Análises microbiológicas de alimentos e água

2013
Anlises Microbiolgicas de
Alimentos de Origem Animal e
gua
Mariana Torres de Castro

Tcnica em Alimentos e laticnios
INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E

TECNOLOGIA DO TRIANGULO MINEIRO CAMPUS ITUIUTABA
Sumrio
ANLISES MICROBIOLGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL E GUA ... 4
CONTAGEM PADRO DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS ESTRITOS E
FACULTATIVOS VIVEIS ......................................................................................................... 5
CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS ................................................................................ 7
PROCEDIMENTOS .............................................................................................................. 7
CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR
ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS LQUIDOS UHT ............................................................ 9
CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens................... 13
CONTAGEM DE Staphylococcus aureus................................................................................ 17
CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS 21
CONTAGEM DE Bacillus cereus ............................................................................................ 23
CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTRIAS .......................................................................... 27
NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM
GUA E GELO ...................................................................................................................... 29
NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM
ALIMENTOS ......................................................................................................................... 32
NMERO MAIS PROVVEL DE Staphylococcus aureus ......................................................... 35
NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus (Pescado e Derivados) ....................... 39
NMERO MAIS PROVVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS
CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS UHT E ESTERILIZADOS,
PASTOSOS E VISCOSOS. ....................................................................................................... 46
PESQUISA DE Listeria monocytogenes (alimentos crneos e lcteos). .................................. 51
PESQUISA DE Salmonella (alimentos de origem animal, raes e ingredientes). .................. 58
PESQUISA DE Salmonella POR SEPARAO IMUNOMAGNTICA (IMS)................................. 67
PESQUISA DE Vibrio cholerae .............................................................................................. 70
PESQUISA DE Escherichia coli O157: H7 ............................................................................... 78
PESQUISA DE Paenibacillus larvae subsp. Larvae (produtos da colmeia). ............................. 86
TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL PARA ALIMENTOS DE BAIXA ACIDEZ pH > 4,6 .......... 91
DILUIES E SOLUES .......................................................................................................... 97
DILUIES ........................................................................................................................... 97
2

SOLUES ......................................................................................................................... 102

PROCEDIMENTOS BSICOS DE CONTAGEM ........................................................................... 108
TCNICAS DE CONTAGEM EM PLACAS ............................................................................... 108
TCNICA DE NMERO MAIS PROVVEL ............................................................................. 109
Tabelas de NMP ................................................................................................................ 116
PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE COLNIAS ............................................................... 127
PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO, PESAGEM E DESCARTE DE AMOSTRAS ......................... 137
PROCEDIMENTOS DE MICROSCOPIA ..................................................................................... 143
PROCEDIMENTOS DE COLORAO ........................................................................................ 150
Bibliografia ........................................................................................................................... 159

ANLISES MICROBIOLGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE

ORIGEM ANIMAL E GUA
Essas anlises foram retiradas da Instruo Normativa N 62, de 26 de Agosto de 2003, em que
oficializou os mtodos Analticos para Anlises Microbiolgicas para Controle de Produtos de
Origem Animal e gua.

CONTAGEM PADRO DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS ESTRITOS

E FACULTATIVOS VIVEIS
FUNDAMENTO
Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluies em gar padro para contagem
seguida de incubao em temperatura de 36 1C por 48 horas. Aplica-se a amostras de
matrias-primas, gua e alimentos.
REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

alimentos;
Agar padro para contagem (PCA);
Soluo salina peptonada 0,1%.
EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.
PROCEDIMENTOS
1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra, de
acordo com os procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras.
Adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar, esta a diluio
10-1.
2. Inoculao em placas: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies
desejadas em soluo salina peptonada 0,1%, de acordo com os procedimentos para
diluies e solues. Semear 1 ml de cada diluio selecionada em placas de Petri
estreis. Adicionar de 15 a 20 ml de PCA fundido e mantido em banho-maria a 4648C. Homogeneizar adequadamente o gar com o inculo. Deixar solidificar em
superfcie plana.
3. Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 48 horas.
4. Leitura:
Segundo o tipo de amostra em anlise, realizar a leitura selecionando as placas de acordo com
o seguinte critrio, contando todas as colnias presentes:
Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias;

Amostras de gua: Placas que contenham entre 30 e 300 colnias.

RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra em
anlise, seguindo os procedimentos para contagem de colnias. Expressar o resultado em
UFC/g ou ml.

CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS

FUNDAMENTO
Baseia-se na verificao da capacidade desses microrganismos se desenvolverem em meios de
cultura com pH prximo a 3,5 e temperatura de incubao de 25 1C. A utilizao de meios
acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o crescimento de fungos, inibindo a maioria
das bactrias presentes no alimento.

alimentos;
gar batata glicose 2%;
L(+) cido tartrico 10%;
EQUIPAMENTOS
PROCEDIMENTOS
1. Preparo das placas: fundir o gar batata glicose. Resfriar em banho-maria at 46-48C.
Acidificar o meio at pH 3,5 por meio da adio de 1,5 ml de soluo de cido tartrico
10% para cada 100 ml de meio. Verter nas placas aproximadamente15 a 20 ml. Deixar
solidificar em superfcie plana. Identificar as placas. Antes da utilizao, secar as placas
semiabertas com o fundo voltado para cima em estufa a 50C por aproximadamente
15 minutos, ou em fluxo laminar expondo a superfcie pelo tempo necessrio para a
completa secagem.
2. Pesagem e preparo da amostra: pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra.
Adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Para amostras de doce de leite e
de leite condensado, utilizar como diluente soluo salina peptonada com 20% de
glicose. A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas.
3. Inoculao em placas: Inocular 0,1 ml das diluies selecionadas sobre a superfcie
seca de gar batata glicose 2% acidificado a pH 3,5. Com o auxlio de ala de Drigalsky
ou basto do tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie
do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou
duplicata da mesma diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores
que 100 UFC/g ou ml, distribuir em duplicata 1 ml da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 ml,
0,3 ml e 0,3 ml). No caso de produtos lquidos poder ser inoculado 0,1 ml
diretamente da amostra (10), o que corresponder diluio 10-1.
4. Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 1C, por 5 a 7 dias, em incubadora
de B.O.D.
7

5. Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.

OBSERVAO: No abrir, em hiptese alguma, as placas que contenham crescimento de
fungos, para evitar a contaminao ambiental por meio da disperso dos seus esporos.
RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes e expressar o
resultado em UFC/g ou ml.

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES

DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS LQUIDOS UHT
FUNDAMENTOS
Pr-incubao
Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias e posterior verificao da
ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto.
Contagem em placa
Baseia-se na semeadura da amostra e suas diluies em gar crebro-corao e em gar
nutriente isento de extrato de levedura, seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, e
posterior identificao dos microrganismos presentes.
Limitaes do Mtodo
Devido opacidade produzida pela homogeneizao do meio de cultura com alguns tipos de
amostras, pode haver dificuldade para a contagem de colnias na diluio 100. Nesses casos, o
resultado final deve ser obtido nas diluies subsequentes, o que pode resultar em dados
finais estimados.

alimentos;
gar crebro-corao (ABHI);
gar nutriente isento de extrato de levedura;
gar esculina; Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3);
Caldo vermelho de fenol com glicose; Soluo salina peptonada 0,1%;
gar ureia;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de paraamino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase (comercialmente disponveis);
Perxido de hidrognio 3%;
Alfa-naftilamina 0,5%;
cido sulfanlico 0,8%;
Corantes para colorao de Gram;
Zinco em p; Etanol 70% ou Etanol 70 GL;
Reagentes para colorao de Gram.

EQUIPAMENTOS
PROCEDIMENTOS
Preparo da amostra
Aps a pr-incubao, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes.
Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo desinfetante e aps
com etanol 70% ou etanol 70GL. Deixar secar. Com auxlio de tesouras ou bisturis
previamente esterilizados, abrir a embalagem. Caso se observe alterao evidente
(coagulao, floculao, dessorao, odor no caracterstico ou outros), interromper a anlise
e reportar como produto alterado aps incubao a 36 1C por 7 dias. As amostras que
apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas. Reportar o resultado como
amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao observada.
Contagem em placas
Diluir a amostra em tubos contendo 9 ml de soluo salina peptonada 0,1% at 10-2. Pipetar 1
ml diretamente da amostra (100) e 1 ml de cada uma das diluies preparadas (10-1 e 10-2),
transferindo-as para placas de Petri estreis, em duplicata. Adicionar aproximadamente20 ml
de gar crebro-corao (ABHI) a uma das placas de cada diluio. Nas demais, adicionar
aproximadamente 20 ml de gar nutriente isento de extrato de levedura. Homogeneizar
adequadamente os meios com os inculos. Deixar solidificar. Inverter as placas.
Incubao
Incubar as placas a 30 1C por 72 horas.
Leitura
Verificar a presena de colnias nas placas, contando cada uma e observando suas
caractersticas. Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colnias para a realizao da
contagem, se os resultados de contagem obtidos em ambos os meios forem coerentes entre si.
Se os resultados forem discrepantes entre si, considerar o resultado obtido nas placas de ABHI.
Quando o crescimento bacteriano devido presena de esporos de Bacillus
sporothermodurans na amostra em anlise, ser observado nas placas de ABHI um abundante
crescimento de colnias lisas, de forma regular, com colorao entre branco e bege, com
dimetro mximo de 3 mm, facilmente identificveis. No gar nutriente isento de extrato de
levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente no forma colnias visveis, porm
podero se desenvolver colnias puntiformes, de colorao entre branco e bege.
10

Esta diferenciao necessria porque as colnias de Bacillus sporothermodurans no devem

ser contabilizadas no clculo de mesfilos aerbios viveis capazes de causar alterao no
produto. Quando for observado crescimento em ambos os meios, realizar a contagem nas
placas de ABHI, registrando em separado o nmero de colnias suspeitas de serem Bacillus
sporothermodurans, que devero ser confirmadas de acordo com o que segue: Repicar 3 a 5
colnias suspeitas para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 1C por at 72h. Realizar os
testes confirmatrios.
Testes Confirmatrios
1. Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram.
Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase.
Quando forem observados microrganismos com morfologia e caractersticas diferentes
de bastonetes Gram positivos, reportar o nmero encontrado como a contagem total
de microrganismos aerbios mesfilos.
2. Catalase: Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta
de Pasteur, estreis, transferir a cultura para uma lmina ou placa de vidro contendo
uma gota de perxido de hidrognio 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a
reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao
de borbulhas indica prova positiva para catalase. A maioria dos membros do gnero
Bacillus apresentam reao de catalase positiva. Quando a colorao de Gram
demonstrar a presena de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva
para a cultura em teste, confirmar a presena de Bacillus sporothermodurans por meio
das provas da oxidase, crescimento em anaerobiose, hidrlise da esculina,
fermentao da glicose, reduo do nitrato e produo de urease, conforme abaixo
descrito.
3. Oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plstico,
descartveis e estreis, realizar a prova de oxidase, espalhando a cultura sobre papelfiltro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras para teste de oxidase.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, reaes falso-positivas podem
ocorrer. O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou
vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de uma reao
positiva. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a
prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada pode produzir
reao falso-positiva. O Bacillus sporothermodurans apresenta reao de oxidase
positiva.
4. Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar
em jarra de anaerobiose a 36 1C por 72h. O Bacillus sporothermodurans no cresce
em anaerobiose.
5. Hidrlise da esculina: Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo gar esculina
inclinado. Incubar a 36 1C por 72h. A hidrlise da esculina evidenciada pelo
enegrecimento do meio. O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina.
6. Fermentao da glicose: Semear tubos com caldo vermelho de fenol-base adicionados
de glicose.
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7. Incubar a 36 1C por at 72 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol

para amarelo indica a fermentao do acar presente. O Bacillus sporothermodurans
no fermenta a glicose.
8. Reduo de nitrato: Inocular a cultura, com ala, em tubos contendo caldo BHINO3.
Incubar a 36 1C por 72 horas. Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 ml de alfa
naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 ml de cido sulfanlico 0,8%. O aparecimento de colorao
rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando no houver desenvolvimento
de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p de zinco. Nessa situao, o
aparecimento de colorao rosa indica reao negativa, enquanto que o no
desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus sporothermodurans no reduz
o nitrato a nitrito.
9. Prova da urease: Inocular a cultura, com ala, em tubos ou placas contendo gar ureia.
Incubar a 36 1C por 72h. Observar o crescimento com mudana de colorao para
rosa intenso, o que indica positividade para produo de urease. O Bacillus
sporothermodurans no produz urease.
RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos mesfilos aerbios

viveis presentes na amostra em anlise. O nmero de UFC/ml de Bacillus
sporothermodurans no dever ser reportado como resultado da contagem de
mesfilos aerbios.
Quando estes microrganismos forem encontrados, constar como observao:

Presena de Bacillus sporothermodurans. Somente ser reportado o nmero de
unidades formadoras de colnias de outros mesfilos encontrados.
Devero ainda acompanhar o resultado da anlise informaes adicionais sobre o tipo

de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes
Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s) presente(s),
quando identificado(s).
Os resultados de contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis em leite UHT

a 30C por at 72 horas devem ser expressos em UFC/ml. Para todos os produtos UHT,
o resultado da anlise de pr-incubao por 7 dias a 36 1C deve ser expresso como
alterado ou sem alterao.
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CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens

FUNDAMENTOS
Contagem
Baseia-se na inoculao da amostra ou de uma diluio da mesma em meios de cultura
seletivos. Aps incubao em anaerobiose, os Clostridium formam colnias negras, devido
reao de reduo de sulfito a sulfeto, que reage com citrato de amnio e ferro III, formando
um precipitado negro.
Fermentao tempestuosa
Baseia-se na verificao da fermentao tempestuosa do leite presente no meio leite com
ferro, caracterstica do Clostridium perfringens.p. Essa fermentao caracteriza-se por
formao de cogulo bem definido, com grande formao de gs, durante incubao
temperatura seletiva de 46 1C.
Testes confirmativos
A confirmao de Clostridium perfringens se faz por meio de provas confirmativas, com as
quais se evidenciam suas caractersticas de: imobilidade, reduo de nitratos, produo de
cido e gs a partir da lactose, fermentao da rafinose e liquefao da gelatina.

alimentos;
Soluo salina peptonada 0,1%;
gar triptose - sulfito - cicloserina (TSC)- base ou gar Sahid Ferguson Perfringens (SFP)
- base;
gar estoque;
gar motilidade - nitrato tamponado;
Meio leite com ferro; Meio lactose-gelatina;
Caldo vermelho de fenol-base;
Soluo de rafinose 10%;
Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi);
Meio tioglicolato;
Alfa naftilamina 0,5%;
Soluo de cicloserina 5%;
Polimixina B; Kanamicina;
Vaspar ou leo mineral ou parafina lquida;
Gerador de anaerobiose;
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EQUIPAMENTOS
PROCEDIMENTOS
Pesagem e preparo da amostra

Pesar 25 0,2 g da amostra, adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1% e
homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1.
Inoculao em Placas
A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas, a partir das diluies escolhidas,
semear alquotas de 1 ml em placas estreis e adicionar aproximadamente15 ml de gar TSC
ou SFP em temperatura de 46 - 48C. Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em
superfcie plana. Aps, adicionar uma segunda camada de aproximadamente 10 ml do mesmo
meio. Deixar solidificar em superfcie plana.
Incubao
Imediatamente aps a solidificao do gar, incubar as placas (sem inverter), em jarra de
anaerobiose a 36 1C por 18 a 24 horas.
Seleo e Isolamento
As colnias tpicas de Clostridium sulfito redutores so negras e de tamanho varivel de 1 a 3
mm no gar TSC e no gar SFP. Selecionar placas que contenham entre 20 e 200 colnias
tpicas. Contar todas as colnias negras presentes. Anotar o resultado. Esse resultado,
multiplicado pela diluio usada, corresponde ao nmero de Clostridium sulfito redutor
presentes por grama da amostra em anlise. Escolher 5 colnias negras e repicar para tubos
com gar estoque. Incubar em anaerobiose a 36 1C por no mnimo 24 horas. Paralelamente,
repicar para meio tioglicolato ou caldo de carne cozida (com selo estril de vaspar ou vaselina
ou parafina lquida ou leo mineral).
Testes confirmativos para Clostridium perfringens

1. Colorao de Gram: A partir de cultura pura em gar estoque ou dos meios usados
paralelamente, preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. Quando for
verificada a presena de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Grampositivos, realizar a prova de fermentao tempestuosa.
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2. Fermentao tempestuosa (storm test): Transferir 1 ml da cultura fresca obtida no

meio tioglicolato ou no caldo de carne cozida para um tubo contendo meio leite com
ferro. Adicionar o selo estril e incubar a 46 1C em banho-maria por 6 horas
(reincubar por maior tempo (12 a 18 h) quando o controle positivo no apresentar
reao claramente positiva). Alternativamente, pode ser utilizada uma suspenso da
cultura em teste, obtida pela lavagem da superfcie do gar estoque com soluo
salina peptonada 0,1%, transferindo 1 ml desta para o meio leite com ferro. O
Clostridium perfringens geralmente coagula o leite em at 6 horas a 46C, com
formao de cogulo firme e grande quantidade de gs (fermentao tempestuosa).
A partir das culturas que se apresentaram como C.perfringens na colorao de Gram e
ofereceram resultado positivo na prova de fermentao tempestuosa, realizar as
seguintes.
3. Prova da motilidade: Inocular a cultura, com agulha, em gar motilidade-nitrato
tamponado. Incubar em anaerobiose a 36 1C por 24 horas. O Clostridium
perfringens imvel, com crescimento apenas ao longo da linha de inoculao.
4. Prova da reduo do nitrato: Aps a leitura da motilidade, acrescentar ao gar 0,5 a 1
ml de soluo de alfa-naftilamina 0,5% e 0,5 a 1 ml de cido sulfanlico 0,8%. O
aparecimento de colorao vermelha indicar a reduo do nitrato a nitrito. Para
confirmao do resultado negativo, acrescentar alguns miligramas de p de zinco. O
aparecimento de uma cor rosa ser indicativo da no reduo do nitrato, enquanto
que a no alterao de cor ser indicativa de reao positiva para reduo do nitrato.
O Clostridium perfringens reduz nitrato a nitrito.
5. Fermentao da lactose e liquefao da gelatina: Inocular a cultura, com agulha, em
vrios pontos do meio lactose-gelatina. Se o meio for utilizado 8 ou mais horas aps a
sua preparao, regener-lo por aquecimento a 50C por 2 horas em banho-maria,
antes da inoculao. Incubar em anaerobiose a 36 1C por 44 2h. Aps a incubao,
manter os tubos em geladeira por 1 hora. Observar a fermentao da lactose pela
produo de bolhas de gs e pela mudana da cor do meio de vermelho para amarelo
e tambm a liquefao da gelatina por meio da permanncia do estado lquido aps o
resfriamento por aproximadamente1 hora em geladeira. O Clostridium perfringens
fermenta a lactose e liquefaz a gelatina em 44 2h a 36 1C.
6. Fermentao da rafinose: Repicar a cultura para tubo contendo caldo para
fermentao da rafinose. Aps inoculao, adicionar 1 a 2 ml de selo estril: vaspar ou
vaselina ou parafina lquida ou leo mineral. Incubar a 36 1C por 72 2h. Verificar a
fermentao da rafinose pela viragem da cor do indicador vermelho de fenol para
amarelo. As provas de liquefao da gelatina em 44 2h horas e a fermentao da
rafinose em 72 2h tornam possvel a diferenciao entre Clostridium perfringens e
outros clostrdios imveis e redutores de nitrato como o Clostridium celatum,
Clostridium sardiniense e Clostridium paraperfringens. O Clostridium perfringens
fermenta a rafinose dentro de 72 2h.
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CARACTERSTICAS DIFERENCIAIS DE CLOSTRDIOS

Meio motilidade nitrato
Espcies de Clostridium
Motilidade
Nitrato
C. perfringens A
C.perfringens B
C. absonum
C. baratii
C. celatum
C. paraperfringens
C. sardiniense
+
+
+
+
+
+
(+)
Meio lactose-gelatina
Liquefao.
cido/ gs
gelatina
AG/T
+ (48h)
AG/T
+ (48/72h)
AG/CS
-*
AG/CS
AG/CS
AG/CS
AG/CS
-*
A = cido; AG = cido e gs; T = turbidez; CS = claro com sedimento celular; + = positiva; - =

negativa; (+) = fraco; = motilidade fraca; * = hidrlise lenta da gelatina.
RESULTADOS
Clculo do nmero de Clostridium sulfito redutor presentes na amostra: Calcular o

nmero de Clostridium sulfito redutores multiplicando o nmero de colnias negras
contadas no gar TSC ou no gar SFP pelo fator de diluio usado.
Clculo do nmero de Clostridium perfringens: Considerar como Clostridium
perfringens as colnias que se apresentarem, na colorao de Gram, como bastonetes
Gram positivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de
fermentao tempestuosa, imveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose
em 44 2h, da rafinose em at 72 2h e capazes de hidrolisar a gelatina em 44 2h.
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes. Expressar
o resultado em UFC/g.
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CONTAGEM DE Staphylococcus aureus

FUNDAMENTOS
Contagem
Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras em gar Baird-Parker, cuja
composio evidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presena de 0,01 a
0,05% de telurito de potssio em combinao com 0,2 a 0,5 % de cloreto de ltio e 0,12 a
1,26% de glicina. O Staphylococcus aureus reduz anaerbia e aerobiamente o telurito de
potssio, produzindo colnias negras. O gar Baird-Parker suplementado com soluo de gema
de ovo possibilita a verificao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus,
por meio do aparecimento de um halo de transparncia e um de precipitao ao redor da
colnia, respectivamente.
Prova da coagulase
Baseia-se na comprovao da capacidade de coagular o plasma de coelho pela ao da enzima
coagulase produzida pelo microrganismo.
Provas complementares
1. Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e
tintoriais do microrganismo.
2. Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos pela
ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo
aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de toluidina e de
clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila.
3. Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o
perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da
formao de borbulhas.
Limitaes do Mtodo
A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de
coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido ao fato de que algumas
espcies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini
e S. schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas. Cepas de S. schleiferi ssp
schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reao na prova da coagulase.
Alm disso, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de termonuclease positiva.
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alimentos;
gar Baird-Parker - base;
gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse, com verde de metila;
gar estoque;
Caldo crebro-corao (BHI);
Soluo salina 0,85%;
Emulso de gema de ovo a 50%;
Telurito de potssio 3,5%;
Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA;
Etanol 70% ou Etanol 70 GL;
EQUIPAMENTOS
PROCEDIMENTOS

Pesar 25 0,2 g da amostra, adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Essa a diluio 10-1.
Inoculao
A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas. Inocular, sobre a superfcie seca
do gar Baird-Parker, 0,1 ml de cada diluio selecionada. Com o auxlio de ala de Drigalsky ou
basto do tipo hockey, espalhar o inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio,
at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma
diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou ml, distribuir
em duplicata 1 ml da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 ml, 0,3 ml e 0,3 ml). No caso de produtos
lquidos podero ser inoculado 0,1 ml diretamente da amostra (10), o que corresponder
diluio 10-1.
Incubao
Incubar as placas invertidas a 36 1C por 30 a 48 horas.
Leitura
18

Selecionar as placas que contenham entre 20 e 200 colnias. Contar as colnias tpicas (T):
negras brilhantes com anel opaco, rodeadas por um halo claro, transparente e destacado
sobre a opacidade do meio. Contar tambm colnias atpicas (A): acinzentadas ou negras
brilhantes, sem halo ou com apenas um dos halos. Registrar separadamente as contagens de
colnias tpicas e atpicas. Selecionar 3 a 5 colnias de cada tipo (T) e/ou (A) e semear cada
colnia em tubos contendo BHI, para confirmao. Incubar a 36 1C, por 24 horas.
Observao: para a obteno do nmero final de UFC/ml ou g, utilizar, de preferncia, apenas
uma diluio, pois, uma colnia atpica pode tornar-se tpica na diluio subsequente em
funo da maior disponibilidade de nutrientes e pela menor competio bacteriana.
Prova da coagulase
1. Transferir 0,3 ml de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 ml
de plasma de coelho.
2. Incubar a 36 1C por 6 horas.
3. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir:
a.
b.
c.
d.
e.
Reao negativa: no formao de cogulo;

Reao 1+: cogulo pequeno e desorganizado;
Reao 2+: cogulo pequeno e organizado;
Reao 3+: cogulo grande e organizado;
Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo, que no se desprender
quando o tubo for invertido;
4. Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para
Staphylococcus aureus;
5. Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova negativa para
Staphylococcus aureus.
6. Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para
um tubo contendo gar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 1C por
24 horas, para a realizao dos testes complementares.
Testes complementares
A partir da cultura pura em BHI ou gar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas:
1. Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A
ausncia de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus
aureus. A presena de cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao
de testes complementares.
2. Pesquisa de termonuclease: Fazer orifcios equidistantes com
aproximadamente 2 mm de dimetro no gar para ensaio de termonuclease
ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas.
Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria
19

fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um

orifcio para cada cultivo a ser analisado.
3. Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas. O aparecimento, ao
redor dos orifcios, de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de
clarificao no gar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo
de reao positiva para termonuclease. Considerar como positivas as culturas
que apresentarem halo de dimetro superior a 1 mm O Staphylococcus aureus
termonuclease positiva.
4. Prova da catalase: Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de
madeira ou Pipeta de Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar
estoque e transferir para uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de
perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a
reao. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A
formao de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus
aureus catalase positiva.
RESULTADOS
Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias

selecionadas e repicadas, o resultado ser igual contagem inicial, levando-se em
considerao a diluio utilizada. Quando o nmero de colnias confirmadas for
diferente do nmero de colnias selecionadas e repicadas, calcular a proporo de
colnias positivas.
O resultado final ser a soma dos resultados de colnias tpicas e atpicas confirmadas.
Expressar o resultado como: Contagem de Staphylococcus aureus: Xx 10y UFC/ g ou ml
ou Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: Xx10y UFC/ g ou ml.
20

CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM

ALIMENTOS
FUNDAMENTOS
Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em
gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das colnias suspeitas. O
gar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composio sais biliares e cristal
violeta, responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um
indicador de pH que revela a fermentao da lactose pelos microrganismos presentes. A
adio de sobrecamada visa a preveno do crescimento e do espraiamento de colnias na
superfcie do gar.
Prova confirmativa para coliformes totais; A confirmao da presena de coliformes totais
feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e
posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de Durham evidencia a
fermentao da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta
em sua composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante)
responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos.
Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmao da presena de coliformes
termotolerantes feita por meio da inoculao das colnias suspeitas em caldo EC e posterior
incubao em temperatura seletiva de 45 0,2C, em banho-maria com agitao ou circulao
de gua. A presena de gs nos tubos de Durham evidencia a fermentao da lactose presente
no meio. O caldo EC apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere
um poder tamponante impedindo a sua acidificao. A seletividade devido a presena de sais
biliares responsveis pela inibio de microrganismos Gram positivos.
Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

alimentos;
gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);
Caldo verde brilhante bile 2% lactose;
Caldo EC;
EQUIPAMENTOS

Banho-maria com movimentao de gua (agitao ou circulao).
21

PROCEDIMENTOS
1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra.
Adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por
aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.
2. Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas.
3. Leitura: A presena de coliformes totais confirmada pela formao de gs (mnimo
1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescncia quando agitado
gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada colnia, bem como a diluio
utilizada.
4. Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero
vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo
devero ser reincubados por mais 24 horas.
Coliformes termotolerantes
1. Inoculao: Inocular as culturas suspeitas de coliformes termotolerantes em tubos
contendo caldo
2. Incubao: Incubar os tubos a 45 0,2C, por 24 a 48 horas em banho-maria com
agitao.
3. Leitura: A presena de coliformes termotolerantes confirmada pela formao de gs
(mnimo 1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescncia quando agitado
gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluio utilizada.
Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero
vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo
devero ser reincubados por mais 24 horas.
RESULTADOS
Para alimentos comercializados no MERCOSUL, os resultados de contagem de coliformes totais
se referem determinao contagem de coliformes a 35C e os resultados da contagem de
coliformes termotolerantes correspondem determinao coliformes a 45C. Para o clculo
final das contagens de coliformes totais e termotolerantes. Expressar o resultado em UFC/g ou
ml.
22

CONTAGEM DE Bacillus cereus

FUNDAMENTOS
Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em gar
polimixina gema de ovo vermelho de fenol (MYP) ou em gar cereus (PEMBA).
Em ambos adicionada emulso de gema de ovo que objetiva a verificao da produo de
lecitinase pelo B.cereus. No gar PEMBA, a presena de 0,1% de peptona associada ao piruvato
de sdio evidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo adicionada ao meio.
A polimixina B um agente seletivo utilizado nos dois meios, que atua sobre a flora
acompanhante. No PEMBA, quando um grande nmero de leveduras esperado no alimento,
poder ser adicionada tambm cicloheximide (40g/ml) como agente seletivo.
Estes dois meios contm manitol, carbohidrato no fermentado pelo B.cereus. No MYP, o
indicador de pH o vermelho de fenol e no PEMBA, o azul de bromotimol.
Provas Bioqumicas: A identificao bioqumica de Bacillus cereus baseia-se na verificao de
produo de -hemolisina, motilidade em meio semislido, na capacidade de decomposio
da tirosina, reduo do nitrato a nitrito, verificao do tipo de crescimento em superfcie de
gar nutriente, e da no produo de corpsculos de incluso cristalina.

alimentos;
gar nutriente;
gar manitol gema de ovo polimixina segundo Mossel (MYP) ou gar cereus (PEMBA);
gar estoque;
gar Columbia sangue de carneiro desfibrinado;
gar tirosina; gar motilidade - nitrato;
cido sulfanlico soluo 0,8%;
Alfa naftilamina soluo aquosa 0,5%;
Polimixina B - soluo contendo 5.000 UI/ml;
Emulso de gema de ovo 50%; Sangue de carneiro desfibrinado;
cido actico 5N;
Zinco em P; Reagentes para colorao de corpsculos de incluso cristalina;
EQUIPAMENTOS
23

PROCEDIMENTOS
1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra,
adicionar 225 ml da soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por
2. Inoculao: A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas. Inocular
sobre a superfcie seca do gar MYP ou gar PEMBA 0,1 ml de cada diluio
selecionada. Com auxilio de ala de Drigalsky ou basto tipo hockey, espalhar o
inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio at completa absoro. Utilizar,
no mnimo, duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que
for necessria a obteno de resultado menor que 100 UFC/g ou ml distribuir 1 ml da
diluio 10-1 em 3 placas (0,4 ml, 0,3 ml e 0,3 ml). No caso de amostras lquidas,
poder ser inoculado 0,1 ml diretamente da amostra.
3. Incubao: Incubar as placas invertidas a 30 1C por 30 a 48 horas.
4. Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as
colnias rodeadas por um halo de precipitao opaco sobre um fundo rseo, no gar
MYP e azul turquesa com aspecto recortado, com aproximadamente 5 mm de
dimetro e rodeadas por halo de precipitao de lecitina hidrolisada, no gar PEMBA.
Selecionar 3 a 5 colnias tpicas e seme-las em tubos com gar estoque inclinado.
Incubar a 36 1C por 24 horas. De cada tubo, fazer esfregao e corar pelo mtodo
Gram para verificar a presena de bastonetes curtos Gram positivos, com
extremidades quadradas dispostos em cadeias. Os esporos so centrais ou
subterminais.
5. Das culturas puras em gar estoque inclinado, realizar as seguintes provas:
Identificao Bioqumica
1. Motilidade e reduo de nitrato: Inocular, com agulha, tubos contendo gar
motilidade-nitrato. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps incubao, verificar o
tipo de crescimento presente. Culturas imveis mostram crescimento apenas na linha
de inoculao, enquanto que as mveis crescem de forma difusa. O Bacillus cereus em
50 a 90% dos casos mostra-se mvel. Aps a leitura da motilidade, adicionar aos tubos
2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de cido sulfanlico 0,8%. O
aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato. Quando
no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns miligramas de p
de zinco. Nesta situao, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa,
enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade. O Bacillus cereus
reduz o nitrato a nitrito.
2. -hemlise em gar sangue de carneiro: Inocular por estria em placa com gar sangue
de carneiro. Incubar a 36 1C por 24 horas. Observar a produo de -hemlise
caracterstica do Bacillus cereus. Bacillus cereus produtor de -hemlise.
3. Decomposio da tirosina: Inocular por estrias a superfcie de gar tirosina (inclinado
em tubo ou distribudo em placas). Incubar a 36 1C por 48 horas. Aps incubao,
observar o aparecimento de uma zona clara prxima ao crescimento produzida pela
24

decomposio da tirosina. Nos casos em que houver dvidas, reincubar por at 7 dias
a 36 1C. O Bacillus cereus decompe a tirosina.
4. Crescimento rizide: Inocular com ala sobre a superfcie seca de gar nutriente,
depositando o inculo no ponto central da placa. Incubar a 36 1C por 48 a 72 horas.
Aps incubao verificar o tipo de crescimento. Crescimento rizide se caracteriza pelo
aparecimento de colnias com longas extenses em forma de razes ou longos fios,
tpicas de Bacillus mycoides. O Bacillus cereus no apresenta crescimento rizide,
porm algumas cepas podem apresentar colnias rugosas em forma de galxia.
5. Teste para verificao da presena de corpsculos de incluso cristalina. A partir das
culturas suspeitas repicadas em gar estoque inclinado (item 5.5) e deixadas em
temperatura ambiente por 2 a 3 dias, verificar a presena de corpsculos de incluso
cristalina. A presena de cristais tetragonais de toxina so abundantes em culturas
velhas (3-4 dias) de Bacillus thuringiensis, que so liberados somente aps a lise do
esporngio. Verifica-se ento a presena dos cristais e esporos livres. O Bacillus cereus
no produz corpsculos de incluso cristalina.
PROVAS DIFERENCIAIS PARA MICRORGANISMOS DO GNERO Bacillus
Bacillus
megaterium
Colorao de
Gram
Catalase
Motilidade
Reduo de
nitrato
Hemlise em
sangue de
carneiro
Decomp. da
tirosina
Bacillus cereus
Bacillus
thuringiensis
Bacillus
mycoides
Bacillus
anthracis
+
+
+a
+
b
+
+
+
+
-c
+
+
-
-d
-d
-d
Corpsc. de
incluso
cristalina
Crescimento
rizide
a: 90 a 100% so positivos
b: 50 a 90% so positivos
c: 90 a 100% so negativos
d: a maioria negativa
25

RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra em
anlise. Calcular o nmero de Bacillus cereus multiplicando o nmero de colnias confirmadas,
nas provas confirmativas, pelo fator de diluio usado. Expressar o resultado em UFC/g ou ml.
26

CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTRIAS

FUNDAMENTOS
Contagem: Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras testadas em gar
cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG), cuja composio evidencia a habilidade dos
microrganismos fermentarem a glicose com produo de cido, reao indicada por uma
viragem do indicador a vermelho e a precipitao de sais biliares ao redor das colnias. A
seletividade exercida pela presena de cristal violeta e bile no meio.

alimentos;
gar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG);
gar estoque;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de paraamino-dimetilanilina), ou tiras de papel para teste de oxidase;
Reativos para colorao de Gram.
EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos, obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.
PROCEDIMENTOS
1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra,
adicionar 225 ml de soluo salina 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60
segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.
2. Inoculao: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em
soluo salina peptonada 0,1%. Inocular 1 ml de cada diluio em placas de Petri
esterilizadas. Adicionar a cada placa aproximadamente15 ml de gar cristal violeta
vermelho neutro bile glicose previamente fundido e mantido a 46C-48C em banhomaria. Homogeneizar cuidadosamente o inculo com o meio e deixar em repouso at
total solidificao. Aps adicionar uma Segunda camada com o mesmo meio e deixar
solidificar.
3. Incubao: Aps completa solidificao do meio, incubar as placas em posio
invertida em temperatura de 36 1C por 18 a 24 horas.
4. Leitura: Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colnias. Contar as colnias
de colorao vermelha, rodeadas ou no por halo de precipitao da bile presente no
meio, com 0,5 a 2 mm de dimetro e anotar os resultados de contagem. Selecionar 3 a
5 colnias tpicas e repicar para tubos com gar estoque inclinado. Incubar a 36 1C
por 24 horas. Realizar a prova da oxidase.
27

5. Prova da oxidase: Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira

estreis, ou de plstico descartveis estreis, realizar a prova da oxidase espalhando a
cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de
papel com reativo para oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a
20 segundos. Aps este tempo, reaes falso-positivas podem ocorrer. O
aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno diamina) ou vermelho
intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. No
utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova da
oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao
falso-positiva. Todas as enterobactrias apresentam reao de oxidase negativa.
6. Colorao de Gram: Das colnias oxidase negativas, preparar esfregao e corar pelo
mtodo de Gram. Todas as enterobactrias apresentam-se como bastonetes Gram
negativos.
RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes. Expressar o
resultado em UFC/g ou ml.
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NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES

TERMOTOLERANTES EM GUA E GELO
FUNDAMENTOS
Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio, em que
a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durham, produzido
pela fermentao da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua
composio, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua
acidificao. A seletividade do meio se deve presena do lauril sulfato de sdio, um agente
surfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram
positivos, inibindo o seu crescimento.
Prova confirmativa para coliformes totais: confirmao da presena de coliformes totais feita
por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose, na prova
presuntiva, em caldo verde brilhante bile 2% lactose, e posterior incubao a 36 1C. A
presena de gs nos tubos de Durham do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da
lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua
composio bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante),
responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos.
termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao em temperatura
seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presena de
gs nos tubos de Durham evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC
apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder
tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena de sais
biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos.
alimentos;
Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples;
Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla;
Caldo verde brilhante bile 2% lactose;
Caldo EC;
EQUIPAMENTOS

29

PROCEDIMENTOS
Preparo da amostra: Preparar a amostra de gua. No caso de amostras de gelo, quando
encaminhadas em frascos de boca larga, deixar descongelar no prprio frasco, sob
refrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo descongelamento. Antes do incio da
anlise, homogeneizar bem. Quando o gelo for encaminhado em sacos plsticos, colocar a
amostra dentro de outro saco plstico resistente (sem perfuraes) e deixar descongelar, sobrefrigerao, pelo perodo necessrio para seu completo descongelamento. Aps
descongelamento total, verificar a presena de gua no saco plstico de proteo da amostra,
o que indica a presena de perfuraes na embalagem do gelo. Nesse caso, no analisar a
amostra. Da mesma forma, as amostras de gelo que chegarem descongeladas ou em
descongelamento devero ser descartadas. Quando a embalagem da amostra de gelo mostrar
evidncias de que no continha perfuraes, aps o descongelamento total, homogeneizar
bem e proceder anlise, seguindo o procedimento estabelecido para amostras de gua.
Prova presuntiva
1. Inoculao: Inocular volumes de 10 ml da amostra a ser analisada em uma srie de 3
tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla. Inocular volumes
de 1 ml da amostra na segunda srie de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sdio
em concentrao simples e volumes de 1 ml da diluio 10-1 na terceira srie de 3
tubos contendo o mesmo meio.
2. Observao: caso seja necessrio um maior nmero de diluies. Neste caso, inocular
volumes de 1 ml de cada uma das diluies efetuadas em sries de 3 tubos contendo
caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples. Quando o limite de aceitao
for <2,0/100ml, usar sries de 5 tubos. Quando o limite de aceitao for <1,0/100ml,
usar sries de 10 tubos.
4. Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de
Durham (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado gentilmente.
Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.
Observao: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero vlidos os
resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero ser reincubados
por mais 24 horas.
Prova confirmativa
Coliformes Totais
1. Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio obtido na prova
presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose.
30


gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.
por mais 24 horas.
Coliformes termotolerantes
presuntiva, para tubo contendo caldo EC.
agitao ou circulao de gua.
por mais 24 horas.
RESULTADOS
A partir da combinao de nmeros correspondentes aos tubos que apresentaram resultado
positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes),
verificar o Nmero Mais Provvel. Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o
caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/100 ml.
31

NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES

TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS
FUNDAMENTOS
Prova presuntiva: Baseia-se na inoculao da amostra em caldo lauril sulfato de sdio, em que
a presena de coliformes evidenciada pela formao de gs nos tubos de Durham, produzido
pela fermentao da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sdio apresenta, em sua
composio, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua
acidificao. A seletividade do meio se deve presena do lauril sulfato de sdio, um agente
surfactante aninico que atua na membrana citoplasmtica de microrganismos Gram
positivos, inibindo o seu crescimento.
Prova confirmativa para coliformes totais: A confirmao da presena de coliformes totais
feita por meio da inoculao dos tubos positivos para a fermentao de lactose em caldo verde
brilhante bile lactose 2% e posterior incubao a 36 1C. A presena de gs nos tubos de
Durham do caldo verde brilhante evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O
caldo verde brilhante bile lactose 2% apresenta, em sua composio, bile bovina e um corante
derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio dos microrganismos
Gram positivos.
termotolerantes feita por meio da inoculao em caldo EC, com incubao em temperatura
seletiva de 45 0,2C a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presena de
gs nos tubos de Durham evidencia a fermentao da lactose presente no meio. O caldo EC
apresenta em sua composio uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder
tamponante, impedindo a sua acidificao. A seletividade do meio se deve presena de sais
biliares, responsveis pela inibio dos microrganismos Gram positivos.

alimentos;
Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples;
Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla;
Caldo verde brilhante bile lactose 2%;
Caldo EC;
EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Banhomaria com movimentao de gua (agitao ou circulao).
32

PROCEDIMENTOS
Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra, adicionar
225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos
em stomacher. Esta a diluio 10-1.
Prova presuntiva
1. Inoculao
Produtos slidos, pastosos e creme de leite pasteurizado.
A partir da diluio inicial (10-1), inocular volumes de 10 ml em srie de 3 tubos

contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao dupla (corresponde diluio
100).
A seguir, inocular volumes de 1 ml da diluio inicial (10-1) em uma srie de 3 tubos
contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples.
A partir da diluio 10-1, preparar a diluio 10-2 em soluo salina peptonada 0,1% de
acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, roteiro anterior.
Inocular 1 ml da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos.
Havendo necessidade, outras diluies decimais podem ser inoculadas em sries de 3
tubos.
Produtos lquidos
Diretamente da amostra (100), inocular volumes de 1 ml em uma srie de 3 tubos

contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples;
Transferir tambm 1 ml da amostra para tubo contendo soluo salina peptonada
0,1% de forma a obter a diluio 10-1.
A partir da diluio 10-1, efetuar as demais diluies desejadas em soluo salina
peptonada 0,1% de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e
solues, roteiro anterior.
A seguir, inocular volumes de 1 ml da diluio 10-1 na segunda srie de 3 tubos
contendo caldo lauril sulfato de sdio em concentrao simples.
Inocular 1 ml da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos.
Havendo necessidade, outras diluies decimais podero ser inoculadas em sries de 3
tubos.

3. Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de
Durham (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado gentilmente;
Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.
33

por mais 24 horas.
Prova confirmativa
Coliformes Totais
presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose.
gentilmente. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.
por mais 24 horas.
Coliformes Termotolerantes
1. Inoculao: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sdio, obtido na prova
presuntiva, para tubo contendo caldo EC.
agitao ou circulao de gua.
por mais 24 horas.
RESULTADOS
positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes),
verificar o Nmero Mais Provvel. Certificar-se que a tabela de NMP usada a indicada para o
caso especfico. Expressar o valor obtido em NMP/g ou ml.
34

NMERO MAIS PROVVEL DE Staphylococcus aureus

FUNDAMENTOS
Determinao do NMP
1. Baseia-se na inoculao das diluies desejadas das amostras sob teste em caldo
telurito manitol glicina, segundo Giolitti e Cantoni ou Caldo soja triptona com sal 10% piruvato de sdio 1% (TSB-NP), com posterior confirmao em gar Baird-Parker.
2. No caldo TSB-NP, a alta concentrao de NaCl (10%) atua seletivamente, inibindo o
crescimento de microbiota acompanhante que no apresente capacidade de se
desenvolver nesta condio.
3. O Staphylococcus aureus reduz, anaerbia e aerobiamente, o telurito de potssio,
produzindo escurecimento do caldo Giolitti e Cantoni, bem como colnias negras no
gar Baird-Parker.
4. O gar Baird-Parker, enriquecido com soluo de gema de ovo, possibilita a
evidenciao das atividades proteoltica e lipoltica do Staphylococcus aureus,
respectivamente, por meio do aparecimento de um halo de precipitao e um de
transparncia ao redor da colnia.
Prova da coagulase
Baseia-se na comprovao da capacidade do microrganismo de coagular o plasma de coelho
pela ao da enzima coagulase.
1. Colorao de Gram: Baseia-se na verificao das caractersticas morfolgicas e
tintoriais do microrganismo.
2. Prova da termonuclease: Baseia-se na degradao do DNA em oligonucleotdeos pela
ao da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A reao evidenciada pelo
aparecimento de um halo de colorao rsea no gar azul de toluidina e de
clarificao, quando utilizado o gar para teste de DNAse com verde de metila.
3. Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o
perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da
Limitaes do Mtodo
A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de
coagulase, apresenta limitaes quanto especificidade, devido ao fato de algumas espcies
de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S.
schleiferi ssp coagulans, tambm serem coagulase positivas;
35

Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reao
na prova da coagulase. Alm disto, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reao de
termonuclease positiva.

alimentos;
gar Baird-Parker-base;
gar azul de toluidina - DNA ou gar para ensaio de DNAse com verde de metila;
gar estoque;
Caldo soja triptona sal 10%-piruvato de sdio 1% (TSB-NP) ou Caldo telurito manitol
glicina segundo; Giolitti e Cantoni (GC);
Caldo crebro-corao (BHI);
Soluo salina 0,85%;
Soluo de azul de toluidina 1%;
Emulso de gema de ovo a 50%;
Telurito de potssio 3,5%;
Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA;
EQUIPAMENTOS
PROCEDIMENTOS
1. Pesagem e preparo da amostra
Alimentos slidos
Pesar 25 0,2 g da amostra. Adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no stomacher. Esta a diluio 10-1. A
partir da diluio inicial 10-1. Inocular 1 ml de cada diluio selecionada em trs sries de trs
tubos contendo caldo telurito manitol glicina (GC) ou caldo TSB-NP. Adicionar a cada tubo de
caldo GC uma camada de 1 a 2 ml de selo estril (vaspar, vaselina, leo mineral ou parafina
lquida, estreis e previamente fundidos).
Alimentos lquidos
36

Pipetar 1 ml diretamente da amostra e transferir para cada um dos trs tubos contendo caldo
GC ou caldo TSB-NP. Transferir tambm 1 ml da amostra para um tubo contendo 9 ml de
soluo salina peptonada 0,1% (diluio 10-1). A partir da diluio inicial 10-1. Inocular 1 ml das
duas diluies subsequentes em sries de trs tubos com caldo GC ou caldo TSB-NP. Adicionar
uma camada de 1 a 2 ml de selo estril (vaspar, vaselina, leo mineral ou parafina lquida,
estreis e previamente fundidos) a cada tubo de caldo GC.
2. Incubao: Incubar a 36 1C por 48 horas.
3. Leitura: Fazer a leitura anotando os tubos que apresentarem escurecimento do meio
ou precipitado negro em caldo GC e turvao em caldo TSB-NP.
Provas confirmatrias
1. Com pipetas de Pasteur estreis, retirar do fundo de cada tubo de caldo GC positivo
uma gota da cultura e coloc-la sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker, junto
borda da placa, estriando posteriormente com ala, de forma a obter colnias
isoladas.
2. A partir dos tubos de caldo TSB-NP que apresentarem turvao, com auxlio de ala de
platina ou nquel-cromo, repicar sobre a superfcie seca de gar Baird-Parker.
3. Incubar a 36 1C por 30 a 48 horas.
4. Selecionar de 2 a 3 colnias negras, brilhantes, com anel opaco de precipitao e/ou
rodeadas por halo transparente, correspondentes a cada um dos tubos positivos e
repicar cada colnia para um tubo contendo caldo BHI.
6. A partir das culturas em BHI, efetuar a prova da coagulase.
Prova da coagulase
1. Transferir 0,3 ml de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estreis contendo 0,3 ml
de plasma de coelho.
2. Incubar a 36 1C, por 6 horas.
3. Verificar a presena de cogulos, considerando os critrios a seguir:
Reao negativa: no formao de cogulo;

Reao 1+ : cogulo pequeno e desorganizado;
Reao 2+ : cogulo pequeno e organizado;
Reao 3+ : cogulo grande e organizado;
Reao 4+: coagulao de todo o contedo do tubo que no se
desprender quando o tubo for invertido;
Quando a reao de coagulao for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para
Staphylococcus aureus; Quando a reao de coagulao for negativa, considerar a prova
negativa para Staphylococcus aureus;
37

Quando a reao for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um
tubo contendo gar estoque ou caldo BHI. Incubar a 36 1C por 24 horas para a realizao
dos testes complementares.
A partir da cultura pura em caldo BHI ou gar estoque, realizar as seguintes provas
confirmativas:
1. Colorao de Gram: Preparar esfregao e corar pelo mtodo de Gram. A ausncia de
cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presena de
cocos Gram positivos indica a necessidade da realizao de testes complementares.
2. Pesquisa da termonuclease:
Fazer orifcios equidistantes, com cerca de 2 mm de dimetro, no gar para ensaio da

termonuclease ou no gar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas.
Colocar os tubos das culturas mantidas em caldo BHI em banho-maria fervente por 15
minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifcio para cada cultivo a ser
analisado.
Incubar a 36 1C por 4 horas ou a 50 2C por 2 horas.
O aparecimento de um halo rosa no gar azul de toluidina ou de um halo de
clarificao no gar para ensaio de DNAse com verde de metila, ser indicativo de
reao positiva para termonuclease.
Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de dimetro superior a 1
mm. O Staphylococcus aureus termonuclease positiva.
3. Prova da catalase
Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de

Pasteur, estreis, retirar uma alquota do cultivo em gar estoque e transferir para
uma lmina ou placa de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%.
Misturar o inculo ao perxido e observar a reao.
A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase.
A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase.
O Staphylococcus aureus catalase positiva.
RESULTADOS
positivo em cada um dos testes confirmativos, verificar o Nmero Mais Provvel. Certificar-se
de que a tabela de NMP em uso a indicada para cada caso especfico. Expressar o valor
obtido em NMP/g ou ml.
38

NMERO MAIS PROVVEL DE Vibrio parahaemolyticus (Pescado e

Derivados)
FUNDAMENTOS
Provas presuntivas
Enriquecimento em caldo seletivo
Inoculao em meio de cultura de enriquecimento seletivo: caldo glicose sal Teepol (GSTB) ou
caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB), em que a presena de Vibrio parahaemolyticus
evidenciada pela turvao do meio aps a incubao. Em sua composio, o meio GSTB
apresenta teepol, soluo aquosa de sulfatos de sdio alcalinos primrios que atuam na
membrana citoplasmtica de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento e
formalina que funciona como um agente antimicrobiano. Como o Vibrio parahaemolyticus
halfilo obrigatrio, os dois meios contm 3% de cloreto de sdio.
Isolamento em gar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS)
Isolamento se realiza em gar TCBS, meio seletivo altamente alcalino que contm elevada
concentrao de tiossulfato e citrato de sdio, responsveis pela inibio do crescimento das
enterobactrias presentes. A bile e o colato de sdio inibem os enterococos. Como indicador
de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol que alteram a cor do meio para
amarelo quando da formao de cido pelos microrganismos que fermentam a sacarose
contida no meio.
Provas de identificao
A identificao de Vibrio parahaemolyticus feita por meio de provas bioqumicas, sorolgicas,
morfolgicas e tintoriais.

alimentos;
gar Meller-Hinton sal 3%;
gar nutriente sal 3%;
gar gelatina sal 3%;
gar soja triptona sal 3%;
gar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS);
gar ferro trs acares (TSI) sal 3% ou gar Kligler sal 3%;
gar motilidade sal 3%;
Caldo glicose sal teepol (GSTB) ou Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB);
Caldo peptonado sem sal;
39

Caldo peptonado sal 3%;

Caldo ONPG sal 3%%;
Caldo vermelho de fenol manitol sal 3%;
Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%;
Caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%;
Caldo vermelho de fenol arginina sal 3%;
Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%;
Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%;
Soluo salina peptonada 0,1% sal 3%;
Soluo fisiolgica (NaCl 0,85%);
Agente vibriosttico O 129 10g;
Agente vibriosttico O 129 150 g;
Arabinose;
L-arginina;
L-lisina;
Manitol;
Sacarose;
leo mineral ou parafina lquida estreis;
Reativo para Oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou NNNN-tetrametilparafenileno-diamina);
Teepol; O-nitrofenil--D-galactopiranosdeo ou p-nitrofenil--D-galactosdeo;
Etanol 96%;
EQUIPAMENTOS
PROCEDIMENTOS
Preparo e Pesagem
Pesar 50g da amostra. Adicionar 450 ml de Caldo peptonado sal 3%. Homogeneizar por
Provas presuntivas
Inoculao em caldo de enriquecimento seletivo:
40

1. A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais diluies desejadas em Caldo

peptonado sal 3% (no mnimo mais duas diluies). Inocular volumes de 1 ml de cada
uma das diluies desejadas em sries de 3 tubos contendo GSTB ou caldo HAEB.
2. Incubao: Incubar os tubos a 36 1C por 18 horas a 24 horas.
3. Leitura A presena de turvao do meio indica a suspeita da presena de Vibrio
parahaemolyticus. Anotar o nmero de tubos de cada srie que apresentaram
turvao.
Isolamento em gar tiossulfato citrato sais biliares (TCBS)
1. Inoculao: A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvao, sem
agit-lo e com auxlio de uma ala de nquel-cromo, de platina ou descartvel estril,
retirar uma alada do crescimento da superfcie e estri-la sobre a superfcie seca de
gar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS).
2. Incubao: Incubar as placas em posio invertida a 36 1C por 24 horas.
3. Leitura: Verificar o aparecimento de colnias arredondadas, opacas, de cor azul
esverdeada, com 2 a 3 mm de dimetro, tpicas de Vibrio parahaemolyticus. Quando
no houver colnias suspeitas, o resultado ser negativo para o tubo de origem.
Provas preliminares para identificao de Vibrio parahaemolyticus

1. De cada placa, selecionar de 2 a 3 colnias tpicas e transferi-las simultaneamente para
tubos contendo caldo peptonado sal 3% e gar nutriente sal 3% inclinado.
Colorao de Gram
A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, proceder colorao de Gram. O Vibrio
parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas
antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos.
Crescimento com 8% de sal e sem sal
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, transferir, com auxlio de ala de
nquel-cromo, platina ou descartvel estril, uma alada para um tubo contendo caldo
peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%. Incubar os tubos a 36 1C por 18 a 24 horas.
Aps o perodo de incubao, verificar a presena de turvao indicativa da ocorrncia de
crescimento. O Vibrio parahaemolyticus no cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8%
de sal.
Prova da oxidase
A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3%, usando palitos de madeira, de plstico
descartveis, pipetas Pasteur, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a
41

cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel para
teste de oxidase, comercialmente disponveis. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este
tempo, podem ocorrer reaes falso-positivas. O aparecimento de cor azul (quando usado o
reativo NNNN-tetrametil-parafenileno-diamina) ou de cor vermelha intensa (quando o
reativo usado o oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva. O
Vibrio parahaemolyticus oxidase positiva OBS.: No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de
ao para realizar a prova de oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada
podem produzir reao falso-positiva.
Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, inocular, com auxlio de ala de nquelcromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3
ml de leo mineral ou parafina lquida, estreis. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o
perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio, de vermelho para amarelo,
devido fermentao da sacarose e produo de cido. O Vibrio parahaemolyticus no altera
a colorao do meio, pois no capaz de fermentar a sacarose.
gar ferro trs acares sal 3% (TSI) ou gar Kligler ferro sal 3%
A partir do cultivo mantido no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de platina
ou nquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do gar e
estriando a superfcie inclinada, tubos com gar TSI sal 3% ou gar Kligler ferro sal 3%. Incubar
a 36 1C por 24 horas. O Vibrio parahaemolyticus apresenta base cida (amarela), sem gs,
sem produo de H2S e bisel alcalino (vermelho).
Teste ONPG
A partir da cultura em TSI, inocular uma alada espessa em tubo contendo 0,5 ml de caldo
ONPG sal 3%. Incubar em banho-maria a 36 1C, durante 2 horas. Examinar os tubos ,
verificando o aparecimento ou no de cor amarela, indicativa de reao positiva. Se o caldo
permanecer incolor, a reao negativa. O Vibrio parahaemolyticus ONPG negativo.
Provas adicionais para identific ao de Vibrio parahaemolyticus

As colnias que apresentarem comportamento compatvel com V.parahaemolyticus nas
provas preliminares devero ser submetidas s provas adicionais.
Teste do crescimento a 42C
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquel-cromo,
platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo peptonado sal 3%. Incubar a
42 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao dos
meios. O vbrio parahaemolyticus cresce temperatura de 42C.
42

gar gelatina sal 3%

platina ou descartvel estril, inocular uma placa de Petri contendo gar gelatina sal 3% (cada
placa pode ser dividida em at 6 setores e cada cultivo pode ser inoculado no centro de cada
setor). Incubar as placas a 36 1C por 18 a 24 horas. Colocar as placas em refrigerao por
alguns minutos antes de realizar a leitura, o que facilita a visualizao do halo. O
aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presena da gelatinase. O
Vibrio parahaemolyticus gelatinase positiva.
Teste da motilidade
A partir da cultura mantida no gar nutriente sal 3% inclinado, com auxlio de agulha de nquelcromo, platina ou descartvel estril, atravs de picada central, inocular um tubo contendo
gar motilidade sal 3%. Incubar a 36 1C por 24 horas. Um crescimento bacteriano difuso ao
redor da picada caracteriza motilidade positiva. O Vibrio parahaemolyticus apresenta
motilidade positiva.
Prova de Hugh-Leifson glicose (OF)
A partir do cultivo mantido em gar nutriente sal 3% , inocular, com auxlio de agulha de
nquel-cromo, platina ou descartvel estril, dois tubos contendo meio OF glicose (HughLeifson) sal 3%. Cobrir um dos tubos com 2 a 3 ml de leo mineral ou parafina lquida, estril.
Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor
dos meios de verde para amarelo e a presena de bolhas de gs nos meios. A cor amarela nos
dois tubos significa fermentao da glicose. A presena de cor amarela somente no tubo sem
leo mineral significa utilizao oxidativa da glicose. O Vibrio parahaemolyticus fermenta a
glicose sem produo de gs, ou seja, os dois tubos devem apresentar colorao amarela.
Descarboxilao da lisina
platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo Caldo vermelho de fenol lisina sal
3%. Inocular tambm um tubo contendo meio base (sem adio do aminocido) que servir de
controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 ml de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36
1C por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenol lisina sal
3% no inoculado, que servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias.
Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da
glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor prpura devido
produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve
virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus descarboxila a lisina.
Hidrlise da arginina
43

platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo arginina sal 3%. Inocular
tambm um tubo contendo o meio base (sem adio do aminocido) que servir de controle.
Cobrir os tubos com 2 a 3 ml de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C
por, no mximo, 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% no inoculado, que
servir de controle negativo. Examinar os tubos todos os dias. Durante o perodo de
incubao, a cor do meio passa para amarela devido fermentao da glicose, e, ocorrendo a
hidrlise da arginina, o meio retorna a cor prpura devido produo de aminas primrias e
dixido de carbono. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim
permanecer. O Vibrio parahaemolyticus no hidrolisa a arginina.
Prova da fermentao do manitol e arabinose
platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal
3% e outro tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3
ml de leo mineral ou parafina lquida, estril. Incubar a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo
de incubao, observar a mudana de colorao dos meios de vermelho para amarelo, devido
fermentao dos acares e consequente produo de cido. 99% das cepas de Vibrio
parahaemolyticus fermenta o manitol. 50% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermenta a
arabinose.
Teste do halofilismo
platina ou descartvel estril, inocular tubos contendo caldo peptonado sal 6% e 10%. Incubar
a 36 1C por 24 horas. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos
meios. O Vibrio parahaemolyticus cresce a 6% de sal e no cresce, ou apresenta crescimento
discreto, a 10% de sal.
Sensibilidade do agente vibriosttico O/129
Esta prova utilizada como diferencial entre Vibrio parahaemolyticus e V. vulnificus. Embeber
um swab previamente esterilizado com a cultura suspeita mantida em caldo peptonado sal
3% e inocular uma placa contendo gar Meller-Hinton sal 3% ou gar soja triptona sal 3%,
espalhando bem o inculo, de forma a obter um crescimento o mais homogneo possvel.
Deixar as placas absorverem o inculo. Colocar um disco do agente vibriosttico O/129 com
concentrao de 10g e um disco de concentrao de 150g. Incubar as placas a 36 1C por
24 horas. O Vibrio parahaemolyticus resistente concentrao de 10g de agente
vibriosttico O/129 enquanto o V. vulnificus sensvel. Todos os vbrios so sensveis
concentrao de 150g do agente O/129.
44

RESULTADOS
Sero consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus as culturas que apresentarem
os seguintes resultados nas provas adicionais de identificao:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Motilidade - positiva
Hugh Leifson (OF) - glicose fermentativo
Descarboxilao da lisina - positivo
Hidrlise da arginina - negativa
Crescimento a 42C - positivo
Fermentao do manitol - positivo
Fermentao da arabinose - positivo
Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 10g - resistente
Sensibilidade ao Agente Vibriosttico O/129 150g - sensvel
gar gelatina sal 3% - crescimento com formao de halo
Halofilismo (6% sal) - positivo
Halofilismo (8% sal) - positivo
Halofilismo (10% sal) - negativo ou crescimento discreto
A partir da combinao de tubos com resultado positivo em cada srie, calcular o Nmero
Mais Provvel. Expressar o valor obtido em NMP/g.
45

NMERO MAIS PROVVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS MESFILOS

AERBIOS VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS
UHT E ESTERILIZADOS, PASTOSOS E VISCOSOS.
FUNDAMENTOS
1. Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias e
posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto.
2. Determinao do NMP: Baseia-se na semeadura de diluies seriadas da amostra em
tubos contendo caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE),
seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, com posterior repique em gar crebrocorao (BHI) e gar nutriente isento de extrato de levedura e a subsequente
identificao da flora presente.

alimentos;
gar nutriente isento de extrato de levedura;
gar esculina;
gar ureia;
Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3);
Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE);
Caldo crebro-corao-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% concentrao dupla (BHISE2); caldo vermelho de fenol com glicose;
Reativo para oxidase (NNNN-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de paraamino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase;
Zinco em p;
EQUIPAMENTOS
PROCEDIMENTOS
Preparo da amostra
46

Aps pr-incubao, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes.
Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo desinfetante e
posteriormente com etanol 70% ou etanol 70 GL. Deixar secar. Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25
0,2 ml da amostra. Adicionar 225 ml de soluo salina peptonada 0,1%. A partir da diluio
inicial 10-1.
Inoculao
Inocular 10 ml da diluio 10-1, 1 ml da diluio 10-1 e 1 ml da diluio 10-2, separadamente, em
trs sries de trs tubos contendo 10 ml de BHI-SE. Na primeira srie de tubos, que foram
inoculados com 10 ml da diluio 10-1, usar o meio com concentrao dupla (BHI-SE2). Incubar
a 30 1C por 72 horas.
Confirmao do crescimento
Finalizado o perodo de incubao, repicar todos os tubos sobre a superfcie seca de ABHI e de
gar nutriente isento de extrato de levedura, estriando de forma a obter colnias isoladas.
Incubar a 30 1C por at 72 horas.
Leitura
1. O crescimento nas placas ser indicativo de presena de mesfilos aerbios no tubo de
origem, porm ser necessria a diferenciao entre Bacillus sporothermodurans (que
no patognico nem produz alterao do produto) e outros mesfilos aerbios
capazes de alterar o alimento.
2. Registrar o nmero de tubos que apresentaram crescimento de colnias nas placas
correspondentes, registrando em separado as colnias suspeitas de Bacillus
sporothermodurans. Quando o crescimento bacteriano for devido presena de
esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em anlise, ser observado
crescimento abundante de colnias lisas, de forma regular, com colorao entre
branco e bege, com dimetro mximo de 3 mm, facilmente identificveis, nas placas
com ABHI. No gar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus
sporothermodurans comumente no forma colnias visveis, porm podero se
desenvolver colnias puntiformes de colorao entre branco e bege.
3. Selecionar de 2 a 3 colnias correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar
para tubos com ABHI inclinado. Incubar a 36 1C por at 72 horas e realizar os
seguintes testes confirmatrios:
Colorao de Gram
1. Preparar esfregao das colnias suspeitas e corar pelo mtodo de Gram
2. Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase
conforme o item 5.7.
47

3. Quando forem observados microrganismos com morfologia e caractersticas diferentes

de bastonetes Gram positivos, considerar o tubo correspondente como positivo para
presena de aerbios mesfilos.
Catalase
1. Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de
Pasteur, estreis, transferir a cultura para uma lmina ou placa de vidro contendo uma
gota de perxido de hidrognio 3%. Misturar o inculo ao perxido e observar a
reao.
2. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formao de
borbulhas indica prova positiva para catalase.
3. A maioria dos membros do gnero Bacillus apresenta reao de catalase positiva.
4. Quando a colorao de Gram demonstrar a presena de bastonetes Gram positivos e a
prova da catalase for positiva para a cultura em teste, proceder confirmao da
presena de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, hidrlise da
esculina, fermentao da glicose, reduo do nitrato, produo de urease e
crescimento em anaerobiose, conforme abaixo descrito.
Oxidase
1. Usando ala de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plstico
descartveis, estreis, realizar a prova da oxidase, espalhando a cultura sobre papelfiltro impregnado com o reativo ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase,
comercialmente disponveis.
2. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, reaes falso-positivas podem
ocorrer.
3. O aparecimento de cor azul (NNNN-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho
intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva.
4. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao inoxidvel para realizar a prova de
oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada pode produzir reao
falso-positiva.
5. O Bacillus sporothermodurans apresenta reao de oxidase positiva.
Crescimento em anaerobiose
1. Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36
1C por 72h.
2. O Bacillus sporothermodurans no cresce em anaerobiose.
Hidrlise da esculina
1. Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo gar esculina inclinado.
2. Incubar a 36 1C por at 72 horas.
48

3. A hidrlise da esculina evidenciada pelo enegrecimento do meio.

4. O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina.
Fermentao da glicose
1. Semear tubos de caldo vermelho de fenol-base adicionados de glicose.
3. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao
do acar presente.
4. O Bacillus sporothermodurans no fermenta a glicose.
Reduo de nitrato
1. Inocular a cultura, com ala, em tubos contendo caldo BHI-NO3.
3. Aps incubao, adicionar aos tubos 0,5 a 1 ml de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 ml de
cido sulfanlico 0,8%.
4. O aparecimento de colorao rosa indica positividade para reduo de nitrato.
5. Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao tubo alguns
miligramas de p de zinco. Nesta situao, o aparecimento de colorao rosa indica
reao negativa enquanto que o no desenvolvimento de cor indica positividade.
6. O Bacillus sporothermodurans no reduz o nitrato nitrito.
Prova da urase
1. Inocular com ala a superfcie de placas ou tubos com gar ureia previamente
preparadas.
3. Observar o crescimento com mudana de colorao para rosa intenso, o que indica
positividade para produo de urease.
4. O Bacillus sporothermodurans no produz urease.
RESULTADOS
1. Considerar positivos os tubos que apresentaram crescimento de outras bactrias
diferentes do Bacillus sporothermodurans e considerar como negativo quando no for
observado crescimento de colnias nas placas e quando o crescimento observado for
confirmado como sendo somente de Bacillus sporothermodurans.
2. A partir dos resultados obtidos, consultando a tabela de NMP apropriada, calcular o
nmero mais provvel de microrganismos mesfilos aerbios viveis presentes na
amostra em anlise.
3. Quando for confirmada a presena de Bacillus sporothermodurans juntamente com
outros mesfilos na amostra, devero ser excludos os tubos que continham apenas
49

4.
5.
6.
7.
8.
Bacillus sporothermodurans para o clculo final do NMP de microrganismos mesfilos

aerbios viveis.
Quando for observada somente a presena de colnias de Bacillus sporothermodurans
na amostra, reportar o resultado de mesfilos aerbios viveis como <0,3 NMP/ml.
Sempre que for observada a presena de Bacillus sporothermodurans, fazer constar no
Certificado Oficial de Anlise (COA), no campo OBS. a expresso: Presena de
Bacillus sporothermodurans.
Devero ainda acompanhar o resultado de anlise informaes adicionais sobre o tipo
de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes
Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aerbio(s) presente(s),
quando identificado(s).
Os resultados da anlise de NMP de microrganismos mesfilos aerbios viveis a 30C
por 72 horas em produtos lcteos UHT e esterilizados, pastosos e viscosos, devem ser
expressos em: NMP/g.
O resultado da anlise de pr-incubao a 36C por 7 dias deve ser expresso como
alterado ou sem alterao.
50

PESQUISA DE Listeria monocytogenes (alimentos crneos e lcteos).

FUNDAMENTOS
Enriquecimento Seletivo
1. O enriquecimento seletivo, realizado em duas etapas (a primeira em caldo UVM, e a
segunda em caldo Fraser), tem a finalidade de inibir a flora acompanhante, permitindo
a recuperao de baixos nmeros de clulas de Listeria sp.
2. O efeito seletivo no caldo UVM exercido pela associao de cido nalidxico e
acriflavina e no caldo Fraser pelo cloreto de ltio, cido nalidxico e acriflavina.
Seleo e Isolamento
1. Nos produtos crneos, a seleo se realiza em dois meios slidos: gar triptose com
cido nalidxico (ATN) e gar Palcam (AP), enquanto que nos produtos lcteos esta se
realiza em gar Oxford (AO), gar Palcam (AP) e gar triptose com cido nalidxico
(ATN).
2. As substncias impedientes presentes nos meios slidos so cido nalidxico no ATN,
sulfato de polimixina B, acriflavina, cloreto de ltio e ceftazidina no AP, e cloreto de ltio,
acriflavina, sulfato de colistina, cefotetan, cicloheximide e fosfomicina no AO.
3. A seleo no ATN baseia-se nas caractersticas das colnias, quando observadas sob luz
oblqua, em estereoscpio. No AP, observa-se a no fermentao do manitol e a
formao de esculetina pela hidrlise da esculina, reao revelada pela presena de ferro
trivalente. No AO, as colnias de Listeria sp apresentam-se pretas, rodeadas por halo
negro devido hidrlise da esculina.
Confirmao da presena de Listeria sp

A confirmao bioqumica de Listeria sp realiza-se por meio da verificao da produo de
catalase, observao das caractersticas morfolgicas e tintoriais, verificao do crescimento
tpico em meio semisslido e, adicionalmente, por meio da verificao da incapacidade de
reduo de nitrato e verificao da positividade nas reaes de Vermelho de Metila e Voges
Proskauer (VM-VP).
Identificao de Listeria monocytogenes

A diferenciao das espcies de Listeria sp realiza-se por meio da verificao da produo de hemlise em gar sangue de cobaio ou gar sangue de carneiro, verificao da capacidade de
produzir reao de CAMP positiva com S. aureus (e opcionalmente tambm com Rodococcus
equi), e verificao da capacidade de fermentao dos carboidratos ramnose, xilose e manitol. A
utilizao concomitante de culturas de R. equi e S. aureus no CAMP teste til para a
diferenciao de L. ivanovii, que apresenta reao de CAMP forte com R. equi (em forma de
flecha). Quando se julgar conveniente, a identificao poder ser realizada por meio de um
51

sistema comercialmente disponvel de testes bioqumicos miniaturizados padronizados,

conjuntamente com a prova de -hemlise ou CAMP teste.

alimentos;
Caldo Fraser base;
Caldo de enriquecimento para Listeria (UVM) ou opcionalmente Caldo para
Enriquecimento de Listeria (LEB);
Caldo VM-VP;
Caldo vermelho de fenol base ou gar para fermentao de carbohidratos base;
gar Palcam (AP);
gar Columbia com cido nalidxico base;
gar triptose com cido nalidxico (ATN);
gar Oxford (AO) base;
gar motilidade;
S. aureus ATCC 25923 para CAMP teste;
Rodococcus equi ATCC 6939 para CAMP teste (opcional);
Sistema miniaturizado para identificao bioqumica de Listeria (opcional);
cido nalidxico 1%;
Acriflavina cloridrato 1%;
Vermelho de metila 0,06%;
Alfa-naftol 5%;
Hidrxido de potssio 40%;
Suplemento para caldo UVM (cido nalidxico 20mg/L; acriflavina 12mg/L);
Suplemento para caldo LEB (acriflavina 12mg/L);
Suplemento para gar Oxford (cicloheximide 200mg/0,5L; sulfato de colistina
10,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L; Cefotetan 1,0mg/0,5L; fosfomicina 5,0mg/0,5L);
Suplemento para gar Palcam (polimixina B 5,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L;
Ceftazidime 10,0mg/0,5L);
Suplemento para caldo Fraser (citrato de amnio e ferro III 250mg/0,5L; acriflavina
12,5mg/0,5L; cido nalidxico 10mg/0,5L);
P de Zinco; Xilose soluo aquosa 5%;
Manitol soluo aquosa10%;
Ramnose soluo aquosa 5%;
Sangue desfibrinado de carneiro;
Sangue desfibrinado de cobaio.
52

OBS.: Os suplementos podem ser adquiridos em forma de vial (comercialmente disponvel),

necessitando apenas a suspenso em diluente antes de seu uso. Verificar sempre a composio,
comparando com aquela indicada nesta metodologia.
EQUIPAMENTOS

Estereoscpio com iluminao em ngulo de 45.
PROCEDIMENTOS
Preparo da Amostra
Acrescentar alquota de 25 0,2 g ou ml da amostra preparada 225 ml de caldo UVM
adicionado de seu suplemento. OBS.: Verificar a formulao do Caldo UVM ou LEB. Algumas
marcas de caldo UVM j contm em sua formulao cida nalidxico e acriflavina. O caldo LEB
j contm cido nalidxico, bastando a suplementao com 0,25 ml de soluo 1% de
acriflavina.
Primeiro enriquecimento seletivo

Homogeneizar as alquotas preparadas conforme item 5.1 e incubar a 30 1C por 24 horas.
Segundo enriquecimento seletivo

Aps a incubao, transferir 0,1 ml da cultura para tubo contendo 10ml de caldo Fraser
suplementando-o, se necessrio, com 0,1 ml do vial diludo conforme a indicao do fabricante.
Incubar a 30 1C por 24 a 48 horas. OBS.: Alguns fabricantes de caldo Fraser fornecem o meio j
pronto para o uso; outros fornecem o meio adicionado de cido nalidxico e de acriflavina,
bastando a suplementao com citrato de amnio e ferro III (0,1 ml de soluo a 5% equivalente
a 250 mg/0,5L de meio).
Isolamento
1. Amostras de produtos crneos: Utilizando ala de platina de 5 mm de dimetro, repicar
do caldo Fraser para placas contendo ATN e placas contendo AP suplementado, sendo
que as placas devem estar com as superfcies secas, de forma a proporcionar a obteno
de colnias isoladas. Opcionalmente, pode ser usado o ATNS em paralelo com os meios
ATN e AP. Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24 horas e as placas de AP e ATNS, na
mesma temperatura, por 24 a 48 horas.
2. Amostras de produtos lcteos: Utilizando ala de platina de 5 mm de dimetro, repicar do
caldo Fraser para placas contendo AO suplementado e placas contendo AP
suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfcies secas, de forma a
53

proporcionar a obteno de colnias isoladas. Incubar as placas de ATN a 30 1C por 24

horas e as placas de AP na mesma temperatura, por 24 a 48 horas.
Seleo
1. Com auxlio de lupa ou estereoscpio com iluminao angular de 45, selecionar 3 a 5
colnias de cor azulada ou azul-acinzentada em ATN.
2. Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao normal,
colnias pretas rodeadas por halo escuro em AO.
3. Selecionar, com o auxlio de conta-colnias ou de estereoscpio com iluminao normal,
colnias verde-amareladas rodeadas por zona escura, ou colnias verde-acinzentadas,
em AP.
Confirmao da presena de Listeria sp

Repicar o mesmo inculo para tubos com gar estoque inclinado e para placas contendo ATN.
Incubar a 30 1C por 24 horas. Verificar a pureza das culturas no ATN. Utilizar as culturas do gar
estoque para a realizao das provas de confirmao e identificao.
1. Prova da catalase: Em uma placa de Petri, depositar 1 gota de perxido de hidrognio 3%.
Com auxlio de ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur,
retirar uma alquota do cultivo e misturar com a gota do reagente. A presena de catalase
se traduz por desprendimento de borbulhas de oxignio (catalase positiva). Das culturas
catalase positivas, fazer um esfregao para colorao de Gram.
2. Colorao de Gram: A Listeria sp se apresenta como bastonete curto ou na forma de
cocobacilos, Gram positivo.
3.
Prova da motilidade tpica: Inocular uma alquota da cultura em gar motilidade, com
agulha, por picada. Incubar em estufa de B.O.D. (Demanda Biolgica de Oxignio) a 2225C por 2 a 5 dias. Aps incubao, verificar o tipo de crescimento. A Listeria sp
apresenta crescimento mvel caracterstico em forma de guarda-chuva.
4. Prova de Reduo de Nitrato: Aps a leitura da motilidade, adicionar a cada tubo 2 a 3
gotas de alfa-naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de cido sulfanlico a 0,8%.: O
aparecimento de colorao rosa indica positividade. Quando no houver
desenvolvimento de colorao, adicionar ao meio alguns miligramas de p de zinco.
Nesse caso, o aparecimento de colorao rosa indica reao negativa e a no alterao de
cor indica positividade. As culturas de Listeria sp no reduzem o nitrato.
5. Prova de VM-VP: Inocular tubos com caldo VM-VP e incubar a 36 1C, por 5 dias. Aps a
incubao, pipetar alquotas de 5 e 1 ml da cultura para dois tubos estreis. No tubo
contendo 5 ml adicionar 2 a 3 gotas de soluo de vermelho de metila a 0,06%. O
aparecimento da cor vermelha indica reao VM positiva. No tubo contendo 1 ml,
adicionar 0,6 ml de alfa-naftol soluo alcolica 5% e 0,2 ml de hidrxido de potssio
54

soluo aquosa 40% (nesta ordem) e agitar. Deixar em repouso por 1 a 2 horas. O
aparecimento da cor vermelha escura indica reao VP positiva. As culturas de Listeria sp
apresentam reaes VM e VP positivas.
Identificao de Listeria monocytogenes

As culturas que tenham confirmado as caractersticas do gnero Listeria devero ser testadas para
diferenciao entre Listeria monocytogenes e outras espcies por meio das seguintes provas
bioqumicas:
1. Produo de -hemlise: Sobre a superfcie seca de gar sangue desfibrinado de cobaio
ou carneiro (ACNS), estriar o inculo com ala ou semear com agulha, por picada. Incubar
a 36 1C por 24 a 48 horas. A reao positiva se traduz pelo aparecimento de zona clara
transparente (-hemlise) ao redor das colnias. As culturas de Listeria monocytogenes,
Listeria ivanovii e Listeria seeligeri so -hemolticas. OBS.: A utilizao de sangue de
cobaio desfibrinado nesta prova oferece a vantagem de zonas de hemlise mais claras,
especialmente com culturas de L.monocytogenes fracamente hemolticas.
2. CAMP teste:
a. Em gar Columbia com cido nalidxico adicionado de 5% de sangue de carneiro
desfibrinado (CNAS), com auxlio de agulha ou ala de 1 L, traar uma linha
perpendicular linha previamente semeada com S. aureus. Tomar o cuidado
para que as linhas no se toquem. Incubar a 36 1C por 72 horas, em atmosfera
de 2 a 5% de dixido de carbono (CO2). As culturas de Listeria monocytogenes e
Listeria seeligeri produzem zona clara de hemlise total acentuada prximo
linha de crescimento do Staphylococcus aureus.
b. Opcionalmente, este teste pode ser feito com S. aureus e R. equi. Nesse caso,
traar na placa de CNAS uma linha vertical com inculo de S. aureus e outra com
R. equi, distantes alguns centmetros entre si. Semear as culturas teste em linhas
horizontais entre as linhas de S. aureus e R. equi, mantendo distncia de cerca de
1,5 cm entre as linhas e cuidando que estas no toquem as linhas de S. aureus e
R. equi. Incubar a 36 1C por 72 horas, em atmosfera de 2 a 5% de dixido de
carbono (CO2).
c. Aps a incubao, examinar as placas para verificao de hemlise na zona de
interao, prximo s linhas verticais. A atividade hemoltica de L.
monocytogenes e L. seeligeri se apresenta aumentada prximo a linha de
crescimento do S. aureus. As demais listerias apresentam reao de CAMP
negativa com o S. aureus. A reao de CAMP produzida pela L. ivanovii com R.
equi se caracteriza por ser mais intensa e se apresentar em forma de flecha. As L.
innocua, L. welshimeri e L. grayi so no hemolticas e no apresentam reao de
CAMP positiva com o S. aureus nem com o R. equi.
d. O CAMP teste diferencia L. ivanovii de L. seeligeri e pode diferenciar uma L.
seeligeri, fracamente hemoltica, de L. welshimeri. Isolados que do reaes
55

tpicas para L. monocytogenes, exceto para a produo de hemolisina, devem ser

testadas para CAMP antes de serem identificadas como L. innocua (no
hemoltica).
e. A maioria dos isolados de L. monocytogenes produz tambm uma zona de
intensificao da hemlise junto linha de crescimento do R. equi.
3. Fermentao de carbohidratos: Inocular 3 tubos com caldo vermelho de fenol-base,
adicionados respectivamente, de xilose, manitol e ramnose. Incubar a 30 1C por 36
horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a
fermentao do acar presente. Alternativamente, esta prova pode ser realizada
inoculando as culturas com agulha (em apenas um ponto) em 3 placas de gar para
fermentao de carbohidratos adicionado de xilose, manitol e ramnose,
respectivamente. A viragem de cor do indicador prpura de bromocresol (azul) para
amarelo indica a fermentao do acar presente.
As reaes tpicas das diversas Listeria sp esto representadas no quadro abaixo:
-hemlise
Red-NO3
CAMP Teste - SA
CAMP Teste - RE
Manitol
Ramnose
Xilose
VM
VP
Catalase
Gram
LM
LIVA
LINN
LW
LS
LG
+
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V
+
+
+
+
V
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V= varivel AS = S.aureus RE = R.equi LM = L. monocytogenes; LIVA = L. ivanovii; LINN = L.

innocua; LW = L.welshimeri; LS = L.seeligeri; LG = L. grayi.
RESULTADOS
Interpretao: Considerar como Listeria monocytogenes as culturas que apresentarem reaes
tpicas nas provas bioqumicas. Expressar o resultado como:
Pesquisa de Listeria monocytogenes: Presena/25 g ou ml; ou.

Pesquisa de Listeria monocytogenes: Ausncia/25 g ou ml
56

Nota: sempre que as anlises laboratoriais demonstrarem a presena de outras espcies de

Listeria, da rea reservada a observaes, do Certificado Oficial de Anlise, dever constar:
Presena de Listeria, seguida do nome da espcie encontrada. Por exemplo: Presena de
Listeria innocua, Presena de Listeria welshimeri ou outra.
57

PESQUISA DE Salmonella (alimentos de origem animal, raes e ingredientes).

FUNDAMENTOS
Pr-enriquecimento
1. Baseia-se na incubao, a 36 1C por 16 a 20 horas, de 25 0,2 g ou 25 0,2 ml da
amostra, adicionada de 225 ml do diluente especfico para cada caso, estabelecido no
item 5.1. Esse procedimento visa minimizar os efeitos do processamento industrial dos
alimentos, capaz de promover estresse nas clulas de Salmonella, sem inativ-las
biologicamente.
2. Quando utilizada soluo salina peptonada tamponada, esta favorece a manuteno
do pH, evitando que as bactrias acompanhantes acidifiquem o meio, prejudicando a
recuperao das clulas de Salmonella.
3. Para leite em p, segundo o FDA, o diluente utilizado gua destilada estril
adicionada de soluo de verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactrias
Gram positivas.
Enriquecimento seletivo
1. Baseia-se na utilizao de meios que contm substncias de ao impediente do
crescimento para a maioria dos microrganismos interferentes e na incubao em
temperatura seletiva.
2. O enriquecimento seletivo de Salmonella se faz obrigatoriamente nos meios lquidos
seletivos, caldo Rappaport Vassiliadis e caldo selenito-cistina.
3. Adicionalmente, utiliza-se o caldo tetrationato.
4. No caldo Rappaport Vassiliadis, a presena de verde malaquita e de cloreto de
magnsio, associada temperatura de 41 0,5C por 24 a 30 horas atua como agentes
seletivos da microbiota acompanhante, enquanto a presena de peptona de farinha de
soja estimula o crescimento de Salmonella.
5. No caldo selenito-cistina, o agente inibidor selenito de sdio atua inibindo os
coliformes e enterococos. Esse meio incubado a 41 0,5C por 24 a 30 horas.
6. No caldo tetrationato, a seletividade conferida pelo tetrationato e pelo verde
brilhante.
Isolamento e seleo
1. Baseia-se na seleo de colnias de Salmonella em, pelo menos, dois meios slidos: o
gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS) obrigatoriamente e
outro gar de maior impedincia escolhido pelo laboratrio.
2. No gar verde brilhante, a novobiocina adicionada visa principalmente a inibio de
Proteus sp. Esse meio apresenta em sua composio bile bovina e um corante
derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsveis pela inibio de
microrganismos Gram positivos.
3. Como meio de maior impedincia, utilizar MLCB ou Rambach ou XLD ou XLT4 ou outro.
58

4. No gar Rambach, a diferenciao entre Salmonella e outros microrganismos

promovida pela presena de propilenoglicol, e tambm de um cromgeno que
evidencia a hidrlise da beta-galactosidase.
5. No gar MLCB, a concentrao de ons Magnsio promove o crescimento de
Salmonella. A presena de verde-brilhante inibe a flora acompanhante. Esse gar no
utiliza a fermentao da lactose como sistema de identificao, o que possibilita a
deteco de cepas de comportamento atpico no BPLS. A produo de H2S
evidenciada pelo enegrecimento do centro da colnia. Cepas de Salmonella H2S
negativas, como Salmonella Sendai, Salmonella Berta, Salmonella Pullorum e
Salmonella Seftenberg, podem produzir colnias azuis. um meio que, associado ao
caldo de enriquecimento Rappaport Vassiliadis, tem sua seletividade substancialmente
aumentada. A Salmonella Typhi e a Salmonella Paratyphi no crescem nesse meio
devido presena de verde-brilhante.
Identificao bioqumica
1. Baseia-se na evidenciao das propriedades fisiolgicas e metablicas das culturas
suspeitas: por meio da verificao da presena de citocromo oxidase; deteco de
pirrolidonil peptidase (PYRase) segundo Bennett et. al (1999); produo de urease;
fermentao da glicose, sacarose e lactose no meio TSI; deteco de betagalactosidase; descarboxilao da lisina; produo de H 2S; motilidade e produo
de indol.
2. Para confirmao final, em casos de dvida, realizam-se outras provas
complementares, baseadas na inoculao das culturas suspeitas em uma bateria
miniaturizada de testes padronizados. Os microtubos contendo substratos
desidratados para cada teste so reidratados pela adio da suspenso do
microrganismo teste em diluente especfico para esta finalidade.
Prova de soroaglutinao
Baseia-se na reao antgeno-anticorpo, com consequente aglutinao do antgeno frente
ao antissoro para Salmonella polivalente O.
Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia

de alimentos;
gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS);
gar Rambach ou gar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB) ou gar
XLD ou gar; XLT4 ou outro;
gar ferro trs acares (TSI) ou gar Kligler (KIA);
gar estoque;
Caldo lisina descarboxilase ou gar lisina ferro (LIA);
Caldo ureia ou gar ureia;
59

gar fenilalanina;
Caldo selenito cistina;
Caldo Rappaport Vassiliadis;
Caldo tetrationato (adicional);
Caldo VM/VP;
Meio SIM;
Sistema miniaturizado de provas bioqumicas para identificao de
enterobactrias;
Soluo salina 0,85%;
Soluo salina 2%;
gua destilada estril;
Soluo salina peptonada 1% tamponada;
Soluo salina peptonada 1% tamponada com 1% Tween 80;
Soluo de -naftol 5%;
Soluo de hidrxido de potssio 40%;
Soluo de ureia 40% estril;
Soluo de iodo-iodeto;
Reativo de Kovacs (opcional: reativo de Ehrlich);
Verde brilhante soluo aquosa 0,1%;
Cloreto frrico soluo aquosa 10%;
Novobiocina soluo aquosa 4%;
Soro anti Salmonella polivalente O;
Reativo para oxidase (NNNN-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de
para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase;
leo mineral, parafina lquida ou vaspar estreis;
Reativos para prova da PYRase - cido L-piroglutmico 7-amino 4-metil cumarina
(7 AMC) e Dimetilaminocinamaldedo;
Tween 80.
EQUIPAMENTOS

PROCEDIMENTOS

Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml da amostra. Adicionar 225 ml de soluo salina
peptonada 1% tamponada (ver excees na observao abaixo). Homogeneizar por
aproximadamente 60 segundos no stomacher. Deixar 1 hora em temperatura ambiente.
OBS: Para leite em p e soro de leite em p, utilizar como diluente gua destilada e adicionar 5
ml de verde brilhante soluo aquosa 0,1%. Para produtos gordurosos (creme e manteiga)
60

utilizar como diluente soluo salina peptonada 1% tamponada com 1% de Tween 80. Para os
demais alimentos, utilizar soluo salina peptonada 1% tamponada.
Pr-enriquecimento
O pr-enriquecimento se realiza por meio da incubao das alquotas das amostras preparadas
conforme item 5.1, a 36 1C por, no mnimo, 16 horas e no mais que 20 horas.
A partir do procedimento de pr-enriquecimento estabelecido em 5.3, inocular,
simultaneamente, nos meios lquidos seletivos conforme abaixo:
1. Inoculao em caldo Rappaport Vassiliadis Pipetar alquotas de 0,1 ml das amostras
pr-enriquecidas para tubos contendo 10 ml de caldo Rappaport Vassiliadis. Incubar os
tubos a 41 0,5C, em banho-maria, preferencialmente com agitao ou circulao
contnua de gua, por 24 a 30 horas.
2. Inoculao em caldo selenito cistina Pipetar alquotas de 1 ml das amostras prenriquecidas e transferir para tubos contendo 10 ml de caldo selenito cistina. Incubar
os tubos a 41 0,5C em banho-maria, preferencialmente com agitao ou circulao
3. Inoculao em caldo tetrationato (adicional) Pipetar alquotas de 1 ml das amostras
pr-enriquecidas e transferir para tubos contendo 10 ml de caldo tetrationato. Incubar
os tubos a 41 0,5C em banho-maria, preferencialmente com agitao ou circulao
Isolamento
A partir dos caldos seletivos de enriquecimento, repicar sobre a superfcie previamente seca
de placas com cada meio slido seletiva, estriando de forma a se obter colnias isoladas. Dessa
forma sero obtidas 2 placas de BPLS, uma originria do caldo Rappaport Vassiliadis e outra
originria do caldo selenito cistina e 2 placas do segundo meio seletivo utilizado pelo
laboratrio, obtidas do mesmo modo. Incubar todas as placas, invertidas, a 36 1C por 18 a
24 horas.
Seleo
Selecionar de 3 a 10 colnias suspeitas por amostra, conforme caractersticas das colnias
tpicas ou suspeitas de Salmonella nos diferentes meios slidos:
1. Em gar BPLS, as colnias apresentam-se incolores ou de cor rosada, entre
translcidas a ligeiramente opacas. Quando rodeadas por microrganismos
fermentadores de lactose, podem apresentar-se de cor verde-amarelada.
61

2. Em gar Rambach, apresentam-se de cor vermelha. Alguns sorovares podem se

apresentar com colorao rosa claro, de cor pssego ou amarelas (cor de gema).
3. Em gar MLCB, apresentam-se negras, convexas, lisas e brilhantes, com bordas
regulares. As colnias de Salmonella Pullorum e de Salmonella Gallinarum
apresentam-se de tamanho pequeno (cerca de 1 mm), de cor azul intensa ou violeta.
Provas Bioqumicas
As colnias selecionadas devem ser repicadas em gar no seletivo e incubadas a 36 1C por
18 a 24 horas, a fim de verificar sua pureza.
Provas bioqumicas preliminares
Como baterias mnimas para identificao de Salmonella devem ser realizadas as seguintes
provas bioqumicas:
1. Produo de urease: Semear maciamente em caldo ou gar ureia. Incubar a 36 1C
por 24 a 30 horas. Observar a colorao do meio. A manuteno da cor inicial do meio
indica que no ocorreu hidrlise da ureia. A alterao para rosa intenso indicativa de
alcalinizao do meio devido ao da urease sobre a ureia. Salmonella no produz
urease.
2. Reaes em gar TSI ou gar Kligler (KIA):
a. Inocular o gar atravs de picada profunda e estriamento na superfcie
inclinada do bisel. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas.
b. No gar TSI, esto presentes: glicose (1,0 g/L), lactose (10,0 g/L) e sacarose (10,0
g/L). Como a glicose um monossacardeo e est em baixa concentrao, ser
rapidamente fermentada anaerobiamente, formando cido no fundo do tubo, o
que torna o meio amarelo pela viragem do indicador vermelho de fenol (todos os
membros da famlia Enterobacteriaceae fermentam a glicose com produo de
cido).
c. A fermentao aerbia da glicose, que ocorre na superfcie do bisel, resulta em
cido pirvico, que posteriormente degradado a CO2 e gua.
d. A grande maioria das salmonelas no fermenta a sacarose e a lactose, no
provocando alteraes no meio TSI (que contm esses dois acares; j no KIA, a
sacarose no est presente). Como a fonte de carbono utilizvel (glicose)
rapidamente esgotada, a Salmonella passa a degradar aerobiamente o substrato
proteico do meio, produzindo amonaco (NH3), o que confere ao meio um pH
alcalino, modificando a colorao do bisel para rosa intenso.
e. A maioria das salmonelas apresenta no TSI e no KIA as seguintes reaes: cido
na base, com ou sem produo de gs; Alcalino ou inalterado no bisel; Com
produo de H2S.
3. Descarboxilao da lisina
a. Utilizar caldo lisina ou gar LIA.
62

b. Inocular o caldo lisina e adicionar selo estril (vaspar, vaselina, parafina),

visando evitar o contato do meio com o ar e o consequente aparecimento de
uma falsa alcalinizao na superfcie do meio por degradao aerbia do
substrato proteico.
c. Quando usar o gar, inocular atravs de picada profunda, estriando na
superfcie inclinada do bisel.
d. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas.
e. Observar se ocorreu descarboxilao da lisina pela alcalinizao do meio, o que
demonstrado pela no alterao de cor do indicador presente.
f. A atividade da enzima lisina descarboxilase dependente do pH, sendo mais
ativa em pH abaixo de 5,5.
g. A acidificao do meio obtida pela fermentao da glicose presente. Nessa
etapa do processo, ocorre a viragem do indicador prpura de bromocresol, de
violeta para amarelo.
h. recomendvel a inoculao de um tubo controle de caldo base para
descarboxilao sem lisina, para comprovao da acidificao pela fermentao
da glicose. Esse tubo deve permanecer amarelo at o final do perodo de
incubao.
i. Na condio anaerbia, obtida pelo uso da camada de selo (no caldo lisina) ou na
base (do LIA), todo o oxignio no combinado consumido pelo microrganismo
presente, na fase inicial de crescimento.
j. A descarboxilao da lisina, que ocorre posteriormente, resulta na produo de
uma diamina (cadaverina) e CO2, que conferem ao meio caractersticas de
alcalinidade e nova viragem da cor do indicador, que passa de amarelo para
violeta. A diamina cadaverina estvel quando produzida em condies
anaerbias.
k. A maioria das salmonelas capaz de produzir lisina descarboxilase. Quatro por
cento das cepas de Salmonella no descarboxilam a lisina. A Salmonella
paratyphi A e alguns outros sorovares no produzem lisina descarboxilase.
4. Meio SIM
a. Inocular com picada o meio de cultura.
b. Incubar a 36 1C por 24 a 30 horas.
c. A motilidade caracterizada pela difuso do crescimento por todo o meio. Se for
restrito linha de semeadura, indica que o microrganismo imvel.
d. A maioria das salmonelas apresenta motilidade positiva. A Salmonella
Gallinarum e a Salmonella Pullorum apresentam motilidade negativa.
e. O meio SIM o meio mais indicado para a verificao da produo de H2S.
f. O H2S um gs incolor produzido pelo microrganismo em teste, pela reduo do
tiossulfato presente no meio. A revelao da presena de H2S se realiza por meio
da reao do H2S com o citrato de ferro e amnio (presente no meio), formando
um precipitado negro insolvel.
g. Quinze por cento das culturas de Salmonella Choleraesuis e 95% das de
Salmonella Paratyphi A no produzem H2S.
h. A maioria das salmonelas produz H2S.
63

i.
j.
Quatorze por cento das cepas de Salmonella so H2S negativo.

Aps a leitura da motilidade e da produo de H2S, adicionar algumas gotas de
reativo de Kovacs (ou, opcionalmente de reativo de Ehrlich) aos tubos para
verificar se houve produo de indol.
k. A oxidao do triptofano presente no meio SIM leva formao de trs principais
compostos: indol, escatol e indolacetato.
l. A adio do reativo de Kovacs resulta na formao de um anel vermelho,
resultante da reao entre o indol e o dimetilaminobenzaldedo contido nesse
reativo.
m. Quase a totalidade das salmonelas no produz indol. Segundo Weissfeld et al
(1994), cerca de 1% das salmonelas produzem indol.
5. Prova da Oxidase
a. Usando palitos de madeira, de plstico descartveis ou pipetas Pasteur,
estreis, ou ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura
sobre papel-filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de
papel para teste de Oxidase, disponveis comercialmente.
b. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps esse tempo, podem ocorrer reaes
falso-positivas.
c. O aparecimento de cor azul (NNNN-tetrametil-parafenileno-diamina) ou
vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de
reao positiva.
d. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de
oxidase, pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir
reao falso-positiva.
e. Todas as salmonelas apresentam reao de oxidase negativa.
Provas bioqumicas complementares opcionais
1. Desaminao da fenilalanina: Inocular a superfcie do gar fenilalanina por
estriamento. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Adicionar 2 a 3 gotas de soluo de
cloreto frrico 10%. A alterao da colorao da cultura na superfcie do bisel para
verde indica reao de desaminao da fenilalanina. Salmonella no desamina a
fenilalanina.
2. Reao de Voges-Proskauer: Inocular o caldo VM-VP em duplicata. Incubar um dos
tubos a 36 1C por, pelo menos, 24 horas. O outro tubo deve ser incubado a 22
1C, por 96 horas. Adicionar primeiramente 0,6 ml de soluo de -naftol 5% e, em
seguida, 0,2 ml de soluo de hidrxido de potssio 40%. Agitar os tubos para que haja
oxigenao do meio. Aguardar de 10 a 15 minutos. A alterao da cor para rosa
intenso indica reao de VP positiva. Hafnia alvei apresenta reao positiva a 22 1C
e resultado varivel a 36 1C. Salmonella apresenta reao negativa para VP nas
duas temperaturas.
3. Deteco da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase): A partir das culturas em gar
estoque que apresentaram resultados compatveis com Salmonella, realizar o teste da
presena da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase). Espalhar a cultura suspeita sobre
64

carto impregnado com cido L-piroglutmico, substrato que ser hidrolisado pela
PYRase, quando produzido pelo microrganismo teste. Para revelar a hidrlise do cido
L-piroglutmico, adicionar sobre o carto algumas gotas de paradimetilaminocinamaldedo, o que, nos casos positivos, resultar no desenvolvimento
de colorao vermelha. Esta prova destina-se diferenciao entre Citrobacter e
Salmonella. Todas as cepas de Citrobacter sp produzem a enzima pirrolidonil peptidase
(reao positiva). Todas as cepas de Escherichia coli e 96% das Salmonella no
produzem essa enzima (reao negativa).
Comportamentos atpicos de Salmonella

1.
2.
3.
4.
5.
6.
Algumas cepas de Salmonella podem apresentar as seguintes reaes atpicas:

Fermentao da lactose (bisel do TSI e KIA cido);
Fermentao da sacarose (bisel do TSI cido);
No produo de H2S (SIM sem H2S, TSI/KIA sem H2S);
No descarboxilao da lisina (meio cido);
Produo de indol (reao positiva no SIM).
Reao sorolgica frente ao antissoro polivalente O

1. Ressuspender o cultivo obtido em gar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em
aproximadamente 2 ml de soluo salina 0,85%.
2. Em lmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma
gota de soluo salina 2% e uma gota do soro anti Salmonella polivalente "O",
diretamente do frasco.
3. Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspenso em teste.
4. Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminao sobre fundo escuro em 1 a
2 minutos.
5. Classificar a reao do seguinte modo:
6. Positiva: presena de aglutinao somente na mistura cultivo + antissoro;
7. Negativa: ausncia de aglutinao em ambas as misturas;
8. No especfica: presena de aglutinao em ambas as misturas (formas rugosas).
9. As culturas que apresentarem resultados compatveis com Salmonella, porm
incapazes de assegurar sua identificao por meio da sorologia, devero ser reisoladas
em gar no seletivo e serem novamente submetidas reao sorolgica.
Provas opcionais
Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioqumicas para
identificao de enterobactrias, aprovados para uso pela CLA/MAPA.
RESULTADOS
Interpretao
65

1. Emitir o resultado como positivo para Salmonella quando as culturas apresentarem

reaes tpicas nas provas bioqumicas e reao sorolgica positiva frente ao antissoro
polivalente O.
2. As culturas que apresentarem perfil bioqumico compatvel com Salmonella e que no
reagirem frente ao antissoro polivalente O ou apresentarem reao inespecfica
devem ser identificadas por mtodo molecular ou remetidas para uma Instituio de
Referncia, para concluso do resultado.
Sorotipificao
1. Remeter as culturas identificadas como Salmonella a uma Instituio de Referncia no
pas, designada pela Coordenao de Laboratrio Animal (CLA) para sorotipificao.
2. Manter no laboratrio as culturas isoladas de Salmonella, adequadamente identificadas.
Manter registro de todas as confirmaes sorolgicas realizadas pela Instituio de
Referncia.
Expresso dos resultados
Pesquisa de Salmonella: PRESENA/25 g ou ml; ou.

Pesquisa de Salmonella: AUSNCIA/25 g ou ml
66

PESQUISA DE Salmonella POR SEPARAO IMUNOMAGNTICA (IMS)

FUNDAMENTOS
Pr-enriquecimento
1. Baseia-se na incubao de 25 0,2 g ou 25 0,2 ml da amostra, adicionada de 225 ml
do diluente especfico para cada caso, a 36 1C por 16 a 20 horas.
2. Este procedimento visa minimizar os efeitos do processo tecnolgico capaz de
promover injria celular fisiolgica, sem inativar biologicamente a clula. Quando
utilizada soluo salina peptonada 1% tamponada, o tampo utilizado favorece a
manuteno do pH, o que assegura melhor recuperao das clulas de Salmonella.
3. Para leite em p, o diluente utilizado gua destilada estril adicionada de soluo de
verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactrias Gram positivas.
Separao imunomagntica
1. Baseia-se em duas aes principais: a captura por ligao imunolgica e a separao
por ao de foras magnticas. A aplicao destas duas aes leva obteno de
efeitos de concentrao e purificao do microrganismo alvo.
2. O sistema de separao imunomagntica utiliza microesferas superparamagnticas
cobertas uniformemente com uma fina camada polimrica, biologicamente inerte, que
protege o material magntico e oferece uma rea de superfcie definida para adsoro ou
acoplamento de vrias molculas, onde esto ligados anticorpos monoclonais especficos
para Salmonella.
Lavagem das microesferas (beads)

Baseia-se em trs passos de lavagem com soluo salina tamponada, adicionada de tween 20,
realizados com a finalidade de retirar microrganismos inespecificamente ligados s partculas
imunomagnticas.
Baseia-se na semeadura da alquota imunomagneticamente separada em meio que contm
substncias de ao impediente do crescimento para a maioria dos microrganismos
interferentes, e incubao em temperatura seletiva de 41 0,5C por 18 a 24h.
Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

alimentos;
Partculas imunomagnticas de 280 nm cobertas com anticorpo anti Salmonella
(beads);
67

gar Rambach;
gar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS);
gar ferro trs acares (TSI) ou gar ferro dois acares Kligler (KIA);
gar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB);
gar estoque;
Caldo lisina descarboxilase ou gar lisina ferro (LIA);
Caldo ureia ou gar ureia;
Caldo Rappaport Vassiliadis (RV);
Meio SIM;
Soluo salina 0,85%;
Soluo salina 2%;
Soluo salina peptonada tamponada, pH 7,2 (PBS);
gua destilada estril;
Soluo salina peptonada 1% tamponada;
cido clordrico 0,1N;
Reativo de Kovacs (ou, opcionalmente, reativo de Ehrlich);
Verde brilhante soluo aquosa 0,1%;
Cloreto frrico soluo aquosa 10%;
Novobiocina soluo aquosa 4%;
Soro anti Salmonella polivalente O;
Soluo salina peptonada 1% tamponada adicionada de 0,02% de tween 20;
leo mineral, vaspar ou parafina lquida estreis.
EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia;

Misturador de amostras;
Separador imunomagntico;
Pipetadores automticos ajustveis (5-50, 50-200, 100-1000 L) e respectivas ponteiras
com barreira.
PROCEDIMENTO
Preparo da amostra
Proceder conforme instrues contidas em Pesquisa de Salmonella, roteiro anterior.
Pr-enriquecimento
Proceder conforme instrues contidas em Pesquisa de Salmonella, roteiro anterior.
68

1. De cada amostra pr-enriquecida, transferir uma alquota de 1 ml para tubo eppendorf

com tampa apegada, com capacidade de 1,5 ml.
2. Adicionar a cada eppendorf 20 microlitros de partculas imunomagnticas de 280nm
cobertas com anticorpo especfico para Salmonella (beads).
3. Aps homogeneizao por suaves inverses sucessivas do eppendorf, dispor os tubos
no equipamento misturador onde devero permanecer por 30 minutos, em baixa
velocidade.
4. Em seguida colocar os tubos no separador com a barra magntica j acoplada no
suporte, onde devem permanecer por 10 minutos.
5. Sem retirar os tubos do separador magntico, retirar todo o lquido dos tubos eppendorf
com o auxlio de pipetas Pasteur, ou descartveis com bulbo, estreis, tomando o cuidado
para no tocar na parede onde as partculas imunomagnticas esto aderidas.
6. Descartar o lquido em recipiente com desinfetante testado e aprovado.
7. Retirar a barra magntica do suporte do separador.
8. A cada tubo, adicionar 1 ml de soluo salina peptonada 1% tamponada, adicionada de
0,02% de tween 20 e misturar delicadamente por repetidas inverses. Recolocar a barra
magntica no suporte do separador e deixar por mais 5 minutos.
9. Repetir esta operao por mais 2 vezes e finalizar com uma lavagem adicional com PBS,
sempre descartando o lquido em recipiente com desinfetante aprovado.
10. Depois da retirada total do lquido, suspender os beads em 20 L de PBS. Esta ser
denominada frao imunomagneticamente separada ou FIS.
Enriquecimento seletivo e pr-isolamento

1. Inocular a FIS, obtida conforme item 5.3, em tubo com 10 ml de caldo Rappaport
Vassiliadis.
2. Incubar os tubos a 41 0,5C, em banho-maria com agitao ou circulao contnua
de gua, por 24 a 30 horas.
Isolamento, seleo e identificao bioqumica e sorolgica.

Proceder conforme Pesquisa de Salmonella, roteiro anterior.
RESULTADOS
Proceder conforme Pesquisa de Salmonella, roteiro anterior.
69

PESQUISA DE Vibrio cholerae

FUNDAMENTOS
Pr-enriquecimento
Baseia-se na recuperao das clulas, fisiologicamente lesadas ou no, e crescimento em meio
no seletivo.
Etapa presuntiva
1. Baseia-se no isolamento das colnias em meio slido seletivo, gar TCBS, e em meio
no seletivo, gar gelatina, e posterior incubao a 36 1C, sendo as colnias tpicas
submetidas identificao bioqumica.
2. O gar TCBS apresenta, em sua composio, elevada concentrao de tiossulfato e
citrato de sdio, alm de ser altamente alcalino, inibindo assim o crescimento das
enterobactrias. A bile e o colato de sdio inibem os enterococos. Como indicador de
pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol, que provocam a mudana de
colorao do meio para amarelo quando da fermentao da sacarose presente no
meio, com consequente formao de cido.
Provas de identificao
A identificao de Vibrio cholerae feita por meio de provas bioqumicas, sorolgicas e
tintoriais.

alimentos;
gar sal triptona (T1N1);
gar ferro dois acares (gar Kligler);
gar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (gar TCBS);
gar soja triptona (TSA);
gar gelatina (AG);
gua peptonada alcalina pH 8,5 0,1;
Caldo peptonado sem sal;
Caldo vermelho de fenol base;
Caldo gelatina fosfato sal (GPS);
Caldo vermelho de fenol manitol;
Caldo vermelho de fenol sacarose;
Meio O/F Hugh-Leifson;
70

Bacto Vibrio cholerae antissoro polivalente;

Arabinose;
Desoxicolato de sdio;
L-arginina;
L-inositol;
L-lisina;
L-ornitina;
Manitol;
Manose;
Reativo para oxidase (oxalato de para-amino-dimetilanilina ou NNNN-tetrametilparafenileno-diamina) ou tiras para teste de oxidase;
Etanol 96%;
Reagentes para colorao de Gram;
leo mineral estril.
Equipamentos
PROCEDIMENTOS
Enriquecimento
1. Preparar a amostra.
2. Pesar, separadamente, 25 0,2 g da amostra em dois recipientes estreis.
3. Adicionar 225 ml de gua peptonada alcalina pH 8,5 a um dos recipientes e 225 ml de
caldo gelatina fosfato sal (GPS) ao outro.
4. Homogeneizar, no mximo por 60 segundos em stomacher.
5. Incubar os caldos a 36 1C por 6 a 8 horas.
6. Para amostras de ostras, inocular um 3 recipiente com 25 0,2 g de amostra e 225 ml
de gua peptonada alcalina pH 8,5, que dever ser incubado por 6 a 8 horas a 42
0,2C.
7. No agitar os frascos aps a incubao.
Inoculao
Aps a incubao, com auxlio de ala de nquel-cromo descartvel, estril ou de platina,
transferir uma alada de 3 mm de dimetro, retirada da superfcie de cada cultivo, para placas
de gar tiossulfato citrato sais biliares sacarose (TCBS) e de gar gelatina (AG). Incubar as
placas em posio invertida a 36 1C por 24 horas.
Leitura
1. Verificar o aparecimento de colnias tpicas.
71

2. No gar TCBS, as colnias de Vibrio cholerae apresentam-se com colorao amarela,

ligeiramente elevadas no centro, com bordas translcidas e 2 a 3 mm de dimetro.
3. Algumas cepas lento-fermentadoras da sacarose se apresentam verdes no TCBS, aps
24 horas de incubao.
4. No gar gelatina, as colnias de Vibrio cholerae apresentam-se como colnias
transparentes com uma zona opaca ao seu redor que, geralmente, torna-se mais ntida
aps alguns minutos sob-refrigerao.
Provas preliminares para a identificao do Vibrio cholerae

Preparo do inculo
1. Selecionar 3 ou mais colnias de cada placa dos diversos meios.
2. Repicar cada colnia para um tubo com gar sal triptona (T1N1) inclinado.
String Test
1. Colocar uma gota (grande) de soluo de desoxicolato de sdio 0,5 % sobre uma
lmina.
2. Retirar uma alada da cultura mantida em T1N1 inclinado (5.5.1) e suspend-la na
gota.
3. O aparecimento, em cerca de um minuto, de uma massa mucoide, que forma um
filamento quando a ala suspensa a uma altura de 2 a 3 cm da lmina (string test
positivo), presuntivo da presena de Vibrio cholerae.
Prova da oxidase
1. Usando palitos de madeira, de plstico descartveis ou pipetas Pasteur, estreis, ou
ala de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel-filtro
impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de oxidase,
comercialmente disponveis.
2. Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Aps este tempo, podem ocorrer reaes falsopositivas.
3. O aparecimento de cor azul (NNNN-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho
intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao positiva.
4. No utilizar alas de nquel-cromo ou alas de ao para realizar a prova de oxidase,
pois traos de xido de ferro na superfcie flambada podem produzir reao falsopositiva.
5. O Vibrio cholerae oxidase positiva.
Colorao de Gram
72

A partir da cultura mantida em T1N1, fazer um esfregao e corar pelo mtodo de Gram, de
acordo com as instrues contidas no Anexo VII, Procedimentos de colorao, roteiro
anterior. O Vibrio cholerae apresenta-se como bastonete Gram negativo, reto ou curvo.
Leitura
Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae, as colnias que forem oxidase-positiva,
"String Test" positiva e se mostrarem ao microscpio como bastonetes Gram negativos, retos
ou curvos.
Provas para a identificao de Vibrio chole rae

Teste do halofilismo
1. A partir da cultura mantida em T1N1, com auxlio de agulha de nquel-cromo ou de
platina, inocular tubos contendo caldo peptonado sem sal, tubos contendo caldo
peptonado sal 3% e caldo peptonado sal 6%.
3. Aps o perodo de incubao, observar a presena de turvao nos meios.
4. O Vibrio cholerae cresce na ausncia e na presena de 3% de sal e no cresce na
presena de 6% de sal.
5. Esta prova permite a diferenciao entre Vibrio cholerae e Vibrio alginolyticus, pois o
primeiro cresce na ausncia de sal, o que no acontece com o segundo.
6. Observao: Reservar o tubo com o caldo peptonado sal 3%, que servir de inculo
para outras provas de identificao.
gar ferro dois acares (Kligler)
1. A partir das culturas mantidas em T1N1, com auxlio de uma agulha de nquel-cromo
ou de platina, inocular o gar Kligler mediante picada central profunda, estriando na
superfcie inclinada do bisel.
3. Neste meio, o Vibrio cholerae fermenta a glicose presente, produzindo a acidificao
da base (amarela), sem produo de gs (sem bolhas) nem de H 2S (sem
enegrecimento). Por no metabolizar a lactose, produz uma alcalinizao no bisel
(vermelho).
Fermentao da sacarose
1. A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquelcromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol-sacarose.
2. Cobrir o meio com 1 a 2 ml de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
73

4. Aps o perodo de incubao, observar a mudana de colorao do meio de vermelho

para amarelo, devido fermentao da sacarose e produo de cido.
5. O Vibrio cholerae fermenta a sacarose.
Descarboxilao da lisina
1. A partir do inculo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquelcromo, inocular um tubo contendo caldo lisina.
2. Inocular tambm um tubo de meio base (sem lisina), que servir de controle para a
produo de cido a partir da glicose contida no meio.
3. Cobrir os tubos com 1 a 2 ml de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
4. Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo lisina, no
inoculado e coberto por leo, que servir de controle negativo.
5. Examinar os tubos todos os dias.
6. Durante o perodo de incubao, a cor do meio passa para amarela devido
fermentao da glicose e, ocorrendo a descarboxilao da lisina, o meio retorna cor
prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono.
7. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer.
8. O Vibrio cholerae descarboxila a lisina.
Leitura
Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que apresentarem as
caractersticas abaixo, que devero ser confirmadas por meio de provas adicionais.
Kligler
Kligler
Kligler
Sacarose
Lisina descarboxilase
Caldo peptonado sem sal
Caldo peptonado sal 3%
Caldo peptonado sal 6%
Bisel vermelho (alcalino)

Base amarela sem gs (cida)
Sem enegrecimento (H2S negativo)
Positiva
Positiva
Crescimento
Crescimento
Sem crescimento
Provas adicionais para a identificao do Vibrio cholerae

Prova de Hugh-Leifson glicose (Meio O/F)
1. A partir do inculo mantido em T1N1, com auxlio de agulha de nquel-cromo ou de
platina, inocular dois tubos contendo meio de Hugh-Leifson glicose.
2. Cobrir um dos tubos com 1 a 2 ml de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
3. Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 48 horas.
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4. Aps o perodo de incubao, verificar a viragem de cor dos meios de verde para
amarelo e a presena de gs nos tubos de Durham.
5. A cor amarela em ambos significa fermentao da glicose. A presena de cor amarela
somente no tubo sem leo mineral significa utilizao oxidativa da glicose.
6. O Vibrio cholerae fermenta a glicose sem produo de gs, por isto ambos os tubos
devem apresentar colorao amarela, sem gs.
Prova da fermentao do manitol
1. A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquelcromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol.
para amarelo, o que indica a fermentao do manitol.
5. O Vibrio cholerae fermenta o manitol.
Prova da fermentao da arabinose
1. A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquelcromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose.
para amarelo, o que indica a fermentao da arabinose.
5. O Vibrio cholerae no fermenta a arabinose, portanto o meio deve permanecer
vermelho.
Prova da fermentao da manose
1. A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquelcromo, de platina ou descartvel estril, inocular um tubo contendo caldo vermelho
de fenol manose.
para amarelo, o que indica a fermentao da manose.
5. O Vibrio cholerae fermenta a manose.
Prova da fermentao do inositol
1. A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquelcromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol inositol.
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para amarelo, o que indica a fermentao do inositol.
5. O Vibrio cholerae no fermenta o inositol, portanto o meio deve permanecer
vermelho.
Prova da descarboxilao da ornitina
1. A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquelcromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo ornitina.
2. Semear tambm um tubo de meio base (sem ornitina) para controle.
3. Cobrir os tubos com 1 ml de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
4. Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo ornitina
no inoculado e com leo, que servir de controle negativo.
fermentao da glicose, e, ocorrendo a descarboxilao da ornitina, o meio retorna
cor prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono. O tubo
controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer.
7. O Vibrio cholerae descarboxila a ornitina.
Prova da hidrlise da arginina
1. A partir da cultura mantida em caldo peptonado sal 3%, com auxlio de ala de nquelcromo ou de platina, inocular um tubo contendo caldo arginina.
2. Semear tambm um tubo de meio base (sem arginina) para controle.
3. Cobrir os tubos com 1 ml de leo mineral, ou vaselina lquida, estril.
4. Incubar a 36 1C por no mximo 4 dias, juntamente com um tubo de caldo arginina
no inoculado e leo, que servir de controle negativo.
fermentao da glicose e, ocorrendo a hidrlise da arginina, o meio retorna cor
prpura devido produo de aminas primrias e dixido de carbono.
7. O tubo controle, sem aminocido, deve virar para amarelo e assim permanecer.
8. O Vibrio cholerae no hidrolisa a arginina, portanto ambos os tubos devem
permanecer amarelos.
Leitura
Sero consideradas como suspeitas de Vibrio cholerae as colnias que apresentarem as
caractersticas abaixo, que devero ser confirmadas por meio do teste sorolgico.
Hugh-Leifson (Meio O/F) glicose
Fermentao do manitol
Fermentao da arabinose
Fermentao da manose
Fermentativo
Positivo
Negativo
Positivo
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Fermentao do inositol
Descarboxilao da ornitina
Hidrlise da arginina
Negativo
Positivo
Negativo
Teste sorolgico
1. Marcar duas sees de aproximadamente 1 x 2 cm no interior de uma placa de Petri
ou em uma lmina de vidro de 2 x 3 polegadas ou em uma placa Huddleson.
2. Colocar uma pequena quantidade da cultura, crescida em gar T1N1 inclinado,
diretamente sobre a placa ou lmina, na regio marcada.
3. Adicionar uma gota de soluo salina 0,85% na parte inferior de cada uma das regies
marcadas. Com auxlio de uma ala ou agulha de nquel-cromo ou de platina,
suspender a cultura com soluo salina em cada seo.
4. Adicionar uma gota do antissoro polivalente de Vibrio cholerae a uma das sees com
a suspenso da cultura e misturar com a ala. A outra seo contendo antgeno
somente um controle de auto aglutinao.
5. Observar a reao em 1 minuto contra um fundo escuro. Uma reao positiva
indicada por uma aglutinao rpida e forte.
6. Enviar as culturas que se comportem como Vibrio cholerae, em gar estoque, para
tipificao Instituio de Referncia designada pela CLA.
RESULTADO
1. Sero consideradas como positivas para Vibrio cholerae as culturas que apresentarem
os resultados esperados tanto nas provas adicionais de identificao quanto no teste
sorolgico.
2. Expressar o resultado como:
3. Pesquisa de Vibrio cholerae: Presena/25g ou ml; ou.
4. Pesquisa de Vibrio cholerae: Ausncia/25g ou ml
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PESQUISA DE Escherichia coli O157: H7

FUNDAMENTOS
Baseia-se na incubao de 25 0,2 g ou ml da amostra em soluo salina peptonada tamponada
adicionada de vancomicina, cefixime e cefsulodin (SPT-VCC), por 6 horas em temperatura de 36
1C. O efeito seletivo exercido pela associao de vancomicina, cefixime e cefsulodin, que visa
inibio da flora acompanhante, especialmente Proteus sp e Aeromonas sp.
1. Baseia-se em duas aes principais: a captura por ligao imunolgica e a separao
por ao de foras magnticas. A aplicao dessas duas aes leva obteno de
efeitos de concentrao e purificao do microrganismo-alvo.
2. O sistema de separao imunomagntica utiliza microesferas superparamagnticas
cobertas uniformemente com uma fina camada polimrica, biologicamente inerte, que
protege o material magntico e oferece uma rea de superfcie definida para adsoro ou
acoplamento de vrias molculas onde esto ligados anticorpos policlonais antiE. coli
O157. Na lngua inglesa, estas microesferas so denominadas de beads.
3. Lavagem das microesferas: Baseia-se em trs passos de lavagem com soluo salina
tamponada, adicionada de tween 20, realizados com a finalidade de retirar
microrganismos inespecificamente ligados s partculas imunomagnticas.
Isolamento
1. Baseia-se na semeadura da alquota imunomagneticamente separada sobre a superfcie
seca de gar MacConkey Sorbitol (MCS), o que permite que as clulas aderidas s
microesferas formem colnias.
2. Normalmente mais de uma clula se adere a cada partcula imunomagntica, o que pode
resultar em colnias originrias de mais do que uma clula aderida.
3. No gar MCS, o efeito seletivo exercido pelos sais biliares e pelo cristal violeta presentes
no meio, que atuam inibindo a flora Gram positiva. A fermentao do sorbitol
evidenciada pela viragem da cor do indicador de pH (vermelho neutro) para vermelho
intenso.
Identificao bioqumica
1. Baseia-se na inoculao das culturas suspeitas em uma bateria miniaturizada de testes
padronizados. Os microtubos, contendo substratos desidratados para cada teste, so
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reidratados pela adio da suspenso do microrganismo teste em diluente especfico

para esta finalidade.
2. Durante a incubao a 36 1C, devido ao metabolismo bacteriano, ocorrem mudanas
de colorao dos indicadores contidos no substrato. Em alguns testes, a leitura final
somente se realiza aps a adio de reativos especficos.
Ltex teste
O ltex-teste para identificao de Escherichia coli O157 consiste de dois reagentes base de
ltex. O primeiro formado por partculas de ltex, cobertas com anticorpo especfico produzido
em coelho (ltex reagente); o segundo o reagente controle, que formado por partculas de
ltex, cobertas com globulinas de coelho pr-imune (ltex controle). Quando cultivos de
Escherichia coli O157 so submetidos ao ltex-teste, ocorre aglutinao do ltex-reagente e no
do ltex-controle.
1. Outras provas complementares so realizadas com a finalidade de identificar e diferenciar
Escherichia coli O157: H7 de outros membros de sua espcie, tais como motilidade,
produo de -D-glicuronidase, e fermentao de carboidratos.
2. A verificao da produo de -hemolisina destina-se obteno de um indicativo
sobre a verocitotoxigenicidade do isolado, j que existe uma forte correlao positiva
entre a produo desta hemolisina e de verotoxina.
Vidraria e outros materiais bsicos para laboratrios de microbiologia de alimentos;
gar MacConkey-sorbitol (MCS);
gar eosina azul de metileno (EMB);
gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);
gar soja triptona, com CaCl2 e eritrcitos lavados de carneiro (ASSTCa);
gar soja triptona;
gar estoque;
gar motilidade;
Soluo salina peptonada tamponada com vancomicina, cefsulodin e cefixime (SPT - VCC);
Caldo verde brilhante-bile-lactose 2% - metilumbeliferil-glicurondeo (BRILA-MUG);
Caldo verde brilhante-bile-lactose 2%;
Caldo vermelho de fenol-base;
Caldo soja triptona;
Caldo EC modificado com novobiocina (Caldo EC + n);
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Soluo salina tamponada pH 7,2;

Soluo salina tamponada 1% adicionada de 0,02% de tween 20;
Soluo salina 0,85%;
Meio SIM;
Soluo aquosa de Vancomicina 0,8%;
Soluo aquosa de Cefsulodin 1%;
Novobiocina;
Soluo aquosa de Cefixime 1%;
Soluo de Sorbitol 10%;
Soluo de Celobiose 10%;
Soluo de Dulcitol 10%;
Cloreto frrico;
Reativo de Kovacs(ou, opcionalmente, reativo de Ehrlich);
Hidrxido de potssio;
Alfa naftilamina 0,5%;
Alfa naftol;
Soluo aquosa de Cloreto de Clcio 10 mol;
Partculas imunomagnticas de 280nm cobertas com anticorpo antiEscherichia coli O157;
Sistema miniaturizado para identificao de Enterobactrias.
EQUIPAMENTOS
Equipamentos bsicos obrigatrios para laboratrios de microbiologia;
Cmara UV (366 nm);
Misturador de Amostras;
Separador Imunomagntico;
Pipetadores automticos ajustveis (5-50, 50-200, 100- 1000L) e ponteiras
correspondentes, com barreira.
PROCEDIMENTOS

Pesar assepticamente 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 ml de amostra em sacos de stomacher
ou frascos Erlenmeyer estreis, seguindo as orientaes contidas no Anexo II, Diluies e
solues, deste Manual.
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Pr-enriquecimento
A cada alquota adicionar 225 ml de SPT-VCC e incubar por 6 horas a 36 1C.
1. Aps as 6 horas de incubao, de cada amostra pr-enriquecida, transferir 1 ml para tubo
eppendorf com tampa apegada.
2. Adicionar a cada eppendorf 20 L de beads 280nm cobertas com anticorpo policlonal
anti Escherichia coli O157.
3. Aps homogeneizao, por suaves inverses sucessivas do eppendorf, dispor os tubos
no equipamento misturador onde devero permanecer por 30 minutos em baixa
velocidade.
4. Em seguida, colocar os tubos no separador com suporte magntico j acoplado, onde
devem permanecer por 5 minutos.
5. Sem retirar os tubos do separador magntico, extrair todo o lquido dos tubos eppendorf,
com o auxlio de pipetas Pasteur ou descartveis com bulbo, estreis, tomando o cuidado
para no tocar na parede onde as partculas imunomagnticas esto aderidas.
6. Descartar o lquido em recipiente com desinfetante.
7. Retirar o suporte magntico do separador. A cada tubo, adicionar 1 ml de soluo salina
peptonada 1% tamponada - 0,02% de tween 20 e misturar delicadamente por repetidas
inverses.
8. Recolocar o suporte magntico no separador e deixar por mais 5 minutos.
9. Repetir esta operao por mais 2 vezes e finalizar com uma lavagem adicional com PBS
sem tween, sempre descartando o lquido em recipiente com desinfetante.
10. Depois da retirada total do lquido, suspender os beads em 20 L de PBS. Esta ser
denominada frao imunomagneticamente separada ou FIS.
Semeadura, seleo e isolamento.

1. Inocular no centro de uma placa com gar MCS, previamente seca, 10 L da FIS.
Espalhar com auxlio de ala de Drigalsky ou basto tipo hockey.
2. Partindo dos 10 L restantes da FIS, inocular com ala de 1 L sobre outra placa com
gar MCS, de forma a obter colnias isoladas.
4. Utilizando estereoscpio com luz oblqua incidente sobre a colnia, selecionar de 3 a 5
colnias sorbitol negativas com superfcie suavemente ondulada, com bordas em
forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com gar VRBA e gar
BEM. Tambm repicar para tubos com gar estoque inclinado.
5. Incubar a 36 1C por 18 a 24h. Aps o perodo de incubao, observar a pureza e
caractersticas das culturas e, quando necessrio, reisolar em superfcie seca de gar MCS.
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6. Quando, aps dois procedimentos de reisolamento, no forem obtidos cultivos puros,

repicar para tubos com caldo EC+n, ou com caldo verde brilhante bile lactose 2% e
incubar por 18 a 24 horas a 36 1C, inoculando posteriormente sobre a superfcie
seca de gar MCS e de gar EMB, independentemente da produo de gs nos tubos
de Durham.
8. Utilizando estereoscpio com luz oblqua incidente sobre a colnia, selecionar de 3 a 5
colnias sorbitol negativas com superfcie suavemente ondulada, com bordas em
forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com gar VRBA e gar
EMB.
9. Tambm repicar para tubos com gar estoque inclinado.
Teste da oxidase
1. A partir dos cultivos puros em gar estoque inclinado, usando palitos de madeira estreis
ou de plstico descartvel, ala de platina ou pipeta de Pasteur, realizar a prova da
oxidase espalhando a cultura sobre papel-filtro impregnado com o reativo para oxidase
(podem tambm ser utilizadas tiras para oxidase, comercialmente disponveis).
2. O aparecimento de cor azul intensa (NNNN-tetrametil-parafenileno-diamina) ou
vermelho escuro (oxalato de para-amino-dimetilanilina) indicativo de reao
positiva.
3. No utilizar alas de nquel-cromo ou de ao para realizar a prova de oxidase.
4. Todas as cepas de Escherichia coli O157: H7 apresentam resultado negativo na prova
de oxidase.
5. As culturas que apresentam resultado positivo no pertencem famlia
Enterobacteriaceae, portanto no necessitam ser submetidas a testes
complementares para Escherichia coli 0157: H7.
Teste de aglutinao de ltex

1. Submeter as culturas puras obtidas conforme item 5.5 ao teste de aglutinao de
ltex, suspendendo-as em duas gotas de soluo salina colocadas sobre o carto de
teste que acompanha o kit.
2. primeira, misturar uma gota do ltex reagente e sobre a outra uma gota do ltex
controle. Misturar por um minuto e observar aglutinao.
3. Considerar como positivas as culturas que, em um minuto ou menos, apresentarem
aglutinao apenas no ltex reagente. Para os controles positivo e negativo, utilizar os
controles que acompanham o kit.
4. As culturas que apresentarem resultado negativo no teste de aglutinao de ltex devem
ser descartadas.
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Testes adicionais
Verificao da motilidade das culturas suspeitas
1. A partir das culturas puras, em gar estoque inclinado, que apresentarem reao positiva
frente ao ltex reagente e negativa frente ao ltex controle, repicar para tubos contendo
gar motilidade modificado, utilizando agulha de inoculao.
2. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Observar o tipo de crescimento: difuso (motilidade
positiva) ou apenas na linha de inoculao (motilidade negativa).
3. As cepas de Escherichia coli O157: H7 apresentam motilidade positiva, enquanto que a
E.coli ATCC 25922 apresenta motilidade negativa.
Verificao da produo de -D-glicuronidase e de gs em caldo BRILA-MUG.
1. A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos com caldo verde
brilhante bile-lactose-metilumbeliferil-glicurondeo (BRILA-MUG), com tubos de
Durham invertidos.
3. Observar a produo de gs nos tubos de Durham. Anotar os resultados.
4. Em cmara de UV (366nm), verificar a formao de 4-metil-umbeliferona a partir do
MUG. Considerar como positivo para -D-glicuronidase as culturas que produzirem
fluorescncia no meio de cultura.
5. A Escherichia coli O157: H7 no produz -D-glicuronidase, portanto no se observa
fluorescncia no caldo BRILA-MUG.
6. A Escherichia coli ATCC 25922 produz fluorescncia (reao positiva) neste meio.
OBS.: A cultura de E.coli O157: H7 ATCC 43888 (no toxignica) no produz gs no caldo verde
brilhante lactose 2%, enquanto que as E.coli O157: H7 verotoxignicas ATCC 43889, ATCC
43890 e ATCC 43894 so capazes de produzir gs neste meio.
Verificao da fermentao do sorbitol, da celobiose e do dulcitol.
1. A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos contendo 3 ml de
caldo vermelho de fenol base adicionado, separadamente, de sorbitol, celobiose e de
dulcitol (esterilizados por filtrao), de forma a obter uma concentrao final do
acar de 0,1%.
2. Incubar os tubos a 36 1C por 24 a 30 horas. Aps incubao, observar a produo de
cido, evidenciada pela viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo nas
culturas fermentadoras dos acares presentes.
3. Os resultados esperados esto na tabela abaixo:
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Cultura
Sorbitol
Celobiose
Dulcitol
Escherichia coli O157: H7
Escherichia hermannii
-/+
Escherichia fergusonii
Escherichia coli
-*
: 60% so pos. -/+: 19% so positivas -*: 2% so positivas

Verificao da produo de enterohemolisina
1. A partir das culturas puras obtidas conforme item 5.5, repicar em estrias para a superfcie
seca de gar soja triptona, com cloreto de clcio e eritrcitos de carneiro (ASSTCa). Para
preparar o ASSTCa, a cada 100 ml de gar soja triptona adicionar 1 ml CaCl2 1M e 5 ml de
eritrcitos lavados de carneiro.
2. Incubar a 36 1C por 4 horas. Verificar atividade hemoltica e registrar os resultados
obtidos. Reincubar at 24 horas repetindo a leitura.
3. Considerar como positivas para produo de enterohemolisina as culturas que no
produzirem hemlise em 4 horas e apresentarem reao hemoltica caracterstica de
alfa-hemolisina (colorao esverdeada ao redor das colnias) aps 24 horas de
incubao.
4. A grande maioria das cepas de Escherichia coli O157: H7 verotoxignicas so alfahemolticas.
Provas Opcionais
Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioqumicas para
identificao de enterobactrias, aprovados para uso pela CLA/MAPA.
Sistema miniaturizado para identificao de enterobactrias
Repicar, para tubos com gar estoque inclinado, as culturas que apresentaram reao positiva
frente ao ltex reagente, negativas frente ao ltex controle, motilidade positiva, -D-glicuronidase
negativa, com ou sem produo de gs a partir da lactose, no fermentadoras do sorbitol e da
celobiose, e capaz de fermentar o dulcitol. Incubar a 36 1C por 18 a 24 horas. Seguir as
recomendaes do fabricante do sistema utilizado.
RESULTADOS
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Considerar o resultado positivo para Escherichia coli O157: H7 as amostras em que os isolados se
comportarem como abaixo descritos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Colnia caracterstica de E.coli em VRBA e EMB

Sorbitol negativo no MCS
Celobiose negativa no caldo vermelho de fenol
Dulcitol positivo no caldo vermelho de fenol
Sorbitol negativo no caldo vermelho de fenol
Aglutinao positiva frente ao ltex reagente em um minuto
Aglutinao negativa frente ao ltex controle
Motilidade positiva
-D-glicuronidase negativa
No hemoltica em 4 horas
Alfa-hemoltica em 24 horas (presuntivo para verotoxina)
Perfil bioqumico correspondente a Escherichia coli no sistema para identificao de
enterobactrias.
As culturas que se comportarem como Escherichia coli O157: H7 devem ser mantidas pelo
laboratrio e encaminhadas Instituio de Referncia para enterobactrias, designada pela CLA
para sorotipificao, inclusive com soro flagelar H7, e teste de verotoxigenicidade.
Os resultados de confirmao sorolgica e de verotoxigenicidade podem demorar um tempo
relativamente grande. Por este motivo, emitir o resultado de anlise considerando os resultados
obtidos no laboratrio. Quando o resultado sorolgico confirmar a presena de E.coli O157: H7
(verotoxignica ou no), comunicar por escrito ao responsvel pelo SIF que encaminhou a
amostra para anlise.
Manter arquivo de todas as informaes sorolgicas realizadas pela Instituio de Referncia.
Expresso do resultado
Expressar o resultado como:
Pesquisa de Escherichia coli O157: H7 - Presena /25 g ou ml; ou.

Pesquisa de Escherichia coli O157: H7 - Ausncia/25 g ou ml.
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PESQUISA DE Paenibacillus larvae subsp. Larvae (produtos da colmeia).

FUNDAMENTOS
Preparo da Amostra
O aquecimento da amostra a 45C visa diminuir a viscosidade, permitir a distribuio
homognea dos esporos e facilitar a manipulao. A diluio com soluo salina tamponada,
alm de viabilizar a concentrao dos esporos pela centrifugao que se segue, contribui para
bloquear parcialmente a ao inibidora de crescimento bacteriano, exercida por substncias
presentes no mel.
Centrifugao
Visa concentrar os esporos presentes na amostra por meio de centrifugao a 3.000 x g por 30
minutos (g = 0, 0000118 x raio do rotor (cm) x rpm2).
Choque Trmico
Por meio do aquecimento, a 80C por 10 min., do sedimento da amostra obtido por
centrifugao, obtm-se a eliminao das formas vegetativas de bactrias que podem
interferir no crescimento de Paenibacillus larvae e dificultar a seleo de colnias.
Isolamento e Seleo
Baseia-se na semeadura sobre a superfcie seca de gar Paenibacillus larvae (ABL), meio
composto por gar estoque, gar soja triptona, gar Cereus (PEMBA) - base, suplementado
com emulso de gema de ovo, cido nalidxico e cido pipemdico. A emulso de gema de ovo
promove a multiplicao de P.larvae e permite a diferenciao de microrganismos pela reao
da lecitinase. A presena de 0,1% de peptona, associada ao piruvato de sdio (presentes no
PEMBA), evidencia a precipitao da lecitina da gema do ovo, provocada por espcies de
Bacillus que possuem essa propriedade. O manitol, carboidrato presente no meio, no
fermentado pelo Paenibacillus larvae. O indicador de pH presente no meio o azul de
bromotimol. O cido nalidxico atua inibindo total ou parcialmente o crescimento de P. alvei,
B. megaterium, P.larvae subsp. pulvifaciens, P. polymyxa e B. pumilus. O cido pipemdico atua
prevenindo o crescimento de B. circulans, B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. mycoides,
P.larvae subsp. pulvifaciens e P. apiarius.
Provas confirmativas
Baseiam-se na observao das caractersticas morfolgicas e tintoriais; na observao da
capacidade de decompor a casena; na incapacidade de produzir catalase; no crescimento
escasso em gar nutriente isento de extrato de levedura e no crescimento tpico no gar leite
com tiamina (ALT).
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Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia;

Tubos para centrfuga tipo Falcon ou similar, com tampa rosquevel, cap. 100 ml;
gar cereus (PEMBA) - base* (opcional: gar manitol gema de ovo poliximina segundo
Mossel (MYP) base);
gar estoque*;
gar soja triptona*;
Emulso de gema de ovo 50%*;
cido pipemdico soluo 0,2%*;
cido nalidxico soluo 0,1%*;
Tiamina cloridrato soluo aquosa 0,1%**;
Leite desnatado UHT**;
gar gar com extrato de levedura**;
gar nutriente sem extrato de levedura;
Caldo crebro-corao com tiamina (BHIT);
Soluo salina fosfatada tamponada pH 7,2 (PBS);
Caldo experimental para anaerbios;
* Componente do gar Bacillus larvae (ABL);

** Componente do gar leite com tiamina (ALT).
EQUIPAMENTOS
Centrfuga (3.000 x g);

Banho-maria a 80C;
Termmetro 100C.
PROCEDIMENTOS
Preparo da amostra
1. Mel e produtos in natura: Aquecer a amostra em banho-maria a 45C para facilitar a
manipulao da mesma e a homogeneizao dos esporos presentes. Transferir,
assepticamente, 20 ml da amostra para tubo de centrifuga estril e adicionar 30 ml de
soluo salina fosfatada tamponada (PBS). Homogeneizar bem.
2. Produtos da colmeia liofilizados: pesar, assepticamente, 5g do produto em tubo de
centrfuga estril e adicionar 45 ml de PBS. Deixar em repouso por 10 a 15 min.
Homogeneizar bem.
3. Plen: pesar, assepticamente, 5g da amostra e adicionar 45 ml de PBS misturando
vigorosamente. Filtrar a mistura em papel filtro n 2 (Whatman). Deixar em repouso
87

por 2 horas para decantao do plen residual. Transferir cuidadosamente para tubos
de centrfuga estreis com tampa.
Concentrao por centrifugao

1. Centrifugar a 3.000x g por 30 minutos.
2. Aps centrifugao, descartar cuidadosamente o sobrenadante.
3. Ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS e transferir para tubos com tampa de
rosca. Aquecer a 80C, em banho-maria, por 10 minutos.
Isolamento
1. Transferir 0,1 ml da suspenso preparada conforme item 5.3 para a superfcie seca de
placas com ABL. Com o auxlio de basto tipo hockey, espalhar cuidadosamente o
inculo sobre a placa.
2. Paralelamente, usando ala de 10 L, inocular a suspenso por estrias sobre a
superfcie seca de outra placa com ABL.
3. Incubar as duas placas invertidas a 36 1C por at 5 dias, observando, aps 48h e
depois diariamente, o crescimento de colnias tpicas de Paenibacillus larvae.
4. No ABL, as colnias tpicas de Paenibacillus larvae se apresentam planas, com
superfcie suavemente granulada, achatadas, com ou sem centro elevado de maior
densidade, com bordas levemente irregulares, sem brilho, de cor verde- amarelada e
dimetro de 2 a 5 mm, sem halo de precipitao da lecitina, com ou sem halo de
liplise;
5. Alguns isolados podem apresentar colnias com centro muitas vezes mais denso
(opaco) que as bordas (translcidas).
Seleo
Selecionar 3 a 10 colnias tpicas e testar quanto presena de catalase.
Prova da Catalase
1. Com auxlio de uma ala de platina, basto de vidro, palito de madeira ou pipeta de
Pasteur estreis, retirar uma alquota do cultivo, transferir para uma lmina ou placa
de vidro contendo uma gota de perxido de hidrognio a 3%. Misturar o inculo ao
perxido e observar a reao.
2. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase.
3. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase.
4. As culturas de Paenibacillus larvae so catalase negativas.
5. Repicar as colnias catalase negativas para tubos contendo gar leite com tiamina
inclinado e incubar a 36 1C por 24 a 48 h. Manter essas culturas para testes
complementares, caso sejam necessrios.
88

Provas Confirmativas
Realizar as provas confirmativas completas em cada uma das colnias catalase negativas.
Colorao de Gram
1. Das colnias suspeitas, fazer esfregao e corar pelo mtodo de Gram. O P.larvae se
apresenta como bastonete Gram positivo, comumente longo e fino, porm, pode se
apresentar de diversos tamanhos, em cadeias de comprimento varivel.
2. As culturas que se apresentarem como suspeitas no Gram e catalase negativas devem
ser testadas para:
Crescimento em superfcie de gar nutriente sem extrato de levedura
1. A partir das colnias catalase negativas, repicar tambm em tubos com gar nutriente
inclinado isento de extrato de levedura e incubar a 36 1C por 3 dias.
2. A maioria dos Paenibacillus larvae apresenta escasso crescimento em gar nutriente
sem extrato de levedura aps 3 dias.
Decomposio da casena e verificao de crescimento tpico no ALT
1. A partir das colnias catalase negativas, repicar sobre a superfcie seca de placas com
gar leite com tiamina (ALT) e incubar a 36 1C por 3 dias.
2. Aps incubao, verificar a presena de halo transparente ao redor das colnias.
3. O Paenibacillus larvae decompe a casena em at 3 dias.
4. As colnias de Paenibacillus larvae subsp. larvae no ALT se apresentam de colorao
entre branco e gelo, de aspecto sutil e delicado (pouco densas).
5. Diferenciao entre Paenibacillus larvae subsp. larvae e outros microrganismos
relacionados comumente encontradas em amostras de produtos apcolas.
Microrganismos
Decomposio da
casena
P.larvae subsp. larvae

POS *
Paenibacillus alvei
POS
Brevibacillus laterosporus
POS
P.larvae subsp. Pulvifaciens
POS
Paenibacillus popilliae
NEG
Paenibacillus lentimorbus
NEG
Associado ao crescimento caracterstico no ALT.
RESULTADOS
Interpretao
89
Catalase
NEG
POS
POS
NEG
NEG
NEG
Crescimento em gar
nutriente sem extrato de
levedura
NEG ou escasso
POS
POS
POS
NEG
NEG

Considerar como P.larvae subsp. larvae as culturas que se apresentarem como bastonetes
Gram positivos finos, mdios a longos, dispostos em cadeias, catalase negativas, com reao
positiva para hidrlise da casena associada ao crescimento tpico no ALT, e com crescimento
escasso no gar nutriente sem extrato de levedura em 3 dias.
Expresso do Resultado
Expressar o resultado das anlises de mel como:
Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Presena / 20 ml de mel; ou.
1. Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Ausncia / 20 ml de mel.
2. Para outros produtos da colmeia expressar o resultado como: Presena (ou Ausncia) /
quantidade de amostra submetida anlise.
90

TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL PARA ALIMENTOS DE BAIXA ACIDEZ pH

> 4,6
FUNDAMENTOS
Pr-incubao
Baseia-se na incubao das amostras nas temperaturas de 36 1C pelo perodo de 10 dias e a
55 1C pelo perodo de 5 a 7 dias, objetivando a deteco de crescimento bacteriano com
formao de gs, evidenciado pelo tufamento da embalagem e na verificao de possveis
microfugas.
Semeadura e incubao
Baseia-se na utilizao de meios lquidos no seletivos com capacidade de promover o
crescimento de microrganismos por meio da incubao em aerobiose e anaerobiose, em
temperaturas ideais para o desenvolvimento de microrganismos mesfilos e termfilos.
Colorao pelo mtodo de Gram e de esporos
Baseia-se na observao microscpica das caractersticas morfolgicas e tintoriais dos
microrganismos presentes e de seus esporos.
Prova da Catalase
Baseia-se na verificao da capacidade do microrganismo em teste produzir a enzima catalase,
que decompe o perxido de hidrognio, liberando oxignio, o que evidenciado por meio da
Prova da termofilia estrita
Baseia-se na verificao da germinao e crescimento dos esporos nas temperaturas

de 36 1C e 55 1C para certificao da exigncia absoluta de elevada temperatura
para seu desenvolvimento.
A germinao dos esporos a 36 1C indica a capacidade mesoflica do
microrganismo.
O crescimento a 36 1C e a 55 1C indica a capacidade termoflica facultativa do
microrganismo.
O crescimento somente a 55 1C indica a capacidade termoflica estrita do
microrganismo.
91


alimentos;
Equipamentos, vidraria e outros;
Abridores metlicos estreis;
Pinas estreis;
Caldo de carne cozida (CCC) ou Caldo Tarozzi;
Caldo glicose triptona;
gar glicose triptona;
gar nutriente;
gar nutriente com sulfato de mangans;
gar para esporulao;
Corantes para a colorao de esporos;
Corantes para a colorao de Gram;
Vaspar ou vaselina ou leo mineral ou parafina lquida.
EQUIPAMENTOS
PROCEDIMENTOS
Pr-incubao
1. Seguir os procedimentos para pr incubao no item 3.1.1 do Anexo V, Procedimento
para o preparo, pesagem e descarte de amostras, roteiro anterior.
2. Verificar, aps o perodo de pr-incubao a 36 1C e 55 1C, se os recipientes no
sofreram tufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que possam
evidenciar a presena de microfugas ou vazamentos.
3. Registrar como sem alterao quando no se observar qualquer alterao dos
recipientes e como alterado quando qualquer alterao for detectada. Descrever a
alterao, quando ocorrer.
Amostras que sofreram alterao durante a pr-incubao
Ao final da pr-incubao, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver
manchado, evidenciando a presena de microfugas, submeter a respectiva amostra anlise
de aerbios e anaerbios, mesfilos ou termfilos, de acordo com a temperatura da princubao. Proceder conforme item 5.3 para a anlise destas amostras.
Amostras tufadas
92

1. As amostras que derem entrada no laboratrio com evidncias de tufamento e

estiverem acompanhadas de ofcio com solicitao de anlise especial sero analisadas
imediatamente, devendo ser preparadas conforme as instrues descritas abaixo:
2. Fazer desinfeco da embalagem com algodo embebido em soluo desinfetante e em
seguida com etanol 70% ou etanol 70 GL.
3. Deixar secar.
4. Posicionar a lata com borda no codificada para cima e costura lateral voltada para o lado
oposto ao analista.
5. Colocar um chumao de algodo embebido em soluo desinfetante, previamente
aprovada pelos testes do laboratrio, no local onde ser iniciada a abertura da
embalagem. Esse procedimento tem o objetivo de proteger o ambiente e o analista
contra uma possvel contaminao proveniente do alimento em anlise pela expulso de
gases e/ou lquidos presentes no recipiente no momento do rompimento da
hermeticidade. Outros cuidados como o uso de luvas, mscara, toucas, etc. tambm
devero ser adotados.
6. Usando um abridor de latas metlico, previamente esterilizado, abrir um pequeno orifcio
sob o chumao de algodo.
7. Deixar em repouso sem retirar a proteo de algodo sobre o orifcio at que a presso
interna do produto esteja equilibrada com a externa.
8. Com outro abridor estril, abrir cuidadosamente a lata e transferir pores do contedo,
tomadas do lado oposto ao local do orifcio inicialmente feito, para os meios de cultivo
indicados.
9. Aps a retirada das alquotas estabelecidas pela metodologia especfica, fechar
cuidadosamente a lata e acondicion-la em saco plstico autoclavvel, fechando-o com
fita adesiva. A amostra, assim embalada, dever ser imediatamente descartada conforme
norma especfica do laboratrio.
10. As amostras alteradas que chegarem desacompanhadas de ofcio com solicitao
especfica no sero analisadas. Fazer constar no Certificado Oficial de Anlise a
informao do motivo da no aceitao.
11. No flambar os recipientes tufados. Os mesmos devero ser somente desinfetados
com algodo embebido em soluo desinfetante.
Inoculao das amostras

1. Utilizando a amostra incubada a 36 1C, retirar alquotas de cerca de 1 a 2 gramas ou
ml e semear em quatro tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi, e
tambm em quatro tubos contendo caldo glicose triptona.
2. Aps a inoculao das amostras, acrescentar, assepticamente, sobre o caldo de carne
cozida ou caldo Tarozzi uma camada de aproximadamente 2 cm de vaspar ou vaselina
ou leo mineral ou parafina lquida, estril, previamente fundido.
Incubao
93

Incubar dois tubos de cada meio nas temperaturas de 36 1C e 55 1C por 120 horas (5
dias).
Leitura e Interpretao
1. Verificar, nos tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi, a formao de
gs, a turvao do meio e possvel alterao na aparncia da carne do meio, sinais
indicativos de crescimento bacteriano.
2. Os clostrdios sacarolticos produzem cido e gs com odor cido, sem a digesto da
carne cozida, mas com consequente avermelhamento da mesma.
3. Os clostrdios proteolticos degradam a protena em aminocidos, com a precipitao
da tirosina na forma de cristais brancos, produzindo um odor ftido de compostos
sulfurados com consequente enegrecimento da carne cozida e turvao do caldo.
4. Verificar, nos tubos com caldo glicose triptona, se ocorreu turvao e/ou formao de
pelcula na superfcie do caldo, alteraes que indicam crescimento bacteriano.
5. Considerar como negativo o teste para a esterilidade comercial quando no se
observar nenhuma das alteraes citadas acima e os controles corresponderem aos
resultados esperados.
6. Dar sequncia ao teste quando forem observadas quaisquer das alteraes citadas
acima e os controles corresponderem aos resultados esperados.
Confirmao de tubos com crescimento positivo ou su speito

Os tubos suspeitos de apresentarem crescimento devem ser repicados por estriamento em
placas de ABHI, conforme segue:
1. Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a 36 1C (aerbios
mesfilos) repicar concomitantemente para duas placas com ABHI. Incubar uma destas
placas a 55 1C e a outra a 36 1C por 24 a 48 horas.
2. Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a 55 1C (aerbios
termfilos) repicar para uma placa com ABHI. Incubar a 55 1C por 24 a 48 horas.
3. Quando o tubo suspeito for o de caldo de carne cozida (ou de caldo Tarozzi), incubado
a 36 1C (anaerbio mesfilo) ou a 55 1C (aerbios termfilos), repicar para uma
placa com ABHI. Incubar por 24 a 48 horas, na mesma temperatura de incubao
usada para o tubo de origem (36 1C ou 55 1C), em anaerobiose.
Leitura
1. Aps a incubao, verificar o crescimento de microrganismos nas placas.
2. O no crescimento indicar resultado negativo para o teste de esterilidade comercial.
3. Quando for verificado crescimento nas placas, repicar as culturas obtidas para tubos
com gar estoque inclinado e incubar nas mesmas condies das placas de origem.
Aps incubao, realizar os testes complementares a seguir:
94

Colorao de Gram
1. A partir das colnias que crescerem nas placas, preparar esfregao e corar pelo
mtodo de Gram, conforme instrues constantes do Anexo VII, Procedimentos de
colorao, roteiro anterior.
2. Quando for verificada a presena de bastonetes Gram positivos nos tubos incubados
em anaerobiose, a realizao da prova de catalase necessria para a diferenciao
entre Bacillus sp (catalase positiva) e Clostridium sp (catalase negativa).
3. Registrar no resultado final a morfologia dos cultivos celulares isolados observada.
Prova da catalase
1. Com auxlio de ala de platina, palito de madeira, basto de vidro ou Pipeta de Pasteur
estril, transferir a cultura para uma lmina de vidro contendo uma gota de perxido
de hidrognio a 3%.
2. A no formao de borbulhas indica prova negativa para catalase.
3. A formao de borbulhas indica prova positiva para catalase.
4. No caso da presena de bastonetes Gram positivos, resultados de catalase negativos
indicam a presena de Clostridium sp e resultados positivos indicam a presena de
Bacillus sp.
5. Quando for detectada a presena de Clostridium sp, guardar as culturas para testes
complementares, caso sejam necessrios.
Prova da termofilia estrita
1. Quando forem detectados bastonetes termfilos, realizar prova para confirmao de
termofilia estrita do microrganismo isolado.
2. A partir dos tubos com caldo glicose triptona positivos incubados a 55 1C, repicar
maciamente para tubos contendo gar nutriente inclinado com sulfato de mangans
(ou gar para esporulao).
3. Incubar a 55 1C de 2 a 10 dias.
4. A partir do segundo dia, verificar a presena de esporos por meio da aplicao da
tcnica para colorao de esporos, conforme instrues constantes do Anexo VII,
Procedimentos de colorao, roteiro anterior.
5. Quando forem detectadas culturas esporuladas, preparar suspenso de esporos,
lavando o crescimento obtido no tubo com gar nutriente/sulfato de mangans com 1
ml de gua destilada ou deionizada estril.
6. Inativar as formas vegetativas por meio da aplicao de um choque trmico a 80C por
15 minutos na suspenso preparada de 1 ml.
7. Inocular 0,1 ml do lavado, aps o choque trmico, em dois tubos contendo caldo
glicose triptona.
8. Incubar um tubo a 36 1C e outro a 55 1C por 2 a 4 dias.
95

9. Verificar o crescimento de microrganismos, evidenciado pela turvao do caldo.

10. O crescimento bacteriano somente no tubo incubado a 55 1C determina a
termofilia estrita do microrganismo isolado.
11. O crescimento bacteriano nos dois tubos determina a termofilia facultativa do
microrganismo isolado.
12. Registrar no resultado final a caracterstica mesoflica ou termoflica do microrganismo
isolado.
Confirmao de microrganismos flat sour (opcional)
1. A partir das culturas obtidas nas placas de ABHI, provenientes dos tubos positivos de
caldo glicose triptona incubados a 55 1C, repicar para a superfcie seca de 2 placas
com gar glicose triptona. Incubar uma das placas a 36 1C por 72 horas e a outra a
55 1C por 48 horas em cmara mida.
2. O crescimento de colnias amarelas, regulares, com dimetro de aproximadamente 2
a 3 mm, rodeadas de zona de clarificao tambm amarela, nas placas incubadas a 55
1C, com ncleo opaco e o no crescimento naquelas incubadas a 36 1C,
confirmar a presena de Bacillus stearothermophilus (renomeado - Geobacillus
stearothermophilus), microrganismo responsvel pela deteriorao flat sour.
RESULTADOS
Pr-incubao
Expressar, no campo referente a emisso do resultado para prova de pr-incubao, nas
temperaturas requeridas, o resultado como sem alterao quando no se observar qualquer
alterao ou anormalidade no recipiente e nas caractersticas fsicas e/ou sensoriais da
amostra, e como alterado quando for observada qualquer alterao ou anormalidade no
recipiente ou nas caractersticas fsicas e/ou sensoriais da amostra. Nesse caso, descrever o
tipo de alterao observado.
Pesquisa de aerbios e anaerbios termfilos e mesfilos

Expressar, nos campos referentes a emisso dos resultados para as pesquisas de aerbio e
anaerbio mesfilo e termfilo, o resultado como negativa, quando no for observado
qualquer desenvolvimento de microrganismos no teste aplicado e como positiva quando for
observada a presena de microrganismos. Sempre que possvel, fazer constar do resultado
final as observaes feitas ao microscpio.
96

DILUIES E SOLUES
DILUIES
Diluio o procedimento de adio de uma substncia a outra para reduzir a concentrao
de uma das substncias.
O uso mais comum da palavra diluio ocorre no sentido de que tantas partes de um material
esto sendo diludas em um nmero total de partes do produto final (diluente + material).
Uma diluio uma expresso de concentrao ou proporo, no de volume.

Diluio indica a quantidade relativa de substncias em uma soluo.
Em frases de diluio, o menor nmero sempre se refere ao nmero de partes da substncia

que est sendo diluda, enquanto que o maior nmero sempre se refere ao nmero departes
que constitui a soluo final.
Exemplo: Frase de Diluio: Fazer uma diluio 1 para 10 de leite em soluo salina
peptonada. Esta frase poderia ser escrita de outras formas, com o mesmo significado:
Fazer uma diluio 1 em 10, de leite em soluo salina peptonada.

Fazer uma diluio 1 para 10, de leite com soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1/10, de leite com soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio 1:10, de leite usando soluo salina peptonada.
Fazer uma diluio de 1 parte de leite e 9 partes de soluo salina
peptonada.
Diluies decimais
Diluies decimais so diluies em que a quantidade de substncia a ser diluda corresponde
unidade, ou mltiplos da unidade e o volume final da soluo diluda igual a 10 ou mltiplo
de 10 (diluies de base 10).
Diluies decimais seriadas
So diluies decimais preparadas em srie e que possuem um fator de diluio nico e igual a
10. Exemplo:
a) Preparar diluies decimais de uma cultura bacteriana em fase estacionria at 10-3:
b) Preparar uma diluio 1:10 da cultura em fase estacionria em soluo salina peptonada, isto
, misturar 1 ml da cultura em fase estacionria com 9 ml de soluo salina peptonada (10-1).
c) A partir da diluio 1:10 preparada conforme item 1 deste exemplo, aps homogeneizao em
agitador de tubos, tomar 1 ml e misturar com 9 ml de soluo salina peptonada, de forma a
obter a diluio 1:100 da cultura em fase estacionria (10-2).
97

d) A partir da diluio 1:100 preparada conforme item 2 deste exemplo, aps homogeneizao
em agitador de tubos, tomar 1 ml e misturar com 9 ml de soluo salina peptonada, de forma
a obter a diluio 1:1000 da cultura em fase estacionria (10-3).
Clculos de Diluies
Clculo envolvendo uma diluio:

Para preparar uma diluio 1:100 de carne em soluo salina peptonada, devemos misturar
uma parte de carne em um volume final de 100partes, isto , 1 + 99.
Quando necessrio preparar um determinado volume de uma diluio especfica de uma
substncia, o clculo se efetua pelo processo razo-proporo, conforme exemplo abaixo:
Substncia: NaCl
Volume a ser preparado: 130 ml
Diluio: 1:80 (= 1 parte de NaCl em volume final de 80 partes)
1 parte de NaCl = X gramas de NaCl
80 partes de soluo final 130 ml de soluo final
80 X = 130 x 1
X = 130 = 1,625 partes de NaCl/130 ml de soluo 80
ou
Vi x Ci = Vf x Cf
Vi = volume inicial
Ci = concentrao inicial
Vf = volume final
Cf = concentrao final
Vrias diluies relacionadas: Vrios mtodos laboratoriais indicam o uso de uma srie de
diluies, o que nada mais que um nmero de solues obtidas pela diluio de uma
substncia em um diluente, e fazendo diluies sequenciais a partir das solues resultantes.
Diluies de alimentos para realizao de anlises microbiolgicas
O processo de diluio da amostra, bem como o procedimento tcnico utilizado durante esse
processo, constituem fatores importantes de interferncia nos resultados finais da anlise
microbiolgica.
98

Em microbiologia de alimentos, comumente so utilizadas diluies decimais da amostra,

adotando-se rotineiramente dois critrios: massa por unidade de volume (m/v) e volume por
unidade de volume (v/v).
Para a obteno de uma diluio de base 10, homogenezam-se pores da amostra com
volume de diluente necessrio para completar o volume correspondente a 10 vezes o volume
(ou peso) da amostra.
Assim, a diluio 1:10 de uma amostra de leite pasteurizado pode ser obtida homogeneizando:
1 ml de leite + 9 ml de diluente, ou.

25 ml de leite + 225 ml de diluente, e assim por diante.
Em todos os exemplos acima, a amostra resulta diluda 1:10 (10-1) e, consequentemente, em

cada ml da diluio teremos uma quantidade de amostra correspondente a um dcimo de ml
(0,1 ml) e 0,9 ml de diluente.
Sempre que necessrio inocular amostras lquidas sem diluir em meios de cultura, considerase que a amostra se encontra na diluio 100.
Para produtos slidos h a necessidade de pesar a amostra. Normalmente utilizam-se
alquotas de 10 ou 25 gramas de alimentos slidos. Dez ou vinte e cinco gramas de alimento
no correspondem necessariamente a 10 ou 25 ml de alimento. O volume vai variar com a
densidade e temperatura do alimento em anlise.
Alimentos slidos, em p ou pastosos sempre tero que sofrer diluio antes do incio da
anlise, usando-se o critrio massa por unidade de volume (m/v).
Normalmente a diluio inicial de amostras slidas, em p ou pastosas, utilizadas para anlises
microbiolgicas 1:10. Outras diluies como 1:2, 1:5, ou outras podem ser usadas em casos
especiais.
Antes do incio do procedimento de diluio fundamental que a amostra seja bem
homogeneizada (produtos lquidos em p e pastosos) ou que a alquota para anlise, obtida de
produtos slidos, seja tomada de vrios pontos de forma a representar realmente a amostra.
Pontos crticos do processo de diluio de amostras de alimentos
Homogeneiza o da amostra e suas diluies
99

A homogeneizao inadequada da diluio inicial, e das subsequentes, poder

acarretar diferenas muito grandes na contagem das colnias e resultados incoerentes
quando do uso de duas ou mais diluies sucessivas.
Para a obteno de resultados corretos de contagem de microrganismos em amostras
de alimentos, a homogeneizao de todas as diluies ponto fundamental.
A homogeneizao da diluio inicial (amostra/diluente) dever ser realizada em
stomacher entre 30 segundos a 2 minutos, dependendo do tipo de amostra.
A homogeneizao das diluies subsequentes dever ser realizada com o auxlio de
agitador de tubos, por um perodo de tempo no superior a 1 minuto.
Evitar a homogeneizao manual das diluies, poiso processo manual resulta a cada
vez em diferentes graus de homogeneidade.
Diluies a utilizar x Intervalo de preciso e repetibilidade
Considerando que o intervalo de preciso e repetibilidade podero variar de 15 a 150,

de 20 a 200, de 25 a 250 e ainda de 30 a 300, dependendo da metodologia analtica
empregada, caber ao analista estabelecer diluies que possibilitem a contagem de
colnias nesses intervalos de preciso.
Dessa forma, para alimentos com expectativa de crescimento bacteriano baixo, devido
ao seu processo de fabricao e de conservao, as inoculaes devero ser efetuadas
a partir da diluio inicial 100 para lquidos ou 10-1para slidos ou pastosos, com no
mnimo, duas diluies sucessivas.
Por outro lado, para alimentos que se desconhece o nmero aproximado de
microrganismos existentes, as diluies a serem preparadas devero garantir
condies de realizao das contagens.
Usualmente, nesses casos, utilizam-se as diluies 10-1 a 10-6.
Tempo desde a primeira diluio at a inoculao em meios de cultura

O tempo gasto para a execuo das diluies de uma amostra de alimentos at sua inoculao
em meios de cultura dever ser de, no mximo, 20 minutos, de forma a no permitir a
multiplicao dos microrganismos contidos nas diferentes diluies, o que acarretaria a
obteno de resultados falsos para a contagem de microrganismos.
Poss veis contaminaes acidentais
Ao retirar as pipetas dos cartuchos ou ao desenrolar o papel que envolve individualmente cada
uma delas, tomar o mximo de cuidado para no tocar com a pipeta a superfcie externa do
cartucho, as mos, as bordas externas dos tubos ou dos recipientes. Esses mesmos cuidados
devero ser tomados quando se estiver efetuando as inoculaes nas placas ou nos tubos de
ensaio. Caso tal situao ocorra, despreze a pipeta e reinicie o procedimento corretamente.
Aderncia do lquido s paredes da pipeta

100

No inserir a ponta da pipeta mais do que 2,5 cm abaixo da superfcie do lquido

dentro dos tubos ou dos recipientes contendo as diluies das amostras, diminuindo
assim, a superfcie de contato da pipeta com a amostra diluda.
Dispensar lentamente o inculo, permitindo a drenagem total at a marca final da
pipeta por um perodo de 4 a 6 segundos, nos casos em que o mesmo corresponda ao
volume total da pipeta. Preferentemente, usar pipetas que no sejam de esgotamento
total.
Quando da dispensa de parte do contedo de uma pipeta, deixar que o lquido escorra
lentamente. O procedimento de expulso rpida do lquido contido na pipeta acarreta
a reteno de um maior volume de lquido aderido s paredes.
Tipo e capacidade das pipetas
Sempre utilizar pipetas com marcao ntida de volume e, preferencialmente, que

permitam a pipetagem do volume desejado sem que seja necessria a expulso da
ltima poro da pipeta. Quando esse tipo de pipeta no estiver disponvel no
laboratrio, para a pipetagem de 1 ml, recomendvel a utilizao de pipetas com
capacidade de 2 ml, com graduao de 1/10 ou 1/100, aspirando o inculo at o
volume total da mesma e dispensando a primeira poro (1 ml) no interior da placa ou
do tubo.
As pipetas utilizadas no devero ter capacidade superior a 10 vezes o volume a ser
medido, para assegurar que o inculo dispensado seja o requerido. Por exemplo, se o
inculo for de 0,1 ml, utilizar uma pipeta de 1 ml com graduao de no mnimo 1/10,
aspirando o inculo at o volume total da mesma e dispensando a primeira diviso no
interior da placa ou do tubo.
Preciso dos volumes dos inculos

Manter a pipeta sempre na posio vertical e inclinar o tubo at posio que forme um ngulo
de 45 em relao pipeta, facilitando, desta forma, a leitura na pipeta do "menisco" do
volume a ser dispensado.
Uso de pipetas
Sempre utilizar uma pipeta para cada diluio.

No tocar com a pipeta de uma determinada diluio no diluente da diluio seguinte.
NUNCA enxaguar a pipeta com o diluente da diluio subsequente.
A mesma pipeta poder ser utilizada para a semeadura de diluies de amostras,
desde que se parta da maior diluio (amostra mais diluda) para a menor diluio
(amostra menos diluda).
101

SOLUES
Solues so misturas homogneas unifsicas constitudas de duas ou mais substncias
miscveis. So formados por dois compostos, o soluto e o solvente. O soluto a substncia
que est dissolvida no solvente e, consequentemente, o solvente a substncia que dissolve o
soluto. Nas solues, os dois componentes no se encontram quimicamente combinados.
Solues saturadas:
So solues que contm a quantidade mxima possvel de um soluto, em uma determinada
temperatura e presso, perfeitamente dissolvido no solvente. Por exemplo, em solues de
Cloreto de sdio, a saturao ocorre quando h aproximadamente 360 g do sal por litro de
gua.
Concentrao de solues
Concentrao o quociente entre a quantidade do soluto e a do solvente ou da prpria
soluo. Para determinar esse quociente alguns autores referem-se ao ttulo de uma
soluo. A concentrao de uma soluo pode ser expressa de 3 maneiras:
a) Massa por unidade de massa (m/m);
b) Massa por unidade de volume (m/v);
c) Volume por unidade de volume (v/v).
A forma mais precisa de se estabelecer a concentrao o de massa por unidade de massa
(m/m), porm, nos laboratrios de microbiologia, onde se trabalha rotineiramente com
produtos slidos que necessitam ser diludos durante a anlise, o sistema mais
frequentemente usado o de massa por volume (m/v).
Para amostras lquidas, o sistema usado o de volume por volume (v/v), que o menos
preciso dos trs, fato que se deve s variaes de volume em funo das temperaturas do
soluto e do solvente (amostra e diluente).
Relao de massa com massa

C = m /M
Onde:
C = Concentrao
m = Massa do soluto
M = Massa do solvente
Neste caso a concentrao toma dois nomes particulares:
102

Molaridade: a relao entre o nmero de moles do soluto e 1000g do solvente. A

concentrao expressa em molaridade utilizada em ebuliometria e criometria.
Porcentagem de peso: a relao entre a massa do soluto e 100g da soluo.
Exemplo:
Preparar uma soluo de sulfato de sdio a 10% em peso significa que em 100g da soluo
existem 10 g do sulfato de sdio e 90 g de gua.
Relao de volume com volume

C = V /V1
Onde:
C = concentrao
V = Volume do soluto
V1 = Volume da soluo
Neste caso, a concentrao toma o nome de Porcentagem em volume, desde que o volume da
soluo seja tomado como 100 ml. aplicada para as solues lquido/lquido e gs/gs. Assim
o lcool a 90% em volume significa que em 100 ml da soluo existem 90 ml de lcool.
Relao de massa com volume

C=M/V
Onde:
C = concentrao
m = massa do soluto
V = volume da soluo
Neste caso, a concentrao toma diversos nomes conforme a massa do soluto. Pode ser
expressa em unidades qumicas de massa (o mol e o n de equivalentes) ou em unidades
fsicas de massa (o grama); e o volume da soluo pode ser expresso em litro ou, no caso
particular da porcentagem, em 100 ml.
Desta forma, podemos fazer o seguinte resumo:
a) Unidades Qumicas:
A. Mol/litro = Molaridade (M)
B. Equivalente-grama/litro = Normalidade( N)
b) Unidades fsicas:
103

A. Gramas/litro = ttulo (T)

B. Gramas/100 ml = Percentagem (%)
Partes
Estabelece uma relao em que a mesma unidade de medida, ou mltiplos da unidade,
usada ao longo de todas as pores relacionadas do processo. Partes no se limitam a uma
nica unidade de medida. Concentraes de partes por milho ou ppm so
frequentemente usadas para aditivos de meios de cultura e solues de antibiticos.
Exemplo:
Uma parte por milho (1 ppm) de cloridrato de tetraciclina possui uma parte do princpio ativo
dissolvido em 1 milho de partes da soluo. Medidas que correspondem a 1 ppm so:
Grama por tonelada (g/ton.);

Miligrama por quilo (mg/kg);
Micrograma por grama (/g);
Mililitro por litro (ml/L);
Microlitro por mililitro (L/ml).
Hidratos
Os sais utilizados no laboratrio de microbiologia podem se apresentar na forma anidra ou na
forma de um ou mais hidratos, em que uma ou mais molculas de gua esto ligadas
molcula do sal.
Quando se necessita preparar uma soluo cuja composio indique o uso de um sal na forma
anidra, e somente est disponvel no laboratrio um hidrato, deve-se determinar quanto do
hidrato corresponde quantidade da forma anidra estabelecida na formulao. Para esse
clculo necessrio considerar os pesos moleculares e, por regra de trs, estabelecer o peso
correspondente.
Exemplo: Preparar uma soluo 10% de CuSO4. Somente est disponvel no laboratrio
CuSO4.H2O.
Sol. 10% = 10 g/100 ml
Peso molecular do CuSO4 = 160
Peso molecular do CuSO4.H2O = 178
10 g (CuSO4) = 160
104

X g (CuSO4.H2O) = 178
X = {(10 x 178) / 160} = 11,125 g
Ento, para preparar a soluo 10% de CuSO4 usando a forma monohidratada, seria necessrio
dissolver 11,125 g de CuSO4.H2O em quantidade de gua suficiente para completar 100 ml. O
mesmo raciocnio utilizado para os casos em que a formulao indica o uso da forma hidrato
e somente est disponvel a forma anidra.
Potncia de antibiticos
A potncia de um antibitico se refere quantidade de princpio ativo, biologicamente ativo,
contido no produto. Poder estar expressa em Unidades (U), em porcentagem (%) ou em
miligramas de princpio ativo por grama de produto (mg/g).
Exemplos:
Sulfato de Polimixina B 7600 U/mg;

Tetraciclina 80%;
Sulfato de estreptomicina 780 mg/g.
As solues de antibiticos, usadas como padres referenciais nas provas de determinao de

resduos de antibiticos em alimentos e como aditivos de alguns meios de cultura, podem
estar expressas em U/ml, ppm ou ainda em microgramas por ml. Para preparar uma soluo
de antibitico proceder conforme abaixo:
a) Sempre verificar a potncia no frasco do produto que est se usando.
b) Quando, no frasco, a informao disponvel for apenas do total de U no frasco,
verificar o peso total contido no mesmo e determinar quantas U existem por mg do
produto.
c) Quando a potncia estiver expressa em U/mg, preparar a soluo em U/ml ou calcular
a converso para obter solues em ppm ou g/ml.
d) Se a potncia se apresenta na forma de porcentagem, converter para mg (um
antibitico com potncia de 80% possui 0,8 mg de princpio ativo por mg do produto).
e) Pesar uma quantidade mnima de 10 mg do antibitico em balana analtica (quanto
menor a quantidade pesada, maior ser o erro possvel de ocorrer).
f) Multiplicar o peso obtido pela potncia e dividir pela concentrao final desejada para
obter o volume de diluente a ser adicionado.
Volume de diluente a adicionar = Peso x Potncia
Concentrao final desejada
105

Para obter a soluo 4000U/ml, baste dissolver as 23,7mg de sulfato de poliximina em

45,03mlde tampo.
Exemplo 1: Preparar uma soluo 4000 U/ml de sulfato de polimixina B em tampo fosfato pH
8. Potncia do produto usado: 7600 U/mg Peso 23,7 mg (quantidade pesada)
Volume = {(23,7 x 7600)/4000} = 45,03 ml
Para obter a soluo 4000U/ml, basta dissolver as 23,7 mg de sulfato de polimixina em45, 3 ml
de tampo. Cada ml desta soluo oferecer uma soluo de sulfato de polimixina de4000U.
OBS: Para que no seja necessrio adicionar volumes fracionados de diluente, conforme o
exemplo acima se pode estabelecer, de forma inversa, qual a quantidade de antibitico a ser
pesado para um volume de diluente pr-determinado, procedendo conforme indicado abaixo.
Exemplo 2 : No meio SFP h a indicao da adio de 3 mg/L de sulfato de polimixina e de 12
mg/Lde canamicina.
Quando as quantidades do aditivo so to pequenas quanto estas, preparar soluo-me.
Adicionar ao meio final, volumes das solues-me que ofeream uma concentrao fina, por
litro de meio, correspondente ao indicado pelo fabricante. No caso deste exemplo (meio SFP)
preparar:
a) soluo de sulfato de polimicina a 3mg/L. (potencia 7600 U/mg)
Pesar 300mg de sulfato de polimicina e diluir para 100ml, com gua destilada. Esta soluo
ter concentrao de 3mg de polimicina B com potncia de 7600U/mg por ml. Neste exemplo
seria usado 1 ml desta soluo por litro d meio.
b) Kanamicina 12mg/ml. Potncia 80%
1mg do produto contm 0,8 mg de princpio ativo.
Pesar mais de 100mg do antibitico (por exemplo 158mg)
Multiplicar o peso obtido pela potncia e dividir pela concentrao final desejada para obter o
volume de diluente a ser adicionado.
X = {(158 x 0.8)/12} = 10,58ml
OBS: Para que no seja necessrio adicionar volumes fracionados de diluentes, conforme o
exemplo acima se pode estabelecer de forma inversa qual a quantidade de antibitico a ser
pesado para um volume de diluente pr-determinado, procedendo conforme indicado abaixo.
106

Cada ml desta soluo conter 12mg de kanamicina

Determinao do peso do peso de antibitico para preparao de solues, priorizando o
volume.
Nos exemplos 1 e 2 acima os volumes de diluentes a serem adicionados resultaram em
nmeros quebrados, o que certamente leva a erros na concentrao final do antibitico. Para
evitar volumes fracionados, fazer o clculo inverso, pr estabelecendo o volume de diluente:
Peso = Vol. De diluente a adicionar x Conc. Final desejada / Potncia.
Supondo que se dispes de um balo volumtrico de 25ml para a preparao da soluo do
exemplo 2, acima, proceder conforme segue:
Peso = {(25x12)/0,8} = 375mg
A quantidade de antibitico a ser pesada neste caso seria de 375mg, que sero diludas em
25ml de diluente para a obteno de uma soluo com 12mg/ml.
Concentrao por Centrifugao

Em microbiologia, o processo de centrifugao frequentemente usado para a concentrao
de clulas ou esporos em processos de lavagem ou purificao. O processo de centrifugao
promove a sedimentao de partculas mais densas por meio da aplicao de fora centrfuga
obtida pela rotao em alta velocidade. As unidades usadas para indicar centrifugao so
Rotaes por minuto (RPM) e fora gravitacional (g). Para calcular g se utiliza a seguinte
frmula:
g = 0,0000118 x raio do rotor (cm) x (rpm)2
107

PROCEDIMENTOS BSICOS DE CONTAGEM

TCNICAS DE CONTAGEM EM PLACAS
As tcnicas de contagem em placas permitem a visualizao da formao de colnias a partir
de um nmero "fixo" de clulas viveis.
So utilizadas, portanto, para se obter a contagem de unidades formadoras de colnias(UFC)
presentes na amostra sob anlise.
Os meios de cultura usados para a obteno do nmero de colnias em uma amostra podem
ser de uso geral (meios com ingredientes nutritivos bsicos), enriquecidos (meios com
nutrientes adicionais, como sangue, gema de ovo e soro), acrescidos ou no de sistemas
inibidores e/ou indicadores.
A aplicao das tcnicas de contagem tem por base o uso de diluies seriadas, obtidas a partir
da homogeneizao de amostras slidas e semisslidas ou a partir de inoculaes diretas de
amostras lquidas e de suas diluies. As tcnicas bsicas de contagem em placas incluem:
Semeadura em profundidade
Distribuir as alquotas das diluies escolhidas em placas de Petri estreis. Acrescentar 12 a 15
ml do gar a 46-48C. Homogeneizar imediata e adequadamente. Deixar solidificar e incubar
as placas (invertidas ou no), de acordo com as exigncias de tempo, temperatura, tenso de
oxignio etc., requeridas pelo microrganismo a ser enumerado.
Semeadura em superfcie
Usar placas em que, previamente, tenha sido distribudo o meio especfico para o
microrganismo a ser enumerado. Promover a secagem da superfcie deixando as placas
invertidas, semiabertas com a base apoiada na tampa, por aproximadamente 15 minutos em
estufa a 45-50C.
Inocular 0,1 ml, ou no mximo 0,5 ml, das diluies selecionadas, lembrando que 0,1 ml de
uma diluio oferece resultado correspondente diluio seguinte, isto , 0,1 ml de 101oferece resultado para a diluio 10-2. Observar que o inculo deve ser depositado no centro
da superfcie do gar, evitando tocar a ponta da pipeta no meio, mantendo-a, entretanto, o
mais prximo possvel.
Espalhar o inculo, com auxlio de ala de Drigalsky ou basto de vidro tipo "hockey", estreis,
por toda a superfcie do gar, at absoro completa. Inverter as placas aps a absoro
completa do inculo e incubar como requerido, o mais rpido possvel.
108

Semeadura por Sobrecamada

Proceder como para semeadura em profundidade. Aps homogeneizao do meio de cultura
com o inculo e solidificao do gar, acrescentar uma nova camada de 10 a 12 ml do gar
correspondente, fundido e mantido a 46-48C. Deixar solidificar sem misturar e incubar
conforme requerido.
A tcnica por sobrecamada poder ser feita a partir de uma semeadura em superfcie,
acrescentando-se uma sobrecamada de 10 a 12 ml de gar fundido aps a semeadura,
distribuio e absoro total do inculo pelo gar. Deixar solidificar sem misturar e incubar o
mais rpido possvel.
Quando se pretende a recuperao de clulas em "stress", o tempo decorrido entre a
inoculao da primeira camada e a adio da sobrecamada pode ser dilatado, deixando as
placas invertidas em temperatura ambiente, conforme indicao da metodologia especfica.
TCNICA DE NMERO MAIS PROVVEL

A tcnica de Nmero Mais Provvel (NMP) um mtodo que permite estimar a densidade de
microrganismos viveis presentes em uma amostra sob anlise. Esta tcnica no permite a
contagem "fixa" de clulas viveis ou de unidades formadoras de colnias (UFC), como
acontece com a tcnica de contagem em placas. A anlise por NMP recomendada quando:
a) esperado, no alimento em anlise, um baixo nmero do microrganismo alvo (<100/g
ou ml) ou quando, em funo de limitaes do mtodo e das diluies necessrias
para o alimento especfico, o padro de aceitao/rejeio no pode ser atendido por
meio de provas de contagem.
b) Quando, devido ao processo tecnolgico sofrido pelo alimento, as clulas presentes
estejam lesadas fisiologicamente (clulas estressadas), no tendo portanto condies
de formar colnias em meios slidos seletivos.
A tcnica de NMP deve ser realizada incluindo as seguintes etapas analticas:
a) Teste presuntivo (leitura dos resultados obtidos na srie de tubos mltiplos).
b) Teste confirmatrio (subcultivo dos tubos positivos do teste presuntivo em caldo de
maior impedincia ou em gar seletivo diferencial para o microrganismo pesquisado).
c) Teste completo (identificao bioqumica da(s) espcie(s)`microbiana(s) presente(s)).
Esta tcnica tem por base a probabilidade estatstica relacionada com a frequncia da
ocorrncia de resultados positivos mais provveis em funo do nmero real de
microrganismos presentes. necessrio que a amostra seja preparada de modo que as
bactrias no se encontrem agrupadas, que estejam aleatoriamente distribudas na amostra; e
que os meios e condies de incubao permitam a recuperao e deteco de ao menos uma
clula vivel do organismo alvo.
109

Para a determinao do NMP, a amostra dever ser diluda tantas vezes quantas necessrias
para que a ltima diluio de 3, 5 ou 10 tubos apresente todos os resultados negativos.
Quanto maior o nmero esperado do microrganismo pesquisado, maiores devero ser as
diluies usadas.
Quando no se pode estimar qual a diluio do alimento que oferecer essa situao, so
inoculadas mais de 3 sries com diluies decimais (por exemplo 100 at 10 -4, ou mais
diluies). Entretanto, na leitura final do NMP devero ser consideradas somente as 3 diluies
mais significativas.
Como na rotina de laboratrios analticos esse procedimento aumenta em muito o volume de
trabalho e de material a ser usado, normalmente so utilizadas apenas trs diluies,
considerando a estimativa do nmero esperado do microrganismo em estudo.
Ento, o nmero de clulas viveis presentes obtido por meio de 3 diluies decimais
sucessivas e transferncia de alquotas determinadas (tambm decimais, como 10 e 1ml) de
cada diluio em sries de tubos. O nmero de tubos por srie varivel, podendo ser de 2 a
10. Mais comumente so usadas sries de 3 ou 5 tubos por diluio. Quando houver
necessidade de inocular grande volume (10 ml) da amostra diluda ou no, na primeira srie de
tubos, estes devero conter meio em concentrao dupla.
O arranjo de nmero de tubos positivos das 3 diluies (ou as mais significativas) transposto
para tabelas estatsticas que informam o NMP para as diferentes combinaes de tubos
positivos e que tambm incluem os limites de confiana dos nmeros mais provveis dos
microrganismos pesquisados em funo da tabela em questo.
Os intervalos de confiana 95% constantes das tabelas de NMP oferecem a informao deque,
em pelo menos 95% das vezes, h a chance da concentrao real do microrganismo alvo estar
includo no intervalo de confiana calculado para cada arranjo de tubos positivos.
Por exemplo, o arranjo de tubos positivos 3-1-0 oferece como NMP o valor 43/g. Nesse caso, o
intervalo de confiana 95% corresponde aos valores compreendidos entre 9 e 180. Isto
significa que a chance do nmero real presente na amostra estar includo no intervalo de
valores entre 9 e 180 UFC/g de 95%.
A expresso do NMP feita somente por meio do nmero mais provvel que corresponda ao
arranjo de tubos positivos por srie. Em geral, as tabelas j esto corrigidas considerando g ou
ml (e consequentemente, as diluies), para a obteno do NMP. Os exemplos a seguir
permitem a seleo das diluies mais significativas, dentre as possibilidades descritas.
TABELA 1
110

Diluio (g ou ml)
Casos
1
2
3
4
5
6
Combinao de tubos
1,0
0,1
0,01
0,001
3/3
3/3
3/3
2/3
3/3
3/3
3/3
3/3
2/3
2/3
3/3
2/3
1/3
2/3
1/3
2/3
0,0001
1/3
1/3
1/3
3-3-1
3-2-1
3-2-0
2-2-0
3-2-2
3-2-1
Numerador = nmero de tubos positivos

Denominador = nmero de tubos inoculados
* 3 diluies consideradas significativas para a obteno do NMP
Interpretao dos resultados de NMP

Para a escolha da tabela na qual se verificar o NMP correspondente combinao de tubos
positivos, atentar para a quantidade (g ou ml) de amostra que foi realmente inoculada em
cada tubo das diferentes sries e no para o volume inoculado.
Exemplo 1:
Inoculao de
10 ml da amostra na 1 srie
1,0 ml da amostra na 2 srie
1,0 ml da diluio 10-1 na 3 srie
Quantidade de amostra inoculada em cada srie

10ml
1,0ml
0,1ml
A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para 10, 1,0 e 0,1g ou
ml. Para a gua, cujo resultado final dever ser expresso em NMP por 100 ml, o nmero
constante da tabela dever ser multiplicado por 10. Nesta apostila, para maior praticidade, a
tabela para leitura de resultados de NMP em gua j contm os nmeros corrigidos
(multiplicado por 10).
Exemplo 2:
Inoculao de
10 ml da diluio 10-1 na 1 srie

1,0 g ou ml
0,1 g ou ml
0,01 g ou ml
ml. Devido ao fato de que a quantidade de amostra inoculada neste caso igual quantidade
para a qual a tabela se refere, o resultado do NMP ser obtido diretamente da tabela.
Exemplo 3:
111

Inoculao de
1,0 ml da amostra na 1 srie

1,0 g ou ml
0,1 g ou ml
0,01 g ou ml
ml. Devido ao fato de que a quantidade de amostra inoculada neste caso igual quantidade
para a qual a tabela se refere, o resultado do NMP obtido ser o mesmo na tabela.
Exemplo 4:
Inoculao de

0,1 g ou ml
0,01 g ou ml
0,001 g ou ml
A tabela a ser consultada dever ser a que oferece resultados de NMP para inculos de 0,1,
0,01 e 0,001 g ou ml. Poder tambm ser usada a tabela de NMP para inculos de 1, 0,1 e0,01
ml desde que o resultado da tabela seja multiplicado por 10, j que a quantidade de amostra
inoculada neste caso foi 10 vezes menor que a quantidade para a qual a tabela se refere.
Casos especficos
a) Inoculao de mais de 3 diluies seriadas
Quando da inoculao de mais de 3 diluies seriadas, selecionar a maior diluio na qual
todos os tubos inoculados so positivos e considerar as 2 diluies maiores seguintes que a
selecionada (casos 2 e 3 da tabela 1 acima e exemplos abaixo).
Exemplo 1: Amostra de alimento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo e apresentou
os seguintes resultados:
100 3 tubos positivos

10-1 3 tubos positivos
O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para o arranjo de tubos positivos 3/2/0,que
corresponde ao valor 9,3 NMP/g ou ml. Como neste caso a amostra estava diluda a 10-2, o
resultado obtido na tabela deve ser multiplicado por 100 para a obteno do valor do NMP
real por grama ou ml do alimento em anlise. Assim, o resultado final seria 930 NMP/g ou ml.
112

Exemplo 2: Amostra de alimento lquido da qual foram inoculadas apenas as diluies 100, 10 1
, 10-2 e 10-3, e os resultados obtidos foram os seguintes:

corresponde ao valor 110 NMP/g ou ml. Como neste caso a amostra estava diluda a 10-1, o
resultado deve ser multiplicado por 10 para se obter o valor do NMP por grama ou ml do
alimento em anlise. Assim, o resultado final seria 1100 NMP/g ou ml.
Exemplo 3: Na anlise do mesmo alimento acima, caso as diluies inoculadas fossem as
seguintes:

corresponde ao valor 0,92 NMP/g ou ml. Como neste caso a amostra estava diludo a 10-3, o
resultado deve ser multiplicado por 1000 para se obter o valor do NMP/g ou ml do alimento
em anlise. Assim, o resultado final seria 920 NMP/g ou ml.
Exemplo 4: No mesmo exemplo acima, se as diluies inoculadas fossem 100, 10-1 e 10-2,
considerando os mesmos resultados:

O valor de NMP a ser lido na tabela seria aquele para a combinao de tubos positivos3/3/3,
que corresponde ao valor >110 NMP/g ou ml. Como neste caso a amostra no estava diluda
(100), o resultado final a ser emitido obtido diretamente da tabela.
As diferenas de resultados observadas nos diferentes exemplos de trabalho com a mesma
amostra e diluies diferentes demonstram a importncia de se fazer diluies da amostra
considerando o nmero estimado do microrganismo teste, pois a mesma amostra analisada
conforme os exemplos 4 (sem suficiente diluio) e 1 (com diluies adequadas)apresentam
resultados bem diferentes (> 110 NMP/g ou ml e 930 NMP/g ou ml).
113

O resultado >110 NMP/g ou ml vago e pode no ser adequado para a tomada de deciso a
respeito do destino do lote a que se refere o alimento analisado, especialmente quando h
uma tolerncia em nmeros maiores que este.
Exemplo 5: Nos casos de inoculao em que se utilizam 5 diluies em sries de 3 tubos e que
apresente os resultados abaixo:

10-2 1 tubo positivo
Considerar o arranjo 3-1-0, j que o resultado mais prximo do real obtido quando a primeira
srie considerada contm os 3 tubos positivos e a ltima srie os 3 tubos negativos.
b) Inoculao de mais de 3 diluies seriadas em que ocorreram tubos positivos em mais
de duas diluies subsequentes escolhida.
Neste caso, repassar um tubo positivo da maior diluio positiva para a imediatamente
anterior, sucessivamente, at obter arranjo de tubos que se enquadre na situao anterior
(casos5 e 6 da tabela 1).
Exemplo 6: Amostra de alimento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo, apresentando

O resultado final, neste caso, ser o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-2-2
tubos positivos. Este arranjo obtido pela transposio do tubo positivo da diluio 10-4 para a
diluio anterior.
Exemplo 7: Amostra de alimento lquido que foi inoculada nas diluies abaixo, apresentando

114

O resultado final, neste caso, ser o valor da tabela NMP correspondente ao arranjo 3-2-1 de
tubos positivos. Esse arranjo de tubos positivos obtido pela transposio do tubo positivo da
diluio 10-3 para a diluio 10-2.
c) Nos casos de inoculao em que se utilizam 5 diluies em sries de 3 tubos, cujos
resultados indicam duas possibilidades de todos os tubos da primeira srie serem
positivos e todos os da ltima srie serem negativos, considerar o maior valor de NMP
apresentado pela tabela correspondente.

3-3-0 - 24 NMP/g ou ml (100, 10-1 e 10-2).

3-0-0 - 23 NMP/g ou ml (10-1, 10-2 e 10-3)
O resultado final, neste caso, ser o valor NMP correspondente ao arranjo 3-3-0 (24 NMP/g ou
ml).
d) Inoculao de somente 3 diluies seriadas Nos casos de inoculao de somente 3
diluies seriadas, fazer a leitura diretamente na tabela (casos 1 e 4 e exemplo 4).
e) Arranjos inexistentes nas tabelas
Repetir a anlise sempre que os resultados dos controles aplicados no processo analtico
apontarem para esta necessidade, e/ou os arranjos de tubos positivos, na srie de tubos
mltiplos, revelarem comportamento incoerente como 0-1-3 ou outros arranjos inexistentes
nas tabelas de NMP.
f)
Atendendo a legislao
Utilizar a inoculao de 3 sries de 10, 5 ou 3 tubos quando a legislao estabelecer padro

para NMP menor que 1,0, 2,0 ou 3,0, respectivamente.
115

Tabelas de NMP
Tabela 1. Nmero Mais Provvel por grama ou ml, para sries de 3 tubos com inculos de
0,1, 0,01 e 0,001 g ou ml e respectivos intervalos de confiana 95%.
Fonte: Adaptado Bacteriological Analytical Manual Online, 2001.
116

OBS: Para obter o NMP/g ou ml, para sries de 3 tubos, com inculos de 1,0, 0,1 e 0,01 g ou
ml, e respectivos intervalos de confiana 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 1
correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na anlise.
117

Tabela 2. Nmero Mais Provvel por 100 ml, para sries de 3 tubos com inculos de 10 ml,
1,0 ml e 0,1 ml, e respectivos intervalos de confiana 95%.
118

Tabela 3. NMP por grama ou ml para sries de 10 tubos com inculos de 10 ml, 1,0 ml e
0,1ml e respectivos intervalos de confiana 95%.
119

120

121

122

123

124

125

126

PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE COLNIAS

INTRODUO
A aplicao de procedimentos de controle durante o processo analtico visa garantia da
confiabilidade do resultado final, assegurando a sua repetibilidade, preciso e exatido.
A preciso e a exatido do mtodo tambm dependero da correta observao e aplicao dos
procedimentos padronizados estabelecidos para a rea analtica.
A garantia da validade dos resultados da contagem estar assegurada quando os resultados
dos controles indicarem no haver qualquer falha em nenhuma etapa do processo analtico.
RECOMENDAES GERAIS
1. Sempre utilizar mais de uma placa, seja uma duplicata da mesma diluio, seja duas ou
mais diluies diferentes.
2. As contagens devero ser realizadas imediatamente aps o perodo de incubao das
placas.
3. Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente aps o perodo de
incubao, manter as placas sob-refrigerao em temperatura de 4C a 7C por um
perodo no superior a 24 horas. Esse procedimento no deve tornar-se uma prtica
rotineira.
4. Para a contagem, selecionar placas que contenham um nmero de colnias que se
encontre dentro do intervalo de preciso e repetibilidade estabelecido pelo mtodo
em uso (por exemplo, 20 a 200 colnias, 25 a 250 colnias, etc.).
5. As colnias devero ser contadas com o auxlio de contador de colnias equipado com
placa de vidro ou acrlico, com dimetro compatvel com o das placas utilizadas,
dividido milimetricamente em quadrantes com 1 cm 2 de rea e com iluminao
artificial uniforme.
6. O contador de colnias dever ter capacidade para aumento de 1 a 2 vezes, com
dispositivo de regulagem de altura para melhor ajuste do foco, podendo ainda dispor
de sistema eletrnico ou manual de registro das contagens.
7. O contador de colnias dever estar localizado em local onde no haja incidncia
direta de luz sobre a plataforma de apoio da placa, para evitar possveis enganos na
identificao das colnias.
8. Utilizar o estereoscpio para observao de caractersticas morfolgicas das colnias,
para diferenciar microrganismos de partculas da amostra ou do meio e para seleo e
isolamento de colnias.
9. Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluies sucessivas.
REGRAS GERAIS PARA CLCULO E REGISTROS
Expresso de resultados de contagem

127

No clculo das contagens, o resultado final ser expresso em UFC/g ou ml, levando-se em
conta a diluio empregada, da seguinte maneira:
R = a x 10b UFC/g ou ml
R = resultado
a = os dois primeiros algarismos significativos, nmeros de 0 a 9
b = expoente (0 a 10)
UFC = unidade formadora de colnias
g = grama e ml= mililitro
Exemplos: Diluio 10 -2 (1:100) Mdia das contagens: 25 UFC
Resultado: 25 x 100 = 2.500 = 2,5 x 103 UFC/g ou ml
Diluio 10 -3 (1:1.000) Mdia das contagens: 38 UFC
Resultado: 38 x 1.000 = 38.000 = 3,8 x 104 UFC/g ou ml
O resultado final ser expresso considerando-se os dois primeiros algarismos representativos,
separados por vrgula. Os algarismos subsequentes, quando existirem, devero ser
arredondados e transformados em potncia de 10.
Arredondamento de resultados
Quando se fizer necessrio, e visando no criar uma falsa ideia de preciso, aplicar a seguinte
regra para a aproximao dos resultados:
1. Arredondar para cima o segundo algarismo ou o subsequente quando o algarismo
imediatamente aps for superior a 5.
Exemplo: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 186 UFC
Arredondando o 3 algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104
UFC/g ou ml
2. Arredondar para baixo o segundo algarismo ou o subsequente quando o algarismo
imediatamente aps for inferior a 5.
Exemplo: Diluio 102 Mdia das contagens: 184 UFC
Arredondando o 3 algarismo para baixo tem-se como resultado: 180 x 100 = 18.000 = 1,8 x
104 UFC/g ou ml
128

3. Nos casos em que o 3 algarismo ou o subsequente for igual a cinco, arredondar para
baixo quando o segundo ou o subsequente for menor ou igual a 5 e para cima quando
for maior que 5.
Exemplos: Diluio 10-2 Mdia das contagens: 185 UFC
Arredondando o 3 algarismo para cima tem-se como resultado: 190 x 100 = 19.000 = 1,9 x 104
UFC/g ou ml
Mdia das contagens: 145 UFC
104 UFC/g ou ml
104 UFC/g ou ml
4. Arredondamento de resultados obtidos pela contagem de placas em duplicata de duas
diluies diferentes. Nas contagens de placas de duas diluies diferentes, o
procedimento de arredondamento semelhante ao da contagem de mesma diluio, isto
, s poder ser efetuado aps o clculo da mdia das contagens, que ser explicado a
seguir nas regras especficas para contagem de colnias.
Resultados estimados
Nas contagens, em que em todas as placas o nmero de colnias encontrado estiver fora do
intervalo de preciso e repetibilidade da metodologia aplicada, incluir no registro do resultado
final a expresso "estimado" ou "por estimativa, por meio da abreviatura est.", aps o g ou ml.
Quando houver condies para efetuar a contagem, expressar o nmero obtido. Pode-se ainda
expressar o resultado como o limite inferior com o sinal de menor ou o superior com o sinal de
maior, por estimativa ou estimado.
Exemplos, com limite entre 15 e 150: Diluio 10 -2Mdia das contagens: 160 UFC
Resultado: 160 x 100 = 16.000 = 1,6 x 104 UFC/g ou ml est. ou >1,5 x 104 UFC/g ou ml est.
Resultado: 11 x 100 = 1.100 = 1,1 x 103 UFC/g ou ml est. ou <1,5 x 103 UFC/g ou ml est.
129

Nas contagens de amostras lquidas inoculadas diretamente, ou seja, diluio 100, quando no
houver crescimento ou a contagem for menor que 10 UFC, o resultado ser expresso por
estimativa e na potncia 100. Caso a contagem seja superior a 10 UFC o resultado ser
expresso de acordo com o nmero obtido, ou seja, potncia de 101 ou 102.
Exemplo 1: Diluio 100: Intervalo de seleo: 15 a 150 N de colnias contadas: 12
Resultado: 12 x 1 = 12 = 1,2 x 101 UFC/ml est. ou <1,5 x 101 UCF/ml est.
Exemplo 2: Diluio 100: Intervalo de seleo: 15 e 150 N de colnias contadas: 232
Resultado: 232 x 1 = 232 = 2,3 x 102 UFC/ml est. Ou 1,5 x 102 UFC/ml est.
REGRAS ESPECFICAS PARA CONTAGEM DE COLNIAS
As contagens se realizam de maneira similar para os casos em que os limites de nmeros de
colnias para as placas selecionadas se encontram em diversos intervalos como 15 a 150, 20 a
200, 30 a 300 ou outro.
1. Situaes nas quais o nmero d e colnias, nas diversas diluies, se

encontra dentro dos limites do intervalo de preciso e de
repetibilidade.
Para os exemplos abaixo, foi considerada a seleo de placas com nmero de colnias contido no
intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias.
a) Mesma diluio - placas em duplicata: Calcular a mdia aritmtica dos resultados
encontrados e multiplicar pela diluio correspondente.
Exemplo: Diluio: 10-3 = 130 colnias Diluio: 10-3 = 224 colnias
(130 + 224) /2 = 177 x 1.000 = 177.000 180.000 UFC Resultado: 1,8 x 105 UFC/g ou ml
b) Diluies Diferentes: Multiplicar o resultado encontrado em cada placa pela respectiva
diluio e calcular a mdia aritmtica.
Exemplo: Diluio: 10-3 = 210 colnias = 210 x 1.000 = 210.000
Dil: 10-4 = 32 colnias = 32 x 10.000 = 320.000
Fazer a mdia das diluies diferentes (210.000 + 320.000) /2 = 265.000 270.000
Resultado: 2,7 x 105 UFC/g ou ml
130

2. Situaes nas quais o nmero de colnias se encontra dentro dos

limites do intervalo de preciso e de repetibi lidade em uma s
diluio.
intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. Quando, nas diversas diluies, o
nmero de colnias em uma diluio encontra-se dentro do limite de 25 a 250 colnias e na
outra diluio encontra-se fora deste limite, o resultado no ser expresso como estimado.
a) Mesma Diluio placas em duplicata
Calcular a mdia aritmtica dos resultados encontrados e multiplicar pela diluio
correspondente.
Exemplo: Diluio: 10-3 = 230 colnias Diluio: 10-3 = 261 colnias
(230+261) /2 = 245,5 x 1.000 = 245.500 240.000 Resultado: 2,4 x 10-5 UFC/g ou ml
b) Diluies diferentes
Exemplo 1: Diluio: 10-3 = 232 colnias = 232 x 1.000 = 232.000
Diluio: 10-4 = 15 colnias = 15 x 10.000 = 150.000
(232.000 + 150.000) /2 = 191.000 Resultado final: 1,9 x 105 UFC/g ou ml
Exemplo 2: Diluio: 10-3 = 270 colnias = 270 x 1.000 = 270.000
Diluio: 10-4 = 29 colnias = 29 x 10.000 = 290.000
(270.000 + 290.000) /2 = 280.000 Resultado final: 2,8 x 105 UFC/g ou ml
3. Situaes nas quais as placas apresentam resultados de contagem

acima do intervalo de preciso e repetibilidade
a) Quando for possvel realizar a contagem em pelo menos uma das placas:
intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. Quando todas as placas apresentarem
mais de 250 colnias na maior diluio, multiplicar o resultado encontrado em cada placa pelas
respectivas diluies e calcular a mdia aritmtica.
Expressar o resultado como estimado.
131

Exemplo: Diluio: 10-4 = 380 colnias = 380 x 10.000 = 3.800.000

Resultado: 3,8 x 106 UFC/g ou ml est.
b) Quando o nmero for excessivamente alto para contar
Nunca expressar o resultado como muito numeroso para contar ou TNTC (too numerous to
count). Escolher pores da placa que sejam representativas da distribuio das colnias em toda
placa e estimar o nmero de colnias presentes.
Se houver menos de 10 colnias por cm2 : Contar as colnias em 12 cm2 selecionando 6 quadrados
consecutivos dispostos horizontalmente e 6 quadrados consecutivos dispostos em ngulo reto
com os quadrados horizontais escolhidos. Somar as contagens obtidas nos 12 quadrados e dividir
o valor obtido por 12, de forma a obter a mdia de colnias por cm2 da placa.
Multiplicar o valor encontrado para cada cm2 pela rea da placa utilizada (placas padro de
plstico de 15 x 100 mm possuem rea aproximada de 56 cm2) e, finalmente, multiplicar pela
diluio usada. Expressar o resultado como estimado.
Exemplo: rea das placas: 56 cm2; Maior diluio inoculada: 10-3.
Quadrado 1: 7 colnias
7+7+6+8+6+8+8+8+8+6+9+7 = 88/12 = 7,3 UFC por cm2

7,3 x 56 x 1.000 = 408.800
Resultado final = 4,1 x 105 UFC/g ou ml estimado
Quando o nmero de colnias por cm2 exceder a 10: Contar as colnias em 4 quadrados
representativos, somar os valores encontrados e dividir por 4 para obter a mdia de colnias por
cm2 da placa. Multiplicar o valor encontrado para cada cm2 pela rea da placa utilizada (placas
padro de plstico de 15 x 100 mm possuem rea aproximada de 56 cm2) e, finalmente,
multiplicar pela diluio usada. Expressar o resultado como estimado.
Exemplo: rea das placas: 56 cm2 Maior diluio inoculada: 10-3
132

35 + 40 + 32 + 37 = 144 / 4 = 36 UFC por cm2

36 x 56 x 1.000 = 2.016.000
Resultado final = 2,0 x 106 UFC/g ou ml est.
Quando o nmero de colnias por cm2 exceder a 100: Multiplicar a rea da placa por 100 e
aps multiplicar pela maior diluio usada. Expressar o resultado como maior que (>) o
nmero obtido.
Exemplo: Placa de rea de 56 cm2. Diluies usadas: 10-2, 10-3 e 10-4.
Observou-se mais de 100 colnias por cm2 nas placas onde foi inoculada a maior diluio.
56 x 100 x 10.000 = 56.000.000
Resultado final = > 5,6 x 107 UFC/g ou ml est.
OBS: Nas situaes descritas acima, nos itens a e b, o resultado tambm pode ser expresso
como maior que 250 vezes a maior diluio utilizada. Expressar o resultado como nmero
estimado.
Exemplo: 10-2 (> 250); 10-3 (> 250) = > 2.500.000; 10-4 (> 250)
Resultado: > 2,5 x 106 UFC/g ou ml est.
4. Placas com colnias invasoras

a) Quando a rea invadida exceder 1/4 da rea total, expressar o resultado como
"presena de colnias invasoras".
b) Quando a rea invadida for inferior a 1/4 da rea total, contar tanto as invasoras
como as normais. Quando as colnias invasoras estiverem aglutinadas, contar
como uma colnia e quando estiverem isoladas, contar uma a uma.
5. Contagem incoerentes
Quando o resultado da contagem da maior diluio for duas ou mais vezes maior que o resultado
obtido na diluio anterior, ou o da menor diluio for duas ou mais vezes maior que o resultado
obtido na diluio posterior, considerar como resultado final o valor da menor diluio.
Exemplo 1: Diluio: 10-2 = 140 colnias (14.000) Diluio: 10-3 = 52 colnias (52.000)
133


Exemplo 2: Diluio: 10-2 = 95 colnias (9.500) Diluio: 10-3 = 2 colnias (2.000)
6. Situaes nas quais todas as placas encontram-se com nmeros de

colnias abaixo dos limites do intervalo de preciso e repetibilidade.
intervalo de preciso e repetibilidade de 25 a 250 colnias. Neste caso, o resultado deve ser
expresso pelo nmero de colnias da placa de menor diluio, por estimativa.
Exemplo: Diluio: 10-2 = 21 UFC Diluio: 10-3 = 2 UFC 21 x 100 = 2.100 Resultado 2,1 x 103 UFC/g
ou ml est.
Situaes nas quais todas as placas no apresentem crescimento de colnias, independente do
intervalo de seleo. Quando em nenhuma placa for observado o crescimento de colnias, emitir
o resultado como estimado: <1,0 vezes a menor diluio utilizada.
Ex.: <1,0 x 101 UFC/g ou ml est.
7. Clculo de contagens quando necessria a confirmao de colnias

Tpicas (T) e Atpicas (A)
Verificar qual das situaes descritas anteriormente dever ser aplicada. Seguir a regra
especfica para cada caso, contando e registrando, separadamente, colnias tpicas (T) e
atpicas (A).
a) Quando todas as colnias repicadas so confirmadas pelos testes confirmativos. O
resultado final da contagem ser igual ao nmero obtido na contagem inicial
multiplicado pela diluio (de acordo com o determinado pela regra de contagem
aplicada).
b) Quando no se confirmam todas as colnias repicadas. Quando o nmero de colnias
confirmadas diferente do nmero de colnias repicadas, calcular o resultado final
utilizando a seguinte frmula:
R =
Cxcxd
R
R = Resultado
C = nmero de colnias contadas
c = nmero de colnias confirmadas
r = nmero de colnias repicadas
134

d = diluio utilizada
Exemplo: Diluio 10-2 = 30 colnias contadas, das quais 20 eram tpicas e 10 atpicas. Para
confirmao, foram repicadas 5 colnias de cada tipo. Quatro colnias tpicas e duas atpicas
apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos. Aplicando-se a frmula, teremos
para colnias tpicas:
RT =
20 x 4 x 100
5
1.600
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:

RA =
10 x 2 x 100
5
400
O resultado final ser igual soma das colnias tpicas e atpicas confirmadas: Resultado final
= RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou ml.
c) Quando for necessrio contar colnias tpicas e atpicas em placas de diferentes
diluies. Nunca somar colnias tpicas ou atpicas de diferentes diluies, pois
colnias atpicas em uma determinada diluio podero se apresentar tpicas em
diluies subsequentes. Submeter aos testes confirmativos, segundo a metodologia
especfica para cada caso, 3 a 5 colnias tpicas e 3 a 5 colnias atpicas da diluio
escolhida. Calcular o nmero de UFC/g ou ml somente aps a confirmao de cada
tipo (T e A) em uma mesma diluio.
Exemplo: Diluio 10-2 = 240 colnias contadas, das quais 50 eram tpicas e 190 atpicas.
Diluio 10-3 = 20 colnias tpicas e 5 atpicas. Como na diluio 10-3 o nmero de colnias se
encontra fora do intervalo de preciso e repetibilidade, a diluio escolhida para confirmao
foi 10-2. Destas, foram repicadas 5 colnias tpicas e 5 colnias atpicas. Todas as colnias
tpicas e 4 atpicas apresentaram resultado positivo nos testes confirmativos.
10-2 RT
50x5x100
5
5000
15.200
Aplicando-se a frmula, teremos para colnias atpicas:

10-2 RA
190x4x100
5
Colnias confirmadas na diluio 10-2 = 20.200 colnias

Resultado final ser a soma do nmero de colnias confirmadas na diluio escolhida:
135

Resultado
final
5.000 + 15.200
136
2,0 x104UFC/g ou ml.

PROCEDIMENTOS PARA O PREPARO, PESAGEM E DESCARTE DE

AMOSTRAS
CONSIDERAES GERAIS
1. A pesagem e o preparo de amostras so pontos crticos de controle do processo analtico.
2. O local deve estar higienizado antes do incio da pesagem, conforme norma especfica do
laboratrio.
3. Deve ser feito um controle do ambiente, conforme norma especfica do laboratrio.
4. O responsvel pelo procedimento deve, antes do incio dos trabalhos, realizar assepsia
das mos e antebraos.
5. Deve ser usado uniforme de uso exclusivo para a rea analtica e Equipamento de
Proteo Individual (EPI), conforme estabelecido em normas especficas do laboratrio.
6. Devem ser aplicados os procedimentos de verificao de balanas, conforme
procedimento especfico do laboratrio.
7. O trabalho deve ser realizado perto da chama do bico de Bunsen, no caso de uso de
bancada, ou em fluxo laminar especfico para tal atividade.
8. A superfcie de trabalho deve estar protegida por pano de campo embebido em soluo
desinfetante no inflamvel, previamente testada.
9. Todo o material deve estar organizado e em condies adequadas de uso antes do incio
dos trabalhos.
10. No deve ser permitida a entrada e a permanncia de pessoas estranhas no local,
principalmente durante a pesagem das amostras.
INSTRUES PARA MANUTENO E DESCARTE DE AMOSTRAS NO LABORATRIO
1. No laboratrio, aps o recebimento, as amostras devem ser estocadas at o momento da
anlise, conforme abaixo:
a) Refrigeradas perecveis: devem ser mantidas sob refrigerao e analisadas o mais
rapidamente possvel. Aguardar no mximo at o dia seguinte.
b) Congeladas: devem ser mantidas no mximo a -18 C e analisadas em um prazo
mximo de 7 dias da colheita.
c) No perecveis: devem ser estocadas em lugar fresco, protegidas da umidade e
da luz, de forma que suas caractersticas originais sejam mantidas, e analisadas o
mais rapidamente possvel.
2. Manter registros completos sobre as amostras recebidas e analisadas, conforme
estabelecido em procedimento especfico do laboratrio.
3. Manuteno das amostras aps a anlise:
a) Aps a retirada das alquotas para anlise, as amostras devem ser embaladas em
sacos plsticos de primeiro uso, perfeitamente identificadas e mantidas
congeladas.
137

b) As amostras estveis em temperatura ambiente devem ser mantidas

identificadas, protegidas por saco plstico de primeiro uso ou adequadamente
fechadas na embalagem original, em temperatura ambiente e em local
apropriado previamente estabelecido.
c) Todas as amostras, exceto gua, leite e outros produtos lquidos, os quais devem
ser descartados logo aps a realizao do procedimento analtico, devem ser
mantidas nas condies acima especificadas por 10 dias. Aps esse prazo, as
amostras devem ser descartadas conforme descrito abaixo.
4. Descarte de amostras analisadas: Todas as amostras que derem entrada no laboratrio
de microbiologia devem ser descartadas conforme procedimento especfico estabelecido
pelo laboratrio.
PREPARO DA AMOSTRA
Quando a metodologia indicar diluentes diferentes, como por exemplo, para provas de:
Contagem de Microrganismos, Pesquisa de Salmonella, Pesquisa de Listeria monocytogenes,
Pesquisa de Vibrio cholerae, etc., fazer tantas pesagens por amostra quantas forem necessrias.
1. Enlatados
No recebimento de amostras de conservas enlatadas, verificar a integridade das embalagens,
observando se esto amassadas, levemente tufadas ou com microfugas aparentes. Quando
forem observadas quaisquer dessas alteraes, proceder conforme estabelecido no Teste de
Esterilidade Comercial para Alimentos de baixa acidez.
a) Pr-incubao de amostras visualmente normais
As amostras de conservas visualmente normais devem ser incubadas a 36 1C por 10 dias a 55
1C por um perodo de 5 a 7 dias, conforme instrues abaixo:
Retirar cuidadosamente a cinta de identificao;

Lavar a lata com gua e detergente, usando esponja;
Secar com flanela limpa e seca;
Identificar a amostra com o nmero de protocolo do laboratrio;
Recolocar a cinta de identificao usando fita adesiva para prend-la na amostra;
Forrar a prateleira das estufas com papel filtro e incubar as amostras de forma que a
recravao fique em contato com o papel filtro.
Verificar, aps o perodo de pr-incubao a 36 1C e 55 1C, se os recipientes no

sofreram tufamento. Verificar se o papel-filtro apresenta manchas que possam evidenciar a
presena de microfugas ou vazamentos. Registrar como sem alterao quando no se
observar qualquer alterao dos recipientes e como alterado quando qualquer alterao for
detectada. Descrever a alterao, quando ocorrer.
138

Ao final da pr-incubao, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver
manchado, evidenciando a presena de microfugas, submeter a respectiva amostra anlise
de aerbios e anaerbios, mesfilos ou termfilos, de acordo com a temperatura da princubao.
b) Preparo das amostras aps a pr-incubao
Fazer desinfeco da embalagem com algodo embebido em soluo desinfetante e

etanol 70% ou etanol 70 GL.
Posicionar a lata com borda no codificada para cima e costura lateral voltada para o lado
oposto ao analista.
Usando um abridor de latas metlico, previamente esterilizado, abrir um pequeno
orifcio.
Abrir a lata e transferir pores do contedo para os meios de cultivo indicados.
2. Produtos UHT
No recebimento das amostras, verificar a integridade e alteraes nas embalagens logo aps o
recebimento. As amostras que apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas.
Fazer constar como amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao
detectada.
a) Pr-incubao das amostras visualmente normais
Aps sofrerem limpeza e desinfeo, as amostras devem ser incubadas sobre folhas de papel
filtro, em estufa a 36 1C, por um perodo de 7dias. As amostras cujas embalagens mostrarem
qualquer alterao aps o perodo de incubao no devem ser analisadas. Emitir o resultado
como amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao observada.
b) Preparo das amostras aps a pr-incubao
Produtos UHT lquidos: Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes.
Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo
embebido em soluo desinfetante e em seguida etanol 70% ou etanol 70 GL. Deixar
secar. Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem
e iniciar a anlise conforme indicado no Captulo 3 Contagem de microrganismos
mesfilos aerbios viveis capazes de causar alterao em produtos lcteos lquidos
UHT.
Produtos UHT pastosos e viscosos: Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da
embalagem usando algodo embebido em soluo desinfetante e em seguida etanol 70%
ou etanol 70 GL. Com auxlio de tesoura, previamente esterilizada, abrir a embalagem,
e, usando esptulas ou colheres estreis, pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra e
transferi-la para sacos de stomacher ou para frascos estreis apropriados.
139

3. Produtos slidos
Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem usando algodo

embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Com auxlio de pinas, tesouras ou bisturis, previamente esterilizados, cortar e pesar,
assepticamente, 25 0,2 g da amostra colhida de vrios pontos (superfcie e
profundidade) em sacos para stomacher.
No caso de anlise de mexilhes, antes de abrir as conchas, escov-las com gua e sabo,
enxaguar bem em gua corrente e aps em gua estril. Sec-las com gaze esterilizada e
abri-las assepticamente com o auxlio de faca ou bisturi. Preparar uma amostra
composta, em recipiente estril, misturando de 10 a 12 exemplares e incluindo o lquido
das conchas. Pesar 50 g dessa amostra composta e homogeneizar com 450 ml do diluente
especfico. Dividir em duas alquotas de 250 ml e transferir para recipientes estreis.
Frango inteiro resfriado - Pesar, assepticamente, alquotas dos seguintes locais para o
preparo da amostra: peito, coxas ou asas, proximidades da cloaca e dorso, at
completar as 25 0,2 g da amostra, em sacos para stomacher.
Frango inteiro congelado - Antes da pesagem, as amostras devem ser descongeladas
em refrigerador por, no mximo, 18 horas. Pesar da mesma forma que o frango inteiro
resfriado
Outros produtos crneos congelados - Antes da pesagem, as amostras devem ser
descongeladas em refrigerador por, no mximo, 18 horas. Pesar, ento,
assepticamente, 25 0,2 g da amostra em sacos para stomacher.
4. Semiconservas
Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem, usando algodo

Com auxlio de pinas, tesouras, abridores metlicos ou bisturis, previamente
esterilizados, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra, colhida de vrios pontos, em
sacos para stomacher.
5. Produtos pastosos e viscosos
Antes da abertura da amostra, proceder assepsia da embalagem, usando algodo

Amostras de produtos pastosos: com auxlio de esptulas ou colheres, previamente
esterilizadas, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra colhida de vrios pontos
(superfcie e profundidade), em frascos erlenmeyer estreis ou em sacos para
stomacher.
Amostra de produtos lquidos densos (ex: iogurte): Agitar o recipiente que contm a
amostra para homogeneizao. Realizar assepsia da embalagem usando algodo
140

Com auxlio de esptulas ou colheres, previamente esterilizadas, pesar assepticamente 25

0,2 g em frasco erlenmeyer estril ou em sacos plsticos para stomacher.
6. gua
Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes, ou ainda aspirar o contedo
deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador, quando no houver espao livre
para a homogeneizao.
Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo
Para pesquisa de Salmonella em gua usada em aquicultura e em gua de chiller,
homogeneizar bem a amostra invertendo o recipiente por 25 vezes, e transferir 100 ml da
amostra para um frasco contendo 50 ml de gua peptonada 1% tamponada em
concentrao tripla.
7. Outros Produtos Lquidos
Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes. Antes da abertura da

embalagem, proceder assepsia da mesma usando algodo embebido em soluo
desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Quando no houver espao livre dentro do recipiente para homogeneizao da amostra,
aspirar o contedo deste por 10 vezes com pipeta, auxiliado por pipetador.
Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e
retirar a alquota analtica.
8. Produtos gordurosos
Antes da abertura da embalagem, proceder assepsia da mesma, usando algodo

embebido em desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Com auxlio de esptula estril, pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra, retirando
alquotas de vrios pontos da superfcie e profundidade, em frasco erlenmeyer
previamente esterilizado, ou em sacos stomacher.
Colocar em banho-maria a 46 1C, por um perodo mximo de 15 minutos.
Somente aps a liquefao da amostra, adicionar o diluente previamente aquecido a 46
1C.
Agitar, de forma a obter uma suspenso homognea.
Para amostras de produtos gordurosos, utilizar o diluente especificado na tcnica,
adicionado de 1% de Tween 80.
9. Produtos em p e granulados
Agitar ou inverter o produto por 25 vezes.

141

Antes da abertura da embalagem que contm a amostra, proceder assepsia da mesma

usando algodo embebido em soluo desinfetante e etanol 70% ou etanol 70 GL.
Pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra e transferir, cuidadosamente, para um
frasco erlenmeyer ou saco para stomacher.
OBS: Quando as embalagens forem sacos de 25 kg ou mais, ou quando as amostras forem
colhidas em vidros onde no exista espao livre para homogeneizao, transferir cerca de
500g do produto para um saco estril, e em seguida agitar ou inverter o saco com a
amostra por 25 vezes.
Com o auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, cortar a embalagem e em
seguida pesar, assepticamente, 25 0,2 g da amostra em sacos para stomacher,
utilizando esptula ou colher estril.
10. Ovos
Ovos com casca: Lavar a casca de 5 a 7 ovos com escova e secar bem. Coloc-los de
molho em soluo de cido peractico 0,02% por 15 minutos. Aps, secar com algodo
embebido em etanol 70% ou etanol 70 GL.
Quebrar a casca assepticamente, transferindo a gema para recipiente estril.
Descartar as claras. Misturar as gemas com auxlio de basto de vidro estril. Pesar 25
0,2 g da mistura de gemas em sacos para stomacher.
No caso de ovos de codorna, pesar 25 0,2 g de gema com a clara.
Ovo lquido integral e ovo em p: Pesar assepticamente 25 0,2 g da amostra em
frasco erlenmeyer ou saco para stomacher.
142

PROCEDIMENTOS DE MICROSCOPIA
COMPONENTES BSICOS DO MICROSCPIO
1. Estativa: o corpo do microscpio que d suporte aos outros componentes.
2. Revlver porta objetivas: suporte rotativo de objetivas, acoplado no brao da estativa.
3. Objetivas: Tubos de lentes que formam a primeira imagem ampliada do objeto.
Fornecida geralmente nos aumentos 10x (vezes), 20x, 40x e 100x. As objetivas
modernas de 40x vm com a lente frontal mvel para evitar danos lmina e lente
frontal. A objetiva de 40x moderna possui diafragma-ris acionada por anis para
correo da espessura da lamnula.
4. Tubo de observao: Suporte de oculares. Existem trs tipos: monoculares,
binoculares e trinoculares. Neste ltimo caso, o terceiro tubo serve para fixao da
mquina fotogrfica.
Ajuste de dioptria : Dioptria a diferena de capacidade visual
de cada olho. Nos tubos destinados s oculares, existem
controles giratrios que permitem o ajuste da dioptria.
Ajuste da distncia interpupilar: Os tubos das oculares so
mveis, para permitir o ajuste da distncia interpupilar, que
varia individualmente.
5. Oculares: Tubos com lentes por onde se realizam as observaes microscpicas.
Fornecidos com aumentos de 10x e 16x. Para maior comodidade dos usurios de
culos, existem as oculares de campo amplo que permitem a observao com os
culos. Estas lentes aumentam a imagem virtual formada pelas objetivas. Se a
objetiva for de 100x e a ocular de 10x, o resultado ser um aumento de 1.000x (10 x
100).
6. Platina: Mesa onde so colocadas as preparaes para observaes microscpicas.
Nelas, se encontram acopladas o Charriot, com comandos coaxiais que permitem a
movimentao nas coordenadas X e Y.
7. Charriot: O Charriot serve para fixar a lmina microscpica e moviment-la em todas
as direes.
8. Condensador: um conjunto de lentes colocado logo abaixo da platina do microscpio
que concentra e fornece luz necessria iluminao do objeto em estudo. O
diafragma-ris do condensador (diafragma de abertura) crtico na formao da
imagem.
Se estiver totalmente aberto, a imagem torna-se menos ntida
devido reflexo da luz ao longo do trajeto tico e a outros
fatores.
Quando muito fechado, se obtm menor resoluo e
diminuio da nitidez com o aumento da refringncia do
material. Para se obter uma boa imagem, o condensador
dever estar mais prximo possvel da lmina.
Organismos de maior tamanho e mais refringentes, como ovos
de helmintos e protozorios, tornam-se mais facilmente
143

9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
evidenciados com o condensador um pouco baixo e o

diafragma de abertura mais fechado.
Lentes auxiliares: Existentes em alguns modelos de microscpio que possuem lentes
auxiliares abaixo do condensador. Quando disponveis so somente utilizadas junto
com as objetivas de 10x e 20x. Sem estas lentes, no possvel obter uma boa
iluminao do campo microscpico.
Diafragma de campo: Situado na base da estativa e serve para controlar a intensidade
luminosa. Possui um diafragma-ris que pode ser aberto ou fechado atravs do anel de
controle.
Lente fosca: Est localizada sobre o diafragma de campo e se destina a melhorar a
difuso do feixe luminoso.
Lente luz do dia: Lente cinza azulada utilizada para que o feixe luminoso se aproxime
da aparncia da luz natural. Geralmente colocada sobre o diafragma de campo.
Controles de ajuste macromtrico e micromtrico: O controle macromtrico serve
para focalizao inicial do objeto e o micromtrico para ajustes finos de focalizao.
Freio do controle macromtrico: Encontrado na maioria dos microscpios modernos
junto ao controle macromtrico, permitindo a regulagem de sua presso.
Iluminador: Situado na parte posterior da base da estativa. O feixe luminoso emitido
pela lmpada conduzido atravs de um sistema de lentes at o espelho, situado
abaixo do diafragma de campo luminoso, que o conduz para o condensador, passando
pela lmina, objetiva e ocular.
Voltmetro: Para reduo da energia eltrica de rede para a voltagem da lmpada.
Lmpadas: Existem dois tipos: incandescentes e de halognio. As de halognios
fornecem uma iluminao mais eficiente.
MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO

A microscopia de campo claro tem como aplicaes a observao de microrganismos e tecidos
corados, a observao de objetos com bastante contraste a fresco, como helmintos e seus
ovos, e a observao de suspenses de bactrias sem tratamento prvio em lminas
escavadas. Este tipo de microscopia baseia-se na formao de imagem pela multiplicao do
aumento da objetiva pelo aumento da ocular.
A formao de uma imagem ntida est relacionada no s com o grande aumento das
objetivas, mas tambm com sua capacidade de resoluo, que o poder de separar dois
pontos muito prximos.
Uma ocular de grande capacidade pode produzir uma imagem maior que uma ocular padro
de 10x, mas como no haver um aumento correspondente do poder de resoluo, no
mostrar maiores detalhes.
Acessrios
Os acessrios necessrios para microscopia de campo claro so:
144

a) Lente fosca;
b) Lente luz do dia;
c) Oculares de campo amplo.
Procedimento
Ligar o cabo eltrico na tomada;

Ligar a lmpada;
Colocar o preparado no microscpio;
Ajustar a distncia interpupilar e a dioptria;
Colocar a objetiva de 10x no trajeto de luz;
Encostar o condensador na lmina;
Regular a intensidade luminosa com o boto de ajuste correspondente, quando existir
este dispositivo. A intensidade luminosa deve ser ajustada para cada tipo de objetiva.
Quanto maior a capacidade de aumento, maior ser a necessidade de iluminao;
Colocar a lente auxiliar em posio, nos microscpios com este dispositivo;
Fixar o preparado microscpico, montado em lminas perfeitamente limpas, no
Charriot e colocar na posio desejada por meio dos controles coaxiais (Controles
nas coordenadas X e Y);
Focalizar com o macromtrico;
Realizar a focalizao fina com o controle micromtrico;
Movimentar o controle micromtrico para evidenciar estruturas existentes em vrios
nveis do preparado;
Movimentar toda lmina atravs dos controles coaxiais de modo regular at encontrar
a estrutura procurada;
Se necessitar de maior aumento, colocar as lentes correspondentes em posio e
focalizar.
Nota: No utilizar lentes auxiliares em observaes com objetivas de 40x e 100x, pois
prejudicam a nitidez da imagem.
A lente frontal do condensador dever estar na sua posio mais alta para que se
possa aproveitar toda a sua capacidade.
Observao com aumento de 10x e 20x

Geralmente utilizada para organismos grandes como helmintos e seus ovos e para focalizao
de lminas.
Observao com aumento de 40x.

possvel a observao de alguns organismos maiores ou clulas neste aumento. utilizado
para pr-focagem do campo, pois torna mais cmoda a focalizao fina com a objetiva de
100x. Para observao com este aumento necessrio a utilizao de lamnulas.
145

A espessura da lamnula no deve ultrapassar a 0,17 mm. Esta medida vem gravada na
objetiva de 40x. A espessura da montagem da pea (corte histolgico ou esfregao mais meio
de montagem e lamnula) deve ser o mais fina possvel. A espessura excessiva interfere na
formao da imagem devido difrao da trajetria do feixe luminoso.
Observao com aumento de 100x (em leo de imerso)
necessrio utilizar leo de imerso para que os raios luminosos no sejam desviados
pela camada de ar entre a lente e a lmina.
Focalizar o preparado com a objetiva de 40x;
Colocar uma gota de leo de imerso sobre o preparado (o leo de imerso deve
apresentar ndice de refrao ne = 1,518 e de disperso de = 43);
Colocar a objetiva de imerso (100x) em posio;
Encostar a lente frontal da objetiva no leo por meio da manipulao dos controles
coaxiais do Charriot;
Focalizar atravs do controle micromtrico.
Observao de preparados frescos em lminas escavadas
Esta tcnica se utiliza para a observao de movimento bacteriano em suspenso sem

tratamento prvio.
Colocar uma gota de suspenso bacteriana sobre uma lamnula, com uma pipeta de
Pasteur;
Colocar uma pequena quantidade de vaselina slida nos cantos da lamnula com a
gota;
Colar a lamnula com a gota para baixo na rea da escavao da lmina;
Focalizar com aumento de 10x e depois de 40x, com a rea escavada da lmina para
cima.
Os organismos apresentam-se estticos ou com movimentos retilneos, ondulantes,
espiralados, sempre progressivos.
Os movimentos trmulos so causados pelo movimento browniano que provocado
por fenmeno fsico observado em meio fluido se diferenciando do movimento
microbiano.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE

A microscopia de contraste de fase utilizada para a observao de preparados sem
tratamento prvio com corantes (movimentos bacterianos, presena de flagelos, estruturas
celulares). Nesta tcnica, a formao de imagem segue o princpio fsico da interferncia de
ondas luminosas em diferentes fases que se intensificam ou se anulam entre si.
Acessrios de microscopia de contraste de fase

146

Objetivas anulares de 10x, 20x, 40x e 100x: So lentes com uma srie de anis
concntricos (anis de fase).
Discos de diafragmas anulares: So discos acoplados sobre o condensador onde
podemos colocar os diafragmas anulares em posio, por meio de movimento em
revlver. Os anis de cada um correspondem aos espaos existentes entre os anis de
fase da objetiva correspondente. Existem modelos em que o condensador vem
conjugado neste disco. O disco contm marcas indicando o aumento da objetiva
correspondente na sua borda externa, alm da marca zero onde nenhum diafragma
encontra-se no trajeto luminoso.
Lente ou microscpio auxiliar: Usado para centralizao dos anis de fase do
diafragma anular. Tubo tipo telescpio colocado no tubo de observao para
centralizao dos diafragmas anulares.
Filtro verde para diafragma de campo
Procedimento
Colocar o disco de diafragma anular correspondente ao aumento de cada objetiva;

Ligar o microscpio;
Colocar o disco na posio zero e centralizar o diafragma de campo com a objetiva de
10x em posio;
Colocar a lente auxiliar no tubo de observao;
Soltar o parafuso de fixao da lente frontal telescpica da lente auxiliar e movimentla para cima e para baixo, at obter uma imagem ntida dos anis de fase das objetivas
e dos diafragmas anulares; fixar o tubo telescpico;
Fazer com que os anis de fase coincidam entre si atravs dos controles existentes nas
laterais de cada diafragma anular com auxlio da pequena chave que o acompanha.
Realizar este ajuste em todos os aumentos;
Colocar o filtro verde sobre o diafragma de campo;
Colocar uma gota da suspenso de microrganismos em meio lquido ou diluda em
soluo fisiolgica com uma pipeta de Pasteur, e cobrir com uma lamnula;
Seguir o mesmo procedimento para microscopia de campo claro, sempre utilizando o
diafragma anular com a objetiva correspondente.
Observaes: Listeria spp apresentam movimentos de tombamento sobre o seu prprio eixo.
Campylobacter apresenta movimento tpico espiral (saca-rolha).
O microscpio de contraste de fase pode ser utilizado para observaes em campo claro com o
disco de diafragmas anulares colocado na posio zero.
MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO
A microscopia de campo escuro aplica-se observao de microrganismos vivos, sem
preparao prvia. Os raios luminosos so projetados obliquamente sobre o preparado pela
ao do condensador cardioide e, quando encontram obstculos com capacidade de desvi147

los, como por exemplo bactrias, so refratados e atingem a objetiva, formando uma imagem
com contorno brilhante no campo microscpico. Quando no existe nenhum corpo que desvie
estes raios, o campo microscpico aparece escuro porque os raios oblquos no conseguem
penetrar na objetiva.
Acessrio de microscopia de campo escuro

Condensador cardioide: So condensadores que desviam obliquamente o trajeto dos raios
luminosos originrios da fonte luminosa. Existem dois tipos: o seco e o mido. O condensador
mido necessita de um meio lquido entre a lente frontal e a lmina, para que o feixe luminoso
possa atingir de forma correta a preparao. O condensador seco mais prtico, mas a
imagem formada no muito ntida.
Procedimentos
Colocar o condensador cardioide;

Colocar uma gota de leo de imerso sobre a lente frontal do condensador; no caso de
condensador seco, este procedimento dispensvel, entretanto a utilizao na forma
mida aumenta a nitidez da imagem. O condensador seco bastante til para exames
rotineiros de grande quantidade de amostras como nos testes de microaglutinao
para leptospiras;
Colocar uma gota da suspenso de microrganismos em meio lquido ou diluda em
soluo fisiolgica;
Encostar a lente frontal do condensador na lmina;
Focalizar com a objetiva de 10x;
Fechar o diafragma de campo;
Centralizar a imagem do diafragma de campo acionando os parafusos de centralizao;
Colocar outras objetivas em posio e realizar o exame.
Observaes
A visualizao de um campo escuro com microrganismos com halos brilhantes, em
movimentos retilneos, ondulatrios ou espiralados.
As objetivas acima de 20x no so eficientes para este tipo de observao devido
pequena capacidade de captao de luz.
As lminas para campo escuro devem medir entre 0,8 a 1,1 mm
CUIDADOS COM O MICROSCPIO
Durante o uso
Nunca soprar as lentes para retirar a poeira, pois micropartculas de saliva podem se
depositar nas lentes.
Nunca usar lenos faciais para limpeza de lentes, pois estes podem conter filamentos
de vidro que riscam a lente. Podero ser usados tecido de linho ou algodo hidrfilo.
Nunca limpar as lentes com o tecido especial para limpeza de lentes seco.
148

Seguir rigorosamente as instrues do fabricante do equipamento quanto ao uso de

solventes para a limpeza.
Nunca usar lcool para limpeza de lentes, pois a cola usada na montagem das mesmas
frequentemente solvel em lcool.
Limpar o leo residual das objetivas ao final de cada uso com algodo hidrfilo, ou
uma flanela macia, umedecido em xilol ou em ter-acetona 1:1.
Nunca deixar os orifcios de conexo das objetivas e oculares abertos. Mant-los
fechados por plug de proteo adequados ou com as prprias oculares ou objetivas.
No tocar nas lentes com as mos.
Somente usar leo de imerso que atenda a especificao estabelecida pelo
fabricante.
Nunca usar leo de imerso para trabalhos com objetivas que no sejam de imerso.
Estes leos danificam as substncias de montagem destas objetivas.
Os microscpios devem ser colocados em superfcies isentas de vibraes e no so
recomendadas mudanas de localizao.
149

PROCEDIMENTOS DE COLORAO
OBJETIVO
As tcnicas de colorao usadas em microbiologia se destinam observao de estruturas
morfolgicas como esporos, flagelos e forma das clulas, diferenciando microrganismos.
PREPARAO DE ESFREGAO
Para sucesso na observao, necessrio que o esfregao seja bem feito, apresentando-se em
monocamadas, suficientemente concentrado de forma a facilitar a visualizao.
A secagem dos esfregaos deve ocorrer ao ar. Depois de secos, os esfregaos podem ser
fixados com calor, passando rapidamente 2 a 3 vezes atravs da chama de bico de Bunsen.
COLORAO DE GRAM
A colorao de Gram utiliza caractersticas diferenciais das clulas bacterianas. Estas
caractersticas diferenciais se referem estrutura da parede celular dos microrganismos.
Os microrganismos que contm altos teores de cido teicico em sua parede celular se coram,
pela colorao de Gram, em azul intenso e so chamados de Gram positivos.
Os microrganismos que contm lipopolissacardeos na membrana externa somente se coram
com o contra corante, mostrando-se da cor do mesmo (vermelho), e so denominados Gram
negativos.
Reagentes
Cristal Violeta
Este composto cora toda a clula em azul intenso.
Preparo Soluo A
Cristal violeta (90-95% de pureza) 2 g

Etanol 95% 20 ml
Filtrar em papel de filtro.
Preparo Soluo B
Oxalato de amnio 0,2 g

gua destilada 80 ml
150

Preparo Soluo de trabalho

Misturar as solues colocando-se a soluo B sobre a A. Deixar em repouso por 24 horas,
filtrando em seguida. Estocar em frasco mbar.
Soluo de lugol (iodo iodeto de potssio)
O iodeto substitui o cloro do cristal violeta, formando um complexo insolvel em gua.
Preparo da soluo de trabalho:
Cristais de iodo (ou ressiblimado) 1 g

Iodeto de potssio 2 g
gua destilada 300 ml
Misturar e deixar em repouso at dissoluo.
Descorante
A soluo de etanol 95% - acetona atua como descorante. A descolorao ocorre apenas nas
clulas de microrganismos Gram negativos. Alguns autores sugerem que o lcool altera a
permeabilidade da membrana externa dos organismos Gram negativo, devido sua ao
sobre a membrana lipopolissacardica, permitindo a retirada do complexo cristal violeta-iodeto
da clula.
Preparo da soluo descorante de etanol - acetona:
Acetona 10 ml
Etanol 95% 100 ml
Safranina (contracorante)
A safranina atua como contracorante tornando as clulas Gram negativas coradas e visveis. As
clulas de microrganismos Gram positivos provenientes de culturas velhas, lesadas por
qualquer motivo ou mortas, tambm podem ser coradas pela safranina.
Preparo do contracorante - Safranina O - Soluo estoque
Safranina O 2,5 ml
Etanol 95% 100 ml
Soluo de trabalho
Soluo estoque de safranina O 10 ml

gua destilada 90 ml
151

Procedimento de colorao de Gram modificado por Hucker

Originalmente, a colorao descrita por Christiam Gram usava violeta de genciana, que uma
mistura de cristal violeta com outros componentes. Hucker modificou o mtodo substituindo a
violeta genciana pelo cristal violeta puro, que muito estvel e permite uma melhor
diferenciao dos microrganismos.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Cobrir o esfregao com cristal violeta por 1 minuto;

Retirar o excesso de cristal violeta;
Cobrir com lugol por 1 minuto;
Escorrer e lavar suavemente em gua;
Descorar com lcool-acetona ou etanol 95% por 1 a 5 segundos (at que a maior parte
do cristal violeta seja removido);
Lavar delicadamente em gua;
Adicionar soluo de contracorante - safranina - por 30 segundos;
Lavar delicadamente em gua;
Deixar secar no ambiente.
COLORAO DE GRAM PARA ANAERBIOS

Esta colorao se baseia na substituio da safranina por carbol fucsina, que mais efetiva
para a colorao de alguns anaerbios Gram negativos e Legionella.
O aumento do tempo de exposio ao contracorante (carbol fucsina) permite uma maior
penetrao do mesmo dentro destas clulas, o que as tornar mais facilmente visveis.
Para anaerbios o descorante usado o etanol.
Procedimento de colorao
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Corar o esfregao por 30 segundos com cristal violeta;

Retirar o excesso de cristal violeta;
Cobrir com lugol por 30 segundos;
Escorrer e lavar com gua corrente (fluxo suave);
Descorar com etanol 95% por 30 segundos;
Lavar com gua corrente (fluxo suave);
Adicionar soluo de contracorante carbol fucsina por 1 minuto ou mais (soluo
aquosa de fucsina bsica 0,8% (m/v);
8. Deixar secar em ambiente.
TCNICAS DE COLORAO PARA FLAGELOS
Colorao para flagelos
152

Os flagelos so organelas das bactrias responsveis pela motilidade, os quais possuem, em

sua constituio, molculas proteicas denominadas flagelinas. O flagelo formado por
milhares de monmeros polimerizados de flagelina ordenados de maneira a formar um nico
flagelo.
Algumas dificuldades podem ser encontradas quando se deseja demonstrar este tipo de
estrutura em uma bactria:
a) A produo de flagelos nas bactrias no contnua e dependente de vrios fatores como
temperatura, substrato, estgio do crescimento, etc.
b) Os flagelos podem ser acidentalmente removidos da bactria pela pipetagem ou
homogeneizao muito vigorosa.
c) O flagelo se despolimeriza facilmente, isto , se dissocia em monmeros de flagelina com
frequncia (quando a temperatura alcana mais de 60C, quando o pH se torna muito cido
(pH 4,0) e quando a clula est em presena de lcalis, de ureia e de solventes orgnicos).
d) necessria a aplicao de tcnicas para aumentar o dimetro dos flagelos, de forma a
torn-los visveis pelas tcnicas microscpicas usualmente adotadas em laboratrios
microbiolgicos.
O cido tnico contido no corante se ligar ao flagelo, tornando-o mais grosso. A
demonstrao do flagelo ocorrer devido ligao do corante ao cido tnico.
Procedimento
1. Preparar cultura da bactria em estudo sobre a superfcie de gar infuso de crebro
ou em gar soja triptona (com ou sem sangue), incubando em temperatura e tempo
adequados;
2. Transferir delicadamente uma alada do crescimento para tubo contendo cerca de 3ml
de gua destilada. Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspenso. Colocar
uma gota desta suspenso sobre uma lmina e deixar secar ao ar;
3. Cobrir a lmina com o corante e deixar por 5 minutos, at que um brilho metlico
esverdeado cubra metade da rea. No deixar o corante secar sobre a lmina;
4. Retirar o corante enxaguando com gua;
5. Secar;
6. Observar ao microscpio com objetiva de imerso.
Preparo do corante - Soluo A
Fucsina (certificada para colorao de flagelo) 0,5 g

lcool etlico 95% 50 ml
Misturar e deixar em repouso de um dia para o outro para dissoluo.
153

Preparo do corante - Soluo B
Cloreto de sdio 0,75 g

cido tnico 1,5 g
Misturar vigorosamente as solues A e B.
A mistura de corantes pode ser usada at 2 meses aps o preparo, se mantida sob
refrigerao. Poder se formar um precipitado. O precipitado no deve ser homogeneizado
com o restante da soluo durante procedimento de colorao.
TCNICA PARA COLORAO DE ESPOROS (Wirtz-Conklin)
Colorao com verde malaquita

A parede dos esporos constitui uma barreira eficaz contra a entrada e a sada de materiais do
esporo.
O tempo prolongado de exposio ao corante (verde malaquita), associado ao aquecimento,
permite o rompimento desta barreira obtendo-se, ento, o esporo corado em verde intenso.
Como contracorante utilizada a safranina, que cora outras estruturas em rosa, facilitando a
diferenciao dos esporos.
Preparo de solues
Soluo A : Verde malaquita 5%
Verde malaquita 2,5 g

gua destilada 50 ml
Misturar e deixar em repouso de um dia para o outro para dissoluo.
Soluo B: Safranina - Soluo estoque
Safranina O 50 g
Etanol 95% 2000 ml
Soluo B: Safranina - Soluo de trabalho
Soluo estoque de safranina O 300 ml

Procedimento
1. Preparar esfregao e fixar pelo calor;
154

2. Cobrir o esfregao com o corante verde malaquita;

3. Aquecer gua em um becker at comear a sair vapor. Colocar a lmina sobre este
becker, mantendo o corante aquecido por 5 minutos. Alternativamente, cobrir a
lmina com verde malaquita e aproximar o mximo possvel de uma chama de bico de
Bunsen e deixar at que desprenda vapor. Afastar do fogo e aps 1 a 2 minutos repetir
a operao por 3 a 4 vezes;
4. Lavar suavemente com gua. Evitar o choque trmico que poder quebrar a lmina;
5. Contra corar com soluo de safranina por 30 segundos;
6. Lavar e secar;
COLORAO PARA CORPSCULOS DE INCLUSO
CRISTALINA
A deteco de corpsculos de incluso cristalina uma das provas usadas para caracterizar
algumas variedades de Bacillus thuringiensis, sendo utilizada como prova diferencial de
Bacillus cereus.
Os corpsculos de incluso cristalina de algumas variedades de Bacillus thuringiensis so
cristais tetragonais de toxina, abundantes em culturas velhas (3-4 dias), que somente so
liberados aps a lise do esporngio.
Dois mtodos esto descritos para esta finalidade: colorao a quente, com soluo de fucsina
bsica 0,5%, e colorao a frio, com soluo corante base de azul de Coomasie.
Colorao com fucsina bsica
1.
2.
3.
4.
5.
Repicar a cultura em gar nutriente inclinado;

Incubar a 30 1C por 24 horas e posteriormente em ambiente por 2 a 3 dias;
Preparar esfregao em lmina de vidro limpa;
Secar ao ar e fixar rapidamente passando sobre uma chama de bico de Bunsen;
Mergulhar em lcool metlico, deixando em contato por 30 segundos. Retirar e deixar
secar ao ar.
6. Corar com soluo de fucsina bsica 0,5% a quente (aproximar o mximo possvel de
uma chama de bico de Bunsen e deixar at que desprenda vapor. Afastar do fogo e
aps 1 a 2 minutos repetir a operao;
7. Esperar cerca de 30 segundos para que a lmina esfrie e lav-la com gua;
Os corpsculos de incluso cristalina do Bacillus thuringiensis se apresentam como pequenos
discos de bordas convexas (em forma de gro de lentilha) de cor rosa intensa.
Colorao com azul de Coomasie
155

Preparo da soluo Corante azul de Coomasie
Azul Coomasie 0,25 g

Metanol 50 ml
cido actico glacial 7 ml
Procedimento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Repicar a cultura em gar nutriente inclinado;

Incubar a 30 1C por 24 horas e, posteriormente, em ambiente por 3 a 4 dias;
Preparar esfregao em lmina de vidro limpa;
Secar ao ar e fixar rapidamente passando sobre uma chama de bico de Bunsen;
Cobrir o esfregao com a soluo de azul de Coomasie por 3 minutos;
Escorrer e lavar suavemente com gua corrente;
Secar;
Observar ao microscpio com objetiva de imerso.
Os corpsculos de incluso cristalina do Bacillus thuringiensis se apresentam como estruturas

tetragonais de cor azul intensa.
Alternativamente pode ser utilizada a colorao de Wirtz-Conklin (verde malaquita) para corar
os corpsculos de incluso cristalina. Os corpsculos de incluso cristalina do Bacillus
thuringiensis se apresentam como estruturas tetragonais de cor rosa, enquanto os esporos se
coram em verde.
COLORAO DE GRAM - CARBOL FUCSINA MODIFICADA POR HUCKER PARA Campylobacter
Procedimento
1. Preparar esfregao dos cultivos suspeitos;
2. Deixar secar ao ar e fixar delicadamente passando sobre uma chama de bico de
Bunsen;
3. Corar pelo mtodo de Gram modificado por Hucker;
4. Corar por 1 minuto com cristal violeta oxalato de amnio;
5. Lavar com gua;
6. Cobrir com lugol por 1 minuto;
7. Lavar com gua;
8. Descorar com etanol 95% at que saia todo o corante;
9. Lavar com gua;
10. Contracorar com carbol fucsina por 10 a 20 segundos;
11. Lavar com gua;
12. Secar e examinar em microscpio de campo claro com objetiva de imerso.
156

Todos os cultivos de Campylobacter se apresentam como bastonetes Gram negativos, curvos

ou espiralados, com arranjo tpico em forma de asa de gaivota.
Preparo dos corantes de Gram modificados por Hucker para Campylobacter

Soluo Corante Cristal violeta-oxalato de amnio
Soluo A
Cristal violeta (90-95% de pureza) 2,0 g

Etanol 95%200 ml
Soluo B
Oxalato de Amnio 8,0 g

Etanol 95% 800 ml
Preparo da soluo final

Misturar a soluo A e B. Deixar em repouso por uma noite ou mais em temperatura
ambiente. Filtrar em filtro de papel grosso.
Preparo da soluo de lugol para colorao de Campylobacter
Cristais de iodo ou iodo ressiblimado 1,0 g

Iodeto de potssio 2,0 g
Descorante
Etanol 95%
Preparo da carbol Fucsina 0,3%
Soluo A:
Fucsina bsica 0,3 g

lcool etlico 10 ml
Soluo B:
Fenol (cristais fundidos) 5,0 ml

gua destilada 95 ml
Misturar as solues A e B.
157

COLORAO PARA OBSERVAO DE MOVIMENTO BROWNIANO DE ESPOROS (Paenibacillus

larvae)
1. Preparar o esfregao em uma lamnula limpa;
2. Secar ao ar ou sob o calor de uma lmpada;
3. Fixar sob o calor de uma lmpada ou fixar passando, rapidamente, por 2 ou 3 vezes,
sobre uma chama de bico de Bunsen. Os esporos de P. larvae no se fixam na
lamnula;
4. Corar com soluo carbol-fucsina por 10 segundos;
5. Tirar o excesso de corante, deixando escorrer;
6. Cobrir uma lmina de vidro com uma camada fina de leo de imerso e sobre esta
colocar a lamnula ainda mida, em posio invertida, preparada conforme descrito
acima;
7. Observar em microscpio com objetiva de imerso.
Os esporos se coram em rosa mais intenso que as clulas e apresentam movimento vibratrio
(movimento Browniano).
158

Bibliografia
FDA. Bacteriological Analytical Manual Online. 2013. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento, Mtodos Oficiais para Anlises
Microbiolgicas em Alimentos de Origem Animal e gua, 2013.
Disponvel em:
http://www.agricultura.gov.br/animal/laboratorios/publicacoes.
159

Análises microbiológicas de alimentos e água

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Mariana Torres de Castro

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SOLUES ......................................................................................................................... 102

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ANLISES MICROBIOLGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE

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CONTAGEM PADRO DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS ESTRITOS

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias;

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CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

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5. Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias.

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CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS VIVEIS CAPAZES

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

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Esta diferenciao necessria porque as colnias de Bacillus sporothermodurans no devem

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7. Incubar a 36 1C por at 72 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol

A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos mesfilos aerbios

Quando estes microrganismos forem encontrados, constar como observao:

Devero ainda acompanhar o resultado da anlise informaes adicionais sobre o tipo

Os resultados de contagem de microrganismos mesfilos aerbios viveis em leite UHT

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CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

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Reagentes para colorao de Gram.

Pesagem e preparo da amostra

Testes confirmativos para Clostridium perfringens

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2. Fermentao tempestuosa (storm test): Transferir 1 ml da cultura fresca obtida no

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CARACTERSTICAS DIFERENCIAIS DE CLOSTRDIOS

A = cido; AG = cido e gs; T = turbidez; CS = claro com sedimento celular; + = positiva; - =

Clculo do nmero de Clostridium sulfito redutor presentes na amostra: Calcular o

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CONTAGEM DE Staphylococcus aureus

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Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

Pesagem e preparo da amostra

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Reao negativa: no formao de cogulo;

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fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um

Quando o nmero de colnias confirmadas for igual ao nmero de colnias

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CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM

Vidrarias e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos.

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CONTAGEM DE Bacillus cereus

Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de

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