ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)

La electroforesis es un mtodo analtico

semipreparativo, en el que se separan
biomolculas, en dependencia entre otros
factores de su carga bajo la accin de un campo
elctrico, fue empleado por primera vez por
Tiselius en el ao 1937.Raymond y Weintraub
en 1959 emplearon como soporte para la
electroforesis un gel de poliacrilamida (PAGE), posteriormente el mtodo fue perfeccionado por
varios investigadores como Davis y Ornstein. La popularidad de este creci rpidamente y se
logr un aumento de la resolucin. El dodecil sulfato de sodio (SDS) se introduce en esta
tcnica en 1970, y ya en 1972 se emplean agentes reductores y SDS en la determinacin del
peso molecular de protenas en lo que se denomin electroforesis en geles de poliacrilamida con
SDS (SDS-PAGE).
1. Fundamento:
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo
elctrico; Estas partculas migran hacia el
ctodo o nodo (electrodos - y +), en
dependencia de una combinacin de su carga,
peso molecular y estructura tridimensional.
Es de destacar que a escala analtica, los
mtodos electroforticos son de alta
sensibilidad, poder de resolucin y
versatilidad, y sirven como mtodo de
separacin de mezclas complejas de cidos
nucleicos, protenas y otras biomolculas,
donde aportan un potente criterio de pureza.
Se pueden conocer tambin mediante estas
tcnicas, las caractersticas cido-bsicas de
las protenas presentes en un extracto crudo,
lo que da la informacin necesaria si se
pretende
realizar
una
separacin
cromatografa basada en diferencias de carga.
Es til adems para determinar otros
parmetros como peso molecular, punto
isoelctrico y nmero de cadenas polipetidicas
de las protenas.
La velocidad de migracin (v) de la partcula
es directamente proporcional al producto de
su carga efectiva (q) y el gradiente de
potencial elctrico (E) e inversamente
proporcional al coeficiente de friccin (f)
relativo a la talla y forma de la molcula, o
sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
V=qE/f

La movilidad electrofortica (Me) es un caso particular de la velocidad de migracin de un in,

cuando se aplica un campo elctrico de 1 V/cm.
Su signo es igual al de la carga de la partcula. La velocidad de migracin electrofortica
depende de la densidad de carga de la molcula (relacin carga / peso), del voltaje aplicado y de
la porosidad del gel de electroforesis. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente
porque se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre
separacin, por causa de la difusin por tiempo muy prolongado de la corrida electrofortica.

La mayora de las biomacromolculas (protenas, cidos nucleicos y polisacridos) poseen

determinada carga elctrica con grupos aninicos y catinicos capaces de disociarse. La carga
neta de la partcula est dada por el pH del medio y puede ser modificada por la interaccin con
pequeas molculas de iones u otras macromolculas. De lo anterior se deduce que el pH
influye sobre la velocidad de migracin de las molculas.
En el punto isoelctrico de la biomolcula, pH al cual su carga neta es 0, esta no migra. Por
debajo del punto isoelctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el ctodo, y por encima del
punto isoelctrico tienen carga neta negativa y migra hacia el nodo.

2. Elementos:

SOPORTE: Poliacrilamida

SOLUCIN ACUOSA: SDS

AGENTE REDUCTOR:
mercaptoetanol o ditiotreitol

CAMPO ELCTRICO

BUFFER o TAMPN

CMARA DE
ELECTROFORESIS
MUESTRA

Matriz inerte que acta como filtro

molecular.
Presenta numerosos poros a travs
de los cuales migran las protenas
Potente detergente que despliega las
cadenas polipetidicas de la protena.
Rodea las subunidades cargndolas
negativamente
1 molcula cada 2 enlaces peptdicos.
Rompe enlaces disulfuro
Separa todos los poliptidos de una
protena.

Fuente de emisin de energa para la

movilizacin de las molculas
proteicas
Solucin amortiguadora que mantiene
estable el pH de una disolucin frente
a la adicin de cantidades
relativamente pequeas de cidos o
bases fuertes.
Equipo en el cual se desarrolla la
migracin proteica por accin del
campo elctrico suministrada por una
batera.
Protenas

3. Proceso:

zamiento de la acrilamida para formar una matriz porosa que acta como un filtro molecular

Desplegamiento de las cadenas polipetidicas por accin del DSD.

Formacin de complejos CP SDS que dota de carga negativa.
Migracin de los complejos a travs del gel.

acin de bandas de acuerdo al tamao de las cadenas polipetidicas (CP)

Tincin con Azul de Coomassie.