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PALABRAS CLAVE:
RESUMEN
KEYWORDS:
Amiloglucosidase, amilase,
cassava starch, enzymes amylolitics, bacillus sp.
ABSTRACT
In Colombia few studies of prospection have been made, in spite of
having a high biological diversity. In the present work the study of isolated
____________
Recibido para evaluacin: Diciembre 1 de 2003. Aprobado para publicacin: 27 de febrero de 2004.
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Todos los autores son miembros del Grupo de Biotecnologa, Universidad de Antioquia.
M. Sc. Ingeniera Qumica.
M.Sc. Biotecnologa. Ingeniero Qumico, Microbiologo.
Ph.D. Microbiologo.
Microbiologa.
Ingeniera Qumica.
Qumica, Politcnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid (PCJIC).
microbial stocks of different ecological niches, producing of amilolticas enzymes were made, thus: cassava,
potatoes and corn starch processing. The criteria used for the isolation of the amylolitics stocks, were
inherent to the growth on means modified with starch and the true of the Test of Lugol. The culture employees
were modified CZAPEK, PCA and MRS. The obtained stocks properly were purified, child conserved and identified
biochemically, obtaining a total of 103 native stocks. Of this one total of stocks, they were selected due to the
similarity between isolated microorganisms, 13 stocks. These last ones were identified biochemically. The
found sorts were Bacillus sp, Clostridium sp and Kurthia sp. The obtained amylolitics enzymes from the native
stocks displayed molecular weights that oscillate approximately between 30 and 150 KDa.
INTRODUCCIN
La produccin de jarabes se basa en la degradacin del
almidn, y ha sido empleada industrialmente desde la
dcada del 70. Desde entonces, se han venido desarrollando procesos enzimticos que permiten transformar el almidn en los llamados jarabes con alto contenido de fructosa, dando origen a nuevos productos con
mayor poder edulcorante y menor costo en relacin con
el azcar de caa. La produccin de jarabes se da en
dos etapas, en la primera se utiliza una enzima -amilasa
y en la segunda una amiloglucosidasa. En el mundo
actualmente se buscan enzimas amilasas y amiloglucosidasas con caractersticas diferentes a las ya comercializadas.
Los jarabes glucosados son soluciones de glucosa en
alta concentracin que se utilizan en diversas aplicaciones de la industria alimenticia y biotecnolgica (1). Los
jarabes de glucosa se obtienen por hidrlisis enzimtica
del almidn (2). Este proceso requiere dos etapas, la
primera etapa, denominada de licuefaccin, es una
hidrlisis de las largas cadenas de almidn para obtener maltodextrinas (cadenas mas cortas de almidn),
esta es llevada a cabo por la enzima -amilasa que corta
los enlaces glicosdicos -1,4 internos en forma aleatoria
del almidn. En la segunda etapa, denominada
sacarificacin se hidrolizan los enlaces -1,4 y/o -1-6
del terminal no reductor de la cadena de dextrina, por la
enzima amiloglucosidasa, liberando glucosa (3).
Hasta el momento el proceso de hidrlisis enzimtica del
almidn hasta glucosa, se ha llevado a cabo en dos etapas, licuefaccin y sacarificacin, por lo que ha sido necesario cultivar y manipular dos microorganismos productores de enzimas amilolticas separadamente, conllevando a un alto consumo de energa y de equipos para el
proceso adems de las diferencias existentes entre el pH
y la temperatura que necesitan las dos enzimas, es difcil
que ambos acten simultneamente con el almidn.
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La amiloglucosidasa se utiliza a gran escala en la industria del procesado del almidn en tanques discontinuos
a 55-60C y pH de 4.5 y con perodos de incubacin de
48-92 h. para transformar las dextrinas formadas por la
hidrlisis de alfa-amilasa en glucosa. El calcio la
estabiliza frente a la desnaturalizacin por el calor o el
lcalis (6).
En las industrias de alimentos y bebidas, las enzimas han
sido aplicadas satisfactoriamente desde hace muchos
aos y la necesidad de controlar los costos es dominante. Por ejemplo, en la produccin de edul-corantes se
han venido reemplazando la sacarosa de caa por otros
provenientes de una materia prima ms barata y accesible; como es el almidn de maz que se puede transformar en glucosa y de ella producir jarabes ricos en fructosa
con mayor poder endulzante y a menor costo, adems,
de las ventajas que tiene por ser producidos por va
enzimtica y no por va qumica. (6).
En el mundo actualmente se buscan enzimas amilasas
y amiloglucosidasas con caractersticas diferentes a las
ya comercializadas. Esto se hace mediante estudios de
bioprospeccin microbiana, que tratan de identificar las
potencialidades de la flora microbiana presente en los
diversos nichos ecolgicos del mundo, que posibiliten
la formacin de industrias productoras de enzimas y las
industrias derivadas de su aplicacin (4). En Colombia
se han realizado pocos estudios de este tipo, pese a que
posee una elevada diversidad biolgica (7).
Por tal razn, el objetivo del presente trabajo fue realizar
el estudio de cepas microbianas aisladas de diferentes
nichos ecolgicos, productoras de enzimas amilolticas.
Los resultados obtenidos incluyen el aislamiento de 103
cepas amilolticas. De estas, debido a la similitud entre
microorganismos aislados, se seleccionaron 13 cepas, las cuales fueron identificadas bioqumicamente.
De las 13 cepas estudiadas se seleccion una de las
que result positiva en la prueba de lugol y que present mayor halo, al igual que su expresin en la protena
fue siempre mejor, para establecer si presentaba actividad amiloltica; se estudi cualittivamente el efecto que
presentan diferentes fuentes de carbono en la expresin de la protena. La cepa utilizada en la fermentacin
correspondi a un Bacillus sp, para el cual no se obtuvieron resultados satisfactorios de actividad amiloltica
tanto para alfa amilasa como para amiloglucosidasa,
bajo las condiciones de fermentacin establecida.
MATERIALES Y METODOS
MICROORGANISMOS:
Se aislaron cepas microbianas de las fuentes de almidn (maz, papa y yuca) procedentes de sus respectivas procesadoras. Se identificaron por medio de
coloraciones y crecimiento en cultivos selectivos (MRS,
CZAPEK y PCA), para que crecieran, segn sean mohos, levaduras o bacterias.
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Con base en el crecimiento sobre los medios modificados con almidn, la positividad frente al Test
de Lugol, y los aspectos mor folgicos de los
microorganismos, se hizo el aislamiento de las cepas amilolticas.
Estas cepas se sembraron por agotamiento en el
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CONDICIONES DE CULTIVO
Se utilizaron frascos tapa rosca de 500 mL conteniendo
medio de cultivo PCA en volumen de 150 mL por duplicado, incluyendo el almidn como substrato de degradacin para las enzimas amilolticas y como fuente de
carbono para los microorganismos. Estos cultivos se
colocaron en agitadores orbitales (BOEKEL cerant ORS
200) a una agitacin de 130rpm, T de 30C, durante
72h.
FERMENTACIN
El inculo para la fermentacin, se prepar con la cepa
incubada en cajas petri. Tomando la muestra con asa
de ojo y adicionndola a 20 mL de medio lquido PCA,
hasta obtener una concentracin adecuada, verificada
con la lectura de la densidad ptica de la muestra en un
espectrofotmetro, a una longitud de onda de 600 nm.
Posteriormente fue adicionada al medio lquido para ser
fermentada en un bao agitado a 130 rpm y 30 C durante un perodo de 24 a 96 horas.
Determinacin de la Actividad enzimtica
Se tomaron 10 mL de muestra de la fermentacin a las
24, 48, 72 y 96 horas, en cmara de flujo laminar para
evitar contaminacin. Posteriormente la muestra fue
centrifugada a 4000 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente. Se tom el lquido decantado y se
practic la determinacin de actividad enzimtica de la
AMG, utilizando la tcnica desarrollada por Industrias
NOVO, en la que 1 AGU es la cantidad de enzima que a
condiciones estndar hidroliza una micromol de maltosa
por minuto a 25 C y pH 4.3 (Mtodo analtico Referencia: AF 22/ 4-GR. 1976, http:// www. Enzymes. Novo.dk,
2003)(9).
Se realiz tambin la determinacin de la actividad
enzimtica de la Alfa Amilasa siguiendo el protocolo descrito en el mtodo analtico Novozyme. EB-SM- 0009 02/
01. Mtodo basado en la degradacin de almidn por la
enzima alfa amilasa, en el que 1 KNU (kilo Novo Unit) es
la cantidad de enzima la cual degrada 5 mg de almidn
soluble por hora bajo condiciones estndar (9).
Adicionalmente, se realiz la concentracin de las muestras y se les practic las pruebas de medicin de la
actividad tanto amiloglucosidasa como alfa amilasa, siguiendo los protocolos establecidos. Para la concentracin se tomaron 5 mL de muestra se le adicionaron
13
15 mL de sulfato de amonio concentrado (solucin saturada), se guard en nevera a 4 C por 60 min., luego
se centrifug a 10000 rpm por 10 min. a 4 C, se elimin el decantado y se resuspendi el precipitado en 200
?L de solucin buffer fosfato (6).
RESULTADOS Y DISCUSION
Proceso de aislamiento y seleccin
Se aislaron 103 cepas, teniendo en cuenta los
parmetros morfolgicos, el crecimiento en los medios
modificados con almidn y la positividad frente al Test
de Lugol. Dentro de las cepas obtenidas figuran
microorganismos de tipo bacilos y cocos Gram Positivos y Gram. negativos. Debido a la marcada similitud
existente entre algunos de las cepas aisladas y con base
en las diferencias de tipo morfolgico, se seleccionaron 13 de ellas para su respectiva identificacin las cuales se presentan en la Tabla 1.
Identificacin bioqumica
Las cepas amilolticas seleccionadas fueron identificadas bioqumicamente, mostraron per tenecer a
los gneros Bacillus sp, Clostridium sp y Kurtia sp.,
siendo el primero el ms predominante dentro de
las cepas seleccionadas. En la Tabla 2. aparecen
consignados los resultados obtenidos a par tir del
anlisis bioqumico de las cepas seleccionadas y la
clasificacin segn gnero de las mismas. Los
parmetros utilizados para la clasificacin y anlisis
de resultados de los microorganismos manejados
son los descritos por Bergeys. (10).
'(6&5,3&,1
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EODQFDV
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&RORQLDVUHJXODUHVEULOODQWHV\FUHPRVDV
&RORQLDVLUUHJXODUHVJUDQGHV\EODQFDV
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&RORQLDVUHJXODUHVPHGLDQDV\FUHPRVDV
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7,32'(02*
),/$1&,$
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%DFLORV*UDP
%DFLORV*UDP
* M.O: microorganismo, las muestras seleccionadas fueron del muestreo de almidn de maz, estas presentaron una
mayor formacin de halo.
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electroforesis para determinar el peso molecular promedio de las protenas presentes en las fermentaciones. Los resultados se presentan en la Tabla 3, donde
se observa como vara el peso molecular de las protenas de acuerdo con la especie; el peso molecular
oscila entre 38-175 KDa (11), 1997; (3), 1998). Como
se puede observar de los resultados, es posible que
las cepas estn expresando protenas de AMG, ya que
estn en rango de pesos moleculares esperados, seguira la prueba de actividad enzimtica para corroborar si son AMG (amilogucosidasas) o alfa amilasas.
Las enzimas amilolticas varan su peso molecular dependiendo del microorganismo que las produce presentando pesos entre 38 y 175 KDa. Cabe anotar que,
las -amilasas microbianas oscilan entre 23-96KDa,
mientras que las amiloglucosidasas estn entre 82114KDa En nuestro caso, las enzimas amilolticas producidas por los microorganismos nativos seleccionados, presentaron pesos moleculares que oscilaron entre 30 y 150 KDa aproximadamente. Por esta razn, no
es clara la determinacin si las enzimas producidas son
-amilasas o amiloglucosidasas, dada la diversidad de
tamaos moleculares presentes en ellas. Se recomien-
N DE
COLONIA
*
*
catalasa
GENERO
citrato
SIM
TSI
%DFLOOXVVS
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.XUWKLDVS
%DFLOOXVVS
&ORVWULGLXPVS
%DFLOOXVVS
%DFLOOXVVS
%DFLOOXVVS
* Las colonias 72 y 89 no pudieron ser identificadas por la ambigedad que presentan sus
comportamientos bioqumicos, razn por la cual su clasificacin segn gnero requiere la
realizacin de otras pruebas confirmatorias.
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TABLA 3. Peso molecular de las protenas obtenidas a partir de las cepas amilolticas nativas seleccionadas.
1qGHFRORQLD 3HVRPROHFXODUN'D
CONCLUSIONES
Bajo las condiciones de referencia se logr obtener un
cepario de 103 cepas amilolticas, de las cuales 13
presentaron cualitativamente mayor actividad amiloltica
e identificadas bioqumicamente pertenecen a los gneros Bacillus sp ,Clostridium sp y Kurthia sp,estas fueron presentadas en el Almidn de maz.
Se plantea la necesidad de realizar futuras investigaciones, orientadas a la experimentacin con otros medios
de cultivo diferentes al PCA, que proporcionen los
nutrientes necesarios para el mantenimiento del microorganismo, y que estimulen la expresin de la enzima
amiloltica AMG. A su vez, se puede recomendar una
metodologa diferente, donde se realice un seguimiento
durante un mayor tiempo, con el objetivo de verificar el
comportamiento del microorganismo y la produccin
de protenas a perodos ms largos de fermentacin.
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Figura 1. Perfiles electroforticos (SDS-PAGE) obtenidos usando el marcador de peso molecular de Sigma B2787,
y las enzimas comerciales, a-amilasa bacteriana (Tarmamyl 120L) y la amiloglucosidasa fngica (AMG 300L).
$
7
0
.'D
.'D
.'D
.'D
.'D
Figura 2. Influencia de la fuente de carbono en la expresin de enzimas amilolticas en la cepa 24 a las 72h de
fermentacin. T: enzima Tarmamyl 120L, A: AMG 300L, 24-A: medio con almidn, 24-D: medio con dextrina, 24G: medio con glucosa, M: marcador de peso molecular (Sigma B2787).
24-G
24-A
24-D
116 KDa
97 kDa
58 kDa
39.8
KD
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REFERENCIAS
((1) Quintero, R., 1990. Ingeniera Bioqumica, editorial Alambra Mexicana, Mxico.
(2) James, J. Lee, B., 1997. Glucoamylases: Microbial
Sources, Industrial Applications and Molecular
Biology- A Review. Journal of Food Biochemistry.
21:1-52.
(3) Uhlig, H., 1998. Industrial enzymes and their
applications, John Wiley & sons. 33: 45-64.
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