dilucin en tubo (III.3.1.3.b.). A tal efecto, partiendo de los
sobrenadantes o sustratos parcialmente purificados (SPP) extrados como se indica en el
apartado anterior, se testaron diferentes diluciones de los mismos para lo cual se mezcl un
determinado volumen de SPP y agua destilada tal y como se indica en la tabla III.5.
A continuacin, se tom 1 mL de cada una de las diluciones anteriores y se aadi 1
mL del cultivo de L. innocua (106 ufc/mL) y se incub 20 horas a 37 C Tras el periodo
incubacin se determin la concentracin residual de L. innocua mediante recuento en placa
en BHI agar obtenindose la curva dosis-respuesta con los datos obtenidos. La

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III. Materiales y Mtodos

concentracin mnima inhibitoria CMI del sobrenadante es la concentracin ms baja a la

cual se inhibe el crecimiento total de 106 ufc/mL de L. innocua
Tabla III.5. Diluciones de sobrenadante (SPP) testadas.
Dilucin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

SPP
2
1,9
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2

Volumen (mL)
agua estril
SPP en incubacin
0
1
0,1
0.95
0,2
0,9
0,3
0.85
0,4
0,8
0,5
0.75
0,6
0,7
0,7
0.65
0,8
0,6
0,9
0.55
1
0,5
1,1
0.45
1,2
0,4
1,3
0.35
1,4
0,3
1,5
0.25
1,6
0,2
1,7
0.15
1,8
0,1

Finalmente, se estableci una relacin de equivalencia entre la concentracin mnima

inhibitoria de la nisina y la concentracin mnima inhibitoria del volumen del sobrenadante.
As, la actividad en IU/mL del volumen del sobrenadante de la dilucin en la que se
produce la completa inhibicin del crecimiento de L. innocua se puede calcular segn la
ecuacin (4)
As (IU/mL) = Ap (IU) / Vs (mL)

(Ecuacin 4)

Dnde:
As (IU/mL): Actividad del sobrenadante del medio de optimizacin en estudio.
Ap (IU): Actividad de la nisina patrn con la concentracin mnima inhibitoria.
Vs (mL): Volumen del sobrenadante de la dilucin en la que se produce la completa
inhibicin del crecimiento de L. innocua.

Paralelamente a la determinacin de la actividad antilisteria de los SPPs se

determin el pH del medio de cultivo a partir del cual se obtuvieron los distintos sustrato

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III. Materiales y Mtodos

parcilemente purificados, o sea el pH de los medios elaborados con las 16 formulaciones

testadas antes de la extraccin del SPP. A tal efecto se utiliz un pHmetro porttil Crison
III.3.4.2. Diseo central compuesto (DCC).
Para describir la naturaleza de la superficie de respuesta en la regin optima, se
utiliz un Los diseos centrales compuestos son diseos de tratamientos factoriales 2 2 con
2*2 combinaciones adicionales llamadas puntos axiales. En este estudio se considero
nicamente la propiedad de rotabilidad consistente en que la varianza de los valores
estimados sea constante en puntos equidistantes del centro del diseo. As el valor de
para un diseo con dos factores es de =1.414.
Para los clculos estadsticos las variables independientes Xi fueron codificadas
como xi de acuerdo con la ecuacin 5.
xi= (Xi - X0)/X

(Ecuacin 5)

Donde xi=valores codificados adimensionales de la variable X i; X0=valor de Xi en el

punto central; X=cambio en la magnitud de la variable.
Para dos factores se obtienen ecuaciones de la superficie de respuesta de segundo
orden (ecuacin 6).
2

Y = o + 1 X 1+ 2 X 2 + 12 X 1. X 2. + 11 X 1 + 22 X 2

(Ecuacin 6)

Donde Y es la variable respuesta, 0, 1 y 2 son los coeficientes de regresin lineal;

X1 y X2 son las variables independientes (Figueroa, 2003)
Por otro lado el rango de concentraciones de los factores a ensayar se ampli con
respecto al utilizado cuando se ensayaron los seis factores.
III.3.5. Anlisis de los resultados
Los anlisis de la varianza, los valores de los coeficientes de las regresiones y otros
anlisis estadsticos se efectuaron mediante el software Statgraphics Centurion XV
(Manugistics, Rockville, MD, USA).

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III. Materiales y Mtodos

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