Elementosgenticosmviles

Transposones
Gentica1
2doCuatrimestre2010

Elementosgenticosmviles

Puedencambiarsulocalizaci
Puedencambiarsulocalizacinenelgenoma
Sedetectanporqueproducenanormalidadesenlaestructuraoactividaddelos
Sedetectanporqueproducenanormalidadesenlaestructuraoactividaddelos
genes
Importantesdesdeuncontextoevolutivo(generaci
Importantesdesdeuncontextoevolutivo(generacindediversidady
reorganizaci
reorganizacin/relocalizaci
n/relocalizacindegenes/exones/promotoresenelgenoma)
Importantesherramientasenbiotecnolog
Importantesherramientasenbiotecnologa

Rhoades: 1938
Lnea endocriada de maz con granos pigmentados
Aparece una mazorca con una relacin:

1948- Brbara McClintock propone la existencia de genes mviles

12 granos pigmentados

Pero antes ya se haban observado mutaciones inestables,

que revertan con cierta frecuencia (ms alta, por cierto)
Recuerden: Mendel = 1965, redescubierto en 1902

3 granos punteados

Las mutaciones inestables obedecen a las leyes de Mendel?

1905 De Vries, la tendencia a la variegacin en Antirrinum majus es heredable
1910 Correns, observa en Mirabilis jalapa que mutaciones variegadas a
coloreadas se comportaban en forma mendeliana
1911 Hayes observa lo mismo en maz

1 incoloro

Hiptesis de Rhoades: 1938

2 loci

Rhoades lo razona correctamente

9A- Dt3A- dtdt

3 aa Dtdt

aa dtdt

A = grano pigmentado
a = grano incoloro (mutacin recesiva)
Dt= produce efecto variegado
dt= no produce efecto variegado

El tamao del sector depende del momento de la reversin

(si es temprana o tarda en el desarrollo) y el nmero de
sectores depende de la frecuencia

Razon que las reversiones en la lnea germinal deberan ser

heredables y lo teste

50%

50%

Barbara McClintock, Premio Nobel 1983

Observ el efecto de roturas cromosmicas en el

cromosoma 9 de una lnea de maz

1940s:
Observ cambios en la expresin de
genes lindantes, por lo cual los llam
controlling elements, elementos
controladores, porque dedujo que
regulaban la expresin gnica

1920s: Establece una disciplina: la citogentica del maz.

Establece los 10 cromosomas y asocia los grupos de
ligamiento a cada cromosoma.
1935-1941: Mapeo gentico con maces irradiados; observ
los Ring chromosomes
Describi el ciclo breakage-fusion-bridge

Describi el ciclo breakage-fusion-bridge

1948- Propuso que el chromosome-breaking

locus puede moverse de un lugar al otro del
genoma. Concluy adems, que dicho locus, Ds
(dissociator) era regulado por otro, Ac (activator)

En ese momento se hacan mapas

genticos y por lo tanto, se crea que los
genes estaban estticos,
La idea fue revolucionaria y poco
aceptada.
Por eso el premio nobel le lleg casi 40
aos ms tarde

normal

incolora

manchas de
pigmento

Locus Ac promueve
transposicin de Ds

El elemento Ds no es autnomo, se activa

nicamente en presencia de otro elemento
llamado Ac.
Ds puede producir delecin

Locus Ac promueve su
propia transposicin
(autnomo)

Ac controla el movimiento de Ds, por eso

McClintock llam al sistema Ac-Ds
ELEMENTOS CONTROLADORES de maz
Ac tambin es un elemento mvil

Hoy podemos explicar estos eventos en

trminos moleculares

Escisin

Al producirse la escisin
puede (o no)
restablecerse la unin
cromosmica

Posteriormente se describieron otros

transposones en maz

Las familias de transposones estn compuestas

por elementos autnomos y no autnomos

Controversias que el sistema de maz no poda

aclarar
1960s gentica bacteriana

Cmoseencontraron?
promotor galactoquinasa transferasa epimerasa

Opern gal

mRNA

Contexto: se saba la naturaleza del material hereditario, el cdigo gentico y

secuencias limitadas, todava no estaban desarrollados los mtodos de
secuenciacin pero la gentica molecular de bacterias avanzaba rpidamente
(recuerden, opern lac, fagos, etc)

Mutacin polar
Reversin: 10-5!

Los avances con el maz se habian estancado a falta de suficientes herramientas

moleculares
A fines de los 60 se encuentran las IS (insertion sequences). Primero se
encontraron mutaciones polares (se comportaban como deleciones) pero que
tenan frecuencias altas de reversin)

gal+

gal-

::IS1

Hibridacin con gal y 7 lugares ms!

Las dos formas del fago pueden distinguirse

y separarse por densidad
dgalMutante polar

Desnaturalizar y
renaturalizar

dgal+

Desnaturalizar y
renaturalizar

Elementos IS (Insertion sequence)

Interrumpan genes pero las mutaciones podan revertir y eran muy
polares!
Estn normalmente presentes en cromosomas y plsmidos
Unidades autnomas: son los transposones ms simples
Estructura general:
Secuencias invertidas en sus extremos
Duplicacin de una secuencia del sitio blanco: flanqueado por
secuencias directas repetidas (9bp)
La transposicin implica siempre ruptura endonucleoltica de la unin
fosfodiester y la transferencia de estos residuos a una molcula blanco
COMPLEJO
NUCLEOPROTEINA

-TRANSPOSASA
-EXTREMOS DEL TRANSPOSON
-ADN BLANCO

Caractersticas de las IS

Esquema del
mecanismo de
transposicin de
las ISs

Transposones compuestos (Tipo I)

Transposasa

Resistencia a antibiticos

Los transposones compuestos contienen regiones centrales flanqueadas por ISs.

Los IS pueden estar en la misma direccin o no.

Transposonescompuestos

Ejemplos de Transposones compuestos:

evolutivamente

Transposicin desde los extremos de afuera

Transposicin desde los extremos de adentro

Tiene consecuencias muy
diferentes:

Cuando la transposasa acta

sobre las secuencias invertidas
ms lejanas, los dos IS van a
transponer como una unidad,
llevando consigo los genes
entre ellos.
Normalmente una de las transposasas es inactiva.

Secuencia repetida del blanco

Se puede crear otro transposn

Se pueden producir deleciones e
inversiones cuando el ADN blanco es
cercano
Ejemplo:
1) Una bacteria permisiva que alberga el
plsmido dador que contiene el transposn
(ver figura), se infecta con un fago lambda
que tiene mutaciones ambar en los genes de
replicacin.
2) Con la progenie se infecta una bacteria NO
permisiva. Si se obtiene una 2da progenie
quiere decir que transpuso el elemento
nuevo (si hay placas)

PlsmidosR
La inestabilidad del ADN inducida por
transposones compuestos es causada por
transposicin desde los extremos de adentro

Ensamblaje de elementos IS: Plsmidos R

Mecanismo de los
transposones compuestos:

Transposicin no
replicativa
Ejemplos:Tn5 Tn10 Tn9

PlsmidosR
plsmidosconjugativosde
resistencias
compuestosporvariosTn/IS
ejemplo:R100(90kb):lleva
variosgenesderesistencia,
puede transferirseentre
bacteriasentricas

Caractersticas del mecanismo:

Corte y pegado del transposn
Corte doble cadena en el ADN dador
Duplicacin de un pequea secuencia en el ADN
aceptor
Degradacin del dador
Evidencias de una transposicin no replicativa:
No se forma un co-integrado, no poseen resolvasa
(No existen mutantes que acumulen un cointegrado)
Deja una sola copia del transposn en la clula
No se aislaron revertantes (el dador no se re-sella)

Transposones tipo II (o no compuestos)

Mecanismode
transposicindel
Tn5
Ruptura de ADN doble
cadena en el ADN
dador:

OE: outside
end
IE: inside
end

Complejo
Sinptico

res
Transposicin
autorregulada

Transferencia de cadena

La unidad mnima transponible contiene el gen de

resistencia, la transposasa, la resolvasa y la regin res (por
resolucin)

Ejemplos de transposones tipo II

Ensayos para medir la transposicin

1)Vectores
suicidas:
Fagos
suicidas
Plsmidos
suicidas

2)Ensayo de conjugacin:
Ensayo de mating out

Plsmido no se
transfiere por si
mismo y no es
movilizable

Confirmacin
por mapeo de
restriccin

Plsmido transferible

Mecanismo de transposicin de transposones tipo II

Transposicin replicativa
Ejemplo: Tn3
La Transposasa: es responsable de la ruptura
de las uniones y de las ligaciones
Observaciones:
Una secuencia corta del ADN blanco se duplica
Se forma un co-integrado (fusin del dador y aceptor con
2 copias del tn)
Resolucin del co-integrado en la secuencia res: acta
adems de la transposasa, una resolvasa que resuelve el
co-integrado
Ambos (dador y aceptor) terminan con una copia del Tn

Latransposasaylaresolvasa
TnpA se une a las IR e inicia la
transposicin.
TnpR se une a la secuencia res del
transposon duplicado, reprime tnpA y
tnpR, y resuelve el co-integrado en los
sitios res por recombinacin sitioespecfica
.

Pasos en la
transposicin:
1.

Corte simple cadena a

ambos lados del tn.
Corte doble cadena en
el aceptor (extremos
cohesivos--responsables de la
duplicacin del ADN
blanco).

2.

El extremo 5 del
aceptor se liga al 3 del
tn

3. Ocurre la replicacin
en las 2 direcciones
(desde los extremos
3del aceptor:
primers)
4. Ligacin del los 3 del
aceptor con los 5
libres del tn (por la
transposasa):
formacin del cointegrado
5. Resolucin del cointegrado
(recombinacin sitio
especfica) en res
por la resolvasa

Diferencia entre ambas

transposiciones:
Nro de sitios de corte en los
extremos del transposn.
Una evidencia contundente:
Si se muta la transposasa del
transposn Tn7 (no replicativo) de
manera que induce slo un corte en
cada extremo del transposn (un
solo cambio de aa)
Se convierte en una transposicin
replicativa!!!

Regulacin de la transposicin

Regulacin de la transposicin

-Transponen poco frecuentemente: 10-8

-Altamente regulables

Regulacin por ARN antisentido

Regulacin por metilacin

Mecanismos descriptos en la regulacin de transposones:

Menor expresin de tnp

Inhibicin de la traduccin del mRNA de la transposasa tnp
Inestabilidad del mRNA de tnp
Inhibicin de la actividad de Tnp
La transposasa slo acta en cis
La transposasa slo es activa como multmero

RegulacindelTn10
Regulacin por metilacin del DNA

Transposasa(IS10R)acta
preferencialmetneencis,limitalafrecuenciade
transposicin

RegulacinporARNantisentido:
30vecesmayorexpresindeesteARN(Pout/Pin).

MetilacinDam:
LahemimetilacinenGATCactivaelpromotordela
transposasa(Pin)ylaunindelatransposasaalos
extremosdelosIS10;lametilacincompletabloqueala
transposicin
.

Disgnesis hbrida
mediada por
elementos P

Disgnesis hbrida
mediada por
elementos P

La transposicin de los elementos P ocurre slo en la

lnea germinal por una regulacin post-transcripcional
Repeticiones
invertidas
intactas
Gen de
transposasa
eliminado

Plsmidos suicidas (no tienen

capacidad de replicacin en
moscas) expresin transitoria de
la transposasa

Repeticiones invertidas
eliminadas
Gen de transposasa
intacto

Expresin de lacZ

Retrovirusyretrotransposones

Retrovirus

Retrotransposones

El mecanismo explica las dos bases que se pierden del virus y

las duplicaciones en el husped

Los retrotransposones Ty de levaduras

Ciclo simplificado de un retrotransposon

El splicing y la duplicacin
de la mutacin son
evidencias de la forma de
replicacin

Otros retrotransposones (o retroprosones) no tienen LTRs*

Pero siguen teniendo transcriptasa reversa

Transposonesenelgenomahumano

Pueden constituir una parte importante del genoma

Recapitulando

Clase II

Compuestos
No compuestos
Secuencias Alu de humanos (300 pb),1.000.000 de copias, ocupan el 10%
del genoma

Gen de la hogentisato 1,2-dioxigenasa (alkaptonuria)

Clase I

Consecuenciasdela
transposicin

Exon shuffling

Generacindediversidadgentica(juntoamutaciones)
Transmisinhorizontaldenuevosgenes(particularmente,perono
nicamente,enbacterias)
Especiacin?
Reordenamientosgenmicos(deleciones,inversiones,duplicaciones)
Relocalizacion desecuencias(exon ygeneshuffling)
Promovernuevossistemasderegulacindelaexpresingnica

Mediado por
transposasa

UsodeloselementosMvilesen
Biotecnologa
Mutagnesisporinsercin(knock out)
Clonadoposicionaldegenesoetiquetadode
genes (genetagging)
Estudiodesecuenciasreguladoras
Transformacingenticadeinsectos
Terapiagnica

TERAPIA GNICA:
Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) United States
Patent 6,489,458; Hackett , et al. December 3, 2002; DNA-based
transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of
a cell. The adenoviral vector, flanked by inverted terminal repeats
(ITR), contains a Sleeping Beauty transposon (yellow bars indicate
transposon terminal repeats). Flanking the transposon with Flp
recognition target sequences (FRT, blue triangles) and expression
of Flp recombinase results in circularization of theSleeping
Beauty substrate. These circular donor molecules undergo
transposition, resulting in insertion of the transgene into the host
genome.

The image shows transgenic mice that carry the piggyBac

transposon that has caused their cells to express red fluorescent
protein. (Credit: Howard Hughes Medical Institute (HHMI), Yale
University).

Aplicaciones de los transposones

Etiquetado ypesca degenescontransposones

Transposn Tn 5 de E. coli

Enhancer trap
activation tagging

Conjugacin con Rhizobium y transposicin desde el plsmido suicida al genoma

Promotor especifico de anteras

gen nif
expresa
nitrogenasa

Rhizobium nif+ (fijadora)

Sonda de Tn 5 (etiqueta para identificacin

de clones con genes nif )
gen nif
mutado no
expresa
nitrogenasa

Obtencin de mutantes dominantes

mutante nif(no fijadora)

Aislamiento DNA y corte con

ER
Confeccin de genoteca de Rhizobium nif- y plaqueo

Rescate del plsmido o plasmid rescue

Cortes con enzima de restriccin

AmpR

p
Am

Ori

Or
i

secuenciacin

ADN genmico adyacente