CONSERVACIN DE BACTERIAS NO FILAMENTOSAS

Alison Viviana Martin- Maria Juliana Arias

alison.martin@javeriana.edu.co- mariasc@javeriana.edu.co
Departamento de Microbiologa - Facultad de Ciencias
Pontificia Universidad Javeriana
Biotecnologa Industrial
RESUMEN
Esta prctica se realiz con el fin de elaborar y evaluar un Banco de Cepas
Primario utilizando glicerol al 25% (v/v) como crioprotectante; para esto se realiz
coloracin de Gram para verificar la pureza de Escherichia coli; de este cultivo, de
1
hicieron diluciones seriadas de 10
hasta 10-8 y se sembr 0.1 mL en agar BHI
de las diluciones 10-4-10-8, se llev a incubar a 37C por 24 horas y se hizo el
recuento inicial. Posteriormente, se realiz el banco usando 2 mL de caldo BHl y
glicerol al 25%(v/v) + 2 mL del cultivo los cuales se repartieron en tres tubos
eppendorf que se conservaron a -20C. Por ltimo, se hicieron diluciones seriadas
a partir del banco (en el caso de los viales previamente descongelados) hasta la
dilucin 10-8 para sembrar de 10-4 a 10-8 y se incub por 24 horas a 37C. Por
ltimo, se verific pureza y se realiz el recuento posterior a la conservacin. El
recuento inicial fue de 29x10 13UFC/mL que represent el 100% de viabilidad.
Posterior a la conservacin se obtuvo que: Para -20C el recuento fue
25x1013UFC/mL (99,5% de viabilidad), para 7C el recuento fue 32x10 6UFC/mL
(51.8% de viabilidad) y para T ambiente, 26x10 1UFC/mL (16,7% de viabilidad).
Segn los datos de control interno podemos deducir que el mtodo de
conservacin fue efectivo en la temperatura de -20C ya que bajo esta condicin
no disminuy significativamente la viabilidad de la poblacin bacteriana a
diferencia de las dems temperaturas y la concentracin de glicerol no fue txica,
demostrando su efectiva accin como crioprotectante.
PALABRAS CLAVE: Conservacin, Crioprotectante, Glicerol, E.coli, Viabilidad,
Temperatura.
INTRODUCCIN
Los procesos biotecnolgicos requieren de mtodos de conservacin que
garanticen la viabilidad, la pureza y la estabilidad gentica de una o varias cepas
de inters. Los microorganismos pueden ser conservados para su posterior
estudio o utilizacin a travs de diferentes mtodos. La congelacin por ejemplo,
se ha convertido en la eleccin con ms ventajas y por ello es necesario
considerar los diferentes factores que estn implicados en este proceso: papel de
la membrana, estrs bacteriano, criopreservantes como el glicerol, y medios de
conservacin (Snchez et al, 2005). La congelacin bacteriana es un mtodo
fsico qumico que permite conservar microorganismos viables por un tiempo sin
sufrir cambios genotpicos. En este proceso se involucra el agua como

microambiente y es ella la que cambia su estado lquido a solido; por otro lado, la
bacteria inmersa en este medio debe adaptarse a las condiciones de este nuevo
ambiente, transformar la velocidad de su metabolismo, conservar su viabilidad y
evitar que los cristales de hielo formados por el cambio de temperatura del agua le
ocasione algn dao. En el proceso de adaptacin bacteriana inducido por la
congelacin, es significativa la reduccin en la velocidad metablica, a tal punto
que su metabolismo se hace imperceptible, pero suficiente para mantener el
microorganismo vivo y algunas de estas adaptaciones son : Produccin de
enzimas resistentes al frio, sistemas de transporte adaptados a bajas
temperaturas, aumento de la concentracin de cidos grasos en la cadena de
fosfolpidos de la membrana celular, esta ltima, para que contine el estado
semifluido de la membrana y evitar la congelacin. Entre los factores relacionados
con la adaptacin bacteriana al proceso de congelacin se encuentran: El
microambiente ya que la bacteria reconoce sus espacios favorables , los modifica
si puede, y se adapta o se aleja de ellos (Pettersson, 2003);la membrana
citoplasmtica, ya que acta como barrera esencial y el estrs bacteriano, que
condiciona los cambios de adaptacin en la bacteria y normalmente es un estado
transitorio que le permite tener condiciones de resistencia, situacin que finaliza
cuando las condiciones de estrs se eliminan; este estado genera una adaptacin
que incluye entrar en un periodo de latencia, donde la actividad enzimtica
disminuye notablemente e incluso podra decirse que se detiene (Mukamolova et
al, 2003). Segn lo mencionado en el artculo protectantes usados en la
criopreservacin, Las sustancias denominadas criopreservantes tienen
interaccin molecular con el agua, la cual evita la accin destructiva del
congelamiento sobre las clulas, evitando formacin de cristales de hielo con un
grado bajo de toxicidad para las clulas vivas (Hubalek Z, 2003). Entre las
sustancias ms utilizadas en la conservacin bacteriana a bajas temperaturas se
encuentran: macromolculas no proteicas, sustancias ricas en protenas, protenas
purificadas, y/o sustancias no ionizables de bajo peso molecular que evitan la
deshidratacin celular: glicerol, .sacarosa, lactosa DMSO (dimetilsulfoxido), entre
otros (5).El objetivo de la prctica fue elaborar y evaluar un BCP (Banco de Cepas
Primario) utilizando glicerol al 25% (v/v) como crioprotectante (Pedroza et al, 2007)

MATERIALES Y MTODOS

Microorganismo:
Escherichia coli: Se realiz una coloracin de Gram con el fin de confirmar la
pureza del cultivo.
1.

Determinacin de la poblacin inicial a partir de la cual se hizo el banco de cepas

de trabajo.
Se incub un cultivo de E.coli por 12 horas 150 rpm a 37C, siendo esta la
poblacin inicial para realizar diluciones seriadas de

10

hasta 10-8.Seguido a

esto, se sembr 0.1mL en agar BHI de forma masiva, de las diluciones 10 -4 hasta
10-8. Se incubaron las cajas por 24 horas a 37C, y se hizo recuento siguiendo las
normas establecidas para siembras en superficie.

2.

Elaboracin de un banco de clulas de trabajo.

Se mezclaron 2mL de suspensin con 2 mL de caldo de cultivo BHI con glicerol
50% (v/v), para obtener un volumen final de 4 mL, con una concentracin de
glicerol 25% (v/v), seguido a esto, se reparti este volumen en 3 tubos eppendorf
de 1.5 mL, solamente para la temperatura de -20C y se llevaron a congelacin.
Se realiz el mismo procedimiento en tubos de vidrio para la conservacin a
temperaturas de 7C y T ambiente.

3.

Pruebas de viabilidad y estabilidad aceleradas.

Se realiz el recuento de las cajas sembradas con el fin de determinar la
viabilidad, se descongelaron los viales, y a partir de estos y de los tubos evaluados
a las diferentes temperaturas, se realizaron diluciones seriadas 1/10 hasta 10 -8
para hacer la siembra en agar BHI de la dilucin 10 -4 a la 10-8 de forma masiva;
Se incub por 24 horas a 37Cy posteriormente se realiz el recuento.

RESULTADOS

En la tabla No.1 se muestra la morfologa microscpica observada al hacer la

coloracin de Gram con el fin de verificar que el cultivo utilizado para el
procedimiento era un cultivo axnico.
Tabla 1. Prueba de Pureza
Microorganismo Evaluado

Reporte de coloracin de Gram

Escherichia coli

Cocobacilos Gram negativos

En la tabla No.2 se reporta el recuento de la poblacin inicial a conservar

equivalente al 100% de viabilidad, previa a la preparacin del banco de trabajo.
Tabla 2. Poblacin inicial a conservar
Microorganismo

Recuento (UFC/mL)
29x1013

Escherichia coli

En el procedimiento realizado se obtuvo como resultado del laboratorio un reporte

de NO DATO, por lo cual se trabaj con los datos de control interno.
En la tabla 3 se muestran los datos de control interno donde se puede observar el
recuento y porcentaje de viabilidad obtenido luego de la conservacin para cada
una de las temperaturas evaluadas.
Tabla 3. Prueba de estabilidad acelerada Datos de control interno

Temperatura

Absorbancia

Rto
(UFC/mL)

Log
UFC

Porcentaje
de
viabilidad

-20OC

0.942

25x1013

14,4

99.5

7OC

0.356

32x106

7,50

51.8

Ambiente

0.149

26x101

2.41

16.7

En la figura 1 se muestra la disminucin de la viabilidad con respecto a la variacin

de temperaturas evaluadas siendo la temperatura ambiente la que presento mayor
perdida y temperatura de congelacin fue ms estable la viabilidad.

Figura 1. Porcentaje de viabilidad vs temperaturas evaluadas

DISCUSIN
El objetivo principal de la conservacin de cultivos microbianos es mantener al
microorganismo vivo, no contaminado y sin variacin o mutacin, en una condicin
lo ms cercana posible al aislamiento original. La crioconservacin o conservacin
a bajas o ultra bajas temperaturas permite detener los procesos metablicos y el
deterioro biolgico durante largos perodos, manteniendo la estabilidad gentica
del material crioconservado. Con este mtodo resulta muy importante el empleo
de crioprotectores, grupo heterogneo de sustancias de alta afinidad por el agua
que contribuyen a la supervivencia de la clula durante la crioconservacin. Los
crioprotectores disminuyen el punto de congelacin del sistema y reducen la
cantidad y el tamao de los cristales de hielo durante el enfriamiento,
contribuyendo a la proteccin fsica de las membranas y disminuyendo el
incremento de la concentracin inica producto de la congelacin del agua.
(Snchez et al, 2005)
Los resultados en el laboratorio no se tomaron como referencia para la discusin
ya que se inform ND (no dato) para la prctica experimental. Por esta razn se
analizaron los datos del control interno, donde se observaron diferencias entre las
tres temperaturas para la conservacin del microorganismo (Escherichia coli) a
corto plazo mediante la tcnica de congelacin. Entre las tres temperaturas, la
mejor para la conservacin E. coli utilizando glicerol al 25%(V/V) como agente
crioprotector fue a -20C, por tener un porcentaje de viabilidad del 99,5%,por esta
razn, se considera un mtodo de conservacin efectivo para mantener la
viabilidad de las clulas ya que detiene en su totalidad el funcionamiento del

metabolismo. Por ello en la criopreservacin bacteriana es indispensable

considerar el papel que juega la membrana citoplasmtica, ya que acta como una
barrera esencial y separa el interior con el exterior celular. (Bouachanh et all,
2005) para ello se utilizan agentes crioprotectante como el glicerol ya que es el
ms utilizado en microbiologa, porque penetra lentamente en la pared celular y
tambin en la membrana citoplasmtica; este agente, es altamente hidroflico, se
forman puentes de hidrgeno con el agua intracelular evitando as la
deshidratacin excesiva, reduce la toxicidad de la sal y previene la formacin de
grandes cristales de hielo dentro de la clula, dependiendo de la temperatura y el
tipo de las clulas para su conservacin (Van, Thevelein, 2003). Sin embargo, se
presentan algunas desventajas con este mtodo entre las cuales se encuentran la
muerte de los microorganismos a temperaturas por debajo de 0C, esto depende
de varios factores como: el nmero inicial de clulas viables, la tasa de
congelacin y descongelacin y la temperatura de congelacin siendo las
temperaturas de 0 a -20C, las ms destructivas para algunos microorganismos,
tiempo de almacenamiento y la presencia de protectores fsicos. Para conseguir
una mnima destruccin de las bacterias interesa que la cristalizacin sea
extracelular y que las bacterias se deshidraten parcialmente impendindose la
nucleacin intracelular, pero no lo suficiente como para que se reduzca su
viabilidad por se combina con el uso de agentes crioprotectantes (Bouachanh et
all, 2005).
Adems hay que tener en cuenta que la viabilidad del 99,5 %, se debe a que el
glicerol acta de mejor manera a bajas temperaturas porque no alcanza a penetrar
el interior de la clula,slo se adhiere a la clula como una capa protectora, por
ende esta temperatura es ideal para la conservacin de cepas en este medio.
Tambin puede deberse a que Escherichia coli
posee un regulador de
transcripcin, el CdpA, que reconoce los promotores del gen produciendo
protenas de choque frio, que estabilizan el mRNA de manera que pueda
reiniciarse la produccin de protenas, adems, dentro de la membrana de la
clula la composicin de los fosfolpidos y los glicolpidos cambia, ya que se
incrementa la cantidad de cidos grasos insaturados a expensas de los cidos
grasos saturados, formando una bicapa con los grupos principales polares en las
superficies intracelulares y extracelulares. Las cadenas acil del cido graso se
unen con los grupos metlicos terminales situados en el interior de la bicapa para
asegurar la funcin de la membrana tal como actividad enzimtica y transporte de
solutos (Beales, 2004).
Mientras que a temperatura ambiente y a 7C, la poblacin celular disminuye a
travs del tiempo en varias unidades logartmicas, debido probablemente a que el
metabolismo en ambas condiciones pudo acelerarse como efecto de la
temperatura, llevando a que la poblacin celular disminuyera, presentndose una
desnaturalizacin de las protenas y alteraciones producidas en las membranas
lipdicas, generando cambios en la barrera de permeabilidad .(Singlenton, 2004)

Las temperaturas de 7 y a temperatura ambiente se ve una gran disminucin de

la viabilidad de la cepa, debido a que entre ms alta sea la temperatura es ms
fcil para el glicerol penetrar en la clula, desplazando el agua que esta contiene y
por ende intoxicndola y termina matndola, por esta razn el porcentaje de
viabilidad disminuye notoriamente.

CONCLUSIN

A una concentracin de 25% de glicerol y a -20C de temperatura es posible

obtener un 99.5% de viabilidad lo que representa que la poblacin solo disminuye
en un ciclo indicando que el mtodo de conservacin en esas condiciones es
efectivo para un microorganismo como E.coli.

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