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UNIVERSIDAD DE LA AMAZONIA

PROGRAMA INGENIERIA DE ALIMENTOS


MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
LABORATORIO
NMP DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES
PRUEBA PRESUNTIVA Y CONFIRMATIVA
MUESTRA: Aguas residuales o un alimento sin coccin de venta callejera. Buscar una
tabla para Nmero ms probable
PROCEDMIENTO PRUEBA PRESUNTIVA
PREPARAR EL REA DE TRABAJO
1. Preparacin del medio de cultivo
Tome un frasco de caldo Brilla o caldo lactosado bilis verde brillante; lea las instrucciones
de preparacin y calcule la cantidad en gramos necesaria para preparar 90 ml de caldo.
Pese la cantidad de reactivo necesaria y dilyalo con agua destilada. Pipetee 10 ml de
caldo en tubo tapa rosca con campana de Durham.
Coloque los tubos en una gradilla y esterilize en autoclave por 15 minutos.
Deje enfriar y verifique que no haya burbujas de gas en las campanas.
2. Preparacin de la muestra
Prepare la dilucin 10-1:
Muestra slida: Tome 10g de la muestra y macere hasta que sea posible diluir, Agregue la
muestra macerada en 90ml de agua peptonada al 0,1%. Homogenice
Muestra lquida: Destape cuidadosamente el empaque del alimento, Con la ayuda de una
pipeta estril y un pipeteador, tome 10ml de la muestra. Agregue la muestra a 90ml de
agua peptonada al 0,1%. Homogenice
Prepare la dilucin 10-2. Use una pipeta estril de 1ml y tome 1 ml de la dilucin 10-1 y
agrguelo a un tubo con 9ml de agua peptona al 0,1%. Homogenice
3. Siembra
Pipetee 1ml de cada una de las diluciones en tres tubos con 10 ml de caldo Brilla marcado
con el nmero de la dilucin
9 tubos en total, 3 de cada dilucin
4. Incubacin
Incubar a 35C +/- 2 por 24-48 horas

Revisar los tubos a las 24 horas, si hay formacin de gas. Realizar prueba confirmativa, si
no hay formacin de gas, continuar la incubacin hasta las 48 horas.
Realizar prueba confirmativa a los tubos que presenten turbidez y/o formacin de gas
Realizar informe de acuerdo a la tabla de NMP
PROCEDIMIENTO PRUEBA CONFIRMATIVA
Con un asa redonda, tomar una asada de los tubos positivos y sembrar por aislamiento en
una caja de Petri con Agar EMB (Eosina Metil Blue ) o VRB ( Rojo Neutro, Bilis, Agar).
Incubar las cajas invertidas a 35C +/- 2C por 24 horas
Leer las colonias compatibles con coliformes (Revisar bibliografa)
Anotar el nmero de tubos confirmado como positivo
Para calcular el NMP de organismos coliformes por gramo o mililitro utilizar la tabla
COLIFORMES FECALES
A partir de los tubos positivos realice la prueba de Mac kenzie, siga este procedimiento.
Siembre una asada en un tubo con caldo Brilla y campana de Durham y en un tubo con
caldo triptfano.
Incubar por 48 horas.
Lectura e interpretacin de resultados. Evale la produccin de gas en la campana de
Dirham y en el caldo triptfano, agregue unas gotas de reactivo de Kovacs para evaluar la
produccin de indol. Se consideran coliformes fecales si hay produccin de gas e indol.
Calcule el NMP de acuerdo a la tabla
PREGUNTAS
1. Cul es el fundamento bioqumico de la prueba de triptfano?
2. Cules son los componentes de los medios EMB y VRB y cul es la funcin de
cada uno de ellos?
3. Cul es la diferencia entre coliformes totales y fecales?

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