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A.C.C.

A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Empresa: //////
No. De identificacin de laboratorio: 5333
No. De control: 158
PRESENTE:
Identificacin: identificacin de salmonella
Informacin de la muestra: Muestra tomada por personal del
laboratorio de un quesillo artesanal
Fecha de muestreo: 01 de julio del 2014
Hora de muestreo:
01:00 Hrs.
Fecha de obtencin resultados: 04 de julio 2014
Hora de
muestreo: 15:00Hrs.
Temperatura de muestreo: Ambiente

Aislamiento de Salmonella spp. a partir de alimentos.

Mx
Determinacin
Quesill De Salmonella
o
spp.
artesan
al

Tcnica
Aislamiento de
Salmonella spp. a
partir de alimentos
(extensin en
superficie).

RX
Negativo

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.


MTODO PARA LA DETERMINACIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS.

Observaciones: la muestra analizada, est dentro de la NORMA OFICIAL


MEXICANA NOM-114-SSA1-1994 puesto que no se encontr la presencia de
Salmonella.

Responsables:

A.C.C.A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Antony Rosales Martnez


Snchez

Mayra Mora

Jos Abdn Lpez godos

Salmonella
Los miembros del gnero Salmonella han sido muy estudiados como patgenos cuando
se encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo, tanto por
parte de las autoridades sanitarias, como en las plantas procesadoras de alimentos,
depende en cierta medida del mtodo analtico utilizado para su deteccin.
Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clnicas y los mtodos
empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su deteccin en
alimentos. Las modificaciones a los mtodos consideraron dos aspectos principales, el
primero es el debilitamiento o dao a las clulas bacterianas presentes en un alimento,
debido al proceso a que est sujeto (por ejemplo: tratamiento trmico, secado, etc.) y
segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.
Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de Salmonella,
todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de
preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivo selectivo
y diferencial, identificacin bioqumica y confirmacin serolgica de los microorganismos.

Fundamento
Caldo lactosado (medio de preenriquecimiento)
Es un medio rico en nutrientes, y no contiene inhibidores del crecimiento bacteriano. El
extracto de carne y la peptona, son la fuente de carbono y nitrgeno, mientras que la
lactosa es el hidrato de carbono. Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y
gas, y ste ltimo se demuestra al usar las campanas Durham.
Se lo usa tambin como medio de preenriquecimiento, porque permite recuperar clulas
injuriadas, diluye sustancias txicas o inhibitorias y favorece el desarrollo de Salmonella
con respecto a otras bacterias.

A.C.C.A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Frmula (en gramos por litro)

Extracto de carne

Instrucciones

3.0

Peptona

5.0

Lactosa

5.0

Suspender 13 g por litro de agua


destilada. Mezclar bien y distribuir en
tubos con campanitas de Durham.
Esterilizar en autoclave durante 15
minutos a 121C.

pH final: 6.9 0.2

A.C.C.A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Caldo tetriationato (medio de enriquecimiento)


El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos toxicos.
La selectividad est dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado
en el medio por el agregado de la solucin iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales
permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa, como
ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompaante

Frmula (en gramos por litro)

Peptona

5.0

Sales biliares

1.0

Carbonato de calcio

10.0

Tiosulfato de sodio

30.0

pH final: 8.4 0.2

Solucin iodo iodurada

Iodo

6.0

Ioduro de potasio

5.0

Agua

Instrucciones

Suspender 46 g del polvo en 1 litro de agua


destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a
ebullicin. Enfriar a 45C o menos. Agregar
20 ml de solucin iodurada. Mezclar y
distribuir 10 ml por tubo, en tubos estriles.
No debe calentarse luego de agregar la
solucin iodada. El medio base puede
mantenerse a 4C , dura varios meses, pero
una vez agregada la solucin iodada debe
usarse en el mismo da.

20.0

Agar TSI (identificacin bioqumica)

A.C.C.A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes


adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos
de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ ,
los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color
negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio
del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de
sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

Frmula (en gramos por litro)

Extracto de carne

Pluripeptona

Cloruro de sodio

3.0

20.0

5.0

Lactosa

10.0

Sacarosa

10.0

Glucosa

1.0

Sulfato de hierro y amonio

0.2

Tiosulfato de sodio

0.2

Rojo de fenol

Instrucciones

0.025

Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua


destilada. Mezclar bien y calentar con
agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos
hasta disolucin total. Llenar hasta la
tercera parte de los tubos de ensayo.
Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar
en pico de flauta profundo.

A.C.C.A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Agar

13.0

pH final: 7.3 0.2

Agar verde brillante (aislamiento de salmonella)


En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la
fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los
hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al
amarillo cuando hay produccin de cido a partir de la fermentacin de azcares,
el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el verde brillante acta como
agente selectivo.
Frmula (en gramos por litro)

Pluripeptona

10.0

Extracto de levadura

3.0

Cloruro de sodio

5.0

Lactosa

10.0

Sacarosa

10.0

Rojo fenol

0.08

Verde brillante

0.0125

Instrucciones

Suspender 58 g de polvo por litro de agua


destilada. Reposar 5 minutos y mezclar
calentando a ebullicin durante 2 o 3
minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave
a 118-121C durante 15 minutos. Secar la
superficie del medio por unos minutos en la
estufa.

A.C.C.A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Agar

20.0

pH final: 6.9 0.2

Agar LIA
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el
desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el
sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa.
El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin
de cido sulfhdrico. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que
alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La
decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la
glucosa sea previamente fermentada.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan
la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la
influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

LIA
Frmula (en gramos por litro)

Peptona de gelatina

5.0

Extracto de levadura

3.0

Glucosa

1.0

Lisina

10.0

Instrucciones

Suspender 35 g del medio deshidratado en un


litro de agua destilada. Dejar embeber unos
15 minutos. Calentar cuidadosamente,
agitando con frecuencia y hervir durante un
minuto hasta la disolucin completa. Distribuir
y esterilizar a 121C durante 15 minutos.
Enfriar en pico de flauta dejando un fondo
vertical apto para la puncin.

A.C.C.A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Citrato de hierro y amonio

0.5

Tiosulfato de sodio

0.04

Prpura de bromocresol

0.02

Agar

15.0

pH final: 6.7 0.2

MEDIO MIO
Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad,
presencia de ornitina dexcarbocilasa e indol. La movilidad se demuestra por un
enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de
inoculacin.
La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido a la
fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando
que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez,
otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual
decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el
consecuente viraje del indicador hacia el color prpura.
El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la
enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de
reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo .

Frmula (en gramos por litro)

Dextrosa

1.0

Extracto de levadura

3.0

Instrucciones

Suspender 31 g del polvo en un litro de


agua destilada. Calentar a ebullicin hasta
completa disolucin. Distribuir en tubos y

A.C.C.A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Peptona

10.0

Triptena

10.0

Clorhidrato de L-ornitina

5.0

Agar

2.0

Prpura de bromocresol

esterilizar 15 minutos a 121C.

0.02

pH final: 6.5 0.2

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Diagrama de proceso:
Inicio

sdSDadsadasdasdsadassaasfa

20g. de Quesillo
180ml. Caldo Lactosado (previamente preparado)

Colocar en una bolsa esterilizada la muestra y el caldo.


Homogenizar en el stomacher (60seg,)

Pasar la mezcla al frasco (donde


estaba el caldo)

Incubar a 35C/24hrs.

Poner 1ml. de la mezcla al Caldo Tetrationato

Incubar a 43C/24hrs.

Del inculo, se debe estriar de forma cruzada en el Agar verde brillante


Incubar a 35C/24hrs.

Hubo presencia de salmonella?

S
Realizar las pruebas bioqumicas TSI, LIA y MIO

No

Incubar a 35C/24hrs.
Serologa

Fin

A.C.C.A
B
(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Fin

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO


PARA LA DETERMINACIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS.
Objetivo y campo de aplicacin

Esta Norma Oficial Mexicana establece un mtodo general para la determinacin


de Salmonella en alimentos.

Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional


para las personas fsicas y morales que requieran efectuar este mtodo
en productos nacionales y de importacin para fines oficiales.
Fundamento
La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema
general que consiste de 5 pasos bsicos:

Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio


nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas a
una condicin fisiolgica estable.

Enriquecimiento selectivo, empleado con el propsito de incrementar las


poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.

Seleccin en medios slidos, en este paso se utilizan medios selectivos que


restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y permite
el reconocimiento visual de colonias sospechosas.
Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los
cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.

Serotipificacin, es una tcnica serolgica que permite la identificacin especfica


de un cultivo.

Esta norma se complementa con la siguiente Norma Oficial Mexicana:

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NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de


alimentos para su anlisis microbiolgico.*
Definiciones
Para fines de esta norma se entiende por:

Deteccin de Salmonella: determinacin de la presencia o ausencia de estos


microorganismos en una masa determinada de producto, cuando las pruebas se
llevan a cabo de acuerdo con esta norma.

Salmonella: microorganismo patgeno perteneciente al grupo de Enterobacterias.


Bacilo gram negativo, aerobio, no esporulado que forman colonias tpicas en
medios selectivos slidos y que presentan adems las caractersticas bioqumicas
y serolgicas descritas cuando los procedimientos se efectan de acuerdo con esta
norma.

Aislamiento de Salmonella
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella, de
acuerdo con las siguientes caractersticas:
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En
algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio
enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.
Agar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos
casos las colonias pueden aparecer completamente negras.
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o
negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf,
tornndose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la
formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa
crecimiento, incubar 24 h adicionales.
Agar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro
negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

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Identificacin bioqumica
Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para
Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:

Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la
fermentacin de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms
intenso que el medio original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la
sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin negra a lo largo de la
puncin debido a la produccin de cido sulfihdrico.

Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la
descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan
claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las cepas de
Salmonella producen cido sulfihdrico en este medio con ennegrecimiento a lo
largo de la puncin.

Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella en
los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales.
Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA
tpicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el
medio LIA permitir detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella que utilicen
lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atpicas en
ambos medios.
Continuar el anlisis a partir de los tubos de TSI con reacciones tpicas. Si el cultivo
presenta reacciones atpicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de
donde se obtuvo el cultivo atpico anterior y sembrar las pruebas bioqumicas
nuevamente.
Continuar la identificacin bioqumica y serolgica a partir de los cultivos recuperados de
TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analtica seleccionando
colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.

Prueba de ureasa

Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estril, tomar crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea.

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Utilizar un control de medio para comparar el vire prpura de las reacciones positivas con
el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.
Prueba de ureasa (rpida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea
(rpida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5ºC en bao de agua.
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la
prueba negativa (sin cambio de color del medio).
Identificacin serolgica
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo y el
antisuero y no aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin salina.
Si se observa aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar
con las pruebas bioqumicas complementarias.

Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse


el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C,
D y E, suelen ser los ms frecuentes).

Si se requiere, practicar el ensayo de los antgenos flagelares de Salmonella


(Antisuero polivalente H).

Pruebas bioqumicas complementarias

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Resultados:

Quesillo artesal
Con el analisis obtenido se concluye:

a buena calidad sanitaria del queso


Las buenas condiciones higinicas de las materias prima.
Una buena manipulacin durante el proceso del queso analizado.
Por lo tanto local quesillo artesanal cumple con la norma establecida.
En el agar verde brillante se determin ausencia de salmonella en la placa
estriada.
ausencia de salmonella en 20gr de muestra de quesillo artesanal.

Conclusiones
Con esta prctica pudimos verificar si hubo presencia de salmonella en el quesillo por lo
cual no la hubo (Prueba NEGATIVA) eso nos indica que el quesillo est libre de esta

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bacteria y lo podemos consumir sin preocuparnos de que se presenten los sntomas de la


bacteria de salmonella.

BIBLIOGRAFIA
Yabar Villanueva Emilio Fredy. 2005. Microbiologa de alimentos. Criterios microbiolgicos
de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano.
Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias. Universidad Nacional del Centro del
Per
Viana Cmara Snia Aparecida. S.f. Curso de Farmcia. Microbiologia de alimentos.
Microorganismos indicadores.
INAL (Instituto Nacional de Alimentos).2004. Gua de Interpretacin de Resultados
Microbiolgicos de Alimentos ANMAT. Administracin Nacional de Medicamentos,
Alimentos y Tecnologa Mdica. Disponible en www.analizacalidad.com/ arm2004-4.pdf