LABORATORIO DE BIOQUMICA

PROFESORA CLAUDIA SAAVEDRA SNCHEZ

INTRODUCCIN
SOLUCIONES
Una solucin es una mezcla homognea de dos o ms componentes. El
componente que esta en mayor proporcin se llama solvente y el o los
componentes que estn en menor proporcin se llaman solutos. En soluciones
lquidas, el solvente es un lquido, mientras que los solutos pueden ser slidos,
lquidos o gases. La gran mayora de las soluciones usadas en bioqumica son
soluciones acuosas (solvente agua). Para caracterizar una solucin no basta con
indicar sus componentes sino que tambin la proporcin en que estos estn
presentes en la solucin, es decir, la concentracin de cada uno de los solutos en
la solucin.
UNIDADES DE CONCENTRACIN
Las ms usadas en la prctica son de dos tipos:
Unidades de concentracin referidas a volumen: indican cantidad de soluto
disuelto por unidad de volumen de solucin.
Ejemplo: la molaridad, la normalidad, porcentaje p/v, g/l, etc.

Unidades de concentracin referidas a peso: indican cantidad de soluto

disuelto por unidad de peso de solucin o de solvente.
Ejemplo: % p/p, molalidad.

1. Molaridad (M): nmero de moles de soluto por litro de solucin.

Para preparar una solucin de molaridad dada es necesario conocer el peso
molecular (PM) del soluto.
Peso soluto (g) = nmero de moles de soluto PM ( g/mol)
M = moles de soluto / volumen de solucin (L) (1)

Ejemplo: Una solucin 1 M ( 1 molar) de NaCl contienen 1 mol (58.44 g) de NaCl

por litro. Un mol de NaCL corresponde a un valor igual al nmero de Avogadro de
molculas, que es 6.023 x 1023. La concentracin de iones en solucin tambin se
indica en unidades molares, en este caso el in es la molcula.
Ejemplo: Consideremos la solucin 1 M de NaCl. Los enlaces inicos de la red
cristalina de cloruro de sodio se rompen al disolverse la sal.

NaCl

Na+ + Cl -

Por cada mol de NaCl slido se form 1 mol de Na+ y 1 mol de Cl- .
Luego:
Concentracin de Na+
= 1 mol
Concentracin de Cl = 1 mol
Ejemplo: Para molculas distintas, como MgCl2
MgCl2

Mg+2 + 2 Cl-

Una solucin de cloruro de magnesio 1 M contiene:

Concentracin de Mg+2
Concentracin de Cl -

= 1 mol
= 2 mol

La concentracin de soluciones diluidas se suele expresar en unidades que son

submltiplos de M:
1 Milimolar (mM) significa : 1 mmol en 1 L de solucin
( 1 mmol = 10-3 moles)
1 Micromolar (M) significa : 1 mol en 1 L de solucin
(1 Mol = 10-6 moles)
1 Nanomolar (nM) significa : 1 nmol en 1 L de solucin
(1 nMol = 10-9 moles)
1 Picomolar (pM) significa : 1 pmol en 1 L de solucin
(1 pMol = 10-12 moles)

2. Normalidad: Nmero de pesos equivalentes (PE) de soluto por litro de

solucin. Solamente para algunos compuestos se define un Peq y este siempre
tiene relacin con la reactividad del compuesto.
En general : Peq = PM / n
Para cidos y bases n = nmero de protones que puede ceder (el cido) o captar
(la base) por molcula.
Para compuestos que sufren reacciones redox n = N de electrones captados
(agente oxidante) o cedidos (agente reductor) por molcula.

3. Peso de soluto / volumen de solucin en g/l, mg/l, etc.: es la forma ms

sencilla de indicar la concentracin de una solucin es la forma ms usual,
adems de la molaridad.
4. Porcentaje peso / volumen (% p/v) : peso de soluto en gramos por 100 ml de
solucin (% g). Se habla de porcentaje, ya que 100 ml de una solucin acuosa
relativamente diluda pesan aproximadamente 100 gr. Para soluciones muy
diludas se usa el submltiplo mg % = peso del soluto en mg por 100 ml de
solucin.
5. Porcentaje peso / peso ( % p/p): peso en gramos de soluto por 100 gramos
de solucin. La concentracin de la mayora de los cidos comerciales viene
dada en % p/p. Aqu la proporcin de soluto puede ser mayor que la proporcin
de solvente.
Ejemplo: H2 SO4 al 96%. Para transformar % p/p a concentracin molar o
normal es necesario conocer la densidad de la solucin.
Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial de 28 % densidad 1.15 (kg. /
L).
1. Calculamos cuanto pesa un litro de la solucin:
1 L x 1.15 ( kg. / L) =1.15 kg. = 1.150 g.
2. Ahora calculamos el peso de HCl ( HCl puro ) contenido en este litro: 100
g de solucin contienen 28 g., 1.150 g. de solucin contienen:
1.150 g. x 0.28 = 322 g.
3. Finalmente, calculamos a cuantos moles corresponde este peso de HCl:
322 g. / 36.5 (g. / mol) = 8.82 moles
Hemos calculado que el litro del cido comercial contiene 8.82 moles de HCl, es
decir, es 8.82 M.
6. Molalidad (m): nmero de moles de soluto por 1000 g de solvente. Esta
unidad de concentracin se usa solamente para ciertos clculos fsico
qumicos. Expresar la concentracin en estas unidades presenta la ventaja de
que se hace independiente de la temperatura. Al contrario, una concentracin
expresada en unidades referidas a volumen, como la molaridad, vara con la
temperatura, ya que esta afecta el volumen. En soluciones acuosas diluidas m
es prcticamente igual a M.

PREPARACIN DE SOLUCIONES
Para preparar una solucin de un soluto dado se puede usar el soluto puro
(generalmente slido) o una solucin concentrada de l en el mismo solvente
(solucin stock). Este ltimo caso constituye una dilucin.
Para diluciones rige la relacin:
V1 x C1 = V2 x C2 (balance de masa soluto)
V1= volumen de la solucin concentrada
C1= concentracin de la solucin concentrada
V2 =Volumen de la solucin diluda
C2 = concentracin de la solucin diluda
C1 y C2 pueden ser unidades de concentracin de cualquier sistema referido a
volumen.
Ejemplo: En un matraz aforado de 100 ml se colocaron 10 ml de una solucin 2M
de cloruro de sodio y se afor con agua.
Cul ser la concentracin de la solucin resultante?
Nuestro sentido comn nos dice que la respuesta ser 0.2 M, ya que la solucin
se diluy 10 veces. El clculo segn la relacin dad sera:
C2 = V1 x C1 / V2 = 10 ml x 2M / 100 ml
10 ml x 2M = 100 ml x XM
donde X = 0.2 M

II pH Y TAMPONES
CIDOS Y BASES
De acuerdo a la definicin de Bronsted:
1. CIDO: es un compuesto que tiende a ceder protones al medio.
2. BASE: es un compuesto que tiende a captar protones del medio.
En medio acuoso, la reaccin correspondiente de un cido HA ser:
HA + H2O

H3O + A-

U obviando la participacin del agua:

HA

H+ + A-

(1)

Considerando esta reaccin en el sentido inverso, la especie A- puede captar

protones. A- es la base conjugada de HA. Similarmente para una base B:
B + H+

BH+
(2)
BH+ es el cido conjugado de B.
Ejemplos de bases segn Bronsted: los compuestos orgnicos bsicos que deben
su basicidad al grupo funcional amino.
FUERZA DE CIDOS Y BASES
Un cido o una base fuerte es el que esta completamente disociado en solucin.
En cambio en cido dbil esta solamente parcialmente disociado y la base
parcialmente protonada.
cidos fuertes: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4 (solamente el
primer protn que se disocia).
Bases fuertes: NaOH, KOH, etc.
cidos y bases dbiles: prcticamente todos los cidos y bases orgnicos
pertenecen a este grupo.
CIDOS Y BASES DBILES
a. CIDOS DBILES
Consideramos a modo de ejemplo el cido actico, HOAC.
Frmula estructural: CH3 - COOH
Este cido dbil posee un solo protn cido. En solucin acuosa coexisten en
equilibrio molculas de la especie protonada con molculas del anin acetato
(Oac-) y protones.
La relacin entre la concentracin de las especies nombradas a una temperatura
determinada est dada por la constante de equilibrio de la reaccin de disociacin,
llamada constante de acidez, Ka:
HOAc

OAc-

Ka = [ OAc- ] [ H+ ] / [HOAc ]

H+

(3)

(4)

Ka del cido actico a 25 C: 1.78 x 10-5

Se suele expresar la acidez a travs del pKa en vez de usar Ka:
pKa = - log Ka
Ka de HOAc (25 C) = 4.75
Con el fin de comprender mejor el significado de la constante de acidez
calcularemos la concentracin de las especies presentes en una solucin 0.1 M de
HOAc.
Segn la ecuacin 3
[ H+ ] = [ OAc ] = x
[HOAc ] = 0.1 - x
El valor numrico de Ka indica que HOAc estar poco disociado, por lo tanto es
lcito efectuar la siguiente aproximacin:
[HOAc ] =

0.1

reemplazando en la expresin de Ka ( ver recuadro) (4)

Ka = x2 / 0.1 = 1.78 x 10-5
X = 1.33 x 10-3 M
Es decir, en nuestra solucin: la [HOAc ] es virtualmente 0.1 M, en tanto que la
concentracin de [OAc- ] y de [ H+ ] es 1.33 mM.
Una vez conocida la concentracin de H+ se puede calcular el pH de una solucin
de cido actico 0.1 M empleando la siguiente frmula:
pH = - log [H+]
Por consiguiente, el pH de esta solucin ser a igual a log (1.33 x 10-3), vale
decir pH = 2.88.
b. BASES DEBILES
Para Una base dbil B se puede definir tambin una constante. En este caso, la
llamada constante de basicidad Kb

Kb = [ BH+ ] / [ B ] [H+ ]

(5)

Sin embargo, lo usual es caracterizar las bases dbiles a travs de la constante de

acidez de su cido conjugado BH+ ( invirtiendo la reaccin 2 ).
Para un par cido / base conjugada se cumple:

Ka x Kb = Kw
Siendo Kw = constante de disociacin del agua
Kw = [H+ ] [OH- ] = 10-14 ( 25 C)
ECUACIN DE HENDERSON HASSELBACH
En forma anloga a lo visto para el cido actico ( HOAc), se puede generalizar
para un cido dbil que denominaremos HA:
Ka = [A- ] [H+ ] / [HA ]
Despejando H+ y aplicando log se obtiene la ecuacin de Henderson Hasselbach

pH = pKa + log [ A- ] / [ HA ]

(6)

Esta ecuacin establece la relacin entre pH, el pKa y la proporcin de la especie

protonada (HA) y la desprotonada ( A- ). Se usa para calcular el pH de la mezcla
de un cido dbil con un cido fuerte o una base fuerte de un cido dbil con su
sal, mezclas tampn, etc.
SOLUCIONES TAMPN
Cuando se titula una solucin de HOAc con una solucin de una base fuerte
(NaOH), midiendo el pH despus de cada adicin se obtiene el siguiente grfico,
llamado curva de titulacin :
14

zona
tam ponante

0
punto de equivalencia

m l NaOH

Se aprecia que en un rango de pH alrededor de 4.75 (pka) el pH vara muy poco

durante la adicin de base, se trata de la zona tamponante del par HOAC / OAc- .
8

Las 3 reacciones involucradas son:

1. NaOH
2. OH- + H+
3. HOAc

Na+ + OHH2 O
OAc- + H+

La suma de las dos primeras reacciones hace disminuir la concentracin de

protones en la solucin. Sin embargo, la tercera reaccin simultneamente repone
parte de los protones neutralizados. El equilibrio de disociacin de HOAc se
desplaza hacia la formacin de acetato.
Para:
pH = pKa ocurre que HOAC = OAc- (verifique esta aseveracin)
A medida que la concentracin de la especie protonada HOAc en la solucin se
hace pequea, el pH comienza a aumentar ms fuertemente, hasta que la
solucin pierde su caracterstica de tampn.
Al titular una solucin bsica que contiene el anin acetato con un cido fuerte se
observa el mismo fenmeno. Estaramos recorriendo nuestra curva de derecha a
izquierda.
Solucin tampn (solucin amortiguadora o buffer): es una solucin cuyo pH se
mantiene prcticamente constante cuando se le agregan pequeas cantidades de
cido o base. Las soluciones tampn son sistemas formados por un cido dbil y
su base conjugada o por una base dbil con un cido conjugado.
Rango de un sistema tampn: es el rango de pH en el cual el sistema posee
propiedades de tampn, esta dado por el pKa de la especie protonada. Un tampn
es bueno aproximadamente 0.5 unidades de pH alrededor del pKa. Los valores
de pKa para algunos tampones de uso comn en bioqumica estn contenidos en
la tabla 1. Tambin se usan mezclas de dos diferentes sistemas tampn,
ejemplos: tampn tris / fosfato, trienolamina / dietalamina, etc.
Capacidad de una solucin tampn: la capacidad de una solucin tampn indica la
cantidad de cido o de base que es capaz de absorber sin cambiar fuertemente su
pH y depende de:
1. pH: es mxima para pH = pKa
2. Concentracin: a mayor concentracin, mayor capacidad tamponante.

TABLA 1
COMPUESTO

pKa (20 C)

cido fosfrico (pKa 1)

1.96

Glicina

2.45

cido ctrico (pKa 1)

3.1

cido frmico

3.75

cido actico

4.75

cido ctrico (pKa 2)

4.75

cido ctrico (pKa 3)

5.40

MES (cido conjugado)

6.15

Imidazol (cido conjugado)

7.00

cido fosfrico (pKa 2)

7.21

HEPES (cido conjugado)

7.55

Trietanolamina (cido conjugado)

7.77

TRIS (cido conjugado)

8.08

cido fosfrico (pKa 3)

12.30

SELECCIN DE UN TAMPN
Para la seleccin de un sistema buffer adecuado se deben considerar las
siguientes variables:
a. El pH al cual deseamos trabajar
b. La capacidad tamponante requerida
Otros aspectos importantes a considerar son:
c. Solubilidad de los compuestos

10

d.
e.
f.
g.

Ejemplo: una desventaja de los buffer de fosfato es la baja solubilidad de

sus sales.
Variacin del pH con la temperatura
Ejemplo: una desventaja de los tampones de Tris es que su pH vara
notoriamente con la temperatura.
Volatilidad: algunos sistemas tampn presentan la desventaja de ser
voltiles.
Ejemplo: acetato de amonio, bicarbonato de amonio.
Transparencia a la luz U.V. : cuando se desea detectar un compuesto por
absorciometra, es necesario usar un buffer que sea suficientemente
transparente (que no absorba) a al longitud de onda de la determinacin.
Interacciones: entre el sistema tampn sobre la actividad de determinada
enzima.

Observacin: la concentracin de un buffer es la suma de las concentraciones de

la especie protonada y de la especie desprotonada.
Ejemplo: se desea preparar un litro de buffer acetato 0.1 M de pH = 4.60 a partir
de cido actico 2 M y acetato de sodio. La ecuacin de Henderson Hasselbach
permite calcular la razn de las concentraciones de HOAc y OAc- necesaria para
que el pH de la solucin sea igual a 4.60:
pH = pKa + log [ OAc- ] / [ HOAc ]
Reemplazando el pka de HOAc y el pH:
4.60 = 4.75 + log [ OAc- ] / [ HOAc ]
log [ OAc- ] / [ HOAc ] =
Por otra parte:

- 0.15 lo que implica : [ OAc- ] / [ HOAc ] = 0.708

[ HOAc ] + [ OAc- ] = 0.1

(todas las concentraciones en concentracin molar, M)

[ HOAc] = 0.1 - [ OAc- ]
Remplazando [ HOAc ] = 0.1 0.708 x [ HOAc]
[ HOAc ] = 0.0585 M y por
Resolviendo
consiguiente,
[ OAc- ] = 0.0415 M

En consideracin a que se desea preparar un volumen igual a un litro, se

necesitan 0.0415 moles de acetato de sodio.
11

NaOAc : PM = 82 lo que implica que 0.0415 moles = 3.4 g.

HOAc : se aplica la relacin de las diluciones
V1 = 1 L x 0.0585 M / 2 M = 0.0293 L = 29.3 ml
Preparacin de la solucin: en un matraz aforado de 1 litro se colocan 3.4 g. de
acetato de sodio ms 29.3 ml de HOAc 2 M y se afora con agua destilada.
FOTOMETRIA : ABSORCIOMETRIA
MONTAJE DE UNA TCNICA FOTOCOLORIMETRICA
Principios de absorciometra de UV / visible
La absorciometra aprovecha la propiedad de ciertos compuestos de absorber
radiacin electromagntica.
Los diferentes tipos de radiacin electromagntica: rayos X, luz ultravioleta (UV),
luz visible, luz infrarroja, ondas de radio. Etc., se propagan a la misma velocidad,
pero difieren en longitud de onda y frecuencia. Para estas radiaciones se cumple
la siguiente expresin matemtica.
c = velocidad de la luz en el vaco
= longitud de onda
= frecuencia

c = x

El ojo humano detecta la radiacin en un rango de longitudes de onda de 400 a

800 nm, llamada luz visible ( 1 nm = 10-9 m ).
La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la energa
necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital molecular de
menor energa a otro de mayor energa de ciertos compuestos, llamados
cromforos. Las sustancias coloreadas absorben luz visible, su color corresponde
a la radiacin no absorbida: la luz solar es blanca, ya que contiene radiacin de
todo el espectro visible, adems de otras radiaciones.
LEY DE LAMBERT - BEER
La ley de Lambert Beer es la ley fundamental de la absorciometra, ya que
relaciona la absorcin de la luz con la concentracin de las soluciones.
Consideremos un haz de luz monocromtica (luz de una solo longitud de onda)
que atraviesa una solucin de un compuesto contenido en un recipiente de vidrio.

12

El siguiente esquema ilustra la situacin:

Solucin conc. c
I0
-------------------------------->
Luz incidente

I
----------------------------->
Luz transmitida
b

I0.: intensidad de haz incidente

I : intensidad de haz transmitido
b: camino ptico
Si el compuesto absorbe a una longitud de onda dada, I es menor que I0 . Cuanto
mayor es el nmero de molculas de este cromforo encontradas por el haz de luz
en su camino, menor ser la intensidad de la luz transmitida. Dicho nmero de
molculas depende de la distancia recorrida a travs de la solucin (camino
ptico) y de la concentracin. La relacin entre estos parmetros esta dada por la
ley de Lambert Beer :
I = I0 x 10-

bc

(1)

La forma de esta ley que se usa en la prctica es mas sencilla y se obtiene

aplicando logaritmos y reordenando:
Log I0 / I = bc

Se define como absorbancia (A) de la solucin:

A = Log I0 / I

(2)

Luego:
A = bc
(3)
Ley de Lambert - Beer
Por conveniencia se usa el siguiente sistema de unidades:
b = camino ptico en cm.
c = concentracin en M
= coeficiente de extincin molar, en cm-1 x M-1

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El coeficiente de extincin molar, , a una longitud de onda dada es una

caracterstica propia del cromforo y representa la probabilidad de que el
cromforo absorba la radiacin. Para explicar el significado de se suele sealar
que es igual al valor numrico de la absorbancia que tendra una solucin 1 M del
cromforo si el camino ptico es igual a 1 cm. Es importante recalcar el carcter
hipottico de esta afirmacin, ya que normalmente no es posible preparar
soluciones de concentracin 1 M de los cromforos ( si el PM es alto, 1 M es una
concentracin extremadamente alta), y por otra parte el orden de la magnitud de
los corresponde a valores muy superiores al rango de absorbencias medibles en
la practica. Los coeficientes de extincin pueden tomar valores hasta 1000.000 cm
1
M-1 e incluso mayores.
La ley de Lambert Beer indica que la absorbancia a una dada aumenta en
forma lineal con la concentracin (con b = cte.), mientras que la transmitancia
disminuye en forma exponencial:

pendiente = 1

T = 10- cb

C
C

Figura N 1

El grfico de la absorbancia de un cromforo en solucin en funcin de la longitud

de onda se denomina espectro de absorcin o espectrograma de absorcin.
Un espectro de absorcin se obtiene variando para b y c constantes, y por lo
tanto representa la variacin de A con (segn (3) ).
En la figura N 2 se muestra el espectro de absorcin de la riboflavina.
10

Figura N 2 espectro de absorcin de riboflavina(en fosfato de sodio, pH 7.0)

14

El espectro de absorcin de UV/ visible es caracterstico para un cromforo

determinado, por lo tanto se puede usar para su identificacin. Las caractersticas
espectroscpicas se pueden resumir indicando la posicin de los mximos de las
bandas de absorcin ( mx ) con los correspondientes. Por ejemplo, para
riboflavinas a pH 7.0:
mx.
266
373
445

( M-1 cm 1)
31.800
10.400
12.500

La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su nica banda en la regin del
visible a 445 nm, corresponde a absorcin de luz azul.
INSTRUMENTOS DE MEDICIN
Los componentes bsicos de todos los instrumentos que se usan en
absorciometra de UV / visible son:

Fuente de luz
Filtros o monocromador, que permite seleccionar la longitud de onda.
Portador de muestra
Detector
Dispositivo que permite la lectura de la medida directamente o inscriptor

Se pueden distinguir dos tipos de instrumentos:

a. Fotmetros de filtro: la seleccin de la longitud de onda se realiza mediante
filtros intercambiables.
b. Espectrofotmetros: poseen un monocromador; son ms sofisticados que los
fotmetros de filtro. Por otra parte se distinguen instrumentos que operan en el
rango visible solamente y otros que abarcan el UV y el visible (tiene 2 fuentes
de luz ).

15

LA FUENTE DE LUZ
No existe una fuente de luz que proporcione radiacin de todo el rango espectral
UV / visible de suficiente intensidad, por consiguiente, se usan fuentes diferentes:
Fuente de luz visible: lmpara de tungsteno. Sirve para
aproximadamente.

340 850 nm

SELECCIN DE LA LONGITUD DE ONDA

FILTROS
No proporcionan luz realmente monocromatica, sino que permiten el paso de un
cierto rango de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda mxima
transmitancia del filtro.
MONOCROMADORES
Poseen un elemento dispensor, que puede ser un prisma o una red de distraccin.
El elemento dispensor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un
sistema de espejo permite dirigir el haz de luz de la longitud de onda deseada
hacia la ranura de salida.
Al cerrar ms la ranura aumentar la monocromaticidad de la luz, pero siempre
pasara un cierto rango de longitud de onda.
En la prctica se considera que un espectrofotmetro opera con luz prcticamente
monocromtica. La calidad de un espectrofotmetro depende en parte importante
de esta caracterstica.
Un monocromador permite variar la longitud de onda en forma continua, condicin
necesaria para obtener espectros de absorcin. Con un fotmetro de filtro no es
posible obtener espectros de absorcin.
PORTADOR DE MUESTRA
All se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra de referencia. Las
cubetas son de vidrio o plstico (para el visible) o cuarzo (para el UV).
DETECTOR
Los detectores son del tipo fotoelctrico: al incidir luz producen corriente elctrica,
de intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Se distinguen celdas de capa
barrera (solamente para fotmetros de filtro). Fototubos y tubos
fotomultiplicadores.
LECTURA O REGISTRO
La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia.
Si el instrumento informa la transmitancia se calcula A usando la ecuacin (5). La
absorbancia se mide en 3 cifras despus de la coma. El rango de A medible es de
0.000 hasta 1.500 o hasta 2.000 o 3.000 (dependiendo del instrumento).

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APLICACIN DE LA ABSORCIOMETRA EN EL ANLISIS CUANTITATIVO

1. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE UN CROMOFORO PURO
Midiendo la absorbancia de la solucin problema en un espectrofotmetro y
conociendo el correspondiente se puede calcular la concentracin. Normalmente,
se usa la longitud de onda del mximo de una banda, cuyo valor se encuentra en
la literatura.
Un mtodo alternativo es construir una curva de calibracin de A en funcin de C,
que ser una recta si se cumple la ley de Lambert Beer (ver Fig. 1). Interpolando
en la recta con la absorbancia de la solucin problema se puede determinar su
concentracin. La ventaja del mtodo con curva de calibracin es que permite usar
tambin un fotmetro de filtro.
2. DETERMINACIONES A TRAVS DE UNA REACCIN QUMICA O TEST
Compuestos que no pueden ser determinados en forma directa porque no
absorben convenientemente, se hacen reaccionar con un reactivo especfico
formndose un cromforo.
Se realiza en paralelo el test con la muestra problema y con una o varias
soluciones del compuesto a determinar, de concentracin conocida (soluciones
patrn). Posteriormente, se mide la absorbancia.
Esta absorbancia ser proporcional a la concentracin del compuesto que se va a
determinar dentro de cierto rango de concentraciones. Si se us solamente una
solucin, se calcula la concentracin por proporcin directa:
C (problema)
C (estndar)

A (problema)
A (estndar)

Si se usaron varias soluciones estndar se construye la curva de calibracin del

test, y se interpola en sta. Este grafico ser una recta cuya pendiente se ha
llamado factor de calibracin , k:
A=kxC
En forma alternativa a interpolar en la recta se puede calcular C a partir de la
absorbancia medida dividiendo por el factor de calibracin.
CASOS EN LOS CUALES SE REALIZA UN TEST
1. El compuesto no absorbe en todo el UV visible:
se realiza el test, generndose un cromforo, el cual generalmente absorbe en
el visible (se genera un color) o excepcionalmente solamente en el UV.
Ejemplo: determinaciones de azcares.
2. El compuesto absorbe en una regin espectral (generalmente UV) en la cual
no se puede efectuar la determinacin porque la solucin problema es una

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mezcla que contiene otros compuestos que absorben en la misma regin que
el compuesto a determinar y / o el instrumento de la mediada permite medir
solamente en el rango visible.
Ejemplo: determinacin de protenas.
Cuando se monta un mtodo fotocolorimtrico, pueden existir tres
posibilidades:
a. Que la sustancia sea coloreada y que presente un mximo de absorcin
caracterstico solo para ella y por lo tanto, esta podra usarse para su
determinacin fotocolorimtrica.
b. La sustancia en solucin es incolora, y por lo tanto, se aprovecha alguna
propiedad qumica de ella (poder reductor, oxidante, de sustitucin de
grupos, etc. ) para desarrollar una reaccin coloreada que sirve entonces
para determinar su concentracin.
c. La sustancia en solucin, a pesar de ser incolora, presenta un mximo de
absorcin caracterstico, generalmente a longitudes de onda cortas (UV)
que puede ser usada para su determinacin.
BIBLIOGRAFA
H. WILLARD, L. MERRIT, J.DEAN INSTRUMENTAL METHODS OF
ANLYSIS
G. EWING INSTRUMENTAL METHODS OF CHEMICAL ANLYSIS
A. STROBEL INSTRUMENTACIN QUMICA
S.B. BROWN, ED, AN INTRODUCTION TO SPECTROSCOPY FOR
BIOCHEMISTS

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TRABAJO PRCTICO
I.- DETERMINACIN DE PROTENAS
INTRODUCCIN
Se han descrito un gran nmero de mtodos para la cuantificacin de protenas.
Todos representan ventajas y desventajas, la seleccin de uno en particular va a
depender de la protena que deseamos cuantificar, la sensibilidad deseada,
posibles interferencias y la sencillez del mtodo.
En general, los mtodos estn basados en reacciones qumicas, absorcin
ultravioleta, reacciones de fluorescencia y determinacin del nitrgeno.
METODO TURBIDIMTRICO
Las protenas precipitan cuando se mezclan con soluciones diluidas de cido
tricloroactico, sulfosaliclico o ferricianuro de potasio en cido actico. Este
mtodo tiene desventajas ya que no todas las protenas precipitan en la misma
cantidad e interfieren otras sustancias precipitables por cidos nucleicos. La
ventaja que presenta en uso es la rapidez de la determinacin. El rango til de
trabajo es entre 0.1 y 0.3 mg de protenas agregadas.
MTODOS COLORIMTRICOS
El mtodo colorimtrico ms difundido es el mtodo de Lwry, en que el color final
de la reaccin, es el resultado de la reaccin de Biuret de la protena con el in
cobre en medio alcalino y la reduccin del reactivo fosfomolbdico fosfotngstico
por la serina y triptfano presentes en las protenas.
Los mtodos de Biuret y Bradford se discutirn ms adelante en esta gua y son
los que se realizarn en el presente trabajo prctico.
MTODOS DE ABSORCIN ULTRAVIOLETA
La mayora de las protenas tiene un mximo de absorcin a 280 nm, debido
primariamente a la presencia de tirosina y triptfano, y secundariamente, la
fenilalanina y cistena. Por consiguiente, el coeficiente de extincin molar a 280 nm
vara de una protena a otra debido a su composicin aminoacdica. Ms an, los
cidos nucleicos que muchas veces estn como contaminantes en las
preparaciones de protenas, aunque tiene un mximo de absorcin a 260, tambin
lo hacen a 280 nm, falseando la lectura de las protenas. La razn de absorbancia
a 280 nm / 260 nm ha sido usada por Wargurg y Christian para eliminar la
interferencia de cidos nucleicos en la determinacin de protenas. El rango til de
trabajo es entre 0.1 y 0.6 mg / ml.
Por debajo de 230 nm, la extincin de una solucin de protenas sube
precipitadamente alcanzando un mximo a 190 nm, se debe principalmente al
enlace peptdico. En la prctica es ms conveniente medir la extincin a 210 nm,
ya que el coeficiente de extincin molar a esta longitud de onda es de cerca de
200 para la mayora de las protenas.

19

Todas tienen una absorcin especfica similar, pues el contenido de enlaces

peptdicos es semejante.
Se han descrito una serie de mtodos que utilizan absorbancias menores a
240nm, sin embargo, se obtiene mejores resultados con el mtodo de Scopes, en
el cual se efectan lecturas de absorbancia a 205 y 280 nm, pudindose calcular
el coeficiente de extincin molar de una protena a 205 nm con bastante precisin.
EXPERIENCIA A: CUANTIFICACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE
BIURET
El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino) reacciona con un
compuesto de contiene dos o mas enlaces peptdicos dando una coloracin
violeta. El color desarrollado se debe a un complejo de coordinacin entre el Cu y
cuatro tomos de nitrgeno que provienen de dos cadenas peptdicas adyacentes.
Los dipptidos y los aminocidos (excepto la serina y treonina) no dan esta
reaccin. La reaccin no es absolutamente especfica para los en laces peptdicos,
interfiriendo una serie de compuestos en la determinacin de protenas como por
ejemplo, sales de amonio.
Mediante este mtodo se pueden valorar protenas en un rango de 1 a10 mg.
MATERIALES
Reactivo Biuret: colocar 1.5 g, de CuSO4 x H2O y 6 g. de tartrato de sodio y
potasio (NAKC4H4O6 x 4 H2O). Agregue alrededor de 500 ml de agua destilada y
agitar hasta dilucin. Agregue lentamente y agitando constantemente, 300 ml
NaOH 2.5 N. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1.0
gr., de yoduro de potasio y agitar hasta que este totalmente disuelto. Llevar a un
volumen final de 1000 ml y guardar en un frasco de polietileno. Este reactivo es
estable indefinidamente.
Spectronic 20 (540 nm)
Muestra de albmina: solucin patrn de albmina 10 mg / ml.
CURVA DE CALIBRACIN PARA PROTENAS
1. Disponga de seis tubos y coloque en ellos volmenes de solucin estndar que
contengan 2; 4; 6; 8 y 10 mg de albmina. El sexto tubo selo como blanco; 1
ml de agua destilada en vez de albmina.
2. Enrase a 1 ml de volumen final con agua destilada.
3. Agregue 4 ml a cada tubo del reactivo de Biuret
4. Deje desarrollar el color durante 30 min., luego mida A a 540 nm
DETERMINACIN DE PROTENAS DE LA MUESTRA PROBLEMA
1. En un tubo coloque un volumen X (hasta 1 ml) de la muestra a determinar y
enrasar a 1 ml de volumen final con agua destilada.
2. Agregue 4 ml del reactivo de Biuret
3. Deje desarrollar color durante 30 min. y mida A 540 nm.

20

EXPERIENCIA B. CUANTIFICACIN DE PROTENAS POR EL MTODO DE

BRADFORD
Este mtodo utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie G 250 de unirse
a la protena. El colorante slo presenta un mximo de absorcin a 465 nm
mientras que cuando est unido a la protena el mximo es de 595 nm. La
coloracin en presencia de protenas es lineal en el rango de 0 30 g, Interfieren
en la determinacin, detergentes y lcalis. Se recomienda leer a los 10 min. de
iniciada la reaccin, debido a que el color no es estable en el tiempo, puesto que
la protena comienza a precipitar debido al medio cido. Este efecto es
especialmente significativo a altas concentraciones de protenas.
MATERIALES
Reactivo de Bradford: disolver 100 mg. de azul de Coomasie G 250 (sigma) en
50 ml de etanol 95 % (siempre queda un ligero residuo insoluble). Agregue
lentamente 100 ml de cido fosfrico 85 % p /v y luego complete a 100 ml con
agua destilada. Dejar el reactivo en reposo todo un da y luego filtrar. El reactivo
debe filtrarse toda vez que presente residuo o que el blanco de reactivo ledo
contra agua presente una absorbancia mayor a 0.5.
Para 250ml de Bradford: 25 mg de azul de Coomasie, 12.5 ETOH 95 % , 25 ml
H3PO4.
Solucin patrn de albmina 100g / ml: como se trata de una solucin patrn
diluido, debe tenerse extremo cuidado en la pesada, y evitar que la albmina este
con humedad. Si este es el caso puede secarse en estufa a temperaturas
moderadas (30 C).
CURVA DE CALIBRACIN
1. Disponga de 7 tubos y coloque en cada uno volmenes adecuados que
contengan 5; 10; 15; 20; 25; 30 g de albmina, el sptimo tubo selo como
blanco y agregue 0.8 ml de agua destilada.
2. Complete todos los tubos a 0.8 ml con agua destilada.
3. Agregue 0.2 ml del reactivo de Bradford
4. Espere 10 min. y mida A 595 nm.
DETERMINACIN DE PROTENAS EN UNA MUESTRA PROBLEMA
1. Coloque en un tubo un volumen X de la muestra a determinar (hasta 0.5 ml) y
enrasar a 0.5 ml de volumen final con agua destilada.
2. Agregue 5 ml de reactivo de Bradford.
3. espere 10 min. y lea la A a 595 nm utilizando como blanco el sptimo tubo de
la curva de calibracin.
BIBLIOGRAFA
Skoog & West. Anlisis Instrumental

21

 Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &

Company 2 Edicin Pg. 75 77.
Bradford, M (1976) Analytical Biochemistry 72, Pg. 248 254.

22

II.- DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA FOSFATASA

CIDA DE GERMEN DE TRIGO
INTRODUCCIN
Reaccin Enzimtica
Una enzima es una protena que cataliza una reaccin qumica especfica, es
decir, aumenta su velocidad de reaccin. La figura 1 muestra la variacin de la
concentracin de producto de una reaccin enzimtica en el tiempo (cintica), as
como tambin la desaparicin de sustrato.
La pendiente de esta curva corresponde a la velocidad de la reaccin . Se aprecia
que durante cierto tiempo (inicio) la velocidad se mantiene constante (la curva es
una recta) y posteriormente decae.

Figura N 1. Curva de progreso de la reaccin

Para el estudio de la reacciones enzimticas siempre se determinan velocidades
iniciales (V0), es decir, se utiliza unnimemente aquel intervalo de tiempo en el
cual la velocidad se mantiene constante. La velocidad inicial se define como:
V0 =

cantidad de sustrato consumido (moles)

Tiempo (min.)

V0 =

cantidad de producto formado (moles)

Tiempo (min.)

Existen dos tipos diferentes de ensayos enzimticos:

1. Ensayo de tiempo fijo: se detiene despus de un tiempo determinado y se mide
la concentracin de producto formado o sustrato consumido.
2. Ensayo cintico: se determina la concentracin de sustrato o producto en
forma continua o a una serie de tiempos muy prximos entre s, obtenindose
una curva como la figura 1.
Una reaccin catalizada por una enzima aumenta su velocidad con el
incrementos de la concentracin de sustrato hasta un nivel en que por ms
sustrato que se adicione aumentar la velocidad de la misma. Este fenmeno se
denomina saturacin y alcanza la velocidad inicial mxima Vmax..

23

Figura N 2: Variacin de la velocidad inicial ( V0 ) con la concentracin de sustrato

(S).
En este trabajo prctico se determina la actividad enzimtica de una fosfatasa. En
general, las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de fosfatos
monosteres con la consecuente liberacin de fosfato orgnico. Este tipo de
reacciones esta muy distribuido en la naturaleza. La reaccin es la siguiente:
O

R O P O
O

H2 O

Ez

ROH + Pi

Las fosfatasas en general presentan un amplio rango de especificidad de sustrato

y se clasifican como cidas o alcalinas, basndose en su pH ptimo de reaccin.
Las hojas de las plantas son particularmente ricas en fosfatasas cidas y su
actividad comnmente aumenta con la germinacin, aunque su rol fisiolgico no
se conoce bien.
La enzima a utilizar en el presente trabajo prctico, proviene de una fraccin cruda
de germen de trigo, la cual ser empleada para realizar un ensayo enzimtico y en
otra oportunidad para estudiar las propiedades cinticas de sta. En el ensayo
para determinar actividad, se usar un sustrato artificial, el pnitrofenil fosfato
(NPP). El grado de hidrlisis de ste se determinar fotomtricamente
cuantificando el p-nitrofenol liberado. En solucin alcalina el in pnitrofenolato
absorbe la luz fuertemente en la regin de los 405 nm.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Materiales
Amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M pH 5.0
Sustrato pnitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2.5 mM
Solucin de pnitrofenol 60 M en NaOH 0.02 M
Solucin de 0.02 M NaOH
Solucin stock de enzima 5 mg / ml en BSA 0.1 % diluda 1:20
24

 Bao termoregulado a 37 C
EXPERIENCIA A
Curva de calibracin para la formacin de pnitrofenol
Prepare 6 tubos que contengan 0; 1.00; 2.00; 3.00; 4.00; 5.00 ml de una solucin
de pnitrofenol 60 M y enrase cada uno de los tubos con NaOH 0.02 M a 6.00 ml,
de volumen final. Mezcle bien, transfiera a la cubeta y lea absorbancia a 405 nm.
Como tubo blanco utilice el tubo que no contiene pnitrofenol y calibre el equipo.
Grafique A405 versus los moles de pnitrofenol en cada uno de los tubos. Use
esta curva estndar para analizar sus datos cinticos.
EXPERIENCIA B
Determinacin de la actividad de la fosfatasa cida de Germen de trigo
Ya que el ensayo de la fosfatasa se realiza a tiempo fijo, es necesario determinar
la dilucin correcta de enzima a usar el tiempo de ensayo con una misma
dilucin de enzima.
Prepare un tubo que contenga 2.0 ml de amortiguador citrato de sodio 0.1 M;
EDTA 0.15 M, pH 5.0 y 2.0 ml de sustrato NPP 2.5 mM. A continuacin, preincube
el tubo en un bao termoregulado a 37C por un par de minutos y luego agregue
1.0 ml de la dilucin de la enzima (1:20). Mezcle e inmediatamente saque una
alcuota de 0.5 ml adicinelo a un tubo que contenga 5.5 ml de una solucin de
NaOH 0.1 M. Este es un control denominado tiempo cero de la reaccin, que le
permite calibrar el equipo de manera que solo mide la absorbancia del producto
liberado enzimaticamente. En paralelo prepare otros tubos que contengan la
misma mezcla de reaccin que el tiempo cero, agregue 1.0 ml de enzima e incube
respectivamente 15 y 30 min., luego saque una alcuota de 0.5 ml de cada uno de
los tubos y adicinela a los tubos que contengan 5.5 ml de NaOH 0.1 M.
Finalmente determine la absorbancia (405nm) de cada uno de los tubos utilizando
como blanco el tiempo cero. Recuerde que el ensayo se realiza en un volumen
final de 5 ml y que cada una alcuota de 0.5 ml de cada uno de los ensayos es
diluda a 6 ml para medir absorbancia.
i) Una vez realizadas las medidas correspondientes debe completar en forma de
tabla, lo siguiente:
N tubo

A405

moles Pi

1
2
3
4

0.0

0.0

Velocidad (moles /
min.)
0.0

Los moles de Pi liberados por la enzima se calcula utilizando la curva estndar

para el producto pnitrofenol.

25

ii) Adems de la actividad de la enzima calcule al actividad especfica. Mencione

qu indica la actividad especfica de una protena. La actividad especfica esta
definida como unidades / mg protena.
iii) Calcule la concentracin final en el ensayo de cada uno de los componentes
(amortiguador, EDTA, NaOH, enzima, etc,).

BIBLIOGRAFA
Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2 Edicin Pg. 77 85; 105 108.
Lehninger, A y col. Principios de Bioqumica.
Stryer, A. Bioqumica.

26

III.- PROPIEDADES CINTICAS DE LA FOSFATASA CIDA DEL GERMEN DE

TRIGO
EXPERIENCIA C: Determinacin de la constante de Michaelis-Menten para p nitrofenilfosfato y Vmax
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Prepare una serie de tubos que contengan:
0.0 ml, 0.05 ml, 0.1 ml, 0.2 ml, 0.5 ml, 1.0 ml de sustrato NPP 2.5mM. Agregue 2.0
mL del amortiguador citrato de sodio 0.1 M pH 5.0 a cada tubo y enrase con
agua destilada a 4.5 ml final.
Preincube los tubos a 37 c por 2 minutos y adicione 0.5 ml de la solucin de
enzima. Mezcle bien e incube 15 minutos a 37c en un bao termoregulado. Luego
detenga la reaccin en cada tubo, sacando una alcuota de 0,5 ml y adicinela a
otro tubo que contenga 5,5 ml de NaOH 0.1 M. No olvide preparar un tiempo cero.
para finalizar lea absorbancia a 405 nm.

I)
II)
III)
IV)
V)

Calcule los moles de pi liberados a las distintas concentraciones de

sustrato.
Calcule la velocidad de reaccin (moles de p nitrofenol / min / ml de
enzima).
Determine en cada uno de los ensayos la actividad especifica (unidades
/ mg protena)
Haga un grafico de lineweaver burk (1/v vs 1/s).
Determine la vmax. y Km para NPP, expresndola en sus unidades
correctas.

BIBLIOGRAFIA
Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2 Edicin Pg. 77 85; 105 108.
Lehninger, A y col. Principios de Bioqumica.
Stryer, A. Bioqumica.
MATERIALES
-Amortiguador citrato de sodio 0.1 M, EDTA 0.15 M, pH 5.0
-sustrato p nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2.5 mM
-solucin de 0.1 M NaOH
-solucin stock de enzima 5 mg/ml en BSA 0.1% diluida 1:20
-bao termoregulado a 37c

27

IV.- CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO IONICO

La absorcin de las protenas a intercambiadores inicos de celulosa, involucra
principalmente, la formacin de uniones inicas mltiples entre los grupos
cargados de la protena y los grupos disponibles de carga opuesta del absorbente.
La separacin cromatografca depende, por lo tanto, de la elucin diferencial de
las protenas absorbidas por una variedad de tcnicas, basadas ya sea, en la
alteracin de la carga de la protena (pH) o, en el uso de agentes capaces de
competir con la protena absorbida por los sitios cargados en el absorbente.
Materiales
Columna de vidrio de 10 ml
DEAE celulosa (Dietilaminoetil celulosa)
Muestra albmina 20 mg / ml.
Tampn fosfato de sodio 20 mM pH 7.0
Soluciones NaCl 0.05 M; 0.1 M; 0.2 M; 0.5 M en tampn fosfato de sodio 20mM
pH 7.0
MONTAJE DE LA COLUMNA
Ponga una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna con la ayuda de una
bagueta. Mediante una pinza cierre la salida de la columna y llene sta con
tampn fosfato 20 mM pH 7.0. Soltando la pinza, deje escurrir el tampn hasta la
mitad de la columna.
Este procedimiento evita que queden burbujas a la salida de la columna. Si
hubiera quedado alguna burbuja de aire, repita el procedimiento de nuevo.
A la columna llena hasta la mitad con tampn, comience a agregar DEAE,
previamente equilibrada en el tampn fosfato. Abra la pinza dejando escurrir
tampn, sin dejar que se seque el lecho de celulosa que va formando. Contine
agregando celulosa hasta completar un lecho de aproximadamente 4 ml. Haga
pasar 20 ml de tampn por la columna con el fin de equilibrarla.
SEMBRADO DE LA MUESTRA
Una vez equilibrada la columna, deje escurrir el tampn, cuando est a punto de
empezar a secarse la superficie del lecho de la columna, agregue 1 ml de
muestra. Una vez que la muestra ha entrado al lecho de la columna, agregue un
poco de tampn lavando las paredes y espere a que penetre. Luego lave la
columna con 12 15 ml de tampn recolectando fracciones de aproximadamente 3
ml.

28

ELUCIN DE LA MUESTRA
Con el fin de eludir la muestra, agregue sucesivamente de 15 ml de las soluciones
NaCl en concentraciones crecientes. Colecte el eludo de la columna en
fracciones de 3 ml cada una.
CUANTIFICACIN DE LA MUESTRA EN EL ELUATO
La cuantificacin de la protena en las distintas fracciones se realizar por la
tcnica de Biuret. Para ello tome 1 ml de las fracciones impares y agregue 4 ml de
reactivo de Biuret. Prepare el blanco correspondiente y un par de estndares
apropiados (4 y 8 mg de albmina).
Con los resultados de concentracin de protenas, construya un grfico en que en
la ordenada se seale el nmero de fraccin y en la abscisa la concentracin de
protenas por fraccin. Adems, indique con una flecha los cambios de solucin
salina.
CUESTIONARIO
1. Qu puede Ud. concluir del experimento realizado?
2. Qu resultado esperara, si la columna se equilibrara con tampn fosfato 20
mM pH 7.0 u NaCl 500 mM ? (la muestra aplicada est disuelta en el mismo
tampn).
3. Qu resultado esperara Ud. si la columna se equilibrara con tampn pH 5.0?
[pI (pto isoelctrico) de albmina es 5].
4. Si se realiza el mismo experimento utilizando leche como muestra, Qu
resultados esperara? (Podra identificar las fracciones que contienen lacto
albmina). Discuta.
5. Se tiene una solucin que contiene una enzima ms lacto albmina. Si a Ud. le
interesa slo la enzima y debe remover la lacto albmina, como realizara el
experimento si no posee columna?
BIBLIOGRAFA
Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2 Edicin Pg. 16 20.
Lehninger, A (1982). Biochemistry. 2 edicin. Editores Word. Capitulo 6. Pg.
127 129.
Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edicin. Editores Freeman &
Company.

29

V.- CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN

Es una tcnica til para separar compuestos de diferente peso molecular. La base
de la separacin del mtodo es la propiedad del gel (Sephadex) de fraccionar
solutos de acuerdo a su tamao molecular.
Cuando se coloca una solucin acuosa con macromolculas que difieren en
tamao y se pasa a travs de una columna empacada con gel de dextrano
(Sephadex) las molculas ms grandes son incapaces de penetrar los poros del
gel (se excluyen) y se mueven ms rpido a travs de la columna (tienen menos
trayecto que recorrer) que las pequeas. Estas ltimas, difunden a travs de los
poros segn su tamao. Las diferentes molculas eluyen de la columna en una
secuencia decreciente en tamao molecular.
MATERIALES
Columna de vidrio 1.3 x 15 cm.
Sephadex G 75
Muestra: azul dextrano 0.5% PM (x), y dicromato de potasio (K2Cr2O7) al 0.5%.
MONTAJE DE LA COLUMNA
Ponga una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna con la ayuda de una
bagueta. Mediante una pinza, cierre la salida de la columna y llnela con agua
destilada. Soltando la pinza deje escurrir el agua hasta la mitad de la columna.
Este procedimiento evita que queden burbujas a la salida de la columna. Si
hubiera quedado alguna burbuja de aire, repita el procedimiento de nuevo.
A la columna llena hasta la mitad de agua, comience a agregar el Sephadex hasta
llenarlo, con la ayuda de una pipeta, usndola en forma invertida. Espere unos
minutos hasta que comience a sedimentar el gel. Abra la pinza de salida
suavemente hasta obtener un flujo de 1 ml / min. como mximo. Contine
agregando el Sephadex hasta completar una altura de 12 cm en la columna.
Equilibre la columna hacindole pasar 2 volmenes de tampn pH 7.
SEMBRADO DE LA MUESTRA
Una vez equilibrada la columna, con ayuda de la pipeta pasteur retire el agua de
ella. Cuando est a punto de empezar a secarse la superficie del gel, agregue 0.2
ml de una muestra con una pipeta Pasteur. Una vez que la muestra ha entrado al
gel, agregue un poco de tampn lavando las paredes y espere que penetre. Luego
agregue ms tampn.
ELUCIN DE LA MUESTRA
Eluya la muestra haciendo pasar tampn por la columna igual que cuando la
equilibr. Colecte fracciones de aproximadamente 1 ml.

30

CUESTIONARIO
1. Qu puede concluir de las distintas fracciones que ha colectado?
2. de acuerdo al resultado que Ud. Obtuvo Qu podra decir, en forma
comparativa, del peso molecular de los compuestos?
3. Disee un mtodo experimental que le permita cuantificar la muestra eluda.
BIBLIOGRAFA
Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2 Edicin Pg. 20 27.
Lehninger, A (1982). Principles Biochemistry. Capitulo 6. Pg. 127 129.

31

VI.-ELECTROFORESIS
El trmino electroforesis describi originalmente la migracin de partculas
cargadas a travs de un medio lquido o semislido bajo la influencia de un
potencial o campo elctrico. En la actualidad, el trmino se refiere a cualquier
tcnica por la cual las macromolculas se separan unas d otras en gradientes de
potencial elctrico en base a diferencias en sus cargas netas, sin importar el
medio de conduccin.
Las protenas son polielectrolitos y por lo tanto, son susceptibles de ser analizadas
electroforeticamente. Normalmente, las cadenas laterales de ciertos aminocidos
son los sitios ionizables en la protenas (arginina, pKa = 12; lisina; pKa = 9, 7 10,
7; cistena, pKa = 8, 5 9, 5; tirosina, pKa = 8, 5 10, 0; histidina, pKa = 6, 0 7 ,
0; cido aspartico y glutmico, pKa = 3, 9 5, 0) contribuyen a la carga neta de las
protenas, como tambin algunos grupos prostticos (ejemplo: NAD+). Otras
molculas, adems de protenas, pueden ser separadas por electroforesis
despus de formar complejos con los iones inorgnicos u otros grupos cargados.
Los principios de la electroforesis son simples: si dos electrodos se sumergen en
una solucin que contiene un electrolito y una suspensin de macromolculas
cargadas, stas se movilizaran hacia el electrodo de signo opuesto con una
fuerza proporcional a la magnitud de la carga en la macromolcula y a la
diferencia del potencial elctrico aplicado. Debido a que cada una de las partculas
que migran van a enfrentar una resistencia friccional a su movimiento, cada una
alcanzar rpidamente una velocidad mxima de migracin. Por lo tanto, si una
mezcla de estas macromolculas se expone a un campo elctrico constante, se
alcanzaran distintas velocidades mximas parta partculas de distintas cargas
netas.
Adems de la carga neta y el campo elctrico, hay muchos otros factores que
influencian la rapidez de la migracin electrofortica de protenas, incluyendo
tamao, pH y la naturaleza del medio a travs del cual ocurre la migracin.
La velocidad a la cual la protena migra hacia uno u otro electrodo durante la
electroforesis se llama movilidad electrofortica (usualmente expresada en cm2
seg.-1 volt-1 ) y es dependiente del nmero relativo de cadenas laterales de
aminocidos cargados positiva y negativamente.
El hecho que una cadena lateral de un aminocido tenga o no carga, es a su vez
determinado en parte por el pH de la solucin de protenas. A medida que el pH
baja, grupos cargados negativamente como COO- secundarios del cido aspartico
o glutmico y el O- de la tirosina se protonan y por lo tanto, las cargas negativas se
neutralizan. Al mismo tiempo, algunos grupos amino secundarios de la lisina y
arginina pueden aceptar protones adicionales, aumentando as, el nmero de
cargas positivas asociadas a la protena. Por el contrario, si el pH aumenta, los
protones se disocian de las cadenas laterales y la protena se hace mas negativa.

32

Por consiguiente, el nmero y tipo de cargas asociadas a cadenas laterales a

aminocidos de una protena estn determinados por el pH.
A bajo pH, las protenas tienden a llevar ms cadenas laterales positivas que
negativas, por lo tanto la carga neta ser positiva y la migracin en una
electroforesis ser hacia el ctodo (electrodo negativo). A pH alto, las cadena
laterales negativas predominan y la protena migra hacia el nodo (electrodo
positivo). De lo anterior, se deduce que para cada protena existir un pH en el
cual el nmero de cargas positiva y negativas sea igual. Si la electroforesis es
realiza a este pH, no habr migracin, debido a que la protena no tiene carga
neta. Valores de pH del solvente por encima del pI (punto isoelctrico) hacen que
la carga neta de la protena esa ms negativa y su movilidad electrofortica hacia
el ctodo aumenta. En cambio, valores de pH ms bajos que el pI hacen que la
protena sea ms positiva, por ende, la movilidad electrofortica aumenta hacia el
nodo. Debido a que el pH influencia marcadamente la movilidad electrofortica,
es importante mantener el pH constante durante la electroforesis. Esto se lleva a
cabo incluyendo tampones en las soluciones electrolticas.
La electroforesis en geles de poliacrilamida es quizs el sistema electrofortico
mas til y verstil en el anlisis y separacin de protenas, molculas pequeas de
RNA y fragmentos de DNA.
El soporte poliacrilamida ha reemplazado otros medios debido a que el tamao del
poro del gel se puede controlar variando la concentracin de policriamida y
adems, la absorcin de protenas es despreciable. El gel de poliacrilamida es
prepara entrecruzando acrilamida en N, N-metilenbisacrilamida y el resultado es
una matriz inerte, sea un gel continuo a travs del cual migran las
macromolculas de inters, hay, bsicamente, dos formas de realizar
experimentalmente una electroforesis en geles de poliacrilamida: en un tubo
cilndrico de vidrio o bien entre placas planas de vidrio. Los geles en placas han
reemplazado casi totalmente a los geles en tubos, debido al gran nmero de
muestras que pueden correrse en forma simultnea.
Para una buena resolucin, Ornstein y Davis implantaron la electroforesis
discontinua, desarrollada alrededor de 1960. el termino discontinuo se refiere a
que el sistema usa pH discontinuo. El gel se prepara en un tubo de vidrio cilndrico
o bien entre dos placas planas de vidrio. En ambos casos, existen dos regiones:
gel espaciador y gel separador. El gel espaciador tiene una concentracin de
poliacrilamida menor, por lo que el tamao del poro es mayor y esta preparado
adems, en un tampn de menor fuerza inica y a distinto pH en comparacin con
el gel separador. El tamao de poro ms grande significa que las molculas se
movern mas rpido en el gel espaciador. Similarmente, la fuerza inica menor
significa una mayor resistencia elctrica, de manera que el campo elctrico (V/
cm) es mayor en este gel y eso permite a las molculas desplazarse con mayor
velocidad. Este movimiento rpido en el gel espaciador resulta en la acumulacin
de material entre el gel espaciador y el separador. Sin embargo, por razones que
estn mas all del objetivo de este curso, los componentes individuales, aunque
muy juntos, se ordenan en pilas por orden de movilidad. A medida que las
33

molculas migran a travs del gel separador, las diferentes protenas se separan
en bandas discretas de acuerdo a su movilidad. Al trmino de la corrida
electrofortica, las bandas se pueden identificar de varias formas:
1. El gel se puede teir por inmersin en colorante seguido de lavado exhaustivo
para remover colorante no unido. Si es necesaria informacin cuantitativa, se
puede medir la cantidad de colorante unido a cada una de las bandas en un
densitrometro.
2. Cuando la protena en estudio es una enzima, se puede practicar tincin de la
actividad enzimtica.
3. Si la mezcla de protenas es radioactiva, las bandas se pueden detectar por
autoradiografa o fluorografia.
Los principales usos de la electroforesis discontinua son por una parte, determinar
pureza de una protena y en segundo termino para analizar los componentes de
una mezcla compleja. La pureza, es por supuesto, un termino relativo, ya que se
puede obtener una sola banda en el gel, debido a que las impurezas estn a
concentraciones muy bajas para ser detectadas.
GELES DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURANTES
En 1967, A. Shapiro, E. Viuela y J. Maizel mostraron que los pesos moleculares
para la mayor parte de la protenas se podan determinara midiendo la movilidad
electrofortica en geles de poliacrilamida que contiene un poderoso detergente de
carga negativa, dodecil sulfato de sodio (SDS). Esta tcnica fue perfeccionada dos
aos despus por K. Weber y M. Osborn.
A pH cercano al neutro, en 1% SDS y 0.1M - mercaptoetanol, la mayora de la
protenas, son cadenas que unen SDS, los puentes S S se rompen por le MSH
y la estructura segundaria se pierde. Los complejos resultantes que consisten en
subunidades proteicas y SDS asumen una configuracin en espiral al azar. La
protenas, as tratadas, se comportan como si tuvieran forma uniforme y razn
idntica carga / masa. Esto es debido a que la cantidad de SDS unido por unidad
de peso de protena es constante: 1.4 g. SDS / g. de protenas.
La carga es entonces determinada por SDS unido y no por la carga intrnseca de
los aminocidos. Debido a que los espirales al azar de la protena recubierto con
SDS, tiene igual razn carga a masa, uno puede esperar que la movilidad de cada
molcula proteica sea proporcional al nmero de enlaces peptdicos por
molculas, esto es, la movilidad seria proporcional al peso molecular. El gel se
comporta como un cedazo molecular a travs del cual deben pasar las
molculas. En cuanto mas pequeas sea la molcula migrara mas rpidamente a
travs del gel; por lo tanto, la movilidad aumenta con pesos moleculares
decrecientes.

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Weber y Osborn demostraron que si una serie de protenas de peso molecular

conocido son sometidas a electroforesis en un gel, esta se separan en bandas (ver
figura 1 a), y que el grafico: distancia de migracin v / s log peso molecular
corresponde a una lnea recta ( figura 1 b). Por lo tanto, si se somete a
electroforesis una protena de peso molecular de peso desconocido con varias
protenas con PM conocido o estndar, el PM desconocido puede ser calculado
con una exactitud que varia entre 5 al 10 %.
El procedimiento de electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS es una
herramienta poderosa para el anlisis de protenas debido a que se usa para
separar cualquier protena sin importar su solubilidad en solucin acuosa.
Protena de membrana, componentes proteicos del cito esqueleto y protenas que
forman parte de agregados macromoleculares grandes pueden resolverse en
especies separadas.
Finalmente, debido a que el mtodo separa polipptidos de acuerdo la tamao,
provee tambin informacin acerca de PM y la composicin de sus unidades de
cualquier complejo proteico.
BIBLIOGRAFA
Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edicin. Editores Freeman &
Company.
Chrambach, A. & Robbard, D. (1971) Science, 172, 440.
Laemmli, UK (1970) Nature (London) 277, 680 685.
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. I, T.S. Work
+ E: Work Editors A:H: Gordon, Pg. 1 145 (parte I).

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ELECTROFORESIS DISCONTINUA DE PROTENAS SERICAS EN GELES DE

POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURANTES
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A.- SOLUCIONES
A. Acrilamida bisacrilamida: 45% - 1.2% ( 46.2 %T 2.6 %C).
Precaucin: la acrilamida es neurotxica. EVITE EL CONTACTO
DIRECTO. Agregar a la solucin una punta de esptula de carbn
activado agitar durante 2 horas, filtrar por papel whatman. Guardar a 4C.
B. Tampn gel separador
1.5 M Tris HCl pH 8.8, 0.4 % SDS (guardar a 4C).
C. Tampn gel espaciador
0.5 M Tris HCl pH 6.8, 0.4 % SDS (guardar a 4C).0.5 M
D. Persulfato de amonio 1%
Preparar solucin fresca; duracin una semana (guardar a 4C)
E. Temed ( N; N; N; N tetrametiletilendiamina)
F. Tampn de corrida 4X
0.1 M Tris, 0.768 M glicina, 0.4 % SDS. Diluir con agua antes de usar, no
es necesario ajustar pH. (guardar a 4C).
G. SDS 20% P /V (guardar a temperatura ambiente)
H. Azul de Bromofenol:
0.2 % azul de Bromofenol en 0.1 M Tris HCl pH 6.8
I. Tampn de muestra (5X)
0.125 M Tris HCl pH 6.8, 5 % SDS, 25% glicerol, 0.05% azul de
Bromofenol (guardar a -20C).
J. Fijador: 30% etanol, 10% cido actico
K. Solucin de teido
0.3% azul de Coomasie R 250 en 50% metanol y 10% cido actico. Se
disuelve el azul de Coomasie en metanol (agitar 8 horas), se filtra, se
agrega cido actico y el agua.
L. Solucin de desteido: 7% cido actico 30% metanol
B.- PREPARACIN DE GELES
M. Gel separador
Acril Bis 45 1.2&
Tris HCl 1.5 M pH 8.8, 1.2% SDS
Persulfato 1%
Agua
TEMED
Importante: todas las operaciones se realizan en hielo para evitar
polimerizacin.
N. Gel espaciador
Acril Bis 45 1.2&
Tris HCl 0.5 M pH 6.8, 0.8 % SDS
Persulfato 1%
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Agua
TEMED
PROCEDIMIENTO
A. Limpiar las placas de vidrio con acetona y etanol.
B. Engrasar los espaciadores (0.15 cm de grosor) y armar la placa fijando pinzas.
C. Agregar el volumen necesario de la mezcla del gel separador hasta una altura
de 6 cm.
D. Borra el menisco, agregando suavemente por las paredes tampn 1.5 M Tris
HCl pH 8.8, 1.2% SDS, diluido 1: 4.
E. Dejar gelificar por 20 min.
F. Eliminar tampn diluido y lavar la superficie con agua destilada.
G. Preparar el gel espaciador
H. Agregar el volumen necesario sobre el gel separador. Colocar peineta de 8
10 surcos, evitando que queden burbujas de aire. Dejar gelificar por 20 min.
I. Una vez gelificado el gel espaciador, retirar la peineta y el espaciador basal y
colocar las placas en la cmara electrofortica.
J. Agregar el tampn de corrida al deposito inferior evitando atrapar aire en el
borde del gel.

Figura 1a: Esquema del aparato de electroforesis discontinua en geles de

poliacrilamida.

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Figura 1b: La grafica entre el log del peso molecular (PM) y la migracin relativa
durante la electroforesis es lineal, lo cual permite conocer el PM de una protena
desconocida.
C.- PREPARACIN Y APLICACIN DE LA MUESTRA
A. La cantidad de protenas sericas a aplicar es de 30 a 60 g por surco.
B. Diluir las muestras con buffer muestra 1: 5. Agregar - mercaptoetanol 5%
final y hervir por 2 min.
C. Los volmenes recomendables a aplicar por surco son de 40 70 L
D. Aplicar las muestras con micro pipeta adecuada y agregar nuevamente tampn
de corrida sobre las muestras y el deposito superior.

D.- CORRIDA ELECTROFORTICA

A. Conectar los electrodos ( polo +, abajo)
B. Aplicar 10 15 mA hasta que el indicador del frente inico llegue a 1 cm del
borde del gel (ms o menos 2 horas)
E.- FIJACIN Y TINCIN
A. Transcurrido el tiempo de corrida, retirar los espaciadores y placas de vidrio y
sumergir el gel en solucin fijadora por una hora. Luego, trasladar a la solucin
colorante tambin una hora.
B. Cambiar a solucin decolorante hasta que las bandas se observen sobre fondo
claro.
F.- CALCULO DEL PESO MOLECULAR DE LA ALBMINA
A. En forma paralela a las protenas sericas, se someter a electroforesis
albmina srica bovina pura ms otras protenas de peso molecular conocido.

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Mida las distancias de migracin y grafique log peso molecular versus

distancia. Por interpolacin determine el peso molecular de la albmina srica.

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